Способ диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori Российский патент 2018 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и иммунологии, и может быть использовано для диагностики хронического атрофического гастрита.

На сегодняшний день хронический гастрит (ХГ) - наиболее распространенное заболевание желудочно-кишечного тракта. По данным Всемирной организации здравоохранения хроническим гастритом болеют 80% населения Земли. Считается, что инфекция Helicobacter pylori (Н. pylori) является одной из распространенных причин возникновения хронического гастрита, и степень выраженности хронического гастрита зависит от вирулентности штаммов Н. pylori, а развитие атрофии - от генетической предрасположенности и индивидуального ответа на инфицирование Н. pylori [1]. Возникающие при хроническом гастрите структурные изменения слизистой оболочки желудка приводят к нарушению основных функций желудка, в первую очередь кислото- и пепсинообразующей. При этом одной из важных эпидемиологических особенностей хронических гастритов является их предраковый потенциал. Так, при нормальной структуре слизистой оболочки желудка 10-летний риск возникновения рака желудка составляет менее 1%, при хроническом аутоиммунном гастрите с выраженной атрофией он равен 1-9%, а при Н. pylori - ассоциированном хроническом гастрите с выраженной атрофией - 4-30%. [1]. В связи с этим функционально-морфологическое изучение желудка при различных типах ХГ дает возможность предусмотреть возможные варианты дальнейшего развития патологии, провести патогенетическое лечение и предупредить прогрессирование болезни. Таким образом, ранняя диагностика хронического атрофического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori, является актуальной для предупреждения трансформации его в рак желудка.

Известен способ диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori, включающий взятие биоматериала в виде слизистого секрета желудка со всей поверхности антрального и пилорического отделов, смешивание биоматериала с реактивом Несслера для определения в нем наличия аммиака и последующую оценку характера окраски смеси [2]. При окрашивании смеси в желтый цвет и/или выпадении из нее осадка диагностируют хронический гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori. Недостатки известного способа: трудоемкость из-за необходимости забора слизистого секрета со всей поверхности как антрального, так и пилорического отделов желудка, малая информативность, так как оценивается только показатель цвета смеси, при этом не учитываются возможные оттенки полученной окраски смеси и другие характеристики и параметры.

Задачей изобретения является создание информативного способа для ранней диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori с атрофическими изменениями слизистой оболочки.

Задача достигается тем, что проводят иммунологическое исследование гепаринизированной венозной крови больных. Для этого методом непрямой иммунофлюоресценции в крови определяют абсолютное количество естественных киллеров (NK-клеток), а в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют уровни цитокинов - интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (ИФН-γ). При абсолютном количестве NK-клеток ниже 0,17×10⁹/л, уровне ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл, ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл диагностируют хронический гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori, с атрофическими изменениями слизистой оболочки желудка.

Развитие хронического гастрита - сложный патогенетический процесс, характеризующийся последовательными изменениями в слизистой оболочке желудка. Согласно каскаду Корреа, рак желудка развивается через гастрит-атрофию-метаплазию-рак, следовательно, пациенты с хроническим атрофическим гастритом подвергаются повышенному риску развития рака желудка. Это положение было подтверждено 4-м Маастрихтским консенсусом в 2010 г. и европейскими рекомендациями по ведению пациентов с предраковыми изменениями в желудке.

NK-клетки, естественные киллеры, - гетерогенная популяция лимфоцитов системы врожденного иммунитета. Они осуществляют противоопухолевый и противовирусный контроль организма. Кроме естественной цитолитической активности, натуральные киллеры оказывают регулирующее влияние на иммунные реакции посредством секреции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов.

Цитокины, как регуляторы межклеточных взаимодействий в иммунной системе, также способствуют активации противоопухолевого иммунного ответа, являясь связующим звеном между иммунной и другими системами организма. ИЛ-2 индуцирует пролиферацию и усиление цитотоксической функции NK-клеток. NK-клетки служат одним из основных источников ИФН-γ. Таким образом, использование в качестве достоверных маркеров диагностики атрофических изменений в слизистой оболочке желудка при хроническом гастрите абсолютное количество NK-клеток и содержание цитокинов в крови является целесообразным. Было доказано, что наиболее значимыми для диагностики атрофических изменений слизистой оболочки желудка, у больных хроническим гастритом, ассоциированным с Helicobacter pylori, является понижение количества NK-клеток ниже 0,17×10⁹/л, уровни ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл, ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл. При данных уровнях исследуемых цитокинов и абсолютном количестве NK-клеток наличие атрофических изменений слизистой оболочки желудка у больных хроническим гастритом следует признавать высоким.

Пороговые значения цитокинов ИЛ-2, ИФН-γ и количества NK-клеток получены опытным путем на основании сопоставления уровней исследуемых цитокинов и количества естественных киллеров с данными по наличию атрофических изменений слизистой оболочки желудка у больных хроническим гастритом, ассоциированным с Helicobacter pylori, полученных при последующем наблюдении за клиническим состоянием больных.

ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл ОШ=2,73 (95% ДИ=2,07-6,51, p_1,2=0,02)

ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл ОШ=4,23 (95%ДИ=2,63-9,61, p_1,2=0,0008)

NK-клетки менее 0,17×10⁹/л ОШ=7,21 (95%ДИ=2,45-16,28, p_1,2=0,0007)

Проведенные исследования показали, что при развитии атрофических изменений слизистой оболочки желудка у больных хроническим гастритом уровни цитокинов варьировали в пределах: ИЛ-2 - от 2,8 до 9,5 пг/мл, ИФН-γ - от 2,03 до 4,8 пг/мл, количество NK-клеток - от 0,1×10⁹ до 1,0×10⁹/л. При этом в 100% случаев при заявленных уровнях исследуемых цитокинов (ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл, ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл) и количестве NK-клеток (менее 0,17×10⁹/л) у больных хроническим гастритом независимо от стадии заболевания развивались атрофические изменения слизистой оболочки желудка.

NK-клетки - CD16⁺CD56⁺-лимфоциты, участвуют в выработке как противовоспалительных, так и иммуносупрессирующих цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-альфа и ИЛ-10, секретируют гранулоцитарно-макрофагальный и гранулоцитарный колониестимулирующий факторы, ИЛ-3 и служат одним из основных источников интерферона-гамма в организме. Биологическая роль NK-клеток в противоопухолевой активности, контроле инфекционного процесса, регуляции пролиферативной активности и дифференцировки гемопоэтических клеток, участие в реакции отторжения трансплантата.

Интерлейкин-2 (ИЛ-2) является плейотропным цитокином, стимулирует пролиферацию и активацию натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов, способен индуцировать активность практически всех клонов цитотоксических клеток, стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов и секрецию иммуноглобулинов.

Интерферон-гамма (ИФН-γ) обладает противоопухолевой активностью, активирует макрофаги, стимулирует иммунную цитотоксичность, усиливает макрофагальный киллинг, обладает антивирусной активностью.

Заявленный способ апробирован на 110 больных хроническим гастритом, ассоциированным с Helicobacter pylori (у 85 больных - хронический поверхностный гастрит, у 25 - хронический атрофический гастрит), проходивших лечение в гастроэнтерологическом отделение НИИ медицинских проблем Севера ФИЦ КНЦ СО РАН. У 24 больных были диагностированы атрофические изменения слизистой оболочки желудка, которые в дальнейшем подтвердились лабораторно-инструментальными исследованиями (эзофагогастродуоденоскопия с биопсией). У одного больного хроническим гастритом диагноз не совпал. Таким образом, совпадение результатов диагностики предложенным способом и общепринятым лабораторно-инструментальным методом составило 98,0%.

Способ осуществляется следующим образом.

У больных с диагнозом хронический гастрит, независимо от стадии заболевания, при поступлении в гастроэнтерологическое отделение забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирку. Из образца выделяют лимфоциты и сыворотку. Методом непрямой иммунофлюоресценции иммунофенотипируют CD16⁺CD56⁺-лимфоциты (NK-клетки) и определяют их количество в 1 литре. Метод определения цитокинов основан на «сэндвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител к цитокинам ИЛ-2 и ИФН-γ с использованием коммерческих тест-систем «Вектор-Бест». При сочетании содержания цитокинов: ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл, ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл и количества NK-клеток ниже 0,17×10⁹/л, у больных хроническим гастритом, ассоциированным с Helicobacter pylori, независимо от стадии заболевания, диагностируют наличие атрофических изменений слизистой оболочки желудка.

Клинический пример 1. Больной С., 45 лет, поступил на обследование и стационарное лечение в гастроэнтерологическое отделение НИИ медицинских проблем Севера ФИЦ КНЦ СО РАН с диагнозом: хронический гастрит, обострение. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоят явления диспепсии и боль в эпигастральной области.

Проведено обследование по заявленному способу. Определены уровни цитокинов в сыворотке крови и количество NK-клеток:

Согласно изобретению, у больного диагностирован хронический гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori, с атрофическими изменениями слизистой оболочки желудка. Установленный диагноз подтвержден данными ЭФГДС и биопсии. Больному назначена патогенетическая терапия.

Клинический пример 2. Больная Р., 59 лет, поступила на обследование и стационарное лечение в гастроэнтерологическое отделение НИИ медицинских проблем Севера ФИЦ КНЦ СО РАН с диагнозом: хронический гастрит, обострение. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит выраженная диспепсия. Проведено обследование по заявленному способу. Определены уровни цитокинов в сыворотке крови и количество NK-клеток:

Согласно изобретению, у больной не диагностирован хронический гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori, с атрофическими изменениями слизистой оболочки желудка. По данным ЭФГДС с биопсией: у больной хронический поверхностный гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori. Больной назначена патогенетическая терапия.

Технический результат от реализации предлагаемого способа:

- повышение точности диагностики развития атрофических изменений слизистой оболочки желудка у больных хроническим гастритом, ассоциированным с Helicobacter pylori за счет анализа регуляторного звена иммунной системы;

- возможность ранней диагностики атрофических изменений слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите, ассоциированном с Helicobacter pylori;

- расширение арсенала средств для диагностики атрофических изменений слизистой оболочки желудка у больных хроническим гастритом, ассоциированном с Helicobacter pylori.

Таким образом, предложенный высокочувствительный информативный способ позволяет своевременно диагностировать хронический Helicobacter pylori-ассоциированный гастрит с атрофическими изменениями слизистой оболочки желудка, корректировать план и тактику лечения данной категории больных.

Источники информации

1. Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Лапина Т.Л. Хронический гастрит, вызванный инфекцией Helicobacter pylori: диагностика, клиническое значение, прогноз. Пособие для врачей. М., 2009. 24 с.

2. Патент №2069699 РФ. Способ диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori. Опубл. 27.11.1996.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori. Проводят иммунологическое исследование гепаринизированной венозной крови больных. Методом непрямой иммунофлюоресценции в крови определяют абсолютное количество естественных киллеров (NK-клеток), а в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют уровни цитокинов - интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (ИФН-γ). При абсолютном количестве NK-клеток ниже 0,17×10⁹/л, уровне ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл, ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл диагностируют хронический гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori, с атрофическими изменениями слизистой оболочки желудка. Способ позволяет своевременно диагностировать хронический атрофический гастрит, корректировать план и тактику лечения данной категории больных. 2 пр.

Способ диагностики хронического гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что проводят иммунологическое исследование гепаринизированной венозной крови больных, для этого методом непрямой иммунофлюоресценции в крови определяют абсолютное количество естественных киллеров (NK-клеток), а в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют уровни цитокинов - интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (ИФН-γ), и при абсолютном количестве NK-клеток ниже 0,17×10⁹/л, уровне ИЛ-2 ниже 3,35 пг/мл, ИФН-γ ниже 2,25 пг/мл диагностируют хронический гастрит, ассоциированный с Helicobacter pylori, с атрофическими изменениями слизистой оболочки желудка.