Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин и ее применение Российский патент 2024 года по МПК A61K38/04 A61K38/10 A61K47/00 A61P5/26 A61P15/08 A61P15/10 

Группа изобретений относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения или профилактики репродуктивной и эректильной функций у мужчин, в таких областях медицины как урология, андрология, эндокринология и гериатрия.

Из уровня техники известно применение биорегуляторных пептидов в клинической практике для направленной коррекции функциональной активности клеток.

Функцию медиаторных межклеточных сигналов на пара- и аутокринном уровнях могут выполнять как секреторные белки - цитокины, так и пептидные регуляторы, выделенные из тканей животных.

Данные пептидные регуляторы содержатся в лекарственных препаратах и помогают поддерживать структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций.

При этом механизм биологической активности регуляторных пептидов на молекулярном уровне заключается в следующем.

Полипептиды, взаимодействуя с клеточными рецепторами, запускают каскад внутриклеточных реакций, приводящий к изменению экспрессии белков.

Олигопептиды проникают в ядро клетки через цитоплазму и мембрану ядра.

Комплементарное взаимодействие этих пептидов с промоторными зонами генов служит сигналом для транскрипции, трансляции и синтеза белков на рибосомах.

Указанные процессы способствуют изменению функции различных органов и тканей, тем самым обеспечивая необходимый терапевтический эффект.

Применение пептидных биорегуляторов, полученных из тканей животных имеет давнюю историю. Но только в начале двадцатого века были получены научные данные, подтверждающие их биологическую активность при применении пациентами.

Из уровня техники известна фармацевтическая композиция, стимулирующая функцию мочеполовой системы у мужчин, включающая дипептид: Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин, используемый для стимулирования функции мочеполовой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса и способ стимуляции функции мочеполовой системы (см. RU 2324703, 07.09.2006 - далее [1]).

Дипептид, используемый в данной фармацевтической композиции, является искусственным пептидом, получаемым классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Действие дипептида Nα-(γ-L-глутамил)-L-лизин прежде всего направлено на стимуляцию функции мочеполовой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса при старении и при гипогонадном состоянии.

Технический результат решений по патентному документу [1] заключается в создании дипептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в стимулировании функции мочеполовой системы у мужчин, а также фармацевтической композиции, содержащей этот дипептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует функцию мочеполовой системы путем модуляции нейроэндокринного статуса при заболеваниях и патологических состояниях репродуктивной системы, а также при угнетении функции половых желез в процессе старения организма.

Однако, используемый в решениях по патентному документу [1] пептид является синтетическим, тропность его к тканям яичек не установлена. Кроме того, данное решение имеет низкую подтвержденную эффективность.

Из уровня техники также известно средство, влияющее на мочеполовую систему у мужчин, полученное из семенников животных и содержащее терапевтически эффективное количество полипептидов, а также способ его применения (см. RU 2302874, приоритет 22.06.2006-далее [2]).

Решения по патентному документу [2] направлены на повышение биологической активности средства путем снижения в нем примесей не пептидной природы, а также на повышение выхода активного вещества известного средства.

Недостатками известного из [2] средства является то, что оно содержит пептиды с молекулярной массой от 75 до 228 Да. При этом на настоящий момент имеются научно доказанные данные о том, что наибольшей активностью при лечении органов мочеполовой системы у мужчин обладают пептиды, полученные из семенников животных, имеющих большую молекулярную массу.

При размерах пептидов 75 - 228 Да (соответствующих 1-3 аминокислотам) не обеспечивается регуляторная функциональная активность, характерная более длинным пептидам, обладающим вторичной структурой.

Поэтому группа заявленных решений направлена на достижение следующего технического результата.

- Корректировка пептидной регуляции мочеполовой системы у пациентов-мужчин;

- Увеличение количества сперматозоидов и повышение их оплодотворяющей способности у пациентов-мужчин;

- Повышение эффективности терапевтического и профилактического использования фармацевтической композиции и применения полипептидов у пациентов-мужчин;

- Стимуляция функции мочеполовой системы в процессе старения организма у пациентов-мужчин;

- Предотвращение риска развития прионных болезней (трансмиссивных губчатых энцефалопатии) у пациентов-мужчин;

- Защита тканей яичек от неблагоприятных воздействий, повышение жизнеспособности их клеток и усиление способности клеток яичек к восстановлению после повреждений у пациентов-мужчин;

- Восстановление экспрессии генов и мРНК ключевых белков сперматогенеза (PCNA, виментина, Hkl и Вс1-2) по сравнению со стандартной терапией у пациентов-мужчин.

- Снижение повреждения ДНК (фрагментация) на фоне оксидативного стресса как в сперматозоидах, так и в клетках Сертоли у пациентов-мужчин;

- Снижение концентрации внутриклеточных активных форм кислорода в клетках яичек, предотвращение развития внутриклеточного оксидативного стресса, восстановление нормального уровня активных форм кислорода (АФК)у пациентов-мужчин.

- Снижение выраженности апоптоза, индуцированного применением повреждающих агентов, при не нарушении его физиологического уровня, направленного на отбраковку поврежденных сперматозоидов у пациентов-мужчин;

- Повышение количества и общей активности митохондрий в клетках яичек, коррелирующих с интенсивностью процессов сперматогенеза и уровнем подвижности сперматозоидов у пациентов-мужчин.

- Повышение общей концентрации сперматозоидов в эякуляте у пациентов-мужчин;

- Повышение концентрации прогрессивно - подвижных сперматозоидов, а также доли морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте у пациентов-мужчин;

- Повышение степени очистки заявленной композиции при ее изготовлении.

Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемая фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин, содержит в эффективном количестве:

- пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Гистон H2B типа 1 последовательности SEQ ID NO: 1, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2;

- пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Шаперон эндоплазматического ретикулума последовательности SEQ ID NO: 3, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4;

- пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Фактор элонгации 1-альфа-1 последовательности SEQ ID NO: 5, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6.

Указанный результат также достигается тем, что фармацевтическая композиция содержит носитель.

Указанный результат также достигается тем, что фармацевтическая композиция предназначена для парентерального введения.

Указанный результат также достигается тем, что фармацевтическая композиция предназначена для внутримышечного введения.

Указанный результат также достигается в применении фармацевтической композиции в эффективном количестве для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин.

Графические материалы.

Рисунок 1. Сохранение нормального эмбриогенеза до и после облучения при терапевтическом введении композиции (лечение).

Рисунок 2 Оплодотворяющая способность самцов до и после облучения при терапевтическом введении композиции.

Рисунок 3. Содержание сперматозоидов в яичке (%) до и после облучения при терапевтическом введении композиции.

Рисунок 4. Содержание сперматозоидов в яичке (%) до и после облучения при профилактическом введении композиции.

Рисунок 5. Оплодотворяющая способность самцов до и после облучения при профилактическом введении композиции.

Рисунок 6. Сохранение нормального эмбриогенеза до и после облучения при профилактическом введении композиции.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности белков и их фрагментов.

Таблица 2. Результаты оценки фильтратов.

Таблица 3. Аминокислотные последовательности фрагментов белка SEQ ID NO: 1

Таблица 4. Аминокислотные последовательности фрагментов белка SEQ ID NO: 3

Таблица 5. Аминокислотные последовательности фрагментов белка SEQ ID NO: 5

Сущность изобретения

Заявленная группа решений прошла полный комплекс доклинических исследований. Данные исследований свидетельствуют об отсутствии у заявленной фармацевтической композиции острой и хронической токсичности, канцерогенных, эмбриотоксических, мутагенных, иммунотоксических и тератогенных свойств, а также местно-раздражающего и аллергизирующего действия.

Исследование острой токсичности фармацевтическом композиции.

Исследование острой токсичности заявленной фармацевтической композиции проходило в 2 этапа.

На первом этапе исследования было исследовано однократное внутримышечное и внутрижелудочное введение фармацевтической композиции в 10 вариантах доз, мышам SHR обоего пола.

В исследовании были выбраны дозировки по 0,0273 - 14 мг/мышь. Кроме того, в исследовании были использованы крысы Wistar обоего пола.

Дозировки для крыс составили по 0,273 - 140 мг/крысу.

Результаты исследования показали, что токсический эффект препарата не был обнаружен.

При этом наименьшая доза соответствовала двадцатикратной терапевтической дозе, а наибольшая превышала терапевтическую в 10000 раз.

На втором этапе целью исследования была оценка «острой» токсичности фармацевтической композиции при использовании 3 доз и определении индекса кумуляции, т.е. отношения ЛД50 при однократном введении к ЛД50 при кратном введении. По результатам второго этапа исследования при однократном внутримышечном и внутрижелудочном введении фармацевтической композиции в 3 вариантах доз мышам SHR обоего пола (по 3,5 - 14 мг/мышь) и крысам Wistar обоего пола (по 35 - 140 мг/крысу) был сделан вывод, что токсический эффект фармацевтической композиции не обнаружен.

Расчет токсической дозы показал, что ЛД50 для фармацевтической композиции, составляет 1033±25,4 мг/кг при однократном внутримышечном введении и 844±26,1 мг/кг при многократном внутримышечном введении в течение 24 дней ежедневно.

Важно отметить, что ЛД50 превышает терапевтическую дозу в 14000 раз.

Расчет кумуляции составил 0,82, что свидетельствует об отсутствии привыкания к фармацевтической композиции.

Результаты исследования хронической токсичности показали, что при изучаемых дозах и режиме введения: ежедневно, внутримышечно и в течение 1 месяца, в дозах 0,07 мг/кг (терапевтическая и профилактическая) и 35 мг/кг (500-кратная терапевтическая и профилактическая) - композиция не обладает токсическим действием при хроническом введении.

Также было показано, что фармацевтическая композиция не обладает мутагенным потенциалом, не канцерогенна, не обладает репродуктивной токсичностью, не обладает иммунотоксическими свойствами, не аллергена и не обладает местными раздражающими свойствами.

В виду отсутствия токсичности в изученном диапазоне доз установленная доза без наблюдаемого отрицательного эффекта составила более 35 мг/кг, что соответствует эквивалентной дозе 415 мг фармацевтической композиции для человека с массой тела 70 кг.

Исследование специфической фармакологической активности заявленной композиции проводилось на крысах.

В исследование было включено 330 животных самцов крыс, разделенных на 6 групп.

В эксперименте у животных вызывали тяжелую форму лучевой болезни.

В экспериментальной модели радиационного старения была индуцирована тяжелая форма

острой лучевой болезни после тотального облучения животных в дозе 550 рентген.

К 3 суткам после облучения у животных была выявлены следующие результаты:

- Развита выраженная лейкопения, а именно, до 500 клеток в 1 мм³

Для сравнения у интактной группы этот показатель составлял 9000 клеток в 1 мм³;

- Глубокие структурные изменения в костном мозге и селезенке;

- Гибель 18% животных.

При изучении состояния семенников у облученных крыс было выявлено нарушение сперматогенеза, развивающееся в определенной последовательности: уменьшение количества сперматогоний, затем сперматоцитов, затем сперматидов и в последнюю очередь сперматозоидов.

У животных контрольной группы через 30 суток после облучения наступал период полной стерильности, который сохранялся до 6 месяцев.

После этого у животных изучались органы мочеполовой системы, в том числе семенники, их репродуктивная функция, оплодотворяющая способность облученных самцов.

Указанную способность определяли по результатам их скрещивания с необлученными самками.

В эксперименте учитывали: число развивающихся эмбрионов, соотношение нормальных и патологических эмбрионов в первую половину беременности самок, а также численность помета.

Начиная с 7-10 суток после облучения самцов, у подсаженных к ним необлученных самок отмечалось увеличение числа патологических эмбрионов.

Затем к 30 суткам после облучения самцов численность помета у самок снижалась до 0.

Исчезновение зародышевых клеток у самцов являлось стойким. В течение 90 суток после облучения самцов функция сперматогенеза у самцов не восстанавливалась.

Профилактическое введение фармацевтической композиции для восстановления сперматогенеза.

Профилактическое введение фармацевтической композиции при профилактике заболеваний органов мочеполовой системы у мужчин, в частности, для нормализации репродуктивной функции половой системы у мужчин.

Способ применения фармацевтической композиции для восстановления сперматогенеза при ее профилактическом введении до облучения, с целью снижения воздействия на репродуктивную функцию половой системы у мужчин.

Профилактическое введение фармацевтической композиции осуществлялись 1 раз в день внутримышечно, ежедневно в дозировке 0,07 мг/кг (терапевтическая) и 0,7 мг/кг (10-кратная терапевтическая), в течение 10 дней.

Профилактическое введение композиции начинали за 10 дней до тотального облучения животных в дозе 550 рентген

В исследованиях было выявлено, что вышеуказанное профилактическое введение заявленной композиции в дозах 0,7 мг/кг и 0,07 мг/кг в течение 10 дней, препятствует развитию изменений сперматогенеза, способствует его ускоренному восстановлению и повышению вероятности зачатия, предупреждает развитие патологии эмбрионов:

Согласно полученным в исследовании данным, количество созревающих сперматозоидов у самцов после облучения уменьшается до 15% от нормальных показателей.

Затем к 25 суткам количество созревающих сперматозоидов начинает расти и к 90 суткам достигает до 45% - 50% от первоначального уровня.

В контрольной группе, не получавшей до облучения фармацевтической композиции, через 25 - 30 суток после облучения наступал период полной стерильности самцов на 6 месяцев, и количество репродуктивных клеток самцов крыс стойко держалось на уровне 0% (см. рисунок 4).

Терапевтическое введение фармацевтическойй композииии для восстановления сперматогенеза.

Курсовое терапевтическое введение фармацевтической композиции начиналось с пятнадцатых суток после тотального облучения животных.

Введение композиции осуществлялось 1 раз в день внутримышечно, ежедневно в течение десяти дней, в дозах 0,7 мг/кг и 0,07 мг/кг.

В ходе эксперимента при введении фармацевтической композиции было отмечено восстановление к девяностым суткам сперматогенеза до 53% от исходного уровня (см. рисунок 3).

При введении фармацевтической композиции также отмечалось восстановление сперматогенеза к 90 суткам после облучения (см. рисунок 3).

В контрольной группе, не получавшей после облучения композиций, наблюдалось полное отсутствие сперматогенеза, при полном отсутствии наступления беременности у самок.

Профилактическое введение фармацевтической композиции для сохранения оплодотворяющей способности самцов.

Введение фармацевтической композиции осуществлялись 1 раз в день внутримышечно, в дозах 0,7 мг/кг и 0,07 мг/кг, ежедневно в течение 10 дней, до тотального облучения животных в дозе 550 рентген.

В исследованиях было выявлено, что фармацевтическая композиция препятствуют развитию изменений оплодотворяющей способности самцов.

Согласно полученным в исследовании данным, наблюдалось временное уменьшение количества зачатий на 45 сутки до 42%.

Однако, далее количество зачатий повышалось до 65% к 90-м суткам от первоначального уровня при введении фармацевтической композиции (см. рисунок 5).

Кроме того, количество созревающих сперматозоидов также начинало расти (см. рисунок 5).

Терапевтическое введение фармацевтической композиции для восстановления оплодотворяющей способности самцов.

Терапевтическое введение фармацевтической композиции осуществлялось 1 раз в день внутримышечно, в дозах 0,7 мг/кг и 0,07 мг/кг, ежедневно в течение 10 дней до тотального облучения животных (доза облучения 550 рентген).

В исследованиях было выявлено, что вышеуказанное терапевтическое введение фармацевтической композиции позволяет восстановить оплодотворяющую способность, с последующим наступлением беременности у 30%, 57% и 65% самок к 30, 60 и 90 суткам, соответственно (см. рисунок 2).

Кроме того, введение фармацевтической композиции повышает численность помета, а также предотвращает пороки развития плода с уменьшением числа патологических эмбрионов в 3,3 раза (с 72% на 30-е сутки до 22% на 90-е сутки после облучения).

Профилактическое введение фарматической композиции для сохранения развития нормальных эмбрионов.

Введение фармацевтической композиции осуществлялось 1 раз в день внутримышечно, ежедневно, в дозах 0,7 мг/кг и 0,07 мг/кг, в течение 10 дней до тотального облучения животных в дозе 550 рентген.

Согласно полученным в исследовании данным, наблюдалось сохранение образования нормальных эмбрионов с минимумом 37% на двадцатые сутки после облучения.

Затем количество нормальных форм эмбрионов восстанавливалось до 77% к 90 суткам после облучения (см. рисунок 6).

В контрольной группе, не получавшей до облучения фармацевтической композиции, количество патологических эмбрионов в результате облучения начиная с седьмых суток возрастало, достигая 100% в контрольной группе к двадцати суткам после облучения.

С тридцатых суток после облучения в контрольной группе наступал период полной стерильности самцов, который сохранялся до 6 месяцев - эмбрионы полностью отсутствовали.

Терапевтическое введение фармацевтической композиции для сохранения развития нормальных эмбрионов.

Введение фармацевтической композиции осуществлялись 1 раз в день внутримышечно, в дозах 0,7 мг/кг и 0,07 мг/кг, ежедневно в течение 10 дней, до тотального облучения животных в дозе 550 рентген.

В исследованиях было выявлено, что фармацевтическая композиция влияет на сохранение образования нормальных эмбрионов при терапевтическом ее введении. Согласно полученным в исследовании данным, наблюдалось временное уменьшение количества зачатий на 45 сутки до 42%.

Однако, далее количество зачатий повышалось до 65% к 90-м суткам от первоначального уровня при введении фармацевтической композиции (см. рисунок 1).

Кроме того, количество созревающих сперматозоидов также начинало расти (см. рисунок 1)

Изучение влияния заявленной фармацевтической композиции на эректильную функцию при терапевтическом ее введении.

Оценка влияния заявленной композиции на эректильную функцию проводилась на модели эректильной дисфункции, вызванной стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. Изучены эффекты фармацевтической композиции 1 мг/кг (10 инъекций с интервалом 48 часов между введениями) в сочетании с введением полипептидов сосудов 1 мг/кг по сравнению с монотерапией полипептидами сосудов 1 мг/кг.

Для исследования была выбрана достаточно тяжелая животная модель эректильной дисфункции, что подтверждается литературными данными [https://labanimalsjournal.ru/index.php/ru/2618723x-ruslasa2021-37] - смертность животных составила более 40%, наблюдалось нарушение целостности тканей хвоста и конечностей с последующим некрозом. Для данной модели характерен потенцированный механизм развития эректильной дисфункции, когда после формирования первичной, нейрогенной патологии вступают в действие вторичные факторы, глюкозотоксичность и мощный окислительный стресс, что в итоге приводит к развитию устойчивой, практически необратимой эндотелиальной дисфункции. Ввиду тяжести сформированной патологии, основной задачей исследования являлся поиск положительных изменений, тенденций к улучшению ключевых показателей.

По окончании периода введения и периода отмены (через 20 дней после окончания введения препаратов) у животных, получавших комбинацию препаратов, наблюдали тенденцию к увеличению уровня тестостерона в крови, а также интракавернозного давления относительно животных группы плацебо. Измерение интракавернозного давления проводилось на фоне электростимуляции кавернозного нерва к нерву подсоединяли электроды, катетеризировали кавернозное тело, после чего проводили запись давления с помощью программного обеспечения.

В конце периода введения комбинации отмечали тенденцию к увеличению количества стабильных метаболитов оксида азота в крови и тканях пениса, восстановленного глутатиона (ответственного за антиоксидантный статус тканей кавернозного тела) и активности общей NO-синтазы в сравнении с группой «Полипептиды сосудов» и группой плацебо: значения данных показателей соответствовали значениям интактной группы (без патологии).

В конце периода отмены наблюдали тенденцию к восстановлению количества стабильных метаболитов оксида азота в крови и тканях пениса, а также соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (также ответственных за антиоксидантный статус) в тканях пениса относительно группы «Полипептиды сосудов» и группы плацебо: значения данных показателей соответствовали значениям интактной группы.

Таким образом, курсовое введение комбинации препаратов способствует восстановлению гормонального фона, повышению антиоксидантного статуса, восстановлению эндотелиальной функции, о чем можно судить по усилению выработки NO, а также более выраженному по сравнению с монотерапией полипептидами сосудов повышению интракавернозного давления, что свидетельствует о потенциальной терапевтической активности комбинации препаратов Фармацевтическая композиция + полипептиды сосудов.

Изучение влияния заявленном фармацевтической композиции на эндокринную функцию яичка при андрогенной недостаточности на модели репродуктивного старения, гипогонадизме при терапевтическом ее введении.

Оценка влияния заявленной композиции на эндокринную функцию яичка (функциональная активность и количество тестостеронпродуцирующих клеток Лейдига, синтез тестостерона) проводилась при внутримышечном введении мышам линии C57B1/6J, в количестве 60 самцов.

Для подавления эндокринной функции яичка и индукции репродуктивного старения мышам экспериментальных групп вводили D-галактозу в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно, в 0,2 мл физ.раствора. Таким образом, контрольная группа мышей получала по 0,2 мл физ. раствора внутрибрюшинно ежедневно в течение 8 недель.

После окончания введения D-галактозы первой группе мышей вводили заявленную фармацевтическую композицию в дозе 1 мг/кг в течение 5 недель.

Остальные 2 группы мышей получали по 0,2 мл физраствора внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 недель.

Забой животных проводили на 1, 10, 20, 30 день после окончания введения заявленной фармацевтической композиции.

Материалами последующего исследования являлись: сыворотка крови для определения тестостерона и супероксиддисмутазы (далее - SOD) и образцы семенников для патоморфологического исследования и иммуногистохимического окрашивания.

В результате исследования были получены следующие результаты.

Применение заявленной композиции в количестве 1 мг/кг в течение 35 дней позволяло достичь выраженного восстановления уровня тестостерона к 30 дню после окончания введения композиции - 2.23±0.75 нМ/мл (92.1% от контроля).

Применение заявленной фармацевтической композиции в дозировке 1 мг/кг в течение 35 дней позволяло достичь восстановления активности SOD в сыворотке - к 30 дню после окончания введения препарата активность достигала 4.7±0.7 U/мл (57.3% от активности контроля).

Экспрессия PDGFRα в семенниках при применении заявленной фармацевтической композиции увеличивало количество PDGFRα+клеток (3+,>80% клеток) к 30 дню после окончания введения препаратов.

Применение заявленной фармацевтической композиции в течение 35 дней увеличивало количество и экспрессию белка-мишени ядерного транскрипционного фактора (sex determining region Y-box 9) (далее - SOX9+) клеток к 30 дню после окончания ее введения препарата (2+,>50% клеток).

Известно, что SOD - энзим антиоксидантной защиты, катализирующий дисмутацию синглетного кислорода, образующегося при прохождении электронов по дыхательной цепи. Этот фермент присутствует во всех клетках, потребляющих кислород, и представляет важнейшее звено антиоксидантной защиты.

SOD защищает клетки (мембраны клеток) от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся при активации перекисного окисления липидов (далее - ПОЛ), и является одним из основных антиоксидантов в организме человека.

Низкая активность SOD отражает нормальное старение мужчин.

Применение заявленной композиции в количестве 1 мг/кг в течение 35 дней позволяет достичь восстановления активности SOD в сыворотке - к 30 дню после окончания введения препарата активность достигала 4.7±0.7 U/мл (57.3% от активности контроля).

Восстановление активности SOD в сыворотке приводит к повышению антиоксидантной защиты клеток тестостеронпродуцирующих Лейдига, к улучшению их функционального состояния.

Вышеуказанные процессы при применении заявленной композиции позволяют увеличить у пациентов мужского пола количество живых клеток Лейдига и достичь нормализации синтеза тестостерона.

Кроме того, известно, что белок-мишень ядерного транскрипционного фактора SOX9+ является одним из основных маркеров клеток Сертоли.

Введение животным D-gal снижает его количество в семенниках (1+,<50% клеток) по сравнению с контрольной группой (3+,>70% клеток).

Применение заявленной композиции в течение 35 дней увеличивает количество и экспрессию белка-мишени SOX9+клеток к 30 дню после окончания введения препарата (2+,>50% клеток). То есть за счет усиления экспрессии SOX9+стимулируется работа клеток Сертоли, которые в свою очередь регулируют секрецию тестостерона клетками Лейдига.

Исследование безопасности и переносимости возрастающих доз заявленном композиции при обнократном и последующем многократном введении у здоровых добровольцев.

Было проведено двойное-слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование безопасности и переносимости возрастающих доз заявленной композиции при однократном и последующем многократном введении у здоровых добровольцев в количестве 32 чел.

В исследовании были изучены когорты: 5 мг при однократном введении, 10 мг при однократном введении, 5 мг при многократном введении и 10 мг при многократном введении и группы плацебо однократно и многократно.

Заявленная фармацевтическая композиция продемонстрировала благоприятный профиль безопасности, хорошую общую и местную переносимость при однократном и многократном внутримышечном введении

Исследование эффективности и безопасности заявленной фармацевтической композиции у мужчин с нарушениями сперматогенеза.

Было проведено многоцентровое, простое слепое, плацебо-контролируемое рандомизированное исследование в параллельных группах по изучению эффективности и безопасности заявленной фармацевтической композиции у мужчин с нарушениями сперматогенеза в количестве 90 пациентов.

В исследовании были изучены режимы дозирования: 10 инъекций по 5 мг 2 раза в неделю (36 пациентов), 5 мг 3 раза в неделю (36 пациентов), группы плацебо (2 или 3 раза в неделю по 18 пациентов)

Заявленная фармацевтическая композиция показала достоверную эффективность по влиянию на разные параметры сперматогенеза (концентрацию, подвижность и морфологию сперматозоидов) и обладала хорошим профилем безопасности.

По результатам исследования было сделано заключение о предпочтении режима введения «5 мг 1 раз в неделю № 10».

Исследование заявленной фармацевтическом композиции в параллельных группах у мужчин с нарушениями сперматогенеза.

Было проведено многоцентровое, двойное слепое, плацебо-контролируемое рандомизированное исследование в параллельных группах у мужчин с нарушениями сперматогенеза в количестве 100 пациентов.

В исследовании применялся режим дозирования: 10 инъекций 5 мг 1 раз в неделю (50 пациентов) и плацебо 1 раз в неделю (50 пациентов)

Результаты исследования подтвердили, что заявленная фармацевтическая композиция является эффективным и безопасным лекарственным препаратом для повышения мужской фертильности.

Заявленная фармацевтическая композиция оказывала выраженный терапевтический ответ у 83,7% пациентов и обладала благоприятным профилем безопасности, сопоставимым с плацебо.

Таким образом, в результате проведенных исследований заявленной фармацевтической композиции были выявлены следующие уникальные технические результаты, проявляющиеся при ее применении.

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине ткани яичек защищаются от неблагоприятных воздействий, повышается жизнеспособность их клеток и усиливается способность клеток яичек к восстановлению после повреждений.

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине восстанавливается экспрессия генов и мРНК ключевых белков сперматогенеза (PCNA, виментина, Hk1 и Вс1-2) значительно более полно и выраженно по сравнению со стандартной терапией.

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине снижаются повреждения ДНК (фрагментация) на фоне оксидативного стресса не только в сперматозоидах, но и в клетках Сертоли.

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине снижается концентрация внутриклеточных активных форм кислорода в клетках яичек, предотвращается развитие внутриклеточного оксидативного стресса, восстанавливается нормальный уровень активных форм кислорода (АФК).

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине снижается выраженность апоптоза, индуцированного применением повреждающих агентов, при не нарушении его физиологического уровня, направленного на отбраковку поврежденных сперматозоидов. При введении заявленной композиции пациенту-мужчине повышается количество и общая активность митохондрий в клетках яичек, коррелирующих с интенсивностью процессов сперматогенеза и уровнем подвижности сперматозоидов, более выраженно по сравнению со стандартной терапией.

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине повышается общая концентрация сперматозоидов в эякуляте.

При введении заявленной композиции пациенту-мужчине повышается концентрация прогрессивно - подвижных сперматозоидов, а также доля морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте.

Определение количества и идентификация аминокислотных остатков белка в заявленной фармацевтическом композиции.

К настоящему моменту известно большое количество методов определения аминокислотных остатков белка в растворе.

Эти методы, обычно, используются для определения общего содержания белка, и в основе принципа измерения лежит взаимодействие с веществами, содержащими пептидные связи. Для количественного определения аминокислотных остатков белка в составе фармацевтической композиции использовали методику Waddell W.

Данная методика позволила определить содержание аминокислотных остатков белка в заявленной фармацевтической композиции методом спектрофотометрии в УФ области по разности значений оптической плотности на двух длинах волн (215 и 225 нм).

Кроме того, для количественного определения аминокислотных остатков белка в растворе и лиофилизате предложенной фармацевтической композиции был использован метод спектрофотометрии на длине волны 280 нм (по ароматическим аминокислотам в составе). Для проведения вышеуказанного анализа также были применены методы Лоури и спектрофлуориметрии.

Для анализа использовались соответствующие наборы, например: Thermo Fischer кат № 23225.

В качестве стандарта в вышеуказанных аналитических методах был использован бычий сывороточный альбумин. (Protein assay technical handbook, Thermo Ficher Scientific, 2017 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/protein-assay-technical-handook.pdf далее [3]).

Данные методы являются общеизвестными, широко используемыми методами исследовательского и технологического контроля.

Для идентификации аминокислотных остатков белка и установления их последовательности в заявленной группе изобретений использовался метод ВЭЖХ МС-МС (см. Tandem Mass Spectrometry for Peptide and Protein Sequence Analysis. J. J. Coon, J. E.P. Syka, J. Shabanowitz, D.F. Hunt. BioTechniques, Volume 38, Issue 4. Apr 2005. Pages 507-655 далее [4]).

На сегодняшний день тандемная масс-спектрометрия является общепринятым методом, позволяющим устанавливать покомпонентную аминокислотную последовательность, в том числе и в сложных смесях, содержащих тысячи индивидуальных аминокислотных остатков белка.

Дальнейшее отнесение индивидуальных аминокислотных остатков белка к белку-предшественнику выполняется программными средствами с использованием международных протеомных баз, таких как UniProt и др (см.; Orbitrap Mass Spectrometry. R. Zubarev, A. Makarov. Anal. Chem. 2013, 85, 11, 5288 5296 далее [5]).

Алгоритмы отнесения идентифицированных пептидных последовательностей к белкам-предшественникам учитывает длину белка, количество уникальных пептидов, идентифицированных в пробе для данного белка, вероятность ложного определения последовательности пептида и другие факторы (см. Rune, Matthiesen (2006). Mass Spectrometry Data Analysis in Proteomics] Protein Identification by Tandem Mass Spectrometry and Sequence Database Searching., 10.1385/1597452750(), 87-120. doi:10.1385/1-59745-275-0:87 далее [6]).

Результатом масс-спектрометрического анализа аминокислотной смеси является перечень идентифицированных пептидов и белков-предшественников (для пептидов с длиной аминокислотной последовательности более 6 аминокислот), а также всевозможные аналитические характеристики, включая интенсивность пика каждого идентифицированного пептида, соотношение заряда к массе для молекулярного иона, его заряд и др.

Первый способ получения заявленной фармацевтической композиции.

Общеизвестно, что «прионные болезни» или трансмиссивные губчатые энцефалопатии, относящиеся к группе нейродегенеративных заболеваний людей и животных. Данное заболевание вызывается возбудителями - прионами (белками) с аномальной третичной структурой и молекулярной массой 27 36 кДа.

Поэтому при производстве заявленной фармацевтической композиции, содержащей аминокислотные остатки белка, одной из основных технологических задач являлось исключение попадания в нее любых веществ с молекулярной массой выше 10 кДа, включая прионные белки.

В качестве сырья для получения заявленной фармацевтической композиции использовали семенники половозрелых бычков или свиней.

Указанное сырье замораживали и выдерживали в течение 2 недель при температуре (-19)÷(-21)°С.

После чего замороженное сырье размораживали при комнатной температуре в течение приблизительно 20 часов.

Затем замороженные семенники половозрелых бычков или свиней измельчали и загружали в среду экстрагирования 3% уксусную кислоту в воде.

Объемное соотношение сырья и экстрагента составляло 1:2.

Экстрагирование проводили при температуре 11÷13°С.

Экстракцию проводили, в течение 10 минут при постоянном перемешивании.

После получения однородной взвеси в нее добавляли 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 1:50.

Таким образом, при загрузке сырья в количестве 50 кг, экстракционная смесь содержала по массе: 2% уксусная кислота, 0,02% хлористый цинк.

Смесь перемешивали по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 часов.

После этого проводили декантирование экстракционной массы семенников на декантере (декантерной центрифуге).

Затем проводили фильтрацию на глубинном фильтре, задерживающем твердые частицы размером свыше 3 микрон.

Полученный фильтрат передавали на стадию ультрафильтрации на полых волокнах с номинальным отсечением по молекулярной массе (рейтингом) 13 кДа.

Полученный пермеат сушили в лиофильной сушке в течение 3-5 суток и получали ~1,6 кг субстанции полипептидов.

Далее 1,6 кг субстанции полипептидов семенников растворяли в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Фильтровали полученный раствор через фильтр 0,22 мкм.

Полученный раствор подвергали ультрафильтрационной очистке на установке при трансмембранном давлении не более 2,0 кгс/см² через материал с рейтингом 10 кДа.

Далее разводили раствор до концентрации 5,5 мг/мл полипептидов.

Затем в раствор добавляли глицин до его конечной концентрации 20 мг/мл при рН 5,0÷6,6.

После чего раствор подвергали стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см², разливали во флаконы 5 мг и получали приблизительно 90 000 флаконов готовой лекарственной формы «раствор».

Для получения лекарственной формы «лиофилизат» раствор фармацевтической композиции после ее розлива во флаконы подвергают лиофилизации в течение 72 часов при давлении не более 0,05 атм.

Второй способ получения заявленной фармацевтическом композиции.

В качестве исходного сырья использовали 100 кг семенников половозрелых бычков или свиней.

Вышеуказанное сырье замораживали и выдерживали при температуре (-19)÷(-21)°С.

После чего сырье измельчали и загружали в среду экстрагирования, а именно: 3% уксусную кислоту в воде.

Объемное соотношение сырья и экстрагента составляло 1:2, при температуре экстрагирования - 15÷20°С.

Экстракцию проводили при постоянном перемешивании не менее 10 мин., после получения однородной взвеси в нее добавляли 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 1:50.

Таким образом экстракционная смесь содержала по массе: 2% уксусная кислота, 0,02% хлористый цинк.

Смесь перемешивали по 1 ч через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.

Затем экстракт отделяли от балластных веществ сепарированием на центрифужном сепараторе.

К экстракту добавляли ацетон в объемном соотношении 1:4, выдерживали при температуре не выше 5°С не менее 4 ч.

После формирования осадка декантировали надосадочную жидкость.

Полученный осадок, содержащий активное вещество, промывали на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета.

Удаляли ацетон, например сушкой при атмосферном давлении и комнатной температуре в вытяжном шкафу при периодическом перемешивании.

Полученные ~3 кг сухой субстанции имели потерю в массе при высушивании не более 10,0%.

Затем 3 кг сухой субстанции полипептидов семенников, полученной изложенным выше способом, растворяли в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

Отделяли осадок нерастворимых веществ центрифугированием, и надосадочную жидкость фильтровали через фильтр 0,22 мкм.

Полученный раствор подвергали ультрафильтрационной очистке на установке при трансмембранном давлении не более 2,0 кгс/см² через материалы с рейтингом 10кДа.

Разводили раствор до концентрации 5,5 мг/мл полипептидов.

В раствор добавляли глицин до его конечной концентрации 20 мг/мл при рН 5,0÷6,6, раствор подвергали стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см², разливали в объеме, соответствующем дозировке 5 мг на флакон.

В результате получали около 90 000 флаконов готовой фармацевтической композиции в форме «раствор».

В другом случае раствор после ультрафильтрационной очистки, полученный изложенным выше способом, разводили до концентрации 11 мг/мл полипептидов.

В раствор добавляли глицин до его конечной концентрации 40 мг/мл при рН 5,0÷6,6, раствор подвергали стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см².

Затем раствор разливали во флаконы в дозировке 10 мг.

Таким образом было получено около 45 000 флаконов готовой фармацевтической композиции в форме «раствор».

Для получения лекарственной формы «лиофилизат» раствор фармацевтической композиции после розлива во флаконы подвергают лиофилизации в течение 72 часов при давлении не более 0,05 атм.

По итогам проведенных экспериментов в качестве оптимальной технологии для приготовления фармацевтической композиции в инъекционной форме была выбрана мембрана с рейтингом 10 кДа.

При этом мембрана с рейтингом 13 кДа может быть успешно использована при производстве других форм выпуска препарата, в которых фактор иммуногенности не является существенным, например, свечей или пероральных форм. Результаты оценки фильтратов приведены в Таблице 2.

Для полученной таким образом фармацевтической композиции методом масс-спектрометрии был изучен пептидный состав, и в ней были идентифицированы фрагменты белков животных, в том числе:

- состоящие из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 последовательных аминокислотных остатков, входящих в аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и включающие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 (Таблица 3);

- состоящие из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 последовательных аминокислотных остатков, входящих в аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3, и включающие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4 (Таблица 4);

- состоящие из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 последовательных аминокислотных остатков, входящих в аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, и включающие аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6 (Таблица 5).

Группа изобретений относится к химии и фармакологии. Предложена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин, содержащая в эффективном количестве: пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Гистон H2B типа 1 последовательности SEQ ID NO: 1, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Шаперон эндоплазматического ретикулума последовательности SEQ ID NO: 3, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Фактор элонгации 1-альфа-1 последовательности SEQ ID NO: 5, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Также предложено применение указанной фармацевтической композиции в эффективном количестве для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин. Группа изобретений обеспечивает реализацию назначения. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл.

1. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин, содержащая в эффективном количестве:

- пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Гистон H2B типа 1 последовательности SEQ ID NO: 1, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2;

- пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Шаперон эндоплазматического ретикулума последовательности SEQ ID NO: 3, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4;

- пептиды, состоящие из фрагмента из 10-20 последовательных аминокислотных остатков белка Фактор элонгации 1-альфа-1 последовательности SEQ ID NO: 5, причем данный фрагмент включает аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, характеризующаяся тем, что содержит носитель.

3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что предназначена для парентерального введения.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, характеризующаяся тем, что предназначена для внутримышечного введения.

5. Применение фармацевтической композиции по п.1 в эффективном количестве для лечения или профилактики нарушений репродуктивной и эректильной функций у мужчин.