Способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли Российский патент 2018 года по МПК A61K31/704 A61K33/08 A61K47/00 A61K47/50 A61P35/00 B82B1/00 B82Y5/00 

Изобретение относится к области бионанотехнологии и касается способа получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки злокачественных опухолей человека и может быть использовано для адресной доставки лекарств.

Известен способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата - доксорубицина в клетки опухоли, включающий диспергирование 5 мг наночастиц магнетита диаметром 10-15 нанометров (нм), покрытых поливиниловым спиртом, в 5 мл водного раствора доксорубицина с концентрацией 0,1 мг/мл с последующими перемешиванием на ротационном шейкере при 37°С в течение 26 ч, магнитной декантацией модифицированных наночастиц и их ресуспендированием в воде (Kayal S., Ramanujan R.V. Doxorubicin loaded PVA coated iron oxide nanoparticles for targeted drug delivery// Materials Science and Engineering: C, 2010. V. 30(3), P. 484-490). Данный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как использование наночастиц магнетита, покрытых полимерной оболочкой, и обработка модифицированных наночастиц водным раствором доксорубицина.

Известен способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата - паклитакселя в клетки опухоли, включающий диспергирование в 10 мл воды при помощи обработки ультразвуком в течение 1 мин 100 мг наночастиц магнетита размером 140 нм, покрытых глицерил-моноолеатом, добавление в полученную дисперсию по каплям раствора паклитакселя в ацетонитриле с концентрацией 10 мг/мл, перемешивание дисперсии на магнитной мешалке в течение ночи и отделение наночастиц путем трехкратного центрифугирования при скорости вращения ротора центрифуги 13800 об./мин в течение 10 мин с последующим ресуспендированием модифицированных наночастиц в воде (Dilnawaz F., Singh A., Mohanty С.et al. Dual drug loaded superparamagnetic iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy// Biomaterials, 2010. V. 31(13), P. 3694-3706). Данный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как обработка наночастиц магнетита вначале раствором полимера, затем ультразвуком и отделение модифицированных лекарством наночастиц путем центрифугирования с последующим их ресуспендированием в воде.

Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли, включающий смешение в присутствии воды модифицированных полимером (конъюгатом дофамина и полиэтиленгликоля с концевой карбоксильной группой) наночастиц магнетита со средним диаметром 18 нм, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, с водным раствором смеси 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и N-гидроксисульфосукцинимида, перемешивание полученной суспензии, отделение избытка 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида и N-гидроксисульфосукцинимида на хроматографической колонке PD-10, промытой PBS-буфером, смешение суспензии с органическим соединением (производным герцептина), химически связывающимся с наночастицами и обеспечивающим селективное проникновение наночастиц во внутриклеточное пространство клеток аденокарциномы молочной железы человека, отделение модифицированных наночастиц центрифугированием с последующим добавлением водного раствора органического лиганда, связывающего противоопухолевый препарат -производное цисплатина, перемешиванием смеси, удалением избытка лиганда на хроматографической колонке PD-10, смешением с водным раствором производного цисплатина, перемешиванием полученной смеси в темноте в течение ночи и последующим отделением полученных модифицированных наночастиц центрифугированием и хроматографированием на колонке PD-10 (Xu С, Wang В., Sun S. Dumbbell-like Au-Fe₃O₄ Nanoparticles for Target-Specific Platin Delivery// J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131, P. 4216-4217 - прототип).

Данный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, как смешение в присутствии воды модифицированных полимером наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, с органическим соединением, химически связывающимся с наночастицами и обеспечивающим селективное проникновение наночастиц во внутриклеточное пространство клеток аденокарциномы человека, и водным раствором противоопухолевого препарата с последующим отделением полученных модифицированных наночастиц центрифугированием.

Недостатками известного способа являются его сложность и многостадийность, а также то, что описанная в нем система дает возможность доставки в клетки аденокарциномы (опухоли эпителиально-железистых тканей) человека относительно небольшого количества противоопухолевого препарата (17,8% от массы не всей наночастицы, а только от массы наночастицы золота, на которой эпитаксиально была выращена наночастица магнетита) и то, что цитотоксичность системы (концентрация полумаксимального ингибирования IC₅₀, при которой погибает 50% клеток опухоли) недостаточно высока (1,76 мкг препарата/ мл культуральной среды). Если осуществить пересчет количества введенного противоопухолевого препарата на массу всей наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенной на наночастице золота, то оно окажется существенно более низким, чем указанные выше 17,8%.

Задача изобретения заключается в разработке способа получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли, лишенного вышеуказанных недостатков.

Технический результат изобретения заключается в повышении цитотоксичности системы для доставки в клетки аденокарциномы человека противоопухолевого препарата.

Предварительно были проведены эксперименты с различными наночастицами магнетита, эпитаксиально выращенными на наночастицах золота, различными органическими соединениями, химически связывающимися с наночастицами и обеспечивающими селективное проникновение наночастиц внутрь опухолевых клеток, и различными противоопухолевыми препаратами, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли, включающим смешение в присутствии воды модифицированных полимером наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, с органическим соединением, химически связывающимся с наночастицами и обеспечивающим селективное проникновение наночастиц внутрь клеток опухоли, и водным раствором противоопухолевого препарата с последующим отделением полученных модифицированных наночастиц центрифугированием, в качестве модифицированных полимером наночастиц используют наночастицы, полученные путем нагрева до 120°С в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введения в смесь пентакарбонила железа, выдерживания полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа от 120°С до 250°-260°С, выдерживания смеси при 250°-260°С в течение 25-30 мин и ее охлаждения до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, выдерживания смеси при комнатной температуре в присутствии воздуха, добавления в смесь одноатомного спирта и отделения наночастиц магнетита центрифугированием, с последующей их обработкой раствором полимера, выбранного из группы, включающей триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 56 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 101 каждый (полоксамер 407), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси (полиэтиленгликоль)-2000] и триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 30 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 78 каждый (полоксамер 188), в органическом растворителе, затем ультразвуком, с последующим удалением растворителя, введением воды, повторной обработкой ультразвуком и отделением модифицированных наночастиц центрифугированием, в качестве противоопухолевого препарата используют доксорубицин, в качестве органического соединения, обеспечивающего селективное проникновение наночастиц внутрь клеток аденокарциномы предстательной железы человека, используют низкомолекулярный лиганд простатического специфического мембранного антигена, причем наночастицы вначале обрабатывают раствором доксорубицина, затем раствором низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена.

Предлагаемый способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе. Способ получения наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, используемых в предлагаемом техническом решении, также является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.

В отличие от введения чистого противоопухолевого препарата в культуральную среду клеток или организм, где данное лекарственное вещество будет проникать в клетки любого типа, предлагаемый способ позволяет получать системы для адресной (селективной) доставки противоопухолевого препарата только в клетки определенного типа опухоли без проникновения препарата в здоровые клетки, что снижает побочные эффекты, обусловленные введением лекарства для терапии злокачественных новообразований.

Предлагаемый способ может быть использован для лечения онкологического заболевания - аденокарциномы предстательной железы человека.

В предлагаемом способе используют наночастицы магнетита диаметром 4±1 нм, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота диаметром 2±1 нм, полученные путем нагрева до 120°С в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введения в смесь пентакарбонила железа, выдерживания полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторного нагрева полученной смеси от 120°С до 250-260°С, ее выдерживания при этой температуре в течение 25-30 мин и ее последующего охлаждения до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, выдерживания смеси в присутствии воздуха, добавления в смесь одноатомного спирта и отделения наночастиц магнетита центрифугированием.

Малый диаметр используемых в предлагаемом техническом решении наночастиц магнетита облегчает их проникновение внутрь опухолевых клеток.

В предлагаемом способе в качестве высококипящего органического растворителя используют дифениловый эфир. Экспериментально было показано, что при использовании в предлагаемом способе вместо дифенилового эфира других высококипящих органических растворителей, например, таких, как 1-октадецен или дибензиловый эфир, образуются наночастицы магнетита существенно большего размера (7-14 нм), которые после их модификации способны проникать во внутриклеточное пространство, но из-за своих относительно больших размеров не способны проходить внутрь ядра и/или митохондрий клеток.

В предложенном техническом решении смесь, содержащую дифениловый эфир, олеиновую кислоту, олеиламин и 1,2-гексадекандиол, помещают в трехгорлую круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром, системой для подачи инертного газа и магнитным телом для перемешивания. При этом количества введенных олеиновой кислоты, олеиламина, 1,2-гексадекандиола и дифенилового эфира могут варьироваться и составлять, например, 1,5-2,5 мл, 1,5-2,5 мл, 2,1-3,1 г и 18-22 мл, соответственно. Затем подают ток инертного газа, под колбой размещают электрическую нагревательную плитку с функцией магнитного перемешивания, включают плитку и осуществляют нагрев при перемешивании содержимого колбы до 120°С в атмосфере любого инертного газа, например, такого, как аргон, азот и т.д. При этом продолжительность нагрева может варьироваться и составлять, например, 30-90 мин. Затем в колбу вводят жидкий пентакарбонил железа в количестве, например, 0,25-0,30 мл. Следует отметить, что и эту стадию синтеза необходимо проводить в атмосфере инертного газа. Пентакарбонил железа вводят одноразово, и после его введения реакционную смесь выдерживают в атмосфере инертного газа в течение определенного времени, например, в течение 3-5 мин.

После выдерживания реакционной смеси туда вводят смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанную в атмосфере любого инертного газа. При этом количества введенных тригидрата золотохлористоводородной кислоты, олеиламина и дифенилового эфира могут быть различными и составлять, например, 38,0-42,0 мг, 0,4-0,6 мл и 4,9-5,1 мл, соответственно. При реализации способа происходит как термическое разложение пентакарбонила железа с образованием наночастиц магнетита, так и восстановление тригидрата золотохлористоводородной кислоты 1,2-гексадекандиолом с образованием наночастиц золота. Ввиду того, что эти процессы протекают с различной скоростью, при осуществлении способа вначале вводят в реакционную смесь 1,2-гексадекандиол и пентакарбонил железа, проводят частичное термическое разложение пентакарбонила железа, и только затем, спустя, например, 3-5 мин, в реакционную систему вводят раствор, содержащий смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире. Введение на первом этапе синтеза 1,2-гексадекандиола, не принимающего участия в реакции термического разложения пентакарбонила железа, обусловлено тем, что 1,2-гексадекандиол является твердым и достаточно труднорастворимым соединением, и ему требуется определенное время и температура для полного растворения в реакционной системе. После введения раствора тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина реакционную смесь повторно нагревают от 120°С до 250°-260°С и выдерживают нагретую смесь при этой температуре в течение 25-30 мин. Следует отметить, что данные стадии синтеза также проводят в атмосфере любого инертного газа.

При необходимости получения более значительных количеств наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, количество каждого из используемых реагентов должно быть пропорционально увеличено.

В предлагаемом способе после выдерживания реакционной смеси ее охлаждают до комнатной температуры в атмосфере инертного газа и выдерживают при комнатной температуре в присутствии воздуха в течение определенного времени, например, в течение 30-60 мин.

Если любую из вышеперечисленных стадий синтеза вообще не проводить или проводить в других условиях, чем указано выше, то технический результат изобретения не достигается.

После выдерживания реакционной смеси при комнатной температуре туда вводят одноатомный спирт, в качестве которого можно использовать, например, метанол, этанол, изопропанол и т.д., необходимый для эффективного выпадения наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, в осадок в ходе центрифугирования полученной смеси. При этом количество вводимого одноатомного спирта может варьироваться и составлять, например, 150-200% от объема полученной реакционной смеси. Также возможно использовать смесь одноатомных спиртов.

Полученные наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота, можно хранить при комнатной или при пониженной температуре в герметично закрытой емкости в сухом виде без ухудшения их эксплуатационных свойств в течение длительного времени, например, в течение года. При этом хранение целесообразно осуществлять в инертной атмосфере в отсутствие влаги.

Методом рентгенофазового анализа было доказано, что в предложенном способе действительно образуются наночастицы с кристаллической структурой магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота. Размер и распределение по размерам наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, были исследованы методом просвечивающей электронной микроскопии. При этом было показано, что каждая сферическая частица магнетита, имеющая диаметр 4±1 нм, соединена с одной сферической частицей золота, имеющей диаметр 2±1 нм. Магнитные свойства полученных наночастиц были исследованы на приборе Вибромагнетометр VSM-250.

В предлагаемом техническом решении наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота, обрабатывают раствором полимера, выбранного из группы, включающей полоксамер 407 (триблок-сополимер, состоящий из центрального гидрофобного блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 56, и двух концевых гидрофильных блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 101 каждый), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси(полиэтиленгликоль)-2000], полоксамер 188 (триблок-сополимер, состоящий из центрального гидрофобного блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 30 и двух концевых гидрофильных блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 78 каждый), в органическом растворителе.

Каждый из вышеуказанных полимеров коммерчески доступен. Так, полоксамер 407 можно заказать в фирме Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/16758?lang=en&region=RU), 1, 2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси (полиэтиленгликоль) -2000] можно заказать в фирме Avanti Polar Lipids (http://avantilipids.com/product/880135/), полоксамер 188 также можно заказать в фирме Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrichxom/catalog/product/sigma/p5556?lang=en&region=RU).

Используемые в предлагаемом техническом решении полимеры содержат гидрофобную и гидрофильную составляющую, одна из которых обеспечивает стабилизацию используемых наночастиц в воде, а другая обеспечивает связывание наночастицы с противоопухолевым препаратом - доксорубицином. Если в качестве полимера использовать другие известные полимеры или обработку наночастиц вышеуказанными полимерами вообще не проводить, то технический результат изобретения не достигается.

В предлагаемом способе при обработке вышеописанных наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, раствором полимера, в качестве растворителя можно использовать различные органические растворители, например, такие, как хлороформ, дихлорметан, гексан и т.д. При этом концентрация полимера в органическом растворителе может варьироваться и составлять, например 0,5-2 мг/мл. После смешения наночастиц магнетита с раствором вышеуказанного полимера в органическом растворителе полученную смесь обрабатывают ультразвуком, при этом продолжительность такой обработки может варьироваться и составлять, например, 1-5 мин, мощность ультразвука в используемой для этой цели бани также может быть различной и составлять, например, 300-500 Вт. После обработки наночастиц раствором полимера органический растворитель удаляют, например, путем высушивания на воздухе либо путем использования роторного испарителя. Если растворитель не удалять, то технический результат не достигается. Следует отметить, что массовое соотношение между наночастицами магнетита, эпитаксиально выращенными на наночастицах золота, и любым из вышеописанных полимеров может варьироваться и составлять, например, 0,2-1. Для упрощения способа обработку частиц магнетита раствором вышеуказанного полимера целесообразно проводить при комнатной температуре. Экспериментально было показано, что вышеуказанные полимеры связываются с поверхностью как наночастиц магнетита, так и с поверхностью химически связанных с ними наночастиц золота.

Модифицированные наночастицы магнетита отделяют от избытка вышеуказанных полимеров путем введения воды, количество которой может варьироваться и составлять, например, 1-5 мл, повторной обработки ультразвуком, продолжительность которой может варьироваться и составлять, например, 1-5 мин, с последующим центрифугированием полученной дисперсии модифицированных наночастиц в воде при скорости вращения ротора центрифуги 10000-14000 об./мин в течение 5-10 мин.

В предлагаемом способе к отделенным влажным вышеописанным модифицированным полимером наночастицам магнетита добавляют водный раствор известного противоопухолевого препарата - доксорубицина (https:www.macmillan.org.uk/cancerinformation/cancertreatment/treatmenttypes/chemotherapy/individualdrugs/doxorubicin.aspx), связывание которого с модифицированными наночастицами магнетита, эпитаксиально выращенными на наночастицах золота, в научно-технической литературе не описано. При этом массовое соотношение исходных немодифицированных наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, и доксорубицина может варьироваться и составлять, например, 1-3. Концентрация противоопухолевого препарата в воде также может варьироваться и составлять, например, 0,1-0,4 мг/мл После смешения модифицированных наночастиц магнетита с раствором доксорубицина полученную смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 12-24 ч.

Затем в полученную дисперсию вводят водный раствор низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена, который ковалентно связывается только с поверхностью наночастиц золота, вытесняет с их поверхности ранее введенный полимер и обеспечивает селективное проникновение наночастиц внутрь опухолевых клеток аденокарциномы предстательной железы человека. Следует отметить, что получение низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена описано в научно-технической литературе (Machulkin А.Е., Ivanenkov Y.A., Aladinskaya A.V. et al. Small-molecule PSMA ligands. Current state, SAR and perspectives // J Drug Target, 2016. V. 24, P. 679-693).

Вводить низкомолекулярный лиганд простатического специфического мембранного антигена необходимо путем обработки модифицированной доксорубицином дисперсии наночастиц магнетита его водным раствором при перемешивании в течение 12-24 ч. При этом массовое соотношение исходных немодифицированных наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, и низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена может варьироваться и составлять, например, 0,04-0,2. Концентрация низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена в воде также может варьироваться и составлять, например, 5-10 мг/мл.

Наночастицы магнетита, последовательно модифицированные доксорубицином и низкомолекулярным лигандом простатического специфического мембранного антигена, отделяют от избытка вышеуказанных реагентов центрифугированием полученной дисперсии наночастиц в воде при скорости вращения ротора ультрацентрифуги 10000-14000 об./мин в течение 5-10 мин.

Для хранения наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, последовательно модифицированных полимером, доксорубицином и низкомолекулярным лигандом простатического специфического мембранного антигена, модифицированные наночастицы диспергируют в воде. Полученную дисперсию можно хранить как при комнатной, так и при пониженной температуре в герметично закрытой емкости без доступа света. В данных условиях продолжительность хранения препарата составляет не менее 3 месяцев.

Цитотоксичность полученного препарата определяют путем стандартного MTS-теста (Heinemann L., Simpson G.R., Boxall A., Kottke Т., Relph K.L., Vile R., Melcher A., Prestwich R., Harrington K.J., Morgan R., Pandha H.S. Synergistic effects of oncolytic reovirus and docetaxel chemotherapy in prostate cancer// BMC Cancer 2011, V. 11: 221) в диапазоне концентраций 0,5 - 10 мкг доксорубицина/ мл культуральной среды на клеточных культурах аденокарциномы предстательной железы человека LNCaP и РС-3, причем низкомолекулярный лиганд простатического специфического мембранного антигена является специфичным только к клеткам линии LNCaP, экспрессирующим данный антиген на своей поверхности, обеспечивая селективное проникновение наночастиц внутрь данного типа клеток, в то время как клеточная культура РС-3 была выбрана в качестве контрольной, т.к. клетки данной линии не экспрессируют простатический специфический мембранный антиген на своей поверхности.

Следует отметить, что в предлагаемом техническом решении модифицированные полимером наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота, вначале обрабатывают водным раствором доксорубицина, затем водным раствором низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена. При этом экспериментально было показано, что при обратной последовательности обработок цитотоксичность предлагаемой системы снижается.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

В трехгорлую круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром, системой для подачи инертного газа и магнитным телом для перемешивания, помещают 20 мл (126 ммоль) дифенилового эфира, 1,9 мл (2 ммоль) олеиновой кислоты, 2,0 мл (2 ммоль) олеиламина и 2,6 г (10 ммоль) 1,2-гексадекандиола. Затем подают ток аргона, под колбой размещают электрическую нагревательную плитку с функцией магнитного перемешивания, включают плитку и осуществляют нагрев в течение 30 мин содержимого колбы до 120°С при постоянном перемешивании с последующим введением вначале 0,28 мл (2 ммоль) пентакарбонила железа, затем, через 3 мин, раствора, содержащего смесь 40 мг (0,1 ммоль) тригидрата золотохлористоводородной кислоты и 0,5 мл (1,5 ммоль) олеиламина в 5 мл дифенилового эфира, предварительно выдержанного в атмосфере аргона. Затем полученную смесь повторно нагревают от 120°С до 250°С, выдерживают в течение 25 мин при 250°С, после чего охлаждают до комнатной температуры, причем все стадии синтеза проводят в атмосфере аргона. Охлажденную смесь выдерживают при комнатной температуре в присутствии воздуха в течение 30 мин, добавляют в смесь 45 мл одноатомного спирта - изопропанола и отделяют наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота, центрифугированием. Отделенные наночастицы сушат до постоянной массы. Получают 45 мг порошка наночастиц. Полученные наночастицы хранят в герметично закрытой емкости в атмосфере аргона в отсутствие влаги при комнатной температуре. В этих условиях наночастицы сохраняют свои эксплуатационные свойства в течение года.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что строение полученных наночастиц напоминает гантель, в которой каждая наночастица магнетита, имеющая сферическую форму и диаметр 4 нм, связана со сферической наночастицей золота диаметром 2 нм. С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 55 Ам²/кг.

1 мг полученного порошка наночастиц помещают в круглодонную колбу, затем туда добавляют 2 мл раствора триблок-сополимера, состоящего из центрального гидрофобного блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 56, и двух концевых гидрофильных блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 101 каждый, в хлороформе с концентрацией 1 мг/л, колбу на 3 мин переносят в ультразвуковую баню с мощностью 400 Вт, после чего колбу помещают на роторный испаритель, и с его помощью удаляют хлороформ. После удаления хлороформа в колбу добавляют 2 мл воды, колбу на 3 мин повторно помещают в ультразвуковую баню с мощностью 400 Вт, затем полученную дисперсию переносят в пластиковую пробирку и центрифугируют в течение 8 мин при скорости вращения ротора центрифуги 10000 об/мин. Затем в пробирку, содержащую отделенные наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота и модифицированные полимером, добавляют 5 мл водного раствора противоопухолевого препарата - доксорубицина с концентрацией 0,2 мг/мл. После этого в пробирку помещают магнитное тело для перемешивания, пробирку закрывают крышкой, подвешивают на штатив над магнитной мешалкой, включают магнитную мешалку и содержимое пробирки перемешивают в течение 18 ч. Затем пробирку открывают, в нее вводят 5 мл водного раствора органического соединения, химически связывающегося с наночастицами и обеспечивающего селективное проникновение наночастиц во внутриклеточное пространство клеток опухоли (аденокарциномы предстательной железы человека) -низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена с концентрацией 7 мг/мл и повторно перемешивают в течение 18 ч. После этого пробирку размещают в роторе центрифуги и центрифугируют в течение 8 мин при скорости вращения ротора 10000 об./мин. При этом происходит отделение наночастиц от избытка доксорубицина и низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена. Осевшие наночастицы диспергируют в 1 мл воды. Полученную дисперсию хранят при комнатной температуре в герметично закрытой емкости без доступа света.

Содержание противоопухолевого препарата - доксорубицина в дисперсии модифицированных наночастиц, определенное методом спектроскопии поглощения из калибровочной кривой для ряда стандартных образцов с известной концентрацией доксорубицина, составляет 0,31 мг/мл. Концентрация дисперсии модифицированных наночастиц, определенная методом атомно-эмиссионной спектроскопии из калибровочной кривой для ряда стандартных образцов с известной концентрацией железа и золота, равна 0,89 мг/мл. Таким образом, содержание доксорубицина в модифицированных наночастицах, определенное расчетным путем из приведенных в примере данных, составляет 34,8% от массы наночастиц.

Цитотоксичность препарата (1С₅₀) для клеточной культуры LNCaP, специфичной к низкомолекулярному лиганду простатического специфического мембранного антигена, определенная путем MTS-теста, составляет 1,43 мкг препарата/ мл культуральной среды. Цитотоксичность препарата (IC₅₀) для контрольной клеточной культуры РС-3, определенная путем MTS-теста, составляет 9,74 мкг препарата/ мл культуральной среды.

Пример 2.

В трехгорлую круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром, системой для подачи инертного газа и магнитным телом для перемешивания, помещают 22 мл (139 ммоль) дифенилового эфира, 2,5 мл (7,9 ммоль) олеиновой кислоты, 2,5 мл (7,5 ммоль) олеиламина и 3,1 г (12 ммоль) 1,2-гексадекандиола. Подают ток азота, под колбой размещают электрическую нагревательную плитку с функцией магнитного перемешивания, включают плитку и осуществляют нагрев в течение 90 мин содержимого колбы до 120°С при постоянном перемешивании с последующим введением вначале 0,30 мл (2,1 ммоль) пентакарбонила железа, затем, через 5 мин, раствора, содержащего смесь 42 мг (0,11 ммоль) тригидрата золотохлористоводородной кислоты и 0,6 мл (1,8 ммоль) олеиламина в 5,1 мл дифенилового эфира, предварительно выдержанного в атмосфере азота. Затем полученную смесь повторно нагревают от 120°С до 260°С, выдерживают в течение 30 мин при этой температуре, после чего охлаждают до комнатной температуры, причем все стадии синтеза проводят в атмосфере азота. Охлажденную смесь выдерживают при комнатной температуре в присутствии воздуха в течение 45 мин, добавляют в нее 35 мл одноатомного спирта - метанола и отделяют наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота, центрифугированием. Отделенные наночастицы сушат до постоянной массы. Получают 48 мг порошка наночастиц. Полученные наночастицы хранят в герметично закрытой емкости в атмосфере азота в отсутствие влаги при комнатной температуре. В этих условиях наночастицы сохраняют свои эксплуатационные свойства в течение года.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что строение полученных наночастиц напоминает гантель, в которой каждая наночастица магнетита, имеющая сферическую форму и диаметр 5 нм, связана со сферической наночастицей золота диаметром 3 нм. С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 59 Ам²/кг.

1 мг полученного порошка наночастиц помещают в круглодонную колбу, затем туда добавляют 2,1 мл раствора 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси (полиэтиленгликоля)-2000] в дихлорметане с концентрацией 2 мг/л, колбу на 1 мин переносят в ультразвуковую баню с мощностью 500 Вт, после чего колбу оставляют открытой при комнатной температуре, при этом дихлорметан полностью испаряется. Затем в колбу добавляют 5 мл воды, колбу на 1 мин повторно помещают в ультразвуковую баню с мощностью 500 Вт, затем полученную дисперсию переносят в пластиковую пробирку и центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения ротора центрифуги 12000 об./мин. Затем в пробирку, содержащую отделенные наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота и модифицированные полимером, добавляют 5,1 мл водного раствора противоопухолевого препарата - доксорубицина с концентрацией 0,4 мг/мл. После этого в пробирку помещают магнитное тело для перемешивания, пробирку закрывают крышкой, подвешивают на штатив над магнитной мешалкой, включают магнитную мешалку и содержимое пробирки перемешивают в течение 24 ч. Затем пробирку открывают, в нее вводят 5,1 мл водного раствора низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена с концентрацией 10 мг/мл и повторно перемешивают в течение 24 ч. После этого пробирку размещают в роторе центрифуги и центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения ротора 12000 об./мин. При этом происходит отделение наночастиц от избытка доксорубицина и низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена. Осевшие наночастицы диспергируют в 1,1 мл воды. Полученную дисперсию хранят при комнатной температуре в герметично закрытой емкости без доступа света.

Содержание противоопухолевого препарата - доксорубицина в дисперсии модифицированных наночастиц, определенное методом спектроскопии поглощения из калибровочной кривой для ряда стандартных образцов с известной концентрацией доксорубицина, составляет 0,47 мг/мл. Концентрация дисперсии модифицированных наночастиц, определенная методом атомно-эмиссионной спектроскопии из калибровочной кривой для ряда стандартных образцов с известной концентрацией железа и золота, равна 0,85 мг/мл. Таким образом, содержание доксорубицина в модифицированных наночастицах, определенное расчетным путем из приведенных в примере данных, составляет 55,3% от массы наночастиц.

Цитотоксичность препарата (IC₅₀) для клеточной культуры LNCaP, специфичной к низкомолекулярному лиганду простатического специфического мембранного антигена, определенная путем MTS-теста, составляет 1,21 мкг препарата/ мл культуральной среды. Цитотоксичность препарата (IC50) для контрольной клеточной культуры РС-3, определенная путем MTS-теста, составляет 9,35 мкг препарата/ мл культуральной среды.

Пример 3.

В трехгорлую круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром, системой для подачи инертного газа и магнитным телом для перемешивания, помещают 18 мл (113 ммоль) дифенилового эфира, 1,5 мл (4,7 ммоль) олеиновой кислоты, 1,5 мл (4,5 ммоль) олеиламина и 2,1 г (8 ммоль) 1,2-гексадекандиола. Подают ток аргона, под колбой размещают электрическую нагревательную плитку с функцией магнитного перемешивания, включают плитку и осуществляют нагрев в течение 60 мин содержимого колбы до 120°С при постоянном перемешивании с последующим введением вначале 0,25 мл (1,8 ммоль) пентакарбонила железа, затем, через 4 мин, раствора, содержащего смесь 38 мг (0,09 ммоль) тригидрата золотохлористоводородной кислоты и 0,4 мл (1,2 ммоль) олеиламина в 4,9 мл дифенилового эфира, предварительно выдержанного в атмосфере аргона. Затем полученную смесь повторно нагревают от 120°С до 255°С, выдерживают в течение 28 мин при этой температуре, после чего охлаждают до комнатной температуры, причем все стадии синтеза проводят в атмосфере аргона. Охлажденную смесь выдерживают при комнатной температуре в присутствии воздуха в течение 45 мин, добавляют в смесь 40 мл одноатомного спирта - этанола и отделяют наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота, центрифугированием. Отделенные наночастицы сушат до постоянной массы. Получают 40 мг порошка наночастиц. Полученные наночастицы хранят в герметично закрытой емкости в атмосфере аргона в отсутствие влаги при комнатной температуре. В этих условиях наночастицы сохраняют свои эксплуатационные свойства в течение года.

Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что строение полученных наночастиц напоминает гантель, в которой каждая наночастица магнетита, имеющая сферическую форму и диаметр 3 нм, связана со сферической наночастицей золота диаметром 1 нм. С помощью прибора Вибромагнетометр VSM-250 было показано, что у полученных кристаллов намагниченность насыщения равна 47 Ам²/кг.

1 мг полученного порошка наночастиц помещают в круглодонную колбу, затем туда добавляют 1,9 мл раствора триблок-сополимера, состоящего из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 30 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 78 каждый, в гексане с концентрацией 0,5 мг/л, колбу на 5 мин переносят в ультразвуковую баню с мощностью 300 Вт, после чего колбу помещают на роторный испаритель, и с его помощью удаляют гексан. После удаления гексана в колбу добавляют 1 мл воды, колбу на 5 мин повторно помещают в ультразвуковую баню с мощностью 300 Вт, затем полученную дисперсию переносят в пластиковую пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения ротора центрифуги 14000 об./мин. Затем в пробирку, содержащую отделенные наночастицы магнетита, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота и модифицированные полимером, добавляют 4,9 мл водного раствора противоопухолевого препарата - доксорубицина с концентрацией 0,1 мг/мл. После этого в пробирку помещают магнитное тело для перемешивания, пробирку закрывают крышкой, подвешивают на штатив над магнитной мешалкой, включают магнитную мешалку и содержимое пробирки перемешивают в течение 12 ч. Затем пробирку открывают, в нее вводят 4,9 мл водного раствора низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена с концентрацией 5 мг/мл и повторно перемешивают в течение 12 ч. После этого пробирку размещают в роторе центрифуги и центрифугируют в течение 5 мин при скорости вращения ротора 14000 об/мин. При этом происходит отделение наночастиц от избытка доксорубицина и низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена. Осевшие наночастицы диспергируют в 0,9 мл воды. Полученную дисперсию хранят при комнатной температуре в герметично закрытой емкости без доступа света.

Содержание противоопухолевого препарата - доксорубицина в дисперсии модифицированных наночастиц, определенное методом спектроскопии поглощения из калибровочной кривой для ряда стандартных образцов с известной концентрацией доксорубицина, составляет 0,25 мг/мл. Концентрация дисперсии модифицированных наночастиц, определенная методом атомно-эмиссионной спектроскопии из калибровочной кривой для ряда стандартных образцов с известной концентрацией железа и золота, равна 0,93 мг/мл. Таким образом, содержание доксорубицина в модифицированных наночастицах, определенное расчетным путем из приведенных в примере данных, составляет 26,6% от массы наночастиц.

Цитотоксичность препарата (IC₅₀) для клеточной культуры LNCaP, специфичной к низкомолекулярному лиганду простатического специфического мембранного антигена, определенная путем MTS-теста, составляет 1,68 мкг препарата/ мл культуральной среды. Цитотоксичность препарата (IC₅₀) для контрольной клеточной культуры РС-3, определенная путем MTS-теста, составляет 9,10 мкг препарата/ мл культуральной среды.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ по сравнению с прототипом повышает цитотоксичность (снижает на 5-31% IC₅₀) системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки злокачественной опухоли - аденокарциномы предстательной железы человека.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли, включающий смешение в присутствии воды модифицированных полимером наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, с органическим соединением, химически связывающимся с наночастицами и обеспечивающим селективное проникновение наночастиц внутрь клеток опухоли, и водным раствором противоопухолевого препарата с последующим отделением полученных модифицированных наночастиц центрифугированием, отличающийся тем, что в качестве модифицированных полимером наночастиц используют наночастицы, полученные путем нагрева до 120°C в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введения в смесь пентакарбонила железа, выдерживания полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа от 120°C до 250°-260°C, выдерживания смеси при 250°-260°C в течение 25-30 мин и ее охлаждения до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, выдерживания смеси при комнатной температуре в присутствии воздуха, добавления в смесь одноатомного спирта и отделения наночастиц магнетита центрифугированием, с последующей их обработкой раствором полимера, выбранного из группы, включающей триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 56 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 101 каждый, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси(полиэтиленгликоль) - 2000] и триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 30 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 78 каждый, в органическом растворителе, затем ультразвуком, с последующим удалением растворителя, введением воды, повторной обработкой ультразвуком и отделением модифицированных наночастиц центрифугированием, в качестве противоопухолевого препарата используют доксорубицин, в качестве органического соединения, обеспечивающего селективное проникновение наночастиц внутрь клеток аденокарциномы предстательной железы человека, используют низкомолекулярный лиганд простатического специфического мембранного антигена, причем наночастицы вначале обрабатывают раствором доксорубицина, затем раствором низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена. Изобретение позволяет повысить цитотоксичность системы для доставки в клетки аденокарциномы человека противоопухолевого препарата. 3 пр.

Способ получения системы для доставки противоопухолевого препарата в клетки опухоли, включающий смешение в присутствии воды модифицированных полимером наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота, с органическим соединением, химически связывающимся с наночастицами и обеспечивающим селективное проникновение наночастиц внутрь клеток опухоли, и водным раствором противоопухолевого препарата с последующим отделением полученных модифицированных наночастиц центрифугированием, отличающийся тем, что в качестве модифицированных полимером наночастиц используют наночастицы, полученные путем нагрева до 120°C в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введения в смесь пентакарбонила железа, выдерживания полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторного нагрева смеси в атмосфере инертного газа от 120°C до 250°-260°C, выдерживания смеси при 250°-260°C в течение 25-30 мин и ее охлаждения до комнатной температуры, проводимыми в атмосфере инертного газа, выдерживания смеси при комнатной температуре в присутствии воздуха, добавления в смесь одноатомного спирта и отделения наночастиц магнетита центрифугированием, с последующей их обработкой раствором полимера, выбранного из группы, включающей триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 56 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 101 каждый, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбокси(полиэтиленгликоль) - 2000] и триблок-сополимер, состоящий из центрального блока полипропиленгликоля со степенью полимеризации 30 и двух концевых блоков полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 78 каждый, в органическом растворителе, затем ультразвуком, с последующим удалением растворителя, введением воды, повторной обработкой ультразвуком и отделением модифицированных наночастиц центрифугированием, в качестве противоопухолевого препарата используют доксорубицин, в качестве органического соединения, обеспечивающего селективное проникновение наночастиц внутрь клеток аденокарциномы предстательной железы человека, используют низкомолекулярный лиганд простатического специфического мембранного антигена, причем наночастицы вначале обрабатывают раствором доксорубицина, затем раствором низкомолекулярного лиганда простатического специфического мембранного антигена.