МЕМБРАННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ПЕПТИДОВ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2018 года по МПК A61K35/48 A61K35/55 A61P13/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и биотехнологии и может быть использовано в медицине для получения лекарственного средства, применяемого при лечении заболеваний мочеполовой системы.

Уровень техники

Показано, что цитомединовые препараты, получаемые из различных тканей животного происхождения, обладают выраженной тканеспецифичностью и практически не обладают антигенными свойствами и не провоцируют иммунную систему. Основа подобных препаратов - смесь пептидов, осуществляющих регуляцию функционирования, развития и взаимодействия клеточных популяций ткани, из которой происходят [5].

Известны пептидные препараты из ткани предстательной железы, для которых доказана эффективность при терапии заболеваний мочеполовой системы. Исследования показывают, что данные препараты способствуют уменьшению отека, нормализуют секреторную функцию эпителиоцитов, стимулируют мышечный тонус мочевого пузыря. Это обуславливает терапевтический эффект при обострении хронического простатита и доброкачественной гиперплазии предстательной железы [1, 2]. При хроническом пиелонефрите регуляторные пептиды препаратов обеспечивают нормализацию лейкоцитурии и СОЭ, снижение церуллоплазмина и С-реактивного белка в сыворотке крови [1]. Также показано стимулирующее влияние подобных препаратов на гладкую мускулатуру вен мочевого пузыря и предстательной железы [2].

Известен способ получения средства, нормализующего репродуктивную функцию у мужчин [2]. Сырье (семенники) предварительно замораживают при температуре не менее -40°С, выдерживают при - 21±1°С не менее двух месяцев. Экстракция пептидов проводится с добавлением к измельченному сырью пяти объемных частей 3%-ного раствора уксусной кислоты и 1/50 части 1%-ного раствора хлористого цинка. Температурный режим: до добавления хлорида цинка - 20±5°С, последующая экстракция - 11,5±4,5°С. Экстракция проводится 48 ч, при этом каждые четыре часа проводят перемешивание в течение часа. Далее полученный экстракт подвергается очистке, включающей сепарирование, осаждение ацетоном в пятикратном объеме (4 ч при 3÷5°С), повторное двукратное осаждение и промывку осадка, содержащего целевые пептиды (температура 7±16°С) ацетоном на нутч-фильтре. Полученный осадок протирают, высушивают, растворяют до концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл. Затем раствор, содержащий целевые пептиды в указанной концентрации, центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке через материалы с задерживающей способностью 15 кДа. Полученный ультрафильтрат стабилизируют гликоколом (в конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН 5,6÷6,6), подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы и автоклавируют 8 минут при 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см². Данный способ позволяет получить биологически активные пептиды в виде готовой лекарственной формы, однако обладает рядом недостатков. Рассматриваемый процесс получения препарата сложный в исполнении и занимает много времени. Применение органических растворителей не только создает риски экологической безопасности, но и повышает требования к пожарной безопасности производств. Также выход целевого продукта при осаждении его ацетоном относительно низок.

Широко известен способ получения препаратов Простатилен и Сампрост [9]. Способ также основан на осаждении и промывке целевых пептидов при помощи ацетона, в качестве сырья используются предстательные железы. Получение данных препаратов включает следующие стадии: экстрагирование пептидов из сырья 3%-м раствором уксусной кислоты при температуре 15-20°С в течение 48±2 часов при периодическом перемешивании; получение полупродукта - ацетонового порошка путем осаждения, промывки и высушивания при помощи ацетона; растворение полученного порошка в воде для инъекций с последующей ультрафильтрацией и сублимационной сушкой. На основе полупродукта, получаемого при данном способе, производят средства для лечения заболеваний предстательной железы для местного применения, выпускаемые в форме свечей [4, 7, 8]. Однако подобный способ обладает описанными выше недостатками, связанными с применением органических растворителей и низким выходом целевого продукта.

Прототипом настоящего изобретения является способ получения пептидов, восстанавливающих мочеполовую систему мужчин, из предстательной железы [3]. Процесс включает измельчение сырья, экстрагирование целевых пептидов в растворе уксусной кислоты при комнатной температуре при периодическом перемешивании в течение 18-24 ч, однократное замораживание экстракта при температуре минус 5-20°С с последующим оттаиванием, фильтрацию через капроновую сетку, осветление и ультрафильтрацию на мембранах с селективностью 10 кДа. Полученный ультрафильтрат разводят дистиллированной водой до требуемого содержания полипептидов и готовят лекарственную форму. Показано, что выход целевого продукта с единицы сырья повышается в 5-8 раз по сравнению с методами, основанными на осаждении ацетоном. Способ обладает некоторыми недостатками - на этапе замораживания-оттаивания возможно повреждение молекул целевых пептидов, а также недостаточно полный выход пептидов в ходе экстракции.

Сущность изобретения

Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке простого в исполнении способа получения препарата на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин.

При разработке настоящего изобретения была поставлена задача по созданию простого в исполнении способа получения препарата на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин с максимальным выходом целевого компонента из сырья без использования органических растворителей в технологическом процессе.

Решить поставленную задачу удалось за счет подбора оптимальных для технологического процесса условий экстракции, выделения и очистки целевых пептидов предстательной железы из экстракта методом ультрафильтрации и использованием глицина в качестве стабилизатора раствора для лиофилизации в концентрации 20 мг ±10% на 1 мл.

Предлагаемый способ включает следующие этапы:

- измельчение ткани предстательных желез животных (например, крупного рогатого скота или свиней). Экстракция 3%-м раствором уксусной кислоты в течение 24±2 часов с добавлением хлорида цинка из расчета 5 г на 1 кг сырья при температуре +37±2°С;

- изменение рН экстракционной смеси до 9,0-9,5 при помощи 5,0 н. щелочи (например, NaOH) для очистки от балластных веществ. Отделение жмыха от экстракта, полученного на предыдущей стадии, путем сепарирования либо центрифугирования (3000 об/мин, 20 мин); доведение рН экстракта до значения 5,8±0,2 уксусной кислотой;

- осветляющая фильтрация отсепарированного экстракта на нутч-фильтре через фильтровальный картон с применением вспомогательного вещества - 10% кизельгура;

- ультрафильтрация осветленного экстракта в тангенциальном потоке на мембранах с порогом отсечения 10 кДа, сбор пермеата, содержащего целевые пептиды. Очистка целевого продукта от низкомолекулярных примесей с применением ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах, отсекающих вещества с молекулярной массой менее 1 кДа (на этом этапе возможно концентрирование). Диафильтрация концентрата (при необходимости);

- получение стерильного раствора для лиофилизации - корректировка рН до значения 5,8±0,2 (при необходимости; уксусной кислотой либо щелочью), добавление глицина (из расчета 20 мг/мл), разведение водой для инъекций до необходимой концентрации пептидов (при этом раствор должен обеспечивать реактивацию щелочной фосфатазы не менее чем на 20% либо выдерживать иные испытания биологической активности), стерилизующая фильтрация на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм;

- получение готовой лекарственной формы - стерильный розлив раствора, содержащего целевые пептиды и лиофильная сушка.

Исследование влияния температуры экстракции на выход целевых пептидов из сырья пептидов проводилось для двух температурных режимов: 20±3°С (комнатная температура) и +37±2°С (температура тела теплокровных животных). Было показано, что содержание пептидов в 1,85 раз больше в экстрактах, полученных при более высокой температуре. Полученные данные указывают на необходимость проведения процесса экстрагирования при температуре +37±2°С для более полного извлечения целевого продукта из сырья.

Параллельно с подбором оптимальной температуры экстракции производилось исследование зависимости выхода целевых пептидов из ткани в экстракт от времени данной технологической операции. Согласно результатам эксперимента, концентрации пептидов в экстрактах, полученных при экстрагировании в течение 24±2 и 48±2 часов, значимо не отличаются, причем это соблюдается при двух описанных температурных режимах. Исходя из результатов, оптимальным временем проведения экстракции является 24±2 часа, поскольку сокращается длительность технологического процесса при высоком выходе целевых пептидов.

Было изучено влияние соотношения сырья и экстрагента (3% раствора уксусной кислоты) в экстракционной смеси на выход биологически активных пептидов. Рассмотрены соотношения от 1:5 до 1:2 (сырье:экстрагент).

Содержание пептидов в экстрактах, полученных при комнатной температуре экстракции, увеличивается с увеличением доли экстрагента в смеси. В то же время, данное соотношение не влияет на выход целевых пептидов при +37±2°С, при этом подтверждены данные о значимом увеличении выхода продукта при увеличении температуры.

Для осветления экстракта предстательной железы, уменьшения нагрузки и, следовательно, увеличения срока эксплуатации мембран ультрафильтрационных кассет необходим этап предварительной фильтрации. В описываемом изобретении данный процесс включает изменение рН экстракта до умеренно щелочных значений (9,0-9,5), что обеспечивает выпадение балластных компонентов в виде осадка с сохранением целевого продукта, отделение жмыха вместе с балластными веществами и фильтрацию через фильтровальный картон со вспомогательным веществом кизельгуром (10% от массы экстракта).

Молекулярная масса целевых пептидов, обладающих биологической активностью, находится в диапазоне от 1 до 10 кДа. В связи с этим, для получения препарата из предстательной железы мембранным способом осветленные экстракты предстательных желез ультрафильтровали в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 10 кДа.

Краткое описание иллюстративных материалов

Фиг. 1. Подбор температурного режима экстракции пептидов из ткани предстательной железы - содержание (мг) пептидов в 100 г сырья.

Фиг. 2. Влияние длительности и температуры экстракции на выход пептидов в экстрактах предстательной железы в мг на 100 г сырья.

Фиг. 3. Исследование влияния соотношения сырья и экстрагента в экстракционной смеси на выход пептидов в экстрактах предстательной железы при различных температурных режимах в мг на 100 г сырья.

Фиг. 4. Содержание пептидов в растворах пермеатов, полученных по описываемой технологии, при различной температуре экстракции, мг/100 г сырья.

Фиг. 5. Хроматограммы четырех опытных серий 1-4 препарата на основе пептидов предстательной железы, полученных мембранным способом (пермеат 10 кДа; в течение 24±2 ч при различной температуре и соотношении сырья и экстрагента в экстракционной смеси), в сравнении с препаратом «Сампрост, лиофилизат» (производства ООО «Самсон-Мед»).

Возможность осуществления изобретения подтверждает следующий пример.

Предстательные железы половозрелых бычков массой 10 кг измельчили, экстрагировали при температуре +37±2°С в течение 24 часов 3%-ным раствором уксусной кислоты объемом 20 л с добавлением хлорида цинка массой 50 г спустя полчаса после начала экстракции.

После окончания экстракции производили изменение рН экстракта до значения 9,0-9,5 при помощи 5,0 н. гидроксида натрия, после чего отделяли жмых вместе с балластом, путем центрифугирования 3000 об/мин в течение 20 мин. Затем доводили рН до значения 5,8±0,2 уксусной кислотой. К супернатанту добавляли 10% кизельгура (по массе), и фильтровали на нутч-фильтре через фильтровальный картон.

Проводили ультрафильтрацию при комнатной температуре через мембрану с порогом отсечения 10 кДа, собирали пермеат, который затем подвергали очистке от низкомолекулярных примесей на мембране с размером пор1 кДа.

Было получено 21,65 л полупродукта, в котором содержание пептидов составило около 45 г в перерасчете на 1 кг сырья. Добавили глицин до концентрации 20 мг/мл, провели стерилизующую фильтрацию (диаметр пор 0,22 мкм), розлив во флаконы в асептических условиях и сублимационную сушку.

Данные хроматографии показали, что компоненты препарата из предстательной железы, полученного по описываемой технологии, имеют пики, идентичные по молекулярному весу соответствующим компонентам препарата «Сампрост, лиофилизат» (производства ООО «Самсон-Мед»).

Было проведено сравнение данных по выходу продукта на единицу массы сырья при получении препарата на основе пептидов предстательной железы по предлагаемой технологии с выходом продукта при ацетоновой технологии [9], а также сравнение с прототипом [3]. Показано, что выход целевого продукта увеличивается в среднем в 7-8 раз по сравнению с ацетоновой технологией. Также доказана более высокая эффективность процесса экстракции по сравнению с прототипом в 1,85 раз, при эффективности последующих этапов не ниже, чем в прототипе.

Источники информации

1. Хавинсон В.Х., Кузник Б.И. Рыжак Г.А. Пептидные биорегуляторы - новый класс геропротекторов. Сообщение 2. Результаты клинических исследований // Успехи геронтологии, 2013, т. 26, №1, с. 20-37.

2. Патент RU №2058780, 1996.

3. Патент RU №2089204, 1997.

4. Патент RU №2112504, 1998.

5. Патент RU №2186387, 2002.

6. Патент RU №2302874, 2006.

7. Патент UA №86261, 2009.

8. Патент UZ №4128, 2010.

9. ВФС 42-2077-91 "Простатилен".

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения лекарственного средства на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин. Способ получения лекарственного средства на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин, включающий, измельчение и гомогенизацию ткани предстательной железы половозрелых бычков, экстракцию раствором уксусной кислоты с добавлением хлорида цинка, осветляющую фильтрацию и ультрафильтрацию на мембранах, отсечение вещества с молекулярной массой 1-10 кДа, лиофилизацию с последующим приготовлением готовой лекарственной формы, при определенных условиях. Вышеописанное изобретение заключается в разработке простого в исполнении способа получения препарата на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин. 1 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ получения лекарственного средства на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин путем измельчения и гомогенизации ткани предстательной железы половозрелых бычков, экстракции раствором уксусной кислоты с добавлением хлорида цинка, осветляющей фильтрации и ультрафильтрации на мембранах, отсекающих вещества с молекулярной массой 10 кДа с последующим приготовлением готовой лекарственной формы, отличающийся тем, что экстракция проходит в течение 24±2 часов при температуре +37±2°С и соотношении сырья и экстрагента 1:2; осветляющая фильтрация выполняется с предварительным изменением рН экстракта до 9,0-9,5 перед отделением жмыха и с применением вспомогательного вещества - 10% кизельгура с отделением последнего при помощи фильтровального картона; производится очистка полупродукта от низкомолекулярных примесей при помощи ультрафильтрации на мембранах с порогом отсечения менее 1 кДа, стабилизация пептидов происходит с помощью глицина 20 мг ±10% на 1 мл раствора для лиофилизации.

2. Способ получения лекарственного средства на основе пептидов предстательной железы для лечения заболеваний мочеполовой системы мужчин по п. 1, отличающийся тем, что в случае необходимости после ультрафильтрации образца проводят его концентрирование и диафильтрацию концентрата.