СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОПРОЛИФЕРАТИВНОГО ФАКТОРА (ФАКТОРА СТАРЕНИЯ) У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2018 года по МПК C12N5/73 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Изобретение основано на использовании не специализированных клеток млекопитающих для определения цитопролиферативного фактора (фактора старения). Изобретение может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни млекопитающих, в частности собак и кошек, путем определения в сыворотках крови цитопролиферативного фактора (фактор старения - ФС) с использованием неспециализированных сингенных клеток. При этом ФС у собак определяют с использованием клеток MDCK (клетки, полученные из почки собаки), стволовых клеток костного мозга собак, клеток глиального происхождения или нейронов собак (первично трипсинизированных или перевиваемых). У кошек ФС определяют на эмбриональных фибробластах кошки или на клетках глиального происхождения или нейронах кошек (первично трипсинизированных или перевиваемых). Клетки рассевают в 24-луночные планшеты в концентрации 50000 клеток в 1 мл в объеме 900 мкл в лунку и в те же лунки добавляют по 100 мкл прогретой сыворотки в 3 повторах. Планшеты инкубируют 96 часов при 37°C. После инкубации из каждой лунки отбирают надосадок и в лунку добавляют по 200 мкл смеси версена с химопсином. После сползания клеток добавляют надосадок и среду до 1000 мкл. Подсчет клеток производят с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток Scepter™ Millipore™ (Германия). Фактор старения рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению: количество клеток в опыте/количество клеток в контроле. Способ позволяет определить наличие цитопролиферативного фактора в организме млекопитающего, в частности собак и кошек, при их жизни.

Несколько лет назад в ткани головного мозга стареющих мышей был обнаружен фактор, резко стимулирующий пролиферацию глиальных клеток в культуре [1]. Такой цитопролиферативный фактор был обнаружен в сыворотке крови стареющих мышей и стареющих людей. Он накапливается, начиная с конца первой трети средней продолжительности жизни животных и людей с последующим прогрессивным нарастанием его активности. В результате активной пролиферации глиальных клеток формируются два кардинальных признака процесса старения мозга млекопитающих - гибель нейронов и глиоз. Причинная роль фактора в процессе старения доказана опытами ускоренного искусственного старения молодых мышей после введения им мозговых экстрактов или сыворотки крови старых животных [3]. В этих условиях у мышей уже к 5-у месяцу их жизни регистрировалось быстрое и повышенное накопление в крови указанного фактора и развитие клинических признаков старения - вялость движений, вялая реакция на пищу и поседение (мыши линии C57Black/6). Более того, морфометрический анализ головного мозга таких 5-месячных мышей позволил обнаружить у них кардинальные морфологические признаки старения - выраженный глиоз и резко выраженную гибель нейронов [4]; [5].

Поэтому обнаруженный цитопролиферативный фактор был обозначен как «фактор старения». Он отличается видовой специфичностью действия, низкой молекулярной массой (около 10 кД), устойчивостью к повышенной температуре, трипсину, ультразвуку, ультрафиолету и высокой чувствительностью к протеазе К. Подобный фактор обнаруживается в сыворотке крови людей, начиная с их 25-летнего возраста с последующим увеличением его концентрации с возрастом [4], [5].

Широкое распространение домашних животных среди населения сопровождается естественным желанием владельцев увеличить продолжительность жизни своих питомцев, используя для этого различные схемы кормления или имеющиеся в продаже препараты. Для объективной оценки эффективности принимаемых мер может быть использован способ по настоящему изобретению.

Из уровня техники известен способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека, характеризующийся тем, что прижизненно берут сыворотку крови, прогревают ее 30 мин при 90°C, центрифугируют для удаления свернувшихся белков, добавляют к надосадочной жидкости сингенные клетки в виде первичных или перевиваемых культур и инкубируют 72-96 ч при 37°C в атмосфере CO₂ с последующим подсчетом клеток в камере Горяева [2].

Указанный способ является ближайшим аналогом заявленного изобретения.

Как показали исследования по определению цитопролиферативного фактора (фактор старения, ФС), в сыворотках крови собак и кошек с использованием разных клеточных линий, эффективность определения ФС у собак и кошек, зависит от происхождения клеточных культур. Неожиданно было обнаружено, что ФС наиболее эффективно определять с использованием неспециализированных сингенных клеток, у собак, например, с использованием клеток MDCK (клетки, полученные из почки собаки) или стволовых клеток костного мозга собак, а у кошек, например, на клетках эмбриональных фибробластах кошки, в частности на клетках СС-81.

Техническим результатом является повышение эффективности - точности диагностирования цитопролиферативного фактора в организме млекопитающих, в частности собак и кошек, при жизни. То есть точно диагностировать увеличивают ли продолжительность жизни питомцев, используемые для этого схемы кормления или препараты.

Заявленный способ отличается от ближайшего аналога использованием именно не высоко неспециализированных клеток, а также снижением температуры прогрева сыворотки с 90 до 60°C. Неожиданно было установлено, что данные признаки влияют на повышение точности диагностики цитопролиферативного фактора.

Примеры

Животные. Обследовано 16 кошек и 20 собак разного возраста (ветеринарная клиника «Рыжий лис»).

Пробы сывороток. Пробы свернувшейся крови животных доставлялись из ветеринарной клиники «Рыжий лис». Кровь центрифугировали при 1500g 15 минут. Отобранную сыворотку разводили в 10 раз средой 199 и прогревали на водяной бане 30 минут при 60°C. После повторного центрифугирования при 1500g в течение 15 минут надосадок хранили при температуре -20°C.

Культуры клеток. В работе использовали культуры клеток: собаки MDCK (почка собаки) и Cf2Th (тимус собаки), а также кошки СС81 (эмбриональные фибробласты кошки) и CRFK (почка кошки), полученные из музея клеточных культур Института вирусологии им. Д.И. Ивановского Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ. Кроме того, использовали стволовые клетки собаки, полученные из отдела иммунологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» от доктора медицинских наук Р.К. Чайлахяна.

Питательные среды и растворы. Клетки культивировали в питательной среде Игла MEM (производства ПИПВЭ им. М.П. Чумакова, Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, South America). Для разведения сыворотки использовали ту же среду. Для обработки клеток использовали 0,02% раствор версена (ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) и раствор химопсина из расчета 0,1 мг/мл (ООО Самсон-мед, Россия).

Определение фактора старения. Клетки рассевали в 24-луночные планшеты в концентрации 50000 клеток в 1 мл в объеме 900 мкл в лунку и в те же лунки добавляли по 100 мкл прогретой сыворотки в 3 повторах. Планшеты инкубировали 96 часов при 37°C. После инкубации из каждой лунки отбирали надосадок и в лунку добавляли по 200 мкл смеси версена с химопсином. После сползания клеток добавляли надосадок и среду до 1000 мкл. Подсчет клеток производили с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток Scepter™ Millipore™ (Германия).

Фактор старения рассчитывали по индексу пролиферации, т.е. по соотношению: количество клеток в опыте/количество клеток в контроле [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В первой серии использовали 20 сывороток собак разного возраста и разных пород (табл. 1).

Результаты определения фактора старения животных с использованием культуры клеток почки собак (MDCK) отдельно представлены на фиг. 1. Как видно из данных фиг. 1, у большинства животных в возрасте до 6 лет не удается обнаруживать фактор старения, в то время как он определяется у животных более старшего возраста. Однако у молодых животных мы наблюдали 2 исключения (фиг. 1), что может свидетельствовать либо об ускоренном старении данных особей, либо, наоборот, об особо интенсивном накоплении фактора старения у собак данной породы, у которых даже в молодом возрасте уровень фактора старения является несколько повышенным, в то время как к старости он может быть еще более высоким. Из 10 особей старшей возрастной группы у 8 - уровень фактора старения оказался значительно повышен, однако у двух животных - 8-и и 12-и лет - фактор старения обнаружить не удалось (фиг. 1).

Испытания сывороток этой же группы собак на культуре клеток тимуса собак (Cf2Th) практически оказались неэффективными (табл. 2).

В третьей части этого раздела обследовали сыворотки крови собак с использованием культуры стволовых клеток собак. С этой целью были использованы 8 из оставшегося набора сывороток (табл. 3).

Пять животных были старше 6-летнего возраста и 3 - моложе этого возраста. Характерно, что показатели фактора старения у 5 животных и при использовании культуры клеток MDCK, и при использовании культуры стволовых клеток практически совпадали (табл. 4).

Вместе с тем, в группе собак старше 6 лет также регистрировались показатели ниже таковых в контроле (фиг. 2).

Также были испытаны 16 сывороток крови кошек разного возраста и разных пород. Результаты определения фактора старения животных с использованием культуры фибробластов эмбриона кошки (СС81) представлены в табл. 5.

Как видно из данных таблицы 5, у 8 кошек породы «британ» фактор старения не определялся вне зависимости от их возраста. Вместе с тем, у остальных 8 кошек породы «метис», «скотишфолд», «священная бирма» и «бенгал» накопление фактора старения оказывалось характерным для млекопитающих в зависимости от возраста, т.е. с постепенным нарастанием активности в раннем возрасте с последующим снижением ее при вхождении животных в более зрелый возраст (фиг. 3).

Несколько сходные результаты получены при обследовании сывороток кошек с использованием культур клеток почки кошки (CRFK) (фиг. 4, табл. 6).

Как видно из данных фиг. 4 и табл. 6, у животных породы «британ», так же как и при использовании культуры клеток СС81, фактор старения не определялся вне зависимости от возраста кошек. В то же время у кошек других пород («метис», «скотишфолд», «священная бирма» и «бенгал») в возрасте от 1,5 до 5 лет фактор старения определялся.

Анализ результатов определения фактора старения у собак с большой вероятностью свидетельствует об определенной закономерности, связанной с появлением фактора в сыворотке крови животных после 6-летнего возраста (фиг. 1 и 2). При этом, конечно, нельзя не отметить единичных случаев определения повышенных значений фактора у животных в молодом возрасте, что наблюдали у 15% животных при использовании культуры клеток MDCK и у 12,5% животных при использовании культуры стволовых клеток.

Ранее результаты определения фактора старения у мышей показали, что достаточно эффективными оказываются культуры, представляющие собой эмбриональные фибробласты того же животного (Зуев и др., 2000 [1]). Именно поэтому в представленных результатах наиболее демонстративная динамика накопления фактора старения в сыворотках кошек различного возраста представлена (хотя и на примере небольшой выборки) при использовании культуры клеток СС81 - эмбриональных фибробластов кошки (фиг. 3). Использование культур высокоспециализированных клеток не позволяет рассчитывать на положительный результат, как это, например, мы наблюдали при использовании культуры клеток CRFK - почка кошки, или культуры клеток Cf2Th - тимус собаки.

Таким образом, не смотря на то, что порода животных играет определенную роль, однако заявленный способ применим к большинству пород для достоверно прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) в организме.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови собак с использованием культуры клеток MDCK

Фиг. 2. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови собак с использованием культуры стволовых клеток костного мозга собак

Фиг. 3. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови кошек с использованием культуры клеток СС-81

Фиг. 4. Определение цитопролиферативного фактора в сыворотках крови кошек с использованием культуры клеток CRFK

Примечание для фиг. 1, 2, 3, 4: ось абсцисс - возраст животных (год), ось ординат - цитопролиферативный фактор (Ед)

Список литературы

1. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П., Игнатова Н.Г., Быковская С.И., Халанский А.С. - Накопление в стареющем мозге млекопитающих фактора, резко стимулирующего пролиферативную активность глии // Бюл. экспер. биол и мед., 2000, т. 129, №3, с. 317-320.

2. Зуев В.А., Игнатова Н.Г. - Способ прижизненного определения цитопролиферативного фактора в организме стареющих млекопитающих и человека // Патент №2204135 от 10.05.2003 г.

3. Зуев В.А., Автандилов Г.Г., Игнатова Н.Г., Быковская С.И. - Искусственное старение мышей // Бюл. экспер. биол. и мед., 2003, т. 135, №9, с. 325-327.

4. Зуев В.А., Игнатова Н.Г., Автандилов Г.Г. - Накопление фактора старения в организме млекопитающих, включая человека // Успехи геронтологии - 2005, вып. 17, с. 108-116.

5. Zuev V.A., Mezentseva M.V., Schaposchnikova G.M. - Apotential new biological marker of the biological age // Frontiers in Genetics, 2013, vol. 4, P. 1-3.05.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у млекопитающего, исключая человека, способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собаки и способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у кошки. В одном из вариантов способ включает в себя стадии: получение сыворотки крови при помощи центрифугирования, разведение и прогрев на водяной бане 30 минут при 60°С, с последующим повторным центрифугированием; инкубация сыворотки в течение 96 часов при 37°С неспециализированных сингенных клеток; добавление смеси версена с химопсином; подсчет клеток. Изобретение расширяет арсенал способов прогнозирования продолжительности жизни млекопитающих, в частности собак и кошек, путем определения в сыворотках крови цитопролиферативного фактора с использованием неспециализированных сингенных клеток. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 1 пр.

1. Способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у млекопитающего, исключая человека, включающий:

- получение сыворотки крови, для чего кровь центрифугируют, затем отобранную сыворотку разводят и прогревают на водяной бане 30 минут при 60°С, после осуществляют повторное центрифугирование;

- использование полученной сыворотки для инкубации в течение 96 часов при 37°С неспециализированных сингенных клеток;

- добавление смеси версена с химопсином;

- осуществление после сползания клеток их подсчета, при этом цитопролиферативный фактор (фактор старения) рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению количество клеток в опыте/количество клеток в контроле, где индекс более единицы указывает на наличие цитопролиферативного фактора (фактора старения), при этом, чем выше индекс, тем больше присутствует в организме цитопролиферативного фактора (фактора старения).

2. Способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора у собак, включающий:

- получение сыворотки крови, для чего кровь центрифугируют, затем отобранную сыворотку разводят и прогревают на водяной бане 30 минут при 60°С, после осуществляют повторное центрифугирование;

- использование полученной сыворотки для инкубации в течение от 24 часов до 8 суток при 37°С культуры клеток MDCK (клетки, полученные из почки собаки), стволовых клеток костного мозга собак, клеток глиального происхождения или нейронов собак (первично трипсинизированных или перевиваемых);

- добавление смеси версена с химопсином;

- осуществление после сползания клеток их подсчета, при этом цитопролиферативный фактор рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению количество клеток в опыте/количество клеток в контроле, где индекс более единицы указывает на наличие цитопролиферативного фактора (фактора старения), при этом, чем выше индекс, тем больше присутствует в организме цитопролиферативного фактора.

3. Способ прижизненного определения уровня цитопролиферативного фактора (фактора старения) у кошек, включающий:

- получение сыворотки крови, для чего кровь центрифугируют, затем отобранную сыворотку разводят и прогревают на водяной бане 30 минут при 60°С, после осуществляют повторное центрифугирование;

- использование полученной сыворотки для инкубации в течение от 24 часов до 8 суток при 37°С культуры клеток эмбриональных фибробластов кошки, клеток глиального происхождения или нейронов кошек (первично трипсинизированных или перевиваемых);

- добавление смеси версена с химопсином;

- осуществление после сползания клеток их подсчета, при этом цитопролиферативный фактор (фактора старения) рассчитывают по индексу пролиферации, т.е. по соотношению количество клеток в опыте/количество клеток в контроле, где индекс более единицы указывает на наличие цитопролиферативного фактора, при этом, чем выше индекс, тем больше присутствует в организме цитопролиферативного фактора (фактора старения).

4. Способ по пп. 1-3, где сыворотку разводят предпочтительно в 10 раз средой 199.

5. Способ по пп. 1-3, где сыворотку получают центрифугированием при 1500g 15 минут свернувшейся крови.

6. Способ по пп. 1-3, где повторное центрифугирование осуществляют при 1500g 15 минут.

7. Способ по пп. 1-3, где используют 0,02% раствор версена.

8. Способ по пп. 1-3, где клетки рассевают в 24-луночные планшеты в концентрации 50000 клеток в 1 мл в объеме 900 мкл в лунку и в те же лунки добавляют по 100 мкл прогретой сыворотки в 3 повторах, а после инкубации из каждой лунки отбирают надосадок и в лунку добавляют по 200 мкл смеси версена с химопсином, после сползания клеток добавляют надосадок и среду до 1000 мкл.