СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К ОСТРОЙ ГИПОКСИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/4164 A61P7/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакологии и адаптационной медицине. Оно может быть использовано для профилактики и лечения ишемии головного мозга и миокарда, а также других патологических состояний, сопровождающихся гипоксией.

Актуальность поиска новых способов и эффективных средств защиты от гипоксии, прежде всего центральной нервной системы и сердечно-сосудистой системы за счет адаптивной перестройки метаболических процессов мозга или сердца, определяется частотой инвалидности и высоким процентом смертности от инсульта и инфаркта миокарда.

Среди способов повышения устойчивости организма к гипоксии используют прекондиционирование - метаболическую адаптацию организма или отдельных его органов (головного мозга, миокарда) к гипоксии и/или ишемии, когда предварительное кратковременное повторяющееся воздействие потенциально вредным стимулом может увеличить устойчивость организма к последующей более длительной и выраженной гипоксии и/или ишемии. В развитии прекондиционирования существует два защитных периода: ранний (защищает организм от повреждения в интервале от нескольких минут до 2 ч) и поздний (развивается через 24 ч после начала действия причинного фактора и длится 48-72 часов) (Зарубина И.В., Шабанов П.Д. От идеи С.П. Боткина о «предвоздействии» до феномена прекондиционирования. Перспективы применения феноменов ишемического и фармакологического прекондиционирования // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2016. - Т. 14, №1. - С. 5-6).

В настоящее время активно изучается возможность повышать устойчивость организма к острой гипоксии с помощью прекондиционирования. Использование фармакологического прекондиционирования имеет преимущество в сравнении с инвазивным ишемическим или гипоксическим прекондиционированием, которое требует специального оборудования и поэтому доступен не всем пациентам. В качестве средств фармакологического прекондиционирования используют индукторы гипоксией индуцированного фактора-1 альфа (HIF-1α). Кобальта дихлорид оказывает действие, аналогичное гипоксии, влияя на HIF-1α.

Известен способ, когда кобальта дихлорид, вводимый мышам подкожно в дозах 43 и 50 мг/кг, оказывает свое защитное действие на модели полной глобальной ишемии головного мозга, наиболее значимо через 3 часа после инъекции, в более поздние сроки эффект снижается (Гаврилина Т.В., Минакина Л.Н. Прекондиционирование ишемии головного мозга: модели, феномены, механизмы // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2003. - Т. 37, №2. - С. 24).

К недостаткам данного способа относится то, что оценка эффективности проводится на модели полной глобальной ишемии головного мозга, моделируемой путем декапитации, что не очень показательно, т.к. определяется по продолжительности атонального дыхания, трудновоспроизводимо, используемый диапазон доз раствора кобальта дихлорида характеризуется узкой широтой терапевтического действия, в поздний период прекондиционирования способ не эффективен.

Существует способ повышения устойчивости к гипоксии, когда используют кобальта дихлорид в дозе 12,5 мг/кг в течение 7 дней в комбинации с гипоксической тренировкой (путем «подъема» животных на «высоту 7619 метров»). Оценку эффективности способа проводят сразу после прекращения действия на животных тяжелой гипоксии и их последующей декапитации (Thomas P., Bansal A., Singh М., Shukla D. et al. Preconditioning effect of cobalt chloride supplementation on hypoxia induced oxidative stress in male albino rats // Biomedicine & Preventive Nutrition. - 2011. - Vol. 1(2). - P. 84-90). В данном способе с использованием кобальта дихлорида применяется более низкая доза соединения, а, следовательно, более безопасная для животных, но недостатками является то, что способ комбинированный, трудоемкий и долговременный: животных, помимо того, что им вводят кобальта дихлорид ежедневно в течение семи дней, подвергают тяжелой гипобарической гипоксии на 1, 2, 3 и 5й день эксперимента. Оценку эффективности проводят только в ранний период, в поздний период прекондиционирования эффективность не определяют.

Описан способ, в котором кобальта дихлорид вводят крысам дважды в дозе 30 мг/кг, оценку эффективности проводят через 24 часа, т.е. в поздний период прекондиционирования (Belaidi Е., Beguin Р.С., Levy P., Ribuot С. et al. Delayed myocardial preconditioning induced by cobalt chloride in the rat: HIF-1α and iNOS involvement // Fundam. Clin. Pharmacol. - 2012. - Vol. 26(4). - P. 454-62). Недостатками данного способа является то, что его эффективность оценивается только в поздний период, в ранний период прекондиционирования не определяется.

Существует способ повышения устойчивости к гипоксии, при котором используют химически модифицированное средство на основе кобальта дихлорида - тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида, которое вводят мышам внутрибрюшинно однократно в дозе 10 мг/кг, что обеспечивает увеличение продолжительности жизни животных в условиях острой гипобарической гипоксии и острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией, которым их подвергают через 1 час после инъекции соединения, на 38% и 15% соответственно в сравнении с контролем (Стратиенко Е.Н., Катунина Н.П., Петухова Н.Ф., Ромащенко С.В. Изучение антигипоксической активности новых соединений производных винилимидазола // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - Т. 113. - №8. - С. 79-78). Тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида является умеренно токсичным средством, в то время как кобальта дихлорид относится к классу высокотоксичных средств. Недостатками данного способа использования тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида является отсутствие определения эффективности в поздний период прекондиционирования.

Техническим результатом изобретения является увеличение продолжительности жизни животных в условиях острой гипоксии, снижение трудоемкости за счет исключения гипоксической тренировки, что облегчает и упрощает реализацию способа, а также уменьшение токсичности используемого химически модифицированного соединения на основе кобальта дихлорида в сравнении с собственно кобальта дихлоридом.

Сущность предложенного способа повышения устойчивости организма к острой гипоксии состоит в том, что лабораторным мышам в первый, третий и пятый день эксперимента вводят внутрибрюшинно тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида в дозе 30 мг/кг и оценивают эффективность воздействия средством на организм через 1 час и 48 часов после последнего введения вещества. При трехкратном использовании тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида происходит формирование защитного эффекта как в ранний, так и в поздний период прекондиционирования.

Способ осуществляется следующим образом: в первый день эксперимента лабораторным мышам вводят внутрибрюшинно 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида в дозе 30 мг/кг, на следующий день инъекцию не делают, на третий день снова вводят 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида в дозе 30 мг/кг, на четвертый день инъекцию не делают, на пятый день вводят 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида в дозе 30 мг/кг, т.е. всего три инъекции на 1-й, 3-й и 5-й дни эксперимента.

Оценку эффективности воздействия средством на организм проводят через 1 час и 48 часов после последнего введения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида на модели острой гипобарической гипоксии (ОГБГ), которую моделируют путем помещения животного под стеклянный колпак, из-под которого со скоростью 50 метров в секунду с помощью насоса Камовского откачивают воздух до его разрежения 200-210 мм рт.ст., что соответствует высоте 11000 метров. Вариабельность степени разрежения обусловлена ежедневными колебаниями атмосферного давления и температуры воздуха. Степень разрежения, соответствующую высоте 11000 метров над уровнем моря, определяют по так называемой барометрической формуле на сайте www.planetcalc.ru/938, вводя значение настоящего атмосферного давления и температуры воздуха. Кроме того, эффективность прекондиционирования оценивают через 1 час и 48 часов после последнего введения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида на модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией (ОгсГк), когда животное помещают в гермообъем - аптечный штанглаз из прозрачного стекла с притертой стеклянной пробкой объемом 250 мл (Лукьянова Л.Д. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств. - М., 1990. - С. 9-11).

Пример 1

Лабораторной мыши №1 массой 20 граммов в первый, третий и пятый дни эксперимента внутрибрюшинно вводили 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида из расчета 30 мг/кг, после чего мышь через 1 час подвергали острой гипобарической гипоксии при разрежении воздуха 204 мм рт.ст., что соответствует высоте 11000 метров, скорость подъема составляла 50 м/с. Продолжительность жизни мыши спустя 1 час после последнего введения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида, т.е. в ранний период прекондиционирования, составила 11 минут, в то время как продолжительность жизни у контрольной мыши была 5 минут.

Пример 2

Лабораторной мыши №2 массой 22 грамма в первый, третий и пятый дни эксперимента внутрибрюшинно вводили 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида из расчета 30 мг/кг, после чего мышь через 48 ч подвергали острой гипобарической гипоксии при разрежении воздуха 202 мм рт.ст., что соответствует высоте 11000 метров, скорость подъема составляла 50 м/с. Продолжительность жизни мыши спустя 48 часов после последнего введения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида, т.е. в поздний период прекондиционирования, составила 10 минут, в то время как продолжительность жизни у контрольной мыши была 4 минуты 30 секунд.

Пример 3

Лабораторной мыши №3 массой 21 грамм в первый, третий и пятый дни эксперимента внутрибрюшинно вводили 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида из расчета 30 мг/кг, после чего мышь через 1 час подвергали острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией. Продолжительность жизни мыши через 1 час после последнего введения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида, т.е. в ранний период прекондиционирования, составила 48 минут, в то время как продолжительность жизни у контрольной мыши была 26 минут.

Пример 4

Лабораторной мыши №4 массой 20 граммов в первый, третий и пятый дни эксперимента внутрибрюшинно вводили 2% раствор тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида из расчета 30 мг/кг, после чего мышь через 48 часов подвергали острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией. Продолжительность жизни мыши через 48 часов после последнего введения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида, т.е. в поздний период прекондиционирования, составила 38 минут, в то время как продолжительность жизни у контрольной мыши была 23 минуты.

Были использованы две контрольные и четыре опытные группы животных. В каждую группу было взято по 8 лабораторных животных. В контрольной группе 1 (интактные животные, подвергшиеся острой гипобарической гипоксии) продолжительность жизни животных составила 5,21±0,77 минут. В контрольной группе 2 (интактные животные, подвергшиеся острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией) продолжительность жизни животных составила 25,68±2,06 минут.

В результате использования предлагаемого способа, когда впервые применяли трехкратно в прерывистом режиме (через день) тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорид (30 мг/кг), были выявлены значимые изменения в продолжительности жизни мышей на двух моделях острой гипоксии в сравнении с контрольными группами. Так, средняя продолжительность жизни мышей при острой гипобарической гипоксии была на 56% выше относительно контроля в ранний период прекондиционирования и на 44% в поздний период. На модели острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией применение данного способа достоверно повышало продолжительность жизни экспериментальных животных на 61 и 29% в ранний и поздний период прекондиционирования соответственно в сравнении с контрольной группой 2.

Результаты исследований представлены в таблице на Фиг. 1.

Трехкратное в прерывистом режиме (через день) введение тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида (30 мг/кг) сопровождается повышением устойчивости экспериментальных животных как к острой гипобарической гипоксии, так и к острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией в ранний и поздний периоды прекондиционирования.

Для обработки полученных данных и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки BioStat 2009. Для сравнения данных при оценке продолжительности жизни животных в условиях острой гипоксии использовали непараметрический U критерий Манна-Уитни. Достоверными считались различия показателей при р<0,05.

Использование предлагаемого способа повышения устойчивости организма к острой гипоксии имеет следующие преимущества:

1) позволяет увеличить продолжительность жизни животных при тяжелой острой гипобарической гипоксии как в ранний, так и поздний период прекондиционирования;

2) позволяет увеличить продолжительность жизни животных в условиях острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией как в ранний, так и поздний период прекондиционирования;

3) использование комплексного соединения тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида позволяет уменьшить токсичность действующего начала соединения кобальта дихлорида;

4) данный способ является простым в исполнении и легковоспроизводимым.

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакологии и адаптационной медицине. Сущность метода состоит в том, что лабораторным мышам в первый, третий, пятый день вводят внутрибрюшинно тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида в дозе 30 мг/кг и проводят оценку эффективности воздействия средством на организм через 1 час и 48 часов после его последнего введения. Способ легко воспроизводим, позволяет увеличить продолжительность жизни животных при острой гипобарической гипоксии и острой нормобарической гипоксии с гиперкапнией как в ранний, так и поздний период прекондиционирования, а также позволяет уменьшить токсичность действующего начала соединения - кобальта хлорида на организм в процессе его адаптации к гипоксии. 1 ил., 4 пр.

Способ повышения устойчивости организма к острой гипоксии в эксперименте, включающий внутрибрюшинное введение лабораторным мышам 2% раствора тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида, отличающийся тем, что в первый, третий, пятый день вводят тетра-(1-винилимидазол) кобальтдихлорида в дозе 30 мг/кг и проводят оценку эффективности воздействия средством на организм через 1 час и 48 часов после его последнего введения.