3-N-ЗАМЕЩЕННЫЕ БОРНИЛПРОПИОНАТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ВИРУСА МАРБУРГ Российский патент 2018 года по МПК A61K31/4453 A61K31/452 A61P31/12 C07D211/14 

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к лекарственным средствам, конкретно к соединениям 3-N-замещенных борнилпропионатов общей формулы I (включая их пространственные изомеры, в том числе оптически активные формы):

где R - -СН₂-, -СНМе, у которых выявлена биологическая активность, заключающаяся в ингибировании репродукции вируса Марбург. Данные соединения I могут использоваться в качестве ингибитора репродукции вируса Марбург и могут быть применены в медицине, вирусологии и фармакологии.

Лихорадки Марбург и Эбола относятся к геморрагическим лихорадкам, возбудителями которых являются филовирусы. Крупнейшими вспышками филовирусных лихорадок были эпидемии лихорадки Марбург в Анголе в 2004-2005 гг. и лихорадки Эбола в 2014 году в Западной Африке. Инфекция вирусами Марбург и Эбола имеет схожие клинические проявления, вирионы сходны по своей морфологии, однако имеются отличия в их антигенной структуре. Инфицирование людей происходит при контакте с биологическими жидкостями носителя вируса. В настоящее время не существует зарегистрированного патогенетического средства лечения филовирусных лихорадок, однако имеется ряд кандидатных препаратов, показавших антифиловирусную активность in vitro и in vivo на животных моделях (Kaushik A., Tiwari S., DevJayant R., Marty A., Nair M., 2016. Towards detection and diagnosis of Ebola virus disease at point-of-care. Biosens. Bioelectron. 75, 254-272).

Жизненный цикл вируса включает в себя несколько этапов: прикрепление к клетке, проникновение в клетку, разборка капсида, репликация, сборка вирусной частицы и выход из клетки. Вход вируса в клетку - привлекательная точка приложения для терапии, так как блокирование инфекции на начальной стадии уменьшает цитопатическое действие на клетку, связанное с репликацией вируса, снижается риск приобретения вирусом лекарственной резистентности. Так как начальные стадии инфекции, включая вход в клетку и слияние вирусной и клеточной мембран, определяются вирусными поверхностными белками, при поиске ингибиторов этого класса возможно использование псевдотипированных вирусов - рекомбинантных, биологически безопасных вирусных частиц, имеющих капсид одного вируса и поверхностный белок другого («чужого», часто, более патогенного) вируса. Использование таких частиц дает возможность осуществлять поиск специфических препаратов, ингибирующих именно начальные этапы вирусной инфекции, обусловленные «чужим белком». Биологическая безопасность псевдовирусов определяется тем, что в клетках-мишенях они не образуют вирусного потомства благодаря целенаправленному редактированию псевдовирусного генома. Таким образом, их применение особенно удобно в случае поиска ингибиторов высокопатогенных вирусов, так как работа с псевдовирусами может осуществляться в лабораториях класса BSL-2.

Несмотря на то что вспышки эпидемии заболевания филовирусными инфекциями являются довольно редким явлением, разработка препаратов, обладающих специфической противовирусной активностью против данного вируса является важной задачей медицинской химии и вирусологии.

Известно, что коэффициенты летальности во время вспышек марбургской геморрагической лихорадки варьируются в пределах от 24% до 88%. С точки зрения поиска новых соединений, обладающих высокой противовирусной активностью, особое значение имеют соединения с каркасным остовом.

Наиболее близким к заявляемому соединению - прототипом, является глицерам - моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты формулы II:

Данное соединение блокирует инфицирование клеток вирусом Марбург и активно на ранних этапах репродукции вируса Марбург (Докл. Ак. Наук, 1995, 344, 5, 709-711). Недостатком известного соединения является невысокая противовирусная активность.

Задачей изобретения является расширение нового класса эффективных ингибиторов репродукции вируса Марбург.

Технический результат: повышение эффективности подавления репродукции вируса Марбург и расширение ассортимента ингибиторов репродукции данного вируса.

Поставленная задача решается новыми соединениями общей формулы I, обладающими выраженными свойствами ингибиторов репродукции вируса Марбург:

где R - -СН₂-, -СНМе-.

Соединения общей формулы I, после проведения углубленных фармакологических исследований, могут использоваться как в чистом виде, так и в качестве компонента новых низкотоксичных высокоэффективных против вируса Марбург лекарственных форм.

Исследования биологической активности I, проведенные с использованием псевдовирусных систем и вируса Марбург (штамм Рорр), показали их высокую эффективность как ингибиторов репродукции этого вируса.

Полученные количественные показатели ингибирования подтверждают высокую степень подавления трансдукции культуры клеток 293FT псевдовирусом с поверхностным белком вируса Марбург и репликации вируса Марбург в культуре клеток Vero соединениями I, превышающую тот же показатель у эталона сравнения - верапамила.

Синтез соединений проводили по схеме 1, выделение конечных соединений проводили методом колоночной хроматографии. Ход реакций отслеживали отбором проб и анализом хромато-масс спектров. На первой стадии проводили взаимодействие природного (-)-борнеола с хлорангидридом 2-хлорпропионовой кислоты с образованием соответствующего 3-хлорпропионата. Дальнейшая реакция последнего с насыщенными N-содержащими гетероциклами приводит к соединениям общей формулы I:

Спектральные исследования выполнены в Химическом Сервисном Центре коллективного пользования СО РАН. Величины удельного вращения определяли на спектрометре PolAAr 3005. Спектры ЯМР 1Н и 13С регистрировали на спектрометрах Bruker AV-400 (1Н: 400.13 МГц, 13С: 100.61 МГц), DRX-500 (1Н: 500.13 МГц, 13С: 125.76 МГц) и AV-600 (1Н: 600.30 МГц, 13С: 150.95 МГц). В качестве внутреннего стандарта использовали остаточные сигналы растворителя - хлороформа (¹Н 7.24, ¹³С 76.90 м.д.). Отнесение сигналов в спектрах ЯМР проводилось с привлечение стандартных одномерных и двумерных экспериментов (COSY, HETCOR, COLOC, НМВС, HSQC). Нумерация атомов в соединениях дана для отнесения сигналов в спектрах ЯМР и не совпадает с нумерацией атомов в номенклатурном названии. Масс-спектры высокого разрешения записывали на спектрометре DFS ThermoScientific в режиме полного сканирования в диапазоне m/z 0-500, ионизация электронным ударом 70 эВ при прямом вводе образца. Разделение продуктов реакций проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (60-200 μ, Masherey-Nagel). Хромато-масс-спектры записывали на газовом хроматографе Agilent 7890 А с квадрупольным масс-спектрометром Agilent 5975С в качестве детектора, кварцевая колонка HP-5MS 30000 0.25 мм, газ-носитель - гелий. Удельное вращение выражено в (град⋅мл)⋅(г⋅дм)^-1, концентрация раствора (г)⋅(100 мл)^-1. Растворители перед использованием сушились и перегонялись.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение (1S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил 3-хлорпропаноата

К раствору 3-хлорпропановой кислоты в CH₂Cl₂ добавили избыток (COCl)₂ и каплю ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч в атмосфере Ar. Избыток (COCl)₂ удалили на ротационном испарителе, полученный хлорангидрид использовали свежеприготовленный. Далее к раствору (-)-борнеола 0.03 моль и Et₃N 0.03 моль в 20 мл сухого CH₂Cl₂ в атмосфере Ar прибавляли 0.03 моль свежеприготовленного хлорангидрида 3-хлорпропановой кислоты. Реакционную смесь перемешивали и оставили на 24 ч при 23-25°C. Осадок гидрохлорида триэтиламина отфильтровывали, в фильтрат добавляли CH₂Cl₂, промывали насыщ. NaCl, сушили безводным Na₂SO₄. Осушитель отфильтровали, растворитель упарили. Выход 69%. (1S,4S)-1,7,7-Триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил 3-хлорпропаноат (промежуточное соединение) имеет следующую формулу:

ЯМР 1Н (400 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 0.80 (3Н, с, Ме-9), 0.84 (3Н, с, Me-10), 0.87 (3Н, с, Ме-8), 0.97 (1Н, дд, 2J=13.7, J2н, 1к=3.5, Н-2эндо), 1.16-1.33 (2Н, м, Н-4эндо, Н-5экзо), 1.65 (1Н, дд, J3, 2к=J3, 4к=4.6, Н-3), 1.67-1.77 (1Н, м, Н-4экзо), 1.89 (1Н, ддд, 2J=12.9, J5н, 4н=9.3, J5н, 4к=4.4, Н-5эндо), 2.33 (1Н, м, Н-2экзо), 2.77 (2Н, т, J=6.6 Гц, Н-12), 3.74 (2Н, т, J=6.6 Гц, Н-13), 4.91 (1Н, ддд, J1к, 2к=10.0, J1к, 2н=3.5, J1к, 5к=2.2, Н-1экзо). ЯМР 13С (125 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 170.40 с (С-11), 80.50 д (С-1), 48.69 с (С-6), 47.69 с (С-7), 44.71 д (С-3), 39.18 д (С-13), 37.80 д (С-12), 36.54 т (С-2), 27.85 т (С-4), 26.97 т (С-5), 19.55 к (Ме-9), 18.69 к (Ме-10), 13.34 к (Ме-8). = -36.2 (CHCl3, с=0.7). Найдено: m/z 244.1225 [М]+ C13H21O2Cl. Вычислено: М=244.1222.

Пример 2. Получение (1S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил-3-(пиперидин-1-ил)пропаноата

Смесь 1 экв. (1S,4S)-1,7,7-триметилбицикло [2.2.1]гептан-2-ил 3-хлорпропаноата, 1.1 экв. соответствующего амина и 1 экв Et₃N в 15 мл МеОН перемешивали при комнатной температуре в течение суток, затем растворитель упарили. К сухому остатку добавили 20 мл EtOAc и промыли насыщенным раствором NaCl, водный слой еще раз экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой сушили безводным Na₂SO₄ и упарили. Остаток хроматографировали на SiO₂, используя в качестве элюента гексан/этилацетат (100:0→0:100)+метанол (1%). Выход 74%.

(1S,4S)-1,7,7-Триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил-3-(пиперидин-1-ил)пропаноат имеет следующую формулу (Ia):

ЯМР¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д): 0.79 (3Н, с, Me-10), 0.83 (3Н, с, Ме-8), 0.86 (3Н, с, Ме-9), 0.94 (1Н, дд, ²J=13.7, J_{2н, 1к}=3.5, Н-2эндо), 1.15-1.30 (2Н, м, Н-4эндо, Н-5экзо), 1.33-1.43 (2Н, м, Н-16), 1.49-1.57 (4Н, м, 2Н-15, 2Н-17), 1.63 (1Н, дд, J_{3, 2к}=J₃, _4к=4.6, Н-3), 1.65-1.76 (1Н, м, Н-4экзо), 1.85-1.94 (1Н, ддд, ²J=12.9, J_{5н, 4н}=9.3, J_5н, _4к=4.4, Н-5эндо), 2.30 (1H, м, Н-2экзо), 2.31-2.42 (4Н, уш. сиг, 2Н-14, 2Н-18), 2.43-2.53 (2Н, м, Н-12), 2.57-2.66 (2Н, м, Н-13), 4.86 (1Н, ддд, J_1к, _2к=10.0, J_1к, _2н=3.5, J_1к, _5к=2.2, Н-1экзо). ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 172.62 с (С-11), 79.28 д (С-1), 54.02 т (С-13), 53.78 т (С-14, С-18), 48.32 с (С-6), 47.32 с (С-7), 44.73 д (С-3), 36.21 т (С-2), 32.33 т (С-12), 27.57 т (С-4), 26.66 т (С-5), 25.52 т (С-15, С-17), 23.87 т (С-16), 19.23 к (Ме-9), 18.38 к (Ме-10), 13.01 к (Ме-8).

(CHCl₃, с=0.8).

Найдено: m/z 293.2356 [M]⁺ C₁₈H₃₁O₂N. Вычислено: М=293.2349.

Пример 3. Получение (1S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил-3-(4-метилпиперидин-1-ил)пропаноат (Iб)

ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, δ, м.д): 0.79 (3Н, с, Me-10), 0.84 (3Н, с, Ме-8), 0.87 (3Н, с, Ме-9), 0.89 (3Н, д, J=12.1, Me-17), 0.94 (1H, дд, ²J=13.7, J_{2н, 1к}=3.5, Н-2эндо), 1.15-1.37 (5Н, м, Н-4эндо, Н-5экзо, Н-15а, Н-16, Н-18а), 1.53-1.61 (2Н, м, Н-15э, Н-18э), 1.63 (1Н, дд, J_{3, 2к}=J_{3, 4к}=4.6, Н-3), 1.65-1.76 (1Н, м, Н-4экзо), 1.84-1.97 (3Н, м, Н-5эндо, Н-14а, Н-19а), 2.30 (1Н, м, Н-2экзо), 2.45-2.52 (2Н, м, Н-12), 2.60-2.68 (2Н, м, Н-13), 2.79-2.86 (2Н, м, Н-14э, Н-19э), 4.86 (1Н, ддд, J_1к, _2к=10.0, J_{1к, 2н}=3.5, J_{1к, 5к}=2.2, Н-1экзо). ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 172.61 с (С-11), 79.28 д (С-1), 53.67 т (С-13), 53.26 и 53.22 т (С-14, С-19), 48.32 с (С-6), 47.32 с (С-7), 44.43 д (С-3), 36.22 т (С-2), 33.89 и 33.87 т (С-15, С-18), 32.49 т (С-12), 30.25 д (С-16), 27.57 т (С-4), 26.67 т (С-5), 21.42 к (Ме-17), 19.24 к (Ме-9), 18.38 к (Ме-10), 13.01 к (Ме-8).

(CHCl₃, с=0.68).

Найдено: m/z 307.2503 [M]⁺ C₁₉H₃₃O₂N. Вычислено: М=307.2506. Выход 77%.

Пример 4. Определение цитотоксичности соединений на клетках линии 293FT

Стоковые растворы соединений в ДМСО (в концентрации 100 мМ) добавлялись в ростовую среду к клеткам-мишеням линии 293FT в различных концентрациях - от 10 мкМ до 500 мкМ - на 48 ч. По окончании инкубации клеток с веществами, к культурам клеток добавляли тетразолиевый краситель МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) до рабочей концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Образующийся осадок формазана растворяли добавлением в ростовую среду 10% раствора додецилсульфата натрия с 0.01 М соляной кислотой. Количество формазана (пропорциональное количеству жизнеспособных клеток) определяли спектрофотометрически, измеряя абсорбцию при длине волны света 570 нм. Процент жизнеспособных клеток в культурах, содержащих разные концентрации исследуемых веществ [I], определяли по отношению к контролю (который представлял из себя культуру клеток 293FT, инкубируемую в ростовой среде с ДМСО в отсутствие соединений), пользуясь формулой:

% жизнеспособных клеток [I]=ОП[I]/ОП [ДМСО].

За величину CD50 (50% цитотоксическая концентрация) принимали концентрацию вещества, при которой выживало 50% клеток по сравнению с контролем.

Пример 5. Получение псевдовирусов на основе рекомбинантного капсида вируса везикулярного стоматита (ВВС), экспрессирующего на поверхности гликопротеины вирусов Марбург

Рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, псевдотипированный поверхностным гликопротеином G ВВС - pBBC-ΔG-G - представляет собой коммерчески доступный вирусный препарат для получения на его основе рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита, псевдотипированных поверхностными гликопротеинами других вирусов. Для возможности количественного анализа инфекции такими псевдовирусами в геном рекомбинантного ВВС встроен репортерный ген люциферазы светлячка. Для получения псевдовируса, экспрессирующего поверхностный гликопротеин вируса Марбург (штамм Мусоке), клетки-продуценты линии 293FT сначала трансфицировались плазмидой, кодирующей ген этого гликопротеина (pcDNA3-MarVGP) (в количестве 5 мкг плазмиды на 60 мм чашку клеток-продуцентов). Через 24 ч после трансфекции, клетки-продуценты заражались 5 мкл (~10⁶ трансдуцирующих единиц) pBBC-ΔG-G. Через 4 ч после инфекции инфицирующий псевдовирус отмывался, а среда заменялась на свежую. Препарат нового псевдовируса, экспрессирующего гликопротеин вируса Марбург - pBBC-ΔG-MarVGP - собирали через 24 ч после инфекции. Препараты псевдовирусов хранили при температуре -80°C.

Пример 6. Определение полуингибирующих концентраций соединений в отношении псевдовирусов pBBC-ΔG-MarVGP и pBBC-ΔG-G, расчет значений индекса селективности (SI) и коэффициента специфичности ингибитора (SC)

Для определения инфекционной способности псевдовирусов использовали клетки-мишени линии НЕК293, рассаженные в 96-луночный планшет при плотности монослоя 80-90%. Определение инфекционности псевдовирусов в присутствии ингибиторов и в контрольных (неингибированных) образцах производили люминометрией через 24 ч после инфекции, все измерения производили в тройных повторах с определением среднего значения и стандартного отклонения. Для всех исследованных соединений определялись концентрации 50% ингибирования (IC50) для обоих псевдовирусов pBBC-ΔG-MarVGP и pBBC-ΔG-G. В дальнейшем, для каждого соединения рассчитывался индекс селективности (SI) - отношение токсичности соединения и ингибирующей активности против вируса Марбург (CD50/IC_MarV50) и коэффициент специфичности ингибитора (SC), представляющий собой отношение полуингибирующих концентраций для двух псевдовирусов (IC_MarV50 к IC_VSV50). В качестве референсного соединения, ингибирующего инфекцию филовирусов, но не влияющего на инфекцию ВВС в терапевтических концентрациях, выбран ингибитор кальциевых каналов верапамил. Значения IC_MarV50, IC_VSV50, CD50, SI и SC для всех исследуемых веществ приведены в табл. 1.

Пример 7. Определение противовирусного действия соединений Ia-б в отношении вируса Марбург штамм Рорр in vitro на культуре клеток Vero

В работе был использован вирус Марбург штамм Рорр, полученный из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ БВ «Вектор» Роспотребнадзора в виде культуральной жидкости (титр вируса 4,5 lgTCD50/ml).

Определение эффективных (1С50) концентраций соединений было проведено в тесте снижения цитопатического действия вируса Марбург на клетки в трех повторах. Метод основан на способности жизнеспособных клеток поглощать и накапливать суправитальный краситель нейтральный красный.

Культура клеток Vero была выращена в 96-луночных культуральных планшетах с конфлюэнтностью не менее 90%. Готовили последовательные понижающиеся трехкратные разведения соединений, начиная с концентрации 100 мкг/мл. В эксперименте использовали вирус Марбург с множественностью заражения 0,01 (эквивалентно дозе 100 TCD50 на лунку).

Определение ингибирующей активности и токсической концентрации соединений проводили одновременно. Для этого в культуральный планшет с монослоем клеток вносили разведения соединений, затем вносили поддерживающую среду без вируса (для определения токсической концентрации соединений) и жидкость содержащую вирус (для определения ингибирующей активности соединений). Культуральные планшеты инкубировали при 37°C в течение 7 суток, затем окрашивали нейтральным красным. Учет результатов проводили на планшетном анализаторе (Thermo Scientific Multiskan FC), обработку данных осуществляли при помощи программы SOFTmax PRO 4.0 с использованием 4-параметрического метода анализа. Для всех исследованных соединений определены 50% токсическая концентрация (CD50) и концентрации 50% ингибирования (IC50). В дальнейшем, для каждого соединения рассчитывался индекс селективности (SI) - отношение токсичности соединения и ингибирующей активности против вируса Марбург (CD50/IC50) (табл. 2).

Таким образом, заявленные соединения обладают противовирусной активностью в отношении вируса Марбург штамм Рорр.

Изобретение относится к применению 3-N-замещенных борнилпропионатов формулы I:

где R - -СН₂-, -СНМе, в качестве ингибитора репродукции вируса Марбург. Технический результат: получено новое соединение, которое может быть использовано для подавления репродукции вируса Марбург. Изобретение может быть применено в медицине, вирусологии и фармакологии. 2 табл., 7 пр.

Применение соединений 3-N-замещенных борнилпропионатов общей формулы I

где R - -CH₂-, -CHMe, в качестве ингибитора репродукции вируса Марбург.