ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА МАРБУРГ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/70 A61K35/78 

Изобретение относится к вирусологии, медицине, а именно к разработке и поиску противовирусных препаратов, способных ингибировать репродукцию вируса Марбург.

Вирус Марбург известен с 1968 после вспышки геморрагической лихорадки в ФРГ и Югославии. В настоящее время данный вирус отнесен к семейству Filoviridae, являясь его типичным представителем. Помимо вируса Марбург, в данное семейство входят еще два представителя вирусы Эбола и Рестон. Особенностью данного семейства является необычная морфология вирионов, необычно большой размер генома, низкая чувствительность к известным противовирусным препаратам, таким как интерферон и рибавирин (виразол) [2] В настоящее время ингибиторы репродукции вируса Марбург в литературе не описаны.

Противовирусная активность аммониевой соли глицерризиновой кислоты описана для ряда вирусов, таких как ДНК-содержащий вирус осповакцины и РНК-содержащие вирусы болезни Ньюкастл и везикулярного стоматита (штамм Индиана), однако РНК-содержащий вирус полиомиелита 1 типа оказался практически нечувствительным к данному препарату, а противовирусная активность по отношению к вирусу герпеса могла быть связана с инактивацией инфекционности вирусных частиц [1] Известно также, что глицирризиновая кислота и ее производные способны ингибировать рост вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Однако вирус Марбург существенно отличается по организации генома и способу реализации генетического материала от вирусов, в отношении которых показана ингибирущая активность глицирризиновой кислоты и ее производных.

Цель изобретения выявление противовирусных препаратов, обладающих антифиловирусной активностью.

Цель достигается применением глицирризиновой кислоты (ГК) или ее производных, в частности моноаммониевой соли β -глицирризиновой кислоты (глицирама, Г) или пента-О-никотината глицирризиновой кислоты, 3-( b -D-2,3,4-три-о-никотинилглюкуронпиранозил)1 2( a -D- 3,4-ди-O-никотинилглюкуронпиранозил глицирретовой кислоты (ниглизина, НГ) для ингибирования репродукции вируса Марбург.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Монослой клеток Vero, инфицированных вирусом Марбург, культивируют в присутствии указанных препаратов, конечная концентрация которых в культуральной среде составляет 0,5-1,0 мг/мл, и без него (контроль). Об ингибировании репродукции вируса Марбург судят по уменьшению количества вирусспецифических поражений (бляшек), учитывая их количество на 7-е сут инкубирования при +37^oC под полужидким агаровым покрытием по сравнению с контролем.

Изобретение обладает новизной, изобретательским уровнем и возможностью практического пользования, т.е. отвечает всем критериям изобретения, поскольку впервые установлена способность глицирризиновой кислоты и ее производных ингибировать репродукцию вируса Марбург. Следует подчеркнуть, что глицирризиновая кислота и ее производные являются первой группой соединений - ингибиторов репродукции вируса Марбург, которые потенциально могут быть использованы для лечения этого заболевания.

Пример 1. Монослой культуры клеток Vero в культуральных флаконах инфицируют разведениями вируссодержащей суспензии вируса Марбург (от -3 lg до -6 lg). После адсорбции вируса в течение 45 мин при комнатной температуре неадсорбированный вирус удаляют и вносят полужидкое агаровое покрытие, содержащее ГК, Г или НГ в концентрации 1,0 мг/мл или без препарата (контроль). Флаконы с инфицированной культурой клеток инкубируют в течение 7 сут при 37^oC, после чего полужидкое агаровое покрытие удаляют и монослой клеток прокрашивают 1% -ным раствором кристаллвиолета. О наличии ингибирования репродукции вируса судят по разности количества вирусспецифических поражений на монослое клеток (бляшек) в присутствии препаратов и без них (контроль).

Из данных, приведенных в табл.1, видно, что в присутствии препаратов ГК или ее производных Г и НГ количество бляшек снижается в 10-100 раз, то есть данные препараты способны ингибировать репродукцию вируса Марбург в монослое культуры клеток Vero.

Пример 2. Монослой культуры клеток Vero в культуральных флаконах инфицируют вируссодержащей суспензией вируса Марбург в разведении, дающем более 50 бляшек на монослой, как описано в примере 1. Полужидкое агаровое покрытие, содержащее различные концентрации ГК, Г или НГ наносят сразу после адсорбции вируса. Инкубирование флаконов с монослоем культуры клеток и учет результатов проводят как описано в примере 1.

Из приведенных в табл.2 результатов можно видеть, что имеется зависимость между противовирусной активностью исследуемых препаратов и их концентрацией в среде покрытия, при этом ИД₅₀ (доза препарата, обеспечивающая 50%-ный ингибирующий эффект) для ГК и Г составляет около 0,25 мг/мл, а для НГ около 0,0625 мг/мл.

Пример 3. В культуральную среду во флаконы с монослоем культуры клеток Vero вносят ГК, Г или НГ в концентрации 1 мг/мл. Через 24 ч инкубации при 37^oC монослой клеток отмывают от препаратов трехкратной сменой среды, не содержащей препаратов, и монослой культуры клеток инфицируют вирусом Марбург, как описано в примере 2, и вносят полужидкое агаровое покрытие, не содержащее препараты. В качестве контролей используют культуральные флаконы с монослоем культуры клеток без предварительной инкубации с препаратами, которые инфицированы аналогичным образом, но в полужидкое агаровое покрытие препараты вносят сразу после адсорбции вируса через 72 ч инкубации при 37^oC, либо не вносят вообще.

Из данных, приведенных в табл.3, можно видеть, что ГК и ее производные снижают чувствительность клеток к вирусу, и во флаконах с монослоем клеток, предобработанных в течение 24 ч противовирусными препаратами, количество бляшек не отличается от контроля без препаратов. В то же время в культуральных флаконах, монослой клеток в которых был инкубирован с препаратами, внесенными в покрытие сразу после адсорбции, бляшки отсутствуют, а при внесении через 72 ч размер бляшек значительно меньше, чем в контрольных флаконах.

Таким образом, глицирризиновая кислота и ее производные глицирам и ниглизин обладают способностью ингибировать репродукцию вируса Марбург в культуре клеток.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии. Проведено изучение влияния бета-глицирризиновой кислоты (ГК) и ее производных на размножение вируса Марбург на культуре клеток. Установлено, что ГК и ее производные (моноаммонийная соль ГК, пента-о-никотинат ГК) в концентрациях 0,06-0,25 мг/мл подавляют репродукцию вируса. Определены количественные характеристики противовирусного действия ГК против вируса Марбург. 3 табл.

Применение глицирризиновой кислоты и ее производных в качестве ингибитора репродукции вируса Марбург.