Препарат для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики и способ его получения Российский патент 2023 года по МПК A61K47/00 A61K49/04 A61K33/26 A61K33/242 B82B3/00 B82Y5/00 B82Y30/00 B82Y40/00 

Изобретение относится к области бионаномедицины и касается структуры и способа получения модифицированных димерных наночастиц (НЧ) магнетит-золото (Fe₃O₄-Au) вида «гантель», содержащих на поверхности магнетита фотосенсибилизатор, на поверхности золота - флуорофор, что дает возможность использовать совместно фотодинамическую терапию (ФДТ) и флуоресцентную диагностику (ФД) для тераностики онкологических заболеваний.

Фотосенсибилизаторы - это агенты, которые поглощают свет определенной длины волны и используют его энергию. Для синтеза активной формы кислорода (АФК) в фотодинамической терапии (ФДТ) сочетание фотосенсибилизаторов со светом и молекулярным кислородом вызывает гибель клеток, генерируя цитотоксические молекулы. За последние два десятилетия большое количество природных и синтетических красителей были испытаны in vitro и in vivo в качестве фотосенсибилизаторов в экспериментах с ФДТ (Almeida, R.D., Manadas, B.J., Carvalho, А.Р., Duarte, С.В. // Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy. // Biochim Biophys Acta 1704: 59-86 doi:10.1016/j.bbcan.2004.05.003 (2004)). Различные фотосенсибилизаторы вводятся внутривенно, перорально или местно и сохраняются дольше в опухолях по сравнению с нормальными клетками, что требует задержки между введением и облучением светом. Оптимальная временная задержка определяется максимальной концентрацией фотосенсибилизатора в ткани, и она варьируется среди фотосенсибилизаторов. Фотосенсибилизаторы, которые находятся на продвинутых стадиях клинических испытаний или были одобрены для противоракового ФДТ, включают хлорины, бактериохлорины, бензопорфирины, фталоцианины, профилактические вещества и гиперицины.

Флуорофоры это молекулы, при возбуждении которых можно наблюдать свечение в определенной длине волны. Флуоресцентная диагностика - метод определения наличия и локализации злокачественных образований, основанный на избирательном накоплении в них заранее введенного в организм фотосенсибилизатора с последующей регистрацией флуоресценции при световом возбуждении. Пораженные участки обнаруживаются по флюоресценции визуально, или с помощью лазерно-волоконного спектрального анализатора (Jianting Wang, Joseph Moore, Sebastien Laulhe, Michael Nantz, Samuel Achilefu, Kyung A Kang. Fluorophore-gold nanoparticle complex for sensitive optical biosensing and imaging. // Nanotechnology, 2012 Feb 10, Volume 23, Number 9). Метод отличается высокой чувствительностью, позволяет выявлять скрытые опухолевые очаги, новообразования малых размеров (до 1 мм), не дает тяжелых системных или местных осложнений, обследование может проводиться амбулаторно. Метод флуоресцентной диагностики применяется также интраоперационно для уточнения истинных границ злокачественных образований и контроля полноты удаления опухоли.

Известен наногибрид и способ его получения для фотодинамической терапии (ФДТ) и флуоресцентной диагностики (Frances-Soriano L. et al. Nanohybrid for photodynamic therapy and fluorescence imaging tracking without therapy //Chemistry of Materials. - 2018. - T. 30. - №. 11. - C. 3677-3682). Тераностические ап-конверсионные наночастицы подходят для диагностики и проведения ФДТ за счет возбуждения в ближней инфракрасной области (БИК) и последующей эмиссии в видимом области спектра. Наногибрид состоит из NaYF4:Yb, Er, Tm, N-аминобактерио-пурпуринимида, 1,8-нафталимида и представляет собой одновременно эффективный фотосенсибилизатор и трекер с излучением в оранжевой области видимого излучения, который действует как независимый эмиссионный канал для отслеживания флуоресценции без применения ФДТ. Полученный наногибрид обладает нецитотоксисностью, высокой фотостабильностью и чрезвычайной активностью при БИК-индуцированной гибели раковых клеток.

Недостатком известного способа является его относительная сложность реализации, так как применяемое оборудование должно быть адаптировано к возбуждению в ближний инфракрасной области.

Наиболее близким к заявляемому является структура и способ объединения фотосенсибилизатора и флуорофора в одной системе посредством двух линкеров разной длины (Panchenko P.A. et al. Effect of linker length on the spectroscopic properties of bacteriochlorin-1,8-naphthalimide conjugates for fluorescence-guided photodynamic therapy //Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. - 2020. - T. 390. - C. 112338). Конъюгация 4-пиразолинил-1,8-нафталимида и пропаргил-15,17-диметокси-13-амида из бактериохлорина с олиго(этиленгликолевым) линкером привело к созданию двухфункциональной системы включающую фотосенсибилизатор и агент для визуализации флуоресценции. Этот тип флуоресцентных красителей демонстрировал высокие сдвиги Стокса, хорошую фотостабильность и способность к визуализации in vitro.

Недостаток данного способа и структуры заключается в демонстрации более высокой интенсивности эмиссии, исходящей от нафталимидной единицы, что объясняется снижением эффективности резонансного переноса энергии между хромофорами. Флуоресценция нафталимида в исследуемых конъюгатах полностью гасилась из-за резонансного переноса энергии на акцепторный фрагмент фотосенсибилизатора. Визуализация была возможна только после облучения высокой мощности, которое вызывает фотодеструкцию хромофора бактериохлорина.

Техническая проблема структуры для тераностики заключается в разработке получения наноструктуры для совместного использования высокоточной диагностики и эффективной терапии (тераностики) онкологических заболеваний, лишенной вышеуказанных недостатков.

Технический результат изобретения заключается в эффективном совмещении двух хромофоров с нивелированием нежелательных эффектов (переноса энергии) на поверхности наночастиц магнетит-золото для создания успешных агентов нового поколения (с возможностью совместного использования) в тераностики рака.

Технический результат достигается следующим образом. Препарат для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики, включающий димерные НЧ магнетит-золото и FRET-пару хромофоров (фотосенсибилизатор (ФС): бактериофеофорбидного ряда (метиловый эфир ¹³¹-(4-аминобутилкарбомоил) бактериохлорина и флуорофор (ФФ): цианиного ряда (Су5), где ФС иммобилизован на стабилизируемой DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) и PEG (полиэтиленгликоль с СООН группой) поверхности наночастиц магнетита 1 размером 8-11 нм, ФФ иммобилизован на поверхности наночастиц золота 2 размером 3-5 нм, причем размер наночастиц магнетит-золото имеет размер 12-15 нм и гантелевидную форму. Причем на 1 нм² магнитной поверхности НЧ приходится 1 молекула фотосенсибилизатора.

Способ получения препарата для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики включает синтез димерных магнитных наночастиц магнетит-золото вида «гантель» (12-15 нм) путем совместного термического разложения Fe(CO)₅ и HAuCl₄ в органическом растворителе в атмосфере инертного газа в присутствии 1,2-гексадекандиола и органической кислоты (с in situ образующимися НЧ Au), стабилизацию поверхности НЧ магнетита, иммобилизацию FRET-парой хромофоров, причем при синтезе НЧ смесь 1,2-гексадекандиола, олеиновой кислоты, олеиламина и 1-октадецена перемешивали в интенсивном потоке аргона при температуре 120°С в течение 20 минут, с последующим уменьшением потока аргона, подключив к системе обратный холодильник добавили 0,9 мл (6 ммоль) пентакарбонила железа, через 3 минуты в раствор ввели смесь, состоящую из 40 мг (0,1 ммоль) HAuCl₄*(H₂O)₃, 0,5 мл (1,5 ммоль) олеиламина и 5 мл (14 ммоль) 1-октадецена, предварительно выдержанную в атмосфере аргона в течение 7 минут (до соломенно-желтого цвета раствора) далее смесь нагревали со скоростью 25°С в минуту до температуры кипения (300-310°С) и выдерживали при данной температуре 45 минут, после этого полученный раствор охладили до комнатной температуры и подвергли окислению на воздухе в течение часа; модификацией поверхности НЧ магнетита фотосенсибилизирующим агентом бактерифеофорбидного ряда за счет химической конъюгации со стабилизированной DOPAC и PEG поверхностью магнетита (из расчета 1 молекула ФС на 1 нм² Fe₃O₄) с очисткой методами центрифугирования и ВЖЭХ (высокоэффективная жидкостная хроматография); модификацией поверхности НЧ золота флуорофором ряда цианиновых красителей (из расчета десятикратного избытка флуорофора относительно количества наночастиц) за счет ковалентной связи (по средствам тиольной группы) с поверхностью золота с очисткой методами центрифугирования, ВЖЭХ и диализа.

Изобретение поясняется чертежом, где на фиг. 1 приведена принципиальная схема синтеза модификации поверхности НЧ магнетита фотосенсибилизируещим агентом; на фиг. 2 приведена принципиальная схема синтеза модификации поверхности НЧ золота дисульфидным производным флуорофора; на фиг. 3 приведена микрофотография НЧ магнетит-золото гантелевидной формы (метод ПЭМ (просвечивающая электронная микроскопия)); на фиг. 4 приведен рентгенофазовый анализ (РФА) синтезируемых НЧ.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Наночастицы магнетита 2 (Fe₃O₄), эпитаксиально выращенные на наночастицах золота 1, могут быть получены путем нагрева до 120°С в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введения в смесь пентакарбонила железа, выдерживания полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторного нагрева при температуре 250-260°С, выдерживания нагретой смеси при температуре 250-260°С в течение 25-30 мин, ее последующего охлаждения до комнатной температуры, проводимого в атмосфере инертного газа, выдерживания смеси в присутствии воздуха, добавления в смесь одноатомного спирта и отделения наночастиц магнетит-золото центрифугированием. Строение полученных наночастиц напоминает «гантель», в которой наночастица магнетита химически связана с наночастицей золота. Предложенный способ позволяет получать наночастицы магнетита диаметром 10±2 нм, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота диаметром 4±1 нм, более того данный метод позволяет контролировать и варьировать (увеличивать) размер выращенных наночастиц путем изменения скорости нагрева синтеза.

Совмещается FRET-пара хромофоров: бактериофеофорбидного ряда фотосенсибилизатора (метиловый эфир ¹³¹-(4-аминобутилкарбомоил) бактериохлорина) и цианиного ряда флуорофора (Су5). Фотосенсибилизатор иммобилизуется за счет химической конъюгации со стабилизированной поверхностью магнетита (8-11 нм), где стабилизация достигается в несколько этапов: поверхность магнетита за счет ковалентной связи связывается с DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) с дальнейшей активацией карбодиимидным (EDC/NHS) методом далее за счет ковалентной связи дополнительно стабилизируется PEG (полиэтиленгликоль с СООН группой) с последующей активацией карбоксильной группы карбодиимидным (EDC/NHS) методом и далее с фотосенсибилизатором. Принципиальная схема синтеза представлена на фиг. 1.

Производный флуоресцентного красителя Су5, содержащего дисульфидную связь, иммобилизуется на поверхности золота (3-5 нм) за счет тиольной группы, а именно, за счет использования NHS-эфира флуоресцентного красителя Су5 с дигидрохлоридом цистамина с образованием дисульфидной связи и дальнейшей «сшивкой» с поверхностью золота при помощи тиольной группы. Принципиальная схема синтеза представлена на фиг. 2.

Общий размер наночастиц магнетит-золото вида «гантель» имеет размер 12-15 нм, за счет размера и формы последних достигается возможность нивелирования переноса энергии между ФФ и ФС, а также возможность совместного использование детекции платформы и активации синглетного кислорода для дальнейшего достижения терапевтического эффекта.

Предлагаемая структура является новой и не описана в патентной и научно-технической литературе.

Присоединение фотосенсибилизирующего агента может осуществляться в несколько этапов. Путем смешения 6 ммоль (51 мг) DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) с заранее приготовленным раствором 0,6 ммоль (24 мг) гидроксида натрия и 10 мл метанола, с последующим введением в раствор смеси 3 мг наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) и 7 мл гексана. Последующее выдерживание при перемешивании на водяной бане 6-8 часов и последующим охлаждением до комнатной температуры около 12 часов, затем модифицированные наночастицы очищают от избытка DOPAC методом центрифугирования, что позволяет достичь ковалентного покрытия поверхности магнетита DOPAC. Дальнейшая активация DOPAC происходит карбодиимидным методом путем поочередного добавления свежих водных растворов NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно в 500 мкг раствора модифицированных наночатиц DOPAC (C_(Fe)=1 мг/мл). Стоит отметить, что активированные модифицированные наночастицы сохраняют стабильность в течении 10-15 минут. Далее к полученному раствору добавить водный раствор 100 мкл PEG (полиэтиленгликоль с СООН группой) (С_ПЭГ=100 мкг/мл) с дальнейшим перемешиванием (12 ч) и очисткой на колонке от избытка PEG. Активация карбоксильной группы PEG на поверхности магнетита осуществляется карбодиимидным методом, описанным выше. Методом химической конъюгации к полученному раствору стабилизированных наночастиц добавляют раствор 15 мкл фотосенсибилизатора (из расчета 1 молекула ФС на 1 нм² Fe₃O₄, С(ФС)=1 мг/мл, р-ль ДМСО) с последующим перемешиванием (12 ч) очисткой на колонке.

Функционализация димерных НЧ Fe₃O₄-Au была основана на присоединении производного флуоресцентного красителя Су5, содержащего дисульфидную связь, к поверхности наночастиц Au. Для синтеза данного производного в пробирке на 2 мл смешивали раствор 4,1 мг NHS-эфира флуоресцентного красителя Су5 в 100 мкл ДМСО и раствор 0,8 мг дигидрохлорида цистамина в 900 мкл деионизованной воды. Полученную суспензию смешивали с помощью вихревого смесителя, затем в течение 1 часа перемешивали на шейкере и выдерживали 12 часов при температуре -18°С. Для связывания, полученного дисульфидного производного красителя Су5 (С=1 мг/мл, р-ль ДМСО) с модифицированными НЧ, смешивается 2 мл НЧ (Fe₃O₄-Au/ФС/DOPAC/PEG) с концентрацией 1 мг/мл и 200 мкл полученного красителя, смесь гомогенизируется с помощью ультразвуковой бани и выдерживается на шейкере 12 часов. Очистка от избытка красителя происходит с помощью центрифугирования (14500 об/мин) до образования светлой надосадочной жидкости. Стоит отметить, что для получения единичных НЧ и предотвращения слипания частицы ресуспендировали в дистиллированной воде при помощи ультразвукового щупа, для удаления несвязанного красителя аликвоту НЧ пропускают через центрифужные фильтры Amicon Ultra-4 (100 кДа), а затем проводят диализ (диализный мешок с диаметром пор 12-14 кДа) против воды в течение 24 ч.

Также следует отметить, что в предлагаемом способе и структуре можно использовать любые FRET-пары хромофоров, удовлетворяющих условиям.

Фотосенсибилизирующий агент должен содержать первичную аминогруппу в структуре, производное флуорофора должно содержать дисульфидную или тиольную группы. Максимум люминесценции ФФ должен находиться в спектральном диапазоне, где поглощение ФС минимально (для минимизации переноса энергии). Максимумы поглощения ФС и ФФ должны располагаться вблизи границ видимой и ИК (инфракрасной) области, что соответствует левой границы терапевтического окна прозрачности биологических тканей (600-1300 нм).

Преимущества предложенного способа и структуры иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

В трехгорлую круглодонную колбу объемом 250 мл поместили 2,584 г (10 ммоль) 1,2-гексадекандиола, добавили 1,9 мл (6 ммоль) олеиновой кислоты, 2 мл (6 ммоль) олеиламина и 20 мл (62,5 ммоль) 1-октадецена. Полученную смесь перемешивали в интенсивном потоке аргона при температуре 120°С в течение 20 минут.Затем уменьшили поток аргона, собрали систему с обратным холодильником и добавили 0,9 мл (6 ммоль) пентакарбонила железа. Через 3 минуты в раствор ввели смесь, состоящую из 40 мг (0,1 ммоль) HAuCl₄*(H₂O)₃, 0,5 мл (1,5 ммоль) олеиламина и 5 мл (14 ммоль) 1-октадецена, предварительно выдержанную в атмосфере аргона в течение 7 минут. Смесь нагревали со скоростью 25°С в минуту до температуры кипения (300-310°С) и выдерживали при данной температуре 45 минут. После этого полученный раствор охладили до комнатной температуры и подвергли окислению на воздухе в течение часа. Пример иллюстрируется фиг. 3, на которой приведены микрофотографии снятые методом ПЭМ, а также посчитаны гидродинамический диаметр золотой и магнитной частей (фиг. 4). Методом РФА проведен анализ синтезируемых наночастиц магнетит-золото вида «гантель» на наличие фазы магнетита и золота (фиг. 5).

Для очистки наночастиц от избытка 1-октадецена, олеиновой кислоты и олеинамина в колбу добавили 60 мл изопропанола и выдержали на ультразвуковой бане в течение 1 минуты. Суспензию разлили по 3 пробиркам и подвергли центрифугированию при скорости 6000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Надосадочную жидкость слили с помощью магнита, а осадок ресуспендировали в 2 мл гексана при помощи ультразвуковой бани, затем добавили по 30 мл изопропанола в каждую пробирку и центрифугировали в течение 10 минут. Данную процедуру повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не стала прозрачной. После полной очистки наночастиц осадок ресуспендировали в 20 мл гексана. Данный раствор можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре не выше +5°С.

Присоединение фотосенсибилизирующего агента. 6 ммоль (51 мг) DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) смешивают вначале с раствором 0,6 ммоль (24 мг) гидроксида натрия и 10 мл метанола, с последующим введением в раствор смеси 3 мг наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) и 7 мл гексана. Выдерживают при перемешивании на водяной бане 8 часов и охлаждают до комнатной температуры 12 часов. Раствор модифицированных наночастиц очищают от избытка DOPAC методом центрифугирования (2000 об/мин, 10 мин, ресуспензируем, 8000 об/мин, 10 мин.) 3 повтора. В очищенный раствор модифицированных наночатиц DOPAC (500 мкг, C_(Fe)=1 мг/мл) поочередного добавляем свежие водные растворы NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно, перемешиваем при помощи вихревого смесителя 30 минут. Активированные модифицированные наночастицы сохраняют стабильность в течении 10-15 минут. К полученному раствору добавить водный раствор 100 мкл PEG (полиэтиленгликоль с СООН группой) (Спэг=100 мкг/мл) с дальнейшим перемешиванием (12 ч) и очисткой на колонке (метод ВЖЭХ) от избытка PEG. К 1 мл полученного раствора наночастиц (С_(Fe)=1 мг/мл) поочередного добавляем свежие водные растворы NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно, перемешиваем при помощи вихревого смесителя 30 минут. К 500 мкл полученного раствора стабилизированных наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) добавляем раствор 15 мкл фотосенсибилизатора (из расчета 1 молекула ФС на 1 нм Fe₃O₄, С(ФС)=1 мг/мл, р-ль ДМСО), перемешивание на шейкере 12 часов, после очистка на колонке (метод ВЖЭХ).

Присоединении производного флуоресцентного красителя Су5. В пробирке на 5 мл смешивают 2 мл НЧ (Fe₃O₄-Au/ФС/DOPAC/PEG) (C_(Fe)=1 мг/мл) с раствором 0,8 мг дигидрохлорида цистамина в 900 мкл деионизованной воды, перемешивание на шейкере 60 минут, очистка на колонке (метод ВЖЭХ). К 3 мл полученного раствора (C_(Fe)=1 мг/мл) прибавляли 200 мкл раствора 4,1 мг NHS-эфира флуоресцентного красителя Су5 в 100 мкл ДМСО. Смесь гомогенизирует с помощью ультразвуковой бани и выдерживается на шейкере 12 часов. Очищали с помощью центрифугирования (14500 об/мин, 20 мин.) до образования светлой надосадочной жидкости. Аликвоту модифицированных НЧ пропускали через центрифужные фильтры Amicon Ultra-4 (100 кДа), а затем проводили диализ (диализный мешок с диаметром пор 12-14 кДа) против воды в течение 24 ч.

Полученные модифицированные наночастицы магнетита-золота хранят в водном растворе в закрытой стеклянной емкости при 5°С. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных НЧ без увеличения их гидродинамического размера составляет 5 месяцев.

Пример 2

В трехгорлую круглодонную колбу объемом 250 мл поместили 2,584 г (10 ммоль) 1,2-гексадекандиола, добавили 1,9 мл (6 ммоль) олеиновой кислоты, 2 мл (6 ммоль) олеиламина и 20 мл (62,5 ммоль) 1-октадецена. Полученную смесь перемешивали в интенсивном потоке аргона при температуре 120°С в течение 20 минут. Затем уменьшили поток аргона, собрали систему с обратным холодильником и добавили 0,9 мл (6 ммоль) пентакарбонила железа. Через 3 минуты в раствор ввели смесь, состоящую из 40 мг (0,1 ммоль) HAuCl₄*(H₂O)₃, 0,5 мл (1,5 ммоль) олеиламина и 5 мл (14 ммоль) 1-октадецена, предварительно выдержанную в атмосфере аргона в течение 7 минут. Смесь нагревали со скоростью 25°С в минуту до температуры кипения (300-310°С) и выдерживали при данной температуре 45 минут. После этого полученный раствор охладили до комнатной температуры и подвергли окислению на воздухе в течение часа. Были проведены аналогичные методы исследования, как и в примере 1.

Для очистки наночастиц от избытка 1-октадецена, олеиновой кислоты и олеинамина в колбу добавили 60 мл изопропанола и выдержали на ультразвуковой бане в течение 1 минуты. Суспензию разлили по 3 пробиркам и подвергли центрифугированию при скорости 6000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Надосадочную жидкость слили с помощью магнита, а осадок ресуспендировали в 2 мл гексана при помощи ультразвуковой бани, затем добавили по 30 мл изопропанола в каждую пробирку и центрифугировали в течение 10 минут. Данную процедуру повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не стала прозрачной. После полной очистки наночастиц осадок ресуспендировали в 20 мл гексана. Данный раствор можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре не выше +5°С.

Присоединение фотосенсибилизирующего агента. 6 ммоль (51 мг) DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) смешивают вначале с раствором 0,6 ммоль (24 мг) гидроксида натрия и 10 мл метанола, с последующим введением в раствор смеси 3 мг наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) и 7 мл гексана. Выдерживают при перемешивании на водяной бане 8 часов и охлаждают до комнатной температуры 12 часов. Раствор модифицированных наночастиц очищают от избытка DOPAC методом центрифугирования (2000 об/мин, 10 мин, ресуспензируем, 8000 об/мин, 10 мин.) 3 повтора. В очищенный раствор модифицированных наночатиц DOPAC (500 мкг, C_(Fe)=1 мг/мл) поочередного добавляем свежие водные растворы NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно, перемешиваем при помощи вихревого смесителя 30 минут. Активированные модифицированные наночастицы сохраняют стабильность в течении 10-15 минут. К полученному раствору добавить водный раствор 100 мкл PEG (полиэтиленгликоль с СООН группой) (С_ПЭГ=100 мкг/мл) с дальнейшим перемешиванием (12 ч) и очисткой на колонке (метод ВЖЭХ) от избытка PEG. К 1 мл полученного раствора наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) поочередного добавляем свежие водные растворы NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно, перемешиваем при помощи вихревого смесителя 30 минут.К 500 мкл полученного раствора стабилизированных наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) добавляем раствор 45 мкл фотосенсибилизатора (из расчета 1 молекула ФС на 1 нм² Fe₃O₄, С(ФС)=1 мг/мл, р-ль ДМСО, трехкратный избыток), перемешивание на шейкере 12 часов, после очистка на колонке (метод ВЖЭХ).

Присоединении производного флуоресцентного красителя Су5. В пробирке на 5 мл смешивают 2 мл НЧ (Fe3O4-Au/ФС/DOPAC/PEG) (C_(Fe)=1 мг/мл) с раствором 0,8 мг дигидрохлорида цистамина в 900 мкл деионизованной воды, перемешивание на шейкере 60 минут, очистка на колонке (метод ВЖЭХ). К 3 мл полученного раствора (C_(Fe)=1 мг/мл) прибавляли 200 мкл раствора 4,1 мг NHS-эфира флуоресцентного красителя Су5 в 100 мкл ДМСО. Смесь гомогенизирует с помощью ультразвуковой бани и выдерживается на шейкере 12 часов. Очищали с помощью центрифугирования (14500 об/мин, 20 мин.) до образования светлой надосадочной жидкости. Аликвоту модифицированных НЧ пропускали через центрифужные фильтры Amicon Ultra-4 (100 кДа), а затем проводили диализ (диализный мешок с диаметром пор 12-14 кДа) против воды в течение 24 ч.

Полученные модифицированные наночастицы магнетита-золота хранят в водном растворе в закрытой стеклянной емкости при 5°С. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных НЧ без увеличения их гидродинамического размера составляет 5 месяцев.

Пример 3

В трехгорлую круглодонную колбу объемом 250 мл поместили 2,584 г (10 ммоль) 1,2-гексадекандиола, добавили 1,9 мл (6 ммоль) олеиновой кислоты, 2 мл (6 ммоль) олеиламина и 20 мл (62,5 ммоль) 1-октадецена. Полученную смесь перемешивали в интенсивном потоке аргона при температуре 120°С в течение 20 минут. Затем уменьшили поток аргона, собрали систему с обратным холодильником и добавили 0,3 мл (2 ммоль) пентакарбонила железа. Через 3 минуты в раствор ввели смесь, состоящую из 40 мг (0,1 ммоль) HAuCl₄*(H₂O)₃, 0,5 мл (1,5 ммоль) олеиламина и 5 мл (14 ммоль) 1-октадецена, предварительно выдержанную в атмосфере аргона в течение 7 минут. Смесь нагревали со скоростью 25°С в минуту до температуры кипения (300-310°С) и выдерживали при данной температуре 45 минут. После этого полученный раствор охладили до комнатной температуры и подвергли окислению на воздухе в течение часа. Были проведены аналогичные методы исследования, как и в примере 1.

Для очистки наночастиц от избытка 1-октадецена, олеиновой кислоты и олеинамина в колбу добавили 60 мл изопропанола и выдержали на ультразвуковой бане в течение 1 минуты. Суспензию разлили по 3 пробиркам и подвергли центрифугированию при скорости 6000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Надосадочную жидкость слили с помощью магнита, а осадок ресуспендировали в 2 мл гексана при помощи ультразвуковой бани, затем добавили по 30 мл изопропанола в каждую пробирку и центрифугировали в течение 10 минут. Данную процедуру повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не стала прозрачной. После полной очистки наночастиц осадок ресуспендировали в 20 мл гексана. Данный раствор можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре не выше +5°С.

Присоединение фотосенсибилизирующего агента. 6 ммоль (51 мг) DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) смешивают вначале с раствором 0,6 ммоль (24 мг) гидроксида натрия и 10 мл метанола, с последующим введением в раствор смеси 3 мг наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) и 7 мл гексана. Выдерживают при перемешивании на водяной бане 8 часов и охлаждают до комнатной температуры 12 часов. Раствор модифицированных наночастиц очищают от избытка DOPAC методом центрифугирования (2000 об/мин, 10 мин, ресуспензируем, 8000 об/мин, 10 мин.) 3 повтора. В очищенный раствор модифицированных наночатиц DOPAC (500 мкг, C_(Fe)=1 мг/мл) поочередного добавляем свежие водные растворы NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно, перемешиваем при помощи вихревого смесителя 30 минут. Активированные модифицированные наночастицы сохраняют стабильность в течении 10-15 минут. К полученному раствору добавить водный раствор 100 мкл PEG (полиэтиленгликоль с СООН группой) (С_ПЭГ=100 мкг/мл) с дальнейшим перемешиванием (12 ч) и очисткой на колонке (метод ВЖЭХ) от избытка PEG. К 1 мл полученного раствора наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) поочередного добавляем свежие водные растворы NHS (С=0,25 мг/мл) и EDC (С=0,25 мг/мл) в количестве 12 мкл и 8 мкл соответственно, перемешиваем при помощи вихревого смесителя 30 минут. К 500 мкл полученного раствора стабилизированных наночастиц (C_(Fe)=1 мг/мл) добавляем раствор 100 мкл фотосенсибилизатора (из расчета 1 молекула ФС на 1 нм² Fe₃O₄, С(ФС)=1 мг/мл, р-ль ДМСО, шестикратный избыток), перемешивание на шейкере 12 часов, после очистка на колонке (метод ВЖЭХ).

Присоединении производного флуоресцентного красителя Су5. В пробирке на 5 мл смешивают 2 мл НЧ (Fe3O4-Au/ФС/DOPAC/PEG) (C_(Fe)=1 мг/мл) с раствором 0,8 мг дигидрохлорида цистамина в 900 мкл деионизованной воды, перемешивание на шейкере 60 минут, очистка на колонке (метод ВЖЭХ). К 3 мл полученного раствора (C_(Fe)=1 мг/мл) прибавляли 300 мкл (полуторакратный избыток) раствора 4,1 мг NHS-эфира флуоресцентного красителя Су5 в 100 мкл ДМСО. Смесь гомогенизирует с помощью ультразвуковой бани и выдерживается на шейкере 12 часов. Очищали с помощью центрифугирования (14500 об/мин, 20 мин.) до образования светлой надосадочной жидкости. Аликвоту модифицированных НЧ пропускали через центрифужные фильтры Amicon Ultra-4 (100 кДа), а затем проводили диализ (диализный мешок с диаметром пор 12-14 кДа) против воды в течение 24 ч.

Полученные модифицированные наночастицы магнетита-золота хранят в водном растворе в закрытой стеклянной емкости при 5°С. В этих условиях продолжительность хранения модифицированных НЧ без увеличения их гидродинамического размера составляет 5 месяцев.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ действительно описывает новую структуру и способ получения препарата для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики за счет возможности эффективного совмещения фотосенсибилизирующего и флуоресцентного агентов в одной системе и устранения таких нежелательных эффектов, как перенос энергии между хромофорами и относительная простота возбуждения последних, сохраняя нецитотоксисность, высокую фотостабильностью и чрезвычайную активность при возбуждении фотосенсибилизатора гибели раковых клеток.

Группа изобретений относится к препарату для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики, включающему димерные наночастицы магнетит-золото и FRET-пару хромофоров, таких как фотосенсибилизатор (ФС) бактериофеофорбидного ряда, представляющий собой метиловый эфир 131-(4-аминобутилкарбомоил) бактериохлорина и флуорофор (ФФ) цианинового ряда, представляющий собой производное Су5, содержащее дисульфидную связь, полученное смешиванием NHS-эфира Су5 с дигидрохлоридом цистамина, где ФС иммобилизован на стабилизируемой 3,4-дигидроксифенилуксусной кислотой (DOPAC) и полиэтиленгликолем (PEG) поверхности наночастиц магнетита размером 8-11 нм, ФФ иммобилизован на поверхности наночастиц золота размером 3-5 нм, причем размер наночастиц магнетит-золото составляет 12-15 нм и наночастицы имеют гантелевидную форму, и также относится к способу получения препарата для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики, включающему синтез димерных наночастиц магнетит-золото, где размер наночастиц составляет 12-15 нм и наночастицы имеют гантелевидную форму, путем совместного термического разложения Fe(CO)₅ и HAuCl₄ в органическом растворителе в атмосфере инертного газа в присутствии 1,2-гексадекандиола и органической кислоты с in situ, образующимися наночастицами Au, стабилизацию поверхности наночастиц магнетита, иммобилизацию FRET-парой хромофоров, отличающемуся тем, что при синтезе наночастиц смесь 1,2-гексадекандиола, олеиновой кислоты, олеиламина и 1-октадецена перемешивали в интенсивном потоке аргона при температуре 120°С в течение 20 минут, с последующим уменьшением потока аргона, подключив к системе обратный холодильник, добавляли 0,9 мл пентакарбонила железа, через 3 минуты в раствор вводили смесь, состоящую из 40 мг HAuCl₄*(H₂O)₃, 0,5 мл олеиламина и 5 мл 1-октадецена, предварительно выдержанную в атмосфере аргона в течение 7 минут до соломенно-желтого цвета раствора, далее смесь нагревали со скоростью 25°С в минуту до температуры кипения, составляющей 300-310°С, и выдерживали при данной температуре 45 минут, после этого полученный раствор охладили до комнатной температуры и подвергали окислению на воздухе в течение часа; поверхность наночастиц магнетита модифицировали фотосенсибилизирующим агентом (ФС) бактерифеофорбидного ряда, представляющим собой метиловый эфир 131-(4-аминобутилкарбомоил)бактериохлорина, за счет химической конъюгации со стабилизированной DOPAC и PEG поверхностью магнетита с очисткой методами центрифугирования и ВЖЭХ; поверхность наночастиц золота модифицировали флуорофором (ФФ) цианинового ряда, из расчета десятикратного избытка флуорофора относительно количества наночастиц, за счет ковалентной связи с поверхностью золота с очисткой методами центрифугирования, ВЖЭХ и диализа, где флуорофор (ФФ) цианинового ряда представляет собой производное Су5, содержащее дисульфидную связь, полученное смешиванием NHS-эфира Су5 с дигидрохлоридом цистамина. Группа изобретений обеспечивает эффективное совмещение двух хромофоров с нивелированием нежелательных эффектов (переноса энергии) на поверхности наночастиц магнетит-золото для создания успешных агентов нового поколения (с возможностью совместного использования) в тераностики рака. 2 н. и 1 з.п., 5 ил., 3 пр.

1. Препарат для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики, включающий димерные наночастицы магнетит-золото и FRET-пару хромофоров, таких как фотосенсибилизатор (ФС) бактериофеофорбидного ряда, представляющий собой метиловый эфир 131-(4-аминобутилкарбомоил) бактериохлорина, и флуорофор (ФФ) цианинового ряда, представляющий собой производное Су5, содержащее дисульфидную связь, полученное смешиванием NHS-эфира Су5 с дигидрохлоридом цистамина, где ФС иммобилизован на стабилизируемой 3,4-дигидроксифенилуксусной кислотой (DOPAC) и полиэтиленгликолем (PEG) поверхности наночастиц магнетита размером 8-11 нм, ФФ иммобилизован на поверхности наночастиц золота размером 3-5 нм, причем размер наночастиц магнетит-золото составляет 12-15 нм и наночастицы имеют гантелевидную форму.

2. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что на 1 нм² поверхности наночастиц магнетита приходится 1 молекула фотосенсибилизатора (ФС).

3. Способ получения препарата для фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики по любому из пп.1, 2, включающий синтез димерных наночастиц магнетит-золото, где размер наночастиц составляет 12-15 нм и наночастицы имеют гантелевидную форму, путем совместного термического разложения Fe(CO)₅ и HAuCl₄ в органическом растворителе в атмосфере инертного газа в присутствии 1,2-гексадекандиола и органической кислоты с in situ, образующимися наночастицами Au, стабилизацию поверхности наночастиц магнетита, иммобилизацию FRET-парой хромофоров, отличающийся тем, что при синтезе наночастиц смесь 1,2-гексадекандиола, олеиновой кислоты, олеиламина и 1-октадецена перемешивали в интенсивном потоке аргона при температуре 120°С в течение 20 минут, с последующим уменьшением потока аргона, подключив к системе обратный холодильник, добавляли 0,9 мл пентакарбонила железа, через 3 минуты в раствор вводили смесь, состоящую из 40 мг HAuCl₄*(H₂O)₃, 0,5 мл олеиламина и 5 мл 1-октадецена, предварительно выдержанную в атмосфере аргона в течение 7 минут до соломенно-желтого цвета раствора, далее смесь нагревали со скоростью 25°С в минуту до температуры кипения, составляющей 300-310°С, и выдерживали при данной температуре 45 минут, после этого полученный раствор охладили до комнатной температуры и подвергали окислению на воздухе в течение часа; поверхность наночастиц магнетита модифицировали фотосенсибилизирующим агентом (ФС) бактерифеофорбидного ряда, представляющим собой метиловый эфир 131-(4-аминобутилкарбомоил)бактериохлорина, за счет химической конъюгации со стабилизированной DOPAC и PEG поверхностью магнетита с очисткой методами центрифугирования и ВЖЭХ; поверхность наночастиц золота модифицировали флуорофором (ФФ) цианинового ряда, из расчета десятикратного избытка флуорофора относительно количества наночастиц, за счет ковалентной связи с поверхностью золота с очисткой методами центрифугирования, ВЖЭХ и диализа, где флуорофор (ФФ) цианинового ряда представляет собой производное Су5, содержащее дисульфидную связь, полученное смешиванием NHS-эфира Су5 с дигидрохлоридом цистамина.