ХИМЕРНОЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО НН1 ПРОТИВ CD-37 Российский патент 2018 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N5/10 C12N15/63 A61K39/395 A61K51/10 A61P35/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммунотерапии и радиоиммунотерапии гемабластозов химерным или гуманизированным антителом с неожиданно высокой цитотоксичностью, а также к различным применениям антител.

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к химерным и гуманизированным антителам против CD37, а также к их получению и применению.

Настоящее изобретение также относится к иммунотерапии и радиоиммунотерапии, которые основаны на элиминации B-клеток.

В частности, настоящее изобретение относится к молекулам антител против CD-37 для применения в таком лечении, например, лечении B-клеточных злокачественных образований и аутоиммунных состояний.

Иммунотерапия с применением моноклональных антител (mAbs) зародилась как безопасный и избирательный способ лечения рака и других заболеваний.

В частности, роль моноклональных антител в терапии, которая основана на элиминации B-клеток, например, при лечении B-клеточных злокачественных новообразований, расширилась после введения ритуксимаба, антитела, которое направлено против антигена CD20 на поверхности B-клеток.

Антиген CD37 - это антиген клеточной поверхности, который не рассматривался в качестве мишени при B-клеточных злокачественных новообразованиях в той же степени, как антиген B-клеток CD20.

CD37, член суперсемейства тетраспанинов, является в значительной степени гликозилированной молекулой клеточной поверхности с четырьмя трансмембранными доменами и двумя внеклеточными петлями.

Экспрессия CD37 наблюдается в нормальных B-клетках, при неходжкинской лимфоме (NHL), в том числе при лимфоме из клеток мантийной зоны (MCL), лимфоме Беркитта (BL), лимфоме малых лимфоцитов (SLL) и фолликулярной лимфоме (FL), лимфоме из клеток маргинальной зоны (MZL), диффузной B-клеточной лимфоме (DLBCL), лимфоплазмоцитарной лимфомы (LL) и хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL).

Такой паттерн экспрессии делает CD37 привлекательной мишенью для терапии рака, опосредованной антителом.

CD37 был впервые описан в 1986 году и характеризуется моноклональным антителом мыши MB-1 (Link et al., 1986).

Физиологическая роль CD37 неизвестна.

Связывание специфичного к CD37 моноклонального анттела (mAb) с раковыми клетками может запускать различные механизмы: Во-первых, после связывания антитела с внеклеточным доменом антигена CD37 может активироваться каскад реакций комплемента и лизис клетки-мишени.

Во-вторых, антитело против CD37 может опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в клетке-мишени, которая происходит после того, как Fc часть связанного антитела распознается соответствующими рецепторами на цитотоксических клетках иммунной системы.

B-третьих, антитело может изменить способность B-клеток реагировать на антиген или другие стимулы.

Наконец, антитело против CD37 может инициировать запрограммированную гибель клеток (апоптоз).

mAb против CD37 MB-1 оценивали в двух радиоиммунотерапевтических испытаниях на больных B-NHL (B-клеточная неходжкинская лимфома;. Press et al., 1989; Kaminski et al., 1992).

В других работах также раскрыты моноклональные антитела против CD37, которые демонстрируют потенциал (например, WO 2009/019312 Heider et al., и WO 2011/092295 авторов настоящего изобретения), но необходимо пройти еще долгий путь, прежде чем будет доказано, что CD37 является идеальной альтернативой CD20 для лечения B-клеточных злокачественных новообразований.

В заключение было показано, что антиген CD37 часто экспрессируется на опухолевых клетках при нескольких B-клеточных злокачественных новообразованиях человека и на нормальных зрелых B-лимфоцитах и, таким образом, терапия на основе антитела против CD37 может быть перспективным подходом для лечения B-клеточных злокачественных новообразований.

Хотя антитела против CD37 или подобные антителам молекулы, как описано выше (например, MB-1), показали противоопухолевую эффективность на B-клеточных злокачественных новообразованиях и способность поражать CD37, существует потребность в альтернативных антителах против CD37 для улучшения лекарственных средств, основанных на элиминации B-клеток.

Таким образом, улучшенное антитело против CD37 было бы полезно для создания новых способов лечения B-клеточных злокачественных новообразований

Краткое описание изобретения

Объект настоящего изобретения относится к химерному или гуманизированному антителу, полученному из моноклонального антитела мыши HH1.

В частности, объектом настоящего изобретения является обеспечение химерного или гуманизированного антитела.

Один аспект настоящего изобретения относится к молекуле антитела, которое связывается с CD37 человека и которое является производным от a) моноклонального антитела мыши, которое определяется i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; и ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или от б) антитела, не являющегося антителом человека, распознающим тот же эпитоп CD37 человека, что и антитело, определенное в а) или распознающим эпитоп, который близок или перекрывается с указанным эпитопом; причем указанная молекула антитела представляет собой химерное или гуманизированное антитело.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к молекуле ДНК, кодирующей антитела согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, несущей одну или более молекул ДНК, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения антитела согласно настоящему изобретению, включающему трансфекцию клетки-хозяина млекопитающего одним или более векторами, кодирующими антитела согласно настоящему изобретению, культивирование клетки-хозяина и выделение и очистку молекулы антитела.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента одно или несколько антител согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для применения при лечении B-клеточных злокачественных новообразований.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего от B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни, включающему введение указанному пациенту эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату, который связывает CD37 человека, содержащему: а) антитело согласно настоящему изобретению, б) линкер, в) радионуклид, выбранный из группы, состоящей из ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc и ¹⁷⁷Lu.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей радиоиммуноконъюгат, описанный выше.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, описанной выше, для применения при лечении B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни, включающему введение эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору для получения радиоиммуноконъюгата согласно настоящему изобретению, содержащему два или более флаконов, где один флакон содержит конъюгат, содержащий хелатирующий агент, связанный с антителом согласно настоящему изобретению; а второй флакон содержит радионуклид.

Кроме того аспектом изобретения является применение химерных антител для блокирования антигена CD37 в нормальных тканях перед применением меченного радиоактивным изотопом антитела мыши или химерного HH1 для терапии.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показана точечная диаграмма проточной цитометрии при пропускании клеток Daudi и гистограмма для связывания chHH1.1 (изотип IgG1) против CD37 и отсутствия связывания антитела против NIP (отрицательный контроль). Фигура 1 демонстрирует значительное связывание chHH1 с антигеном.

На фигуре 2 показано связывание chHH1.1 с клетками лимфомы линии Daudi. Она демонстрирует быстрое и эффективное связывание с мишенью.

Фигура 3 показывает, что chHH1 имеет аналогичную ADCC, что и ритуксимаб, несмотря на меньшее количество антигенов, и значительную интернализацию CD37 целевыми клетками лимфомы линии Daudi.

Фигура 4 иллюстрирует ADCC на РВМС, стимулированных IL-2, в качестве эффекторных клеток, и клетках Rec-1 в качестве клеток-мишеней в трех различных соотношениях эффектора и клеток-мишеней. Средние и SD для трех индивидуумов.

На фигуре 5 показана CDC с 10% сывороткой на трех индивидуумах для клеток Rec-1, меченных HH1 мыши, ритуксимабом, chHH1.1 или комбинацией ритуксимаба и chHH1.1.

Фигура 6 показывает биораспределение (% I.D./г) ¹²⁵I-chHH1.3 в женских особях голых мышей через 24 и 48 часов после инъекции.

Фигура 7 показывает процент специфического лизиса из-за ADCC в клетках Daudi с NK-клетками в качестве эффекторных. Кровь брали у двух индивидуумов, и один эксперимент проводили с соотношением NK-клеток на 1 клетку Daudi, а другой эксперимент с соотношением 15:1.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к гуманизированным или химерным антителам, полученным из моноклонального антитела мыши HH1.

Гуманизированные или химерные антитела представляют собой антитела из видов, отличных от человека, чьи аминокислотные последовательности были изменены, чтобы увеличить их сходство с вариантами антител, естественно образующимися в организме человека.

Процесс «гуманизации» обычно применяют к моноклональным антителам, разработанным для введения человеку.

Гуманизация может быть необходима, когда процесс разработки специфических антител включает их образование в нечеловеческой иммунной системе (например, в организме мыши).

Белковые последовательности антител, полученных таким образом, частично отличаются от гомологичных антител, естественно образующихся в организме человека, и поэтому являются потенциально иммуногенными при введении человеку.

Не все моноклональные антитела, предназначенные для введения человеку, нужно гуманизировать, так как многие способы лечения являются краткосрочными.

Гуманизация, как правило, рассматривается отдельно от создания химерных антител мышь-человек.

Таким образом, хотя химерное антитело обычно создают для получения антител, более подобных антителам человека (путем замены Fc области антитела мыши, на такую же область из антитела человека) простые химеры такого типа обычно не упоминаются как гуманизированные.

До некоторой степени белковая последовательность гуманизированного антитела, по существу, идентична человеческому варианту, несмотря на нечеловеческое происхождение некоторых из ее участков определяющих комплементарность (CDR), ответственных за способность антитела связываться с его антигеном-мишенью.

Тем не менее, в настоящем контексте термин химерное антитело и гуманизированное антитело используются взаимозаменяемо, как относящиеся к антителу, которое было создано с помощью генной инженерии и получено из моноклонального антитела мыши HH1.

Химерные или гуманизированные антитела, полученные из моноклонального антитела HH1

Тяжелой цепью иммуноглобулина (IgH) является большая полипептидная субъединица антитела (иммуноглобулина).

Типичное антитело состоит из двух тяжелых цепей иммуноглобулина (Ig) и двух легких цепей Ig.

Существует несколько различных типов тяжелой цепи, которые определяют класс или изотип антитела.

Эти типы тяжелой цепи варьируют у различных животных.

Легкая цепь иммуноглобулина является малой полипептидной субъединицей антитела (иммуноглобулина).

У человека есть два типа легких цепей (как и у других млекопитающих), каппа (κ) цепь, кодируемая в каппа-локусе иммуноглобулина на хромосоме 2, и лямбда (λ) цепь, кодируемая в лямбда локусе иммуноглобулина на хромосоме 22.

Антитела производят B-лимфоциты, каждый из которых экспрессирует только один класс легкой цепи.

Будучи полученным однажды, класс легкой цепи остается фиксированным в течение всего срока жизни B-лимфоцита.

У здоровых индивидуумов общее соотношение каппа к лямбда составляет примерно 2:1 в сыворотке крови (измерение общих интактных антител) или 1:1,5, если измерять свободные легкие цепи, сильно отличающееся соотношение свидетельствует о новообразовании.

Точное нормальное соотношение каппа к лямбда находится в диапазоне от 0,26 до 1,65.

Количество и каппа, и лямбда цепей может увеличиваться пропорционально, поддерживая нормальное соотношение.

И вариабельные, и константные цепи химерного или гуманизированного антитела, полученного из моноклонального антитела мыши HH1, могут отличаться от известных последовательностей.

Примеры таких отличий ясны из настоящего изобретения и включают выбор константных цепей, генетические вариации вариабельных цепей и вариации Fc домена, для модулирования эффекторных функций.

Авторы настоящего изобретения используют генноинженерные химерные, гуманизированные антитела, полученные из моноклонального антитела мыши HH1.

Эти антитела демонстрируют перспективный эффект для поиска оптимального лечения связанных с B-клетками злокачественных новообразований.

Эти эффекты проявляются в экспериментах настоящего изобретения.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к молекуле антитела, которое связывается с CD37 человека и которое является производным от а) моноклонального антитела мыши, которое определяется i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; и ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или от б) антитела, не являющегося антителом человека, распознающим тот же эпитоп CD37 человека, что и антитело, определенное в а) или распознающим эпитоп, который близок или перекрывается с указанным эпитопом; причем указанная молекула антитела представляет собой химерное или гуманизированное антитело.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является химерное антитело, характеризующееся i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1; ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, iii) константными тяжелыми и легкими цепями, которые имеют человеческое происхождение.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является химерное антитело, характеризующееся i) константной областью тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из цепей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и ii) константной областью легкой цепи, представляющей собой каппа или лямбда цепь.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является константная область тяжелой цепи, которая определяется как i) содержащая аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7, и в которой константная область легкой цепи ii) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является константная область тяжелой цепи, которая определяется как i) содержащая аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11 и/или SEQ ID NO: 14, и где константная область легкой цепи ii) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.

Последовательность ДНК полноразмерной тяжелой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 10.

Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи Fc chHH1.3 представлена в SEQ ID NO: 11.

Последовательность ДНК полноразмерной тяжелой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 12.

Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 13.

Последовательность Fc chHH1.3 без мутации (константная область) представлена в SEQ ID NO: 14.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению

Процесс гуманизации основан на том, что получение моноклональных антител может быть осуществлено с применением рекомбинантной ДНК, чтобы создать конструкции, способные к экспрессии в культуре клеток млекопитающих.

То есть, участки генов, способные продуцировать антитела, выделяют и клонируют в клетки, которые могут быть выращены в резервуаре так, что антитела, образованные на основе ДНК клонированных генов, могут быть собраны en masse.

Этап с участием рекомбинантной ДНК обеспечивает удобный момент, который может быть легко использован для изменения аминокислотной последовательности экспрессируемого антитела.

Поэтому изменения в структуре антитела, полученные в процессе гуманизации, осуществляются с помощью методик на уровне ДНК.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к молекуле ДНК, кодирующей гуманизированные или химерные антитела согласно настоящему изобретению.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является молекула ДНК, кодирующая кодирующую область вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного или химерного антитела согласно настоящему изобретению.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является кодирующая область вариабельной области тяжелой цепи, слитая с областью, кодирующей константную область тяжелой цепи человеческого происхождения.

Такая константная область тяжелой цепи человека может быть выбрана из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является IgG1, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является тяжелая цепь IgG3, кодируемая последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является легкая цепь IgG3, кодируемая последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является IgG3 с мутационной заменой H435, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение включает константные области тяжелой цепи человека с одной или несколькими заменами в Fc области.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к молекуле ДНК, содержащей участок, кодирующий вариабельную область легкой цепи химерного или гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению.

Такой участок, кодирующий вариабельную область легкой цепи, может быть слит с областью, кодирующей константную область легкой цепи человеческого происхождения.

Константная область легкой цепи может быть каппа или лямбда цепью.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения легкая цепь каппа кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9.

Молекулы ДНК могут быть сконструированы и оптимизированы для экспрессии в клетке-мишени.

Экспрессионный вектор, также известный как экспрессионная конструкция, в общем, является плазмидой, которая используется для введения определенного гена (в данном контексте молекулы ДНК согласно изобретению) в клетку-мишень.

После того, как экспрессионный вектор оказывается внутри клетки, белок, который кодируется геном, образуется с помощью клеточной транскрипции и трансляционного аппарата рибосомных комплексов.

Плазмида часто бывает создана таким образом, чтобы содержать регуляторные последовательности, которые действуют как энхансерные и промоторные области и приводят к эффективной транскрипции гена, который несет экспрессионный вектор.

Целью применения хорошо разработанного экспрессионного вектора является производство больших количеств стабильной матричной РНК, и, следовательно, белка.

Экспрессионные векторы являются основными инструментами для биотехнологии и производства белков, таких как инсулин, которые важны для медицинского лечения конкретных заболеваний, например, диабета.

После экспрессии генного продукта, требуется очистка белка; а так как вектор вводят в клетку-хозяина, белок интереса должен быть очищен от белков клетки-хозяина.

Поэтому, чтобы сделать процесс очистки более простым, клонированный ген должен иметь метку. Эта метка может быть гистидиновой (His) меткой или любым другим маркерным пептидом.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к экспрессионным векторам, содержащим молекулу ДНК, описанную выше.

Клетки, содержащие и экспрессирующие антитела согласно настоящему изобретению

Описанные выше молекулы ДНК или экспрессионные векторы могут быть введены в клетку-хозяина.

Такие клетки могут, с помощью гибридомной технологии, становиться иммортализованными клетками, которые продуцируют химерные или гуманизированные антитела.

Гибридомная технология является технологией формирования гибридных клеточных линий (называемых гибридомы) путем слияния специфических продуцирующих антитело B-клеток с клеткой миеломы (рак B-клеток), выбранной за ее способность расти в культуре ткани и за отсутствие синтеза цепей антител.

Все антитела, продуцируемые гибридомой, обладают единственной специфичностью и поэтому являются моноклональными антителами (в отличие от поликлональных антител).

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, несущей один или более векторов или молекул ДНК согласно настоящему изобретению.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, несущей экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи HH1, и второй экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин является клеткой млекопитающего.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения клетка является клеткой гибридомы.

Способы получения антител согласно настоящему изобретению

Химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены несколькими способами.

Один способ получения таких антител включает трансфекцию клетки-хозяина млекопитающего одним или более векторами согласно настоящему изобретению, культивирование клетки-хозяина и выделение и очистку молекулы антитела.

Другой способ получения таких антител включает создание гибридомных клеток, которые продуцируют химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению.

Идентичность последовательности

Согласно общепринятому определению «идентичность» здесь определяется как идентичность между последовательностями генов или белков на нуклеотидном или аминокислотном уровне, соответственно.

Таким образом, в данном контексте «идентичность последовательности» является мерой идентичности между белками на уровне аминокислот и мерой идентичности между нуклеиновыми кислотами на уровне нуклеотидов.

Идентичность последовательности белка может быть определена путем сравнения аминокислотной последовательности в заданном положении в каждой последовательности, когда последовательности выровнены.

Кроме того, идентичность последовательности нуклеиновой кислоты может быть определена путем сравнения нуклеотидной последовательности в заданном положении в каждой последовательности, когда последовательности выровнены.

Для определения процента идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот или двух аминокислот, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательности могут быть введены разрывы для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравниваются аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях.

Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных положений/общее число положений (например, перекрывающихся позиций) × 100). В одном варианте осуществления эти две последовательности имеют одинаковую длину.

Можно выровнять последовательности вручную и посчитать количество идентичных нуклеотидов или аминокислот. Альтернативно, выравнивание двух последовательностей для определения процента идентичности может быть осуществлено с использованием математических алгоритмов. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST. Поиск нуклеиновых кислот BLAST может быть осуществлен с помощью программы NBLAST, баллы = 100, длина слова = 12, чтобы получить нуклеотидную последовательность, гомологичную молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Поиск белков BLAST может быть осуществлен с помощью программы XBLAST, баллы = 50, длина слова = 3, чтобы получить аминокислотную последовательность, гомологичную молекуле белка согласно изобретению.

Для получения выравнивания с разрывами для сравнения можно применять Gapped BLAST. Кроме того, для выполнения повторяющегося поиска может быть применен PSI-Blast, который выявляет отдаленные отношения между молекулами. При применении программ NBLAST, XBLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ. См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Кроме того, идентичность последовательности может быть рассчитана после выравнивания последовательностей, например, программой BLAST в базе данных EMBL (www.ncbi.nlm.gov/CGI-BIN/BLAST).

Как правило, для выравнивания могут быть использованы настройки по умолчанию в отношении, например, «матрицы похожести» и «штраф за разрыв». В контексте настоящего изобретения могут быть предпочтительными настройки по умолчанию BLASTN и PSI BLAST.

Процент идентичности между двумя последовательностями может быть определен с применением методик, аналогичных описанным выше, с учетом или без учета разрывов. При расчете процента идентичности учитываются только точные совпадения.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, имеющую 80% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела HH1.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность VH (SEQ ID NO: 2) и/или VL (SEQ ID NO: 4) антитела HH1.

В другом варианте осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 2) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 4) антитела HH1, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности.

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность, имеющую 80% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела HH1.

Другой вариант осуществления изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательность VL (SEQ ID NO: 3) антитела HH1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью VH (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью VL (SEQ ID NO: 3) антитела HH1, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эти антитела являются химерными или гуманизированными антителами, полученными из моноклонального антитела HH1.

Генетические изменения

Генетические изменения вызваны изменением порядка оснований в нуклеотидах в генах. Эти изменения вызывают мутации в генах, а затем в белках, которые такие гены кодируют.

Эти мутации могут быть либо смысловыми, либо миссенс-мутациями, либо заменами.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит по меньшей мере 50, например, 20, например, 10, например, 5, например, 4, например, 3, например, 2, например, 1 смысловую мутацию.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит 0-50, например, 1-50, например, 0-20, например, 1-20, например, 0-10, например, 1-10, например, 0-5, например, 1-5, например, 3, например, 1 смысловую мутацию.

Миссенс-мутация (тип несинонимичной мутации) представляет собой точечную мутацию, в которой изменен один нуклеотид, в результате чего образуется кодон, который кодирует другую аминокислоту (мутации, которые изменяют аминокислоту на стоп-кодон называются нонсенс-мутациями, а не миссенс-мутациями). Миссенс-мутация может сделать полученный белок нефункциональным.

Однако не все миссенс-мутации приводят к заметным изменениям белка. Аминокислота может быть заменена аминокислотой с очень сходными химическими свойствами, и в этом случае белок может функционировать нормально; это называется нейтральной, «тихой» или консервативной мутацией.

Альтернативно, замена аминокислоты может произойти в области белка, которая существенно не влияет на вторичную структуру белка или функции. Когда аминокислота может кодироваться более чем одним ко доном (так называемое «вырожденное кодирование») мутация в ко доне может не вызвать никаких изменений при трансляции; это называется синонимичной мутацией (форма молчащей мутации), а не миссенс-мутацией.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит по меньшей мере 50, например, 20, например, 10, например, 5, например, 4, например, 3, например, 2, например, 1 миссенс-мутацию.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к антителу, содержащему полипептидную последовательность цепи VH (SEQ ID NO: 2) и/или цепи VL (SEQ ID NO: 4) моноклонального антитела HH1, которая содержит 0-50, например, 1-50, например, 0-20, например, 1-20, например, 0-10, например, 1-10, например, 0-5, например, 1-5, например, 3, например, 1 миссенс-мутацию.

Консервативная замена является заменой одной аминокислоты на другую с примерно аналогичными свойствами так, что общему функционированию, скорее всего, не будет нанесен серьезный ущерб.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения миссенс-мутации являются консервативными мутациями или заменами.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности или полипептидной последовательности с 80% идентичности с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1) и/или последовательностью вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 3) последовательности HH1, где вариантами последовательности являются консервативные замены.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является последовательность, идентичная на 80%, имеющая, например, 90% идентичности, 91% идентичности, 92% идентичности, 93% идентичности, 94% идентичности, 95% идентичности, 96% идентичности, 97% идентичности, 98% идентичности или 99% идентичности, где вариантами последовательности являются консервативные замены.

Для того чтобы улучшить этап радиоактивного мечения, может быть выгодно вводить дополнительный лизин в, например, Fc часть химерного или гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению.

Это может уменьшить вероятность присоединения связывающих лизин хелатирующих агентов к антигенсвязывающим сайтам антитела, тем самым снижая риск аномальной иммунореактивности в ходе радиоактивного мечения.

Способы введения лизина в, например, Fc часть HH1 известны в данной области техники, например, в Hemminki et al., 1995.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату согласно настоящему изобретению, который был модифицирован 10 Lys в Fc части HH1, например, 8 Lys, например, 6 Lys, например, 5 Lys, например, 4 Lys, например, 3 Lys, например, 2 Lys, например, 1 Lys.

Могут быть выбраны другие варианты Fc части антител согласно настоящему изобретению с целью оптимизации или модулирования одной или нескольких эффекторных функций.

Эти модуляции эффекторных функций делают, например, чтобы увеличить антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

Такие вариации Fc части известны в данной области.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к антителу согласно настоящему изобретению, которое имеет одну или более мутаций в Fc области, которые модулируют одну или несколько эффекторных функций.

Иммуноконъюгаты

Иммуноконъюгаты являются антителами, конъюгированными (соединенными) со второй молекулой, обычно токсином, радиоизотопом или меткой.

Такие иммуноконъюгаты химерного и гуманизированного HH1 являются всеми аспектами настоящего изобретения.

Один тип является химерным и гуманизированным HH1 согласно настоящему изобретению, соединенным с или связанным с хелатирующим линкером.

Хелатирующие линкеры описаны в приведенном ниже разделе в отношении радиоиммуноконъюгатов, и поэтому хелатирующие линкеры, описанные в нем, считаются удобными для иммуноконъюгатов, содержащих химерное и гуманизированное HH1 согласно настоящему изобретению, соединенное с или связанное с хелатирующим линкером.

Радиоиммуноконъюгаты

Аспект настоящего изобретения относится к радиоиммуноконъюгату, который связывает CD37 человека, содержащему химерное или гуманизированное антитело, полученное из моноклонального антитела HH1 в соответствии с настоящим изобретением, линкер и радионуклид, выбранный из группы, состоящей из

²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc и ¹⁷⁷Lu.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер представляет собой хелатирующий линкер.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид является радионуклидом, выбранным из группы, состоящей из ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²²⁷Th и ⁹⁰Y.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид является ¹⁷⁷Lu.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радионуклид является ²¹²Pb.

В еще одном варианте радионуклид является другим бета-излучателем или альфа-излучателем.

Радионуклид может быть присоединен к антителу через первоначальное взаимодействие бифункционального хелатирующего агента, например, p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, USA) с антителом, с последующей очисткой для удаления несвязанного хелатирующего агента, а затем реакцией конъюгата антитела с хелатирующим агентом с радионуклидом, с последующей очисткой для удаления несвязанного радионуклида.

В качестве альтернативы, хелатирующий агент и радионуклид могут быть соединены в первую очередь, а затем конъюгированы с антителом.

Хелатирующие линкеры, такие как, например, p-SCN-bn-DOTA, могут применяться для присоединения других металлических радионуклидов к производным антитела HH1 аналогично тому, как описано для ¹⁷⁷Lu.

Можно применять линкер любого типа с достаточной способностью к комплексообразованию и функциональной группой, позволяющей прямую или косвенную конъюгацию с белком или пептидом.

Примеры таких линкеров описаны в литературе (например, Brechbiel, 2008; Liu, 2008). Некоторыми полезными примерами являются бифункциональные циклические 10 энтеросорбенты, например, p-SCN-BN-DOTA, эфир DOTA-NHS, p-SCN-Bn-TCMC; бифункциональные линейные энтеросорбенты, например, p-SCN-BN-DTPA и CHX-Aʺ-DTPA.

Радионуклиды в настоящем изобретении предпочтительно можно конъюгировать с молекулой с помощью бифункциональных хелатирующих агентов.

Это могут быть циклические, линейные или разветвленные хелатирующие агенты. Отдельно следует упомянуть хелатирующие полиаминополикислоты, которые содержат линейную, циклическую или разветвленную полиазаалкановую основу с кислотными (например, карбоксиалкильной) группами, присоединенными к азотам основы.

Примеры подходящих хелатирующих агентов включают производные DOTA, такие как п-изотиоцианатобензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (p-SCN-Bz-DOTA) или 8-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7,10-тетра (2-карбамоилметил)циклододекан и производные DTPA, такие как п-изотиоцианатобензил-диэтилентриаминпентауксусная кислота (p-SCN-Bz-DTPA), первый из которых является циклическим хелатирующим агентом, последний - линейным хелатирующим агентом.

Металлирование комплексообразующего фрагмента может быть выполнено до или после конъюгации комплексообразующего фрагмента с направляющей частью.

Процедура радиоактивного мечения будет в общем более удобна с точки зрения используемого времени, если хелатирующий агент конъюгируют с антителом до радиоактивного мечения.

Принципы подготовки меченных радиоактивным изотопом конъюгатов с применением хелатирующих агентов, прикрепленных к антителу, описаны более широко, например, в Liu, 2008.

Таким образом, полученные на основе HH1 химерные или гуманизированные антитела могут применяться для получения радиоиммуноконъюгатов с различиями в свойствах излучения и эффективном периоде полураспада.

Например радиоиммуноконъюгат против CD37, состоящий из химерного или гуманизированного антитела, полученного из моноклонального антитела HH1 в соответствии с настоящим изобретением, хелатирующего линкера и бета- или альфа-излучающих радионуклидов, в том числе, но не ограничиваясь ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc могут быть получены и применены для получения фармацевтических препаратов и применяться в терапевтических целях.

Иммунотоксины

Иммунотоксин является сконструированным человеком белком, который состоит из направляющей части, соединенной с токсином. Когда белок связывается с клеткой, он попадает внутрь с помощью эндоцитоза, и токсин убивает клетку.

Они обычно используются для лечения некоторых видов рака и некоторых вирусных инфекций.

Эти белки обычно изготавливают из модифицированного антитела или фрагмента антитела, соединенного с фрагментом токсина.

Направляющая часть состоит из Fv части антитела, которая направляет иммунотоксин на конкретный тип клеток.

Токсин обычно представляет собой цитотоксический белок, полученный из бактериального или растительного белка, из которого удален природный связывающий домен, так что Fv направляет токсин с антигеном на клетку-мишень.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения токсин представляет собой химиотерапевтическую молекулу, в том числе, но не ограничиваясь ими, алкилирующие агенты (цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид), антиметаболиты (азатиоприн, меркаптопурин, пиримидины), алкалоиды (винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин, паклитаксел, доцетаксел, этопозид, тенипозид), ингибиторы топоизомеразы (иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид, тенипозид) и цитотоксические антибиотики (актиномицин, доксорубицин, даунорубицин, валрубицин, идарубицин, эпирубицин, блеомицин, пликамицин, митомицин).

В одном варианте осуществления изобретения доксорубицин конъюгируют с антителом через кросс-линкер SMCC-гидразид (4-[N-малеимидометил]циклогексан-1 карбоксилгидразид).

Иммунотоксин действует через связывание антитела (или другой направляющей части) с антигеном на клетке-мишени с последующим входом в клетку токсина, который убивает клетку.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к иммунотоксину, который содержит антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент.

Фармацевтическая композиция

Антитела для лечения заболеваний обычно применяют в виде фармацевтических композиций.

Такие композиции оптимизированы по таким параметрам, как физиологическая переносимость и срок годности.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента одну или более молекул антитела против CD37 согласно настоящему изобретению (то есть химерное или гуманизированное антитело, полученное из HH1 или их фрагмент) и фармацевтически приемлемый носитель.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, описанной выше, дополнительно содержащей один или более дополнительных терапевтических агентов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения упомянутый один или более дополнительных терапевтических агентов выбирают из агентов, направленных на B-клеточный антиген, отличный от CD37.

Такой антиген может быть B-клеточным антигеном CD20.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения упомянутый один или более дополнительных терапевтических агентов выбран из агентов, индуцирующих апоптоз.

Продукт для радиоиммунотерапии на основе химерного или гуманизированного HH1, как правило, может быть выполнен в виде фармацевтической композиции, состоящей из радионуклида, в соответствии с приведенным выше описанием, связанного с помощью хелатообразующего агента с химерным или гуманизированным антителом HH1, растворенных в буферном растворе, который в значительной степени поддерживает химическую целостность радиоиммуноконъюгата и физиологически приемлем для введения пациентам.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей радиоиммуноконъюгат согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.

Приемлемые фармацевтические носители включают, но не ограничиваются ими, нетоксичные буферные растворы, наполнители, изотонические растворы и т.д. Более конкретно, фармацевтический носитель может быть, но не ограничивается ими, нормальным физиологическим раствором (0,9%), полунормальным физиологическим раствором, лактатом Рингера, 5% декстрозой, 3,3% декстроза/0.3% физиологического раствора. Физиологически приемлемый носитель может содержать радиолитический стабилизатор, например, аскорбиновую кислоту, который поддерживает целостность радиофармацевтического препарата во время хранения и транспортировки.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению и одно или более дополнительных антител или радиоиммуноконъюгатов. Антитела включают, но не ограничиваются указанными, Ритуксимаб, Epratuzumab, L19, F8, F16, Galiximab, Toralizumab, Alemtuzumab, Ofatumumab, Veltuzumab, Afiituzumab, Tositumomab, Reditux, Ibritumomab, K7153A, 37.1 и HH1.

Радиоиммуноконъюгаты включают, но не ограничиваются ими, Zevalin, Bexxar и Betalutin.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения один или более дополнительных антител или радиоиммуноконъюгатов направлены на CD20. Антитела включают, но не ограничиваются ими, Ритуксимаб, Veltuzumab, Ofatumumab, Afutuzumab, Tositumomab, Reditux и Ibritumomab. Радиоиммуноконъюгаты включают, но не ограничиваются ими, Zevalin и Bexxar.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению для лечения злокачественных B-клеток, экспрессирующих антиген CD37.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция предназначена для лечения B-клеточных злокачественных новообразований, выбранных из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни.

Лечение

Терапевтическое применение фармацевтического раствора в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться для лечения злокачественных клеток, экспрессирующих антиген CD37, включая, но не ограничиваясь ими, B-клеточные злокачественные новообразования, выбранные из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфолейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни.

Другие применения включают лечение аутоиммунных заболеваний и лечение эффектов, связанных с трансплантацией.

Терапия может быть основана на, но не ограничиваются ими, излучении бета-частиц или излучении альфа-частиц, или их комбинации.

Лечение можно осуществлять в виде монотерапии или в комбинации с другим лечением, предпочтительно, стандартной терапией. Таким другим лечением могут быть предварительная обработка, хирургия, химиотерапия (включая доксорубицин, винбластин и гемцитабин), иммунотерапия, фотодинамическая терапия, ингибитор протеасом (включая бортезомибом), ингибиторы гистондеацетилазы (включая вориностат и субероиланилид гидроксамовой кислоты), витамин D3 и аналоги витамина D3, ингибиторы контрольных точек клеточного цикла (в том числе UCN-01 и 2-(4-(4-хлорфенокси)фенил)-1H-бензимидазол-5-карбоксамид), радиосенсибилизаторы гипоксических клеток (включая метронидазол и мисонидазол), радиосенсибилизаторы индукторы апоптоза (в том числе витаферин A), радиоиммунотерапия или сочетание двух или более из них.

Введение означает внутривенное вливание или внутривенную инъекцию. Более конкретно, радиоиммуноконъюгат согласно настоящему изобретению можно вводить непосредственно в вену с помощью периферической венозной канюли, соединенной с капельной камерой, которая предотвращает воздушную эмболию и позволяет оценить скорость тока жидкости в организм пациента.

В одном варианте осуществления радиоиммуноконъюгат можно вводить несколько раз.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения радиоиммуноконъюгат может быть введен повторно, но с различными радионуклидами, например, за бета-радиоиммунотерапией может последовать альфа-радиоиммунотерапия, или наоборот.

Аспект настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению для лечения B-клеточных злокачественных новообразований.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению при совместном введении или в дополнение к другой терапии.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения другие способы лечения выбраны из предварительной обработки, химиотерапии, терапии моноклональными антителами, хирургии, лучевой терапии и/или фотодинамической терапии.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения другие способы лечения представляют собой трансплантацию костного мозга или трансплантацию и/или терапию стволовыми клетками.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает терапевтическую предварительную обработку с применением моноклонального антитела против CD20 и/или против CD37 перед обработкой радиоиммуноконъюгатом согласно настоящему изобретению.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является предварительная обработка, осуществляемая путем введения химерного антитела согласно настоящему изобретению, с последующей обработкой радиоиммуноконъюгатом из химерного антитела HH1 или радиоиммуноконъюгатом с антителом HH1.

Аспект настоящего изобретения относится к способу лечения B-клеточных злокачественных образований, выбранных из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни, включающему введение эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является применение и способы лечения согласно настоящему изобретению, проведенные in vitro или ex vivo.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения дозировка антитела 10 составляет 1-1000 мг на пациента, более предпочтительно 5-50 мг на пациента, и ¹⁷⁷Lu до 1-200 МБк/кг, более предпочтительно 10-100 МБк/кг массы тела.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, содержащие химерное или гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению, могут применяться для элиминации B-клеток, которые экспрессируют CD37 на своей поверхности.

Такие фармацевтические композиции могут применяться для лечения B-клеточных злокачественных новообразований.

Эти B-клеточные злокачественные новообразования могут быть выбраны из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни.

Вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей химерное или гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению для применения при лечении аутоиммунных или воспалительных заболеваний, которые связаны с B-клетками в их патологией.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу элиминации экспрессирующих CD37 B-клеток из популяции клеток, включающему введение к указанной популяции клеток молекулы антитела согласно настоящему изобретению фармацевтической композиции, содержащей такую молекулу антитела.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего от B-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из B-клеточной неходжкинской лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза и миеломной болезни, включающему введение указанному пациенту эффективного количества фармацевтической композиции химерного или гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению.

В отдельном варианте осуществления химерное или гуманизированное HH1 вводят пациенту, до терапии радиоактивной или иммунотоксичной версией мышиного, химерного или гуманизированного HH1, чтобы защитить нормальные клетки тканей и улучшить поглощение опухолью.

Дозировка должна быть достаточной, чтобы блокировать поглощение нормальными тканями, но не чрезмерной, так как это приведет к уменьшению поглощения опухолью. Например, химерное или гуманизированное HH1 должно быть дано в дозировке от 0,5 мг до 1 г на пациента.

Ее можно применять, например, за неделю до и/или 1-5 часа до введения радиоиммуноконъюгата.

Наборы

Аспект настоящего изобретения относится к набору для получения радиоиммуноконъюгата согласно настоящему изобретению, содержащему два или более флаконов, где один флакон содержит конъюгат, содержащий хелатирующий агент, соединенный с моноклональным антителом мыши HH1; и второй флакон содержит радионуклид.

Применение набора может требовать проведения некоторых процедур, которые необходимо выполнить до инфузии, например, радиоактивного мечения и/или очистки.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к набору согласно настоящему изобретению, в котором содержимое одного или нескольких флаконов либо лиофилизировано, либо находится в растворе.

При смешивании содержимого двух флаконов для получения радиоиммуноконъюгата образуется конечный продукт. Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения радиоиммуноконъюгат образуется путем смешивания содержимого двух флаконов.

Этот продукт может требовать очистки перед применением.

Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы и к другим аспектам изобретения.

Все ссылки на патенты и не на патенты, приведенные в настоящей заявке, включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте.

Далее изобретение будет описано более подробно в следующих неограничивающих примерах.

Примеры

Пример 1: Создание химерного антитела

Химерный вариант антитела HH1 получали с применением экспрессионных векторов для V-области гена.

Векторы, содержащие гены цепей VH и VL получали методом ОТ-ПЦР.

Затем V-гены секвенировали и создавали новые специфические праймеры для амплификации V-генов, прежде чем клонировать их в вектор pLNOH2, содержащий гены константной области антитела человека IgG (Cγ3, Gγ1 и CH1γ3).

Вектор pLNOH2, содержащий константные области IgG1CH1 (SEQ ID NO. 5), IgG1CH2 (SEQ ID NO. 6), IgG1CH3 (SEQ ID NO. 7), приведен в SEQ ID NO. 8.

Тяжелую и легкую цепи из векторов pLNOH2 (SEQ ID NO. 5) и pLNOK объединяли, чтобы создать комбинированный вектор pLNOH2γ1/κ αCD37. Полный ген легкой цепи (SEQ ID NO: 9), промотор CMV и сигнал полиаденилирования pLNOκ αCD37 переклонировали в pLNOH2 hlgG1 αCD37.

В комбинированном векторе тяжелая и легкая цепи экспрессировались с отдельных промоторов CMV.

Определение константного домена

Константные домены в последовательности pLNOH2 были определены из последовательности IgG1 человека в базе IMGT (номер доступа: Ζ17370).

Ген и аминокислотная последовательность вариабельных областей антитела chHH1 против CD37 является следующими:

VH αCD37 (аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 1 и нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 2)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 2):

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1):

VL αCD37 (аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 3 и нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 4)

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 4):

Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3):

Пример 2: Проточная цитометрия для оценки связывания антигена

Анализ связывания hchlgG1 ααCD37 b (chHH1) с клетками Daudi, экспрессирующими CD37.

Клетки окрашивали и фиксировали.

Связывание с мишенью созданного chHH1 анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки Daudi, экспрессирующие CD37, окрашивали либо chHH1, либо hlgG1 αΝΙΡ. В левой панели выбраны интактные клетки Daudi, а на правой панели представлена гистограмма интенсивности флуоресценции этих окрашенных клеток. chHH1 связывалось с клетками Daudi, экспрессирующими CD37 (сплошная линия), а химерный αΝΙΡ IgG1 нет (пунктирная линия).

Пример 3: Радиоактивное мечение химерного HH1

Иодирование: антитела метили I путем непрямого йодирования с помощью предварительно покрытых пробирок для йодирования IODOGEN (Pierce, Rockford, IL) в соответствии с описанием производителя.

Мечение ¹¹¹In и ¹⁷⁷Lu: сначала провели реакцию антител с хелатирующим агентом (p-SCN-n-DTPA или p-SCN-BN-DOTA).

Хелатирующий агент DTPA или DOTA растворяли в 0,05 M HCl и затем добавляли к антителу, pH которого доводили до приблизительно 8,5 промыванием карбонатным буфером в соотношении 5:1. Затем pH снова проверяли и при необходимости доводили снова. Раствор встряхивали в течение 60 минут при комнатной температуре, а затем реакцию прекращали добавлением 50 мкл 200 мМ раствора глицина (на мг антитела).

Чтобы удалить свободный хелатирующий агент, конъюгированные антитела 4-5 раз промывали PBS (PAA), а затем доводили до pH 5 путем промывки ацетатом аммония. Затем к 0,5 мг DOTA-Ab добавляли ¹¹¹In или ¹⁷⁷Lu (Perkin Elmer, Boston, MA, USA) и встряхивали в течение одного часа при 42°C.

Наконец, продукт очищали путем элюции с гель-фильтрационной колонки, например, Sephadex G-25 PD10 (GE health) или подобной. Общий выход мечения варьировал от 17% до 63%.

Качество радиоиммуноконъюгатов измеряли, используя клетки лимфомы и модифицированный метод Lindmo (пример 4).

Пример 4: Иммунореактивность

Предпосылки: Для измерения способности антитела связывать антиген-положительные клетки-мишени применяли анализ иммунореактивности.

Методы: Проводили два параллельных анализа на 5, 10, 40, 100 или 300 миллионах клеток в мл в примерно 0,3 мл.

К половине пробирок добавили немеченые антитела в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 15 мин, чтобы блокировать антиген.

После во все пробирки добавляли 5-20 нг/мл радиоиммуноконъюгата и суспензию инкубировали при 4°C с использованием шейкера в течение приблизительно 2 часов.

После этого пробирки центрифугировали, и супернатант удаляли и хранили для подсчета. Осадки повторно суспендировали в 1 мл PBS и центрифугировали. Эту процедуру промывки повторяли дважды и супернатанты объединяли. Пробирки, содержащие осадок или объединенные супернатанты подсчитывали на гамма-счетчике.

Конкретную оценку активности рассчитывали по следующей формуле: Счет незаблокированного осадка (PCN), счет объединенного супернатанта (CSC) и всего использовано (TA) для каждого образца. Специфическое связывание (SB) рассчитывали следующим образом: (PCN/TA)-(PCN/TA) заблокированных = SB.

Значения SB вычисляли для каждой концентрации клеток и наносили на график двойной обратной зависимости, иммунореактивную фракцию при бесконечном доступе к антигену определяли по Lindmo et al. (J Immunol Methods. 1984 Aug 3; 72 (1): 77-89).

Результаты: При измерении двух партий меченого ¹⁷⁷Lu химерного HH1 иммунореактивности составили 48,1% и 84,5% соответственно. В одной партии меченого ¹²⁵I химерного HH1 иммунореактивность составила 67,6%. В заключение, эти данные соответствуют тем, которые обычно получают для HH1 мыши, и это показывает, что химерные HH1 имеют подходящую способность для направления на антиген.

Пример 5: Связывание с опухолевыми клетками in vitro

Введение: Связывание проводили с целью определения равновесной константы связывания (K_d) chHH1, среднего количества антигенов на клетках Daudi (B_max) и константы скорости связывания (k_a) chHH1 (Dahle et al., 2007).

Материалы и методы: chHH1 метили ¹²⁵I (пример 3). 5 миллионов клеток на мл в 0,4 мл среды суспендировали в пробирках. Одну половину клеток блокировали 0,5 мг/мл немеченого chHH1 в течение 15 минут перед добавлением меченого 125I chHH1. Другую половину клеток не блокировали. Обе параллели инкубировали с 100, 1000, 5000 и 10000 нг/мл I²⁵¹-HH1. Клетки инкубировали в течение 5, 10, 20, 30 минут и 1, 1,5 и 2 часов. После инкубации клетки промывали PB S с 5% эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки, супернатант и жидкости для промывки подсчитывали в гамма-счетчике. Эксперимент повторяли три раза.

Результаты: Типичные кривые связывания приведены на фигуре 2. K_d chHH1 составила 3,0±0,3, B_max клеток Daudi составила 330000±4000 антигенов CD37 на клетку, и k_a chHH1 составила 0,36±0,03 нМ/ч. Данные похожи на аналогичные значения для HH1 мыши (Kd=2,7±0,3, B_max=340000±5000 антигенов CD37 на клетку и k_a 0,72±0,03 нМ/ч).

Пример 6: Биораспределение и направленность на опухоль в мышах

Биораспределение меченого ¹⁷⁷Lu химерного HH1 изучали на самцах голых мышей линии Balb/C.

Материалы и методы: радиоактивное мечение осуществили с применением p-SCN-BN-DOTA в качестве бифункционального хелатирующего агента, чтобы объединить радионуклид с антителом (см. пример 3). Препарат вводили в хвостовую вену инъекцией 100 мкл раствора для каждого животного.

Использовали самцов голых мышей линии Balb/C с массой тела 21-25 г.

Каждому животному вводили дозу радиоиммуноконюгата с активностью 120 кБк. Пять животных использовали для одной временной точки. Вскрытие проводили после цервикальной дислокации в различные моменты времени после инъекции. Определяли вес каждого образца ткани и измеряли ¹¹¹In с помощью калиброванного гамма-счетчика (автоматический гамма-счетчик Cobra II, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA). Образцы вводимого раствора использовали в качестве контроля при измерении.

Результаты: Биораспределение меченного 177Lu химерного HH1 через 1 час, 20 часов и через шесть дней после инъекции представлены в Таблице 1. Данные показывают, что антитело имеет соответствующее биораспределение, аналогичное тому, которое наблюдали для меченного радиоактивным нуклидом ритуксимаба (Dahle et al, 2006 Nuci Med Biol, 33, 271-279). В заключение, биораспределение меченного химерного HH1 показывает, что антитело имеет подходящие свойства для применения in vivo.

Пример 7: Анализ ADCC in vitro с использованием измерения жизнеспособности с помощью проточной цитометрии

Предпосылки: Свойство ADCC химерного антитела HH1 оценивали с помощью клеток Натуральных киллеров (NK) и клеток лимфомы Daudi.

Методы: Кровь человека собрали у добровольцев и обработали Lymphoprep и Dynabeads для получения изолированных NK клеток. Клетки Daudi обрабатывали DiOC18 для окрашивания клеток.

Клетки-мишени Daudi метили 10 мкл DiOC18 при 10⁶ клеток-мишеней/мл путем инкубации в течение 30 минут при 37°C. Клетки два раза промывали PBS и ресуспендировали в 1 мл в среде для культивирования клеток.

Обработанные DiOC18 клетки Daudi метили антителами путем добавления или химерного HH1, или контрольного ритуксимаба в концентрации 10 мкг/мл и инкубировали в течение 15 минут на льду, центрифугировали и ресуспендировали для удаления несвязанного антитела.

Различные количества NK-клеток разбавляли до концентрации 4×10⁵/мл (40:1), 2×10⁵/мл (20:1), 1×10⁵/мл (10:1) и 5×10⁴/мл (5:1) средой для культивирования клеток. Контрастирующий краситель пропидийиодид готовили путем добавления 40 мкл Р1/мл среды для культивирования, чтобы сделать раствор контрастирующего красителя.

Меченые клетки Daudi разбавляли средой для культивирования до 10⁴/мл. Анализ начинали путем смешивания 50 мкл эффекторных клеток и 50 мкл клеток Daudi в реакционной пробирке.

В реакционную пробирку добавляли 50 мкл раствора PI. После двух часов инкубации при 37°C оценивали процент выживших клеток Daudi с помощью проточной цитометрии.

С chHH1 11% клеток Daudi погибло от ADCC, в то время как для ритуксимаба 15% клеток погибли от ADCC. Процент индукции ADCC существенно не отличается для двух антител (см. фигуру 3).

Пример 8: Анализ ADCC in vitro с применением стимулированных интерлейкином PBMC

Предпосылки: ADCC активность mAb HH1 мыши и химерной версии mAb HH1 оценивали с помощью анализа высвобождения Cr51.

Материалы и методы: Способность HH1 мыши и химерного HH1 опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) оценивали с помощью клеток Daudi качестве клеток-мишеней и стимулированных IL2 РВМС человека в качестве эффекторных клеток.

Клетки Daudi (линия клеток лимфомы Беркитта) выращивали во флаконах для культивирования тканей (175 см²) с использованием RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 1% Пен/Стрепт. Культуры поддерживали при концентрации клеток между 3×10⁵ и 1,5×10⁶/мл путем пересаживания в свежую среду для культивирования 2-3 раза в неделю. Аликвоту клеточной культуры при плотности клеток между 0,5×10⁶/мл и 1,0×10⁶/мл центрифугировали (1200 оборотов в минуту) в течение 5 мин.

Клетки один раз промывали промывочным буфером (DPBS с 2%FCS) и осаждали (1200 оборотов в минуту, 5 минут). Клеточный осадок ресуспендировали в среде для анализа [RPMI с HEPES, 10% FCS] и проводили подсчет клеток. Концентрацию клеток доводили до 1×10⁶/мл для мечения хромом-51.

Примерно 30-50 мл цельной крови отбирали в пробирки с ЭДТА у здоровых доноров и использовали для выделения PBMC. Цельную кровь разводили 1:1 DPBS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса без кальция и магния) в 50 мл пробирке.

Разбавленную цельную кровь наслаивали на Lymphoprep (Medinor) в соотношении 2:1 в 50 мл пробирку и центрифугировали при 1000×g в течение 20 мин при медленном торможении. Мононуклеарные клетки отбирали с поверхности раздела и дважды промывали DPBS (300×g, 10 мин).

Осажденные клетки осторожно ресуспендировали в среде для культивирования (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1% Пен/Стерп) с помощью пипетки и количество клеток определяли с помощью счетчика клеток.

Концентрацию PBMC доводили до 5×10⁵/мл и сохраняли в среде для культивирования, содержащей 25 нг/мл IL-2 (eBiosciences), и культивировали в 6-луночном планшете для культивирования при 37°C в CO₂-инкубаторе в течение 3 дней. Стимулированные IL-2 РВМС собирали, подсчитывали и ресуспендировали в среде для анализа [RPMI с HEPES, 10% FCS] в концентрации 1,5×10⁶/мл.

1×10⁶ клеток Daudi метили 3,7 МБк хрома-51 (Cr51) в объеме 1 мл при 37°C в течение 1 часа.

Меченые клетки три раза промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин).

Меченые клетки разделяли на аликвоты равного объема для связывания с HH1 мыши и химерным HH1, включая контроль без антител. Все образцы инкубировали при 37°C в течение 10 мин, затем центрифугировали и дважды промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин).

Совместное культивирование эффекторных клеток с клетками-мишенями проводили в трех повторностях в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах в конечном объеме 200 мкл.

Сначала посеяли 10000 клеток-мишеней в объеме 100 мкл в среде для анализа, а затем эффекторные клетки в объеме 100 мкл в различной концентрации до достижения исследуемых соотношений эффектор:мишень.

В качестве контроля клетки-мишени культивировали либо только в среде для анализа (спонтанный лизис), либо в среде для анализа с 1% Triton X-100 (максимальный лизис).

Смешанные культуры инкубировали при 37°C в CO₂-инкубаторе с увлажнением в 10 течение 4 часов. Цитотоксический эффект измеряли по выделению Cr51 в супернатант. В конце инкубации клетки удаляли из культуральной среды центрифугированием (1500 оборотов в минуту, 5 минут) при комнатной температуре. Свободные от клеток супернатанты (100 мкл/лунку) переносили в соответствующие 96-луночному планшету микропробирки 0,2 мл. Количество выделенного Cr51 измеряли путем подсчета с помощью счетчика гамма-излучения Packard Cobra II.

Результаты: Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Как показано, лизис клеток Daudi, предварительно обработанных химерным HH1, был значимым для всех трех доноров крови.

Предварительная обработка HH1 мыши, по всей видимости, не вызвала какого-либо значительного лизиса по сравнению с клетками Daudi, необработанными предварительно антителом.

Эффекторные клетки из трех индивидуумов. Данные нормализовали на измеренный лизис клеток без антитела, который был выбран в качестве 100%.

Вывод: При анализе in vitro с использованием РВМС человека, химерное HH1 вызывает значительную ADCC в плане лизиса клеток на клетках лимфомы in vitro, в то время как HH1 мыши не оказывает сколько-нибудь значительного эффекта на лизис клеток по сравнению с отсутствием обработки.

Пример 9: Сравнение связывания между химерным HH1 и HH1 мыши

Чтобы оценить, сохраняет ли химерное HH1 способность связывать эпитоп и антиген, клетки насыщали химерным HH1 и HH1 мыши, а затем исследовали способность блокировать связывание меченного радионуклидом HH1.

Материалы и методы: суспензию клеток Daudi распределяли на 6 пробирок по 1,7 млн. клеток в 0,2 мл PBS в каждую пробирку. Пробирки 1 и 2 оставляли незаблокированными, пробирки 3 и 4 блокировали путем добавления 3 мкг HH1 в 5 мкл и в пробирки 5 и 6 добавляли 3 мкг химерного HH1 в 5 мкл.

Пробирки инкубировали в течение 10 минут, а затем добавляли 2 нг меченного ¹²⁵I HH1 и дополнительно инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре с использованием клеточного шейкера.

Общую активность в каждой пробирке измеряли с использованием гамма-счетчика LKB, и после этого клетки промывали три раза 1 мл PBS с 0,5% BSA и 1 мМ DTPA. В конечных осадках определяли радиоактивность, чтобы определить активность по связыванию клеток.

Результаты: установили, что незаблокированные клетки сохранили 42,7% радиоактивности (диапазон 42,7%-42,7%). Клетки, заблокированные HH1, сохранили 1,6% радиоактивности (диапазон 1.4%-1.8%). Клетки, заблокированные химерным HH1, сохранили 1,3% радиоактивности (диапазон 1.1%-1.5%).

В заключение, то, что связывание меченного HH1 мыши весьма эффективно блокируется химерным HH1 и в той же степени блокируется HH1 мыши, означает, что способность связывать антиген и эпитоп у химерной версии HH1 сохраняется.

Это также показывает, что химерное HH1 может быть полезным в качестве предварительной обработки для блокирования антигена CD37 в нормальных тканях до терапии радиоиммуноконъюгатом или иммунотоксином с HH1.

Пример 10: ADCC chHH1.1 на клетках Rec-1 в качестве клеток-мишеней

Материалы и методы:

Кровь отбирали у трех здоровых индивидуумов в пробирки с ЭДТА и использовали для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Цельную кровь разводили 1:1 DPBS (DPBS, Hyclone, Thermo Scientific, USA) в 50 мл пробирке. Разбавленную цельную кровь наслаивали на Lymphoprep (Medinor, Norway) в соотношении 2:1 в 50 мл пробирке и центрифугировали при 1000×g в течение 20 мин при медленном торможении.

Мононуклеарные клетки отбирали с границы раздела фаз и дважды промывали DPBS (300×g, 10 мин). Осажденные клетки осторожно ресуспендировали в среде для культивирования (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки) с помощью пипетки и определяли количество клеток с помощью клеточного счетчика.

РВМС стимулировали 25 нг/мл рекомбинантного IL-2 человека (eBiosciences) в течение 3 дней.

В качестве клеток-мишеней для анализа цитотоксичности использовали клетки лимфомы мантийной зоны Rec-1. Их выращивали во флаконах для культивирования тканей (175 см²) с использованием RPMI-1640 (Hyclone, Thermo Scientific, USA) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (PAA, Thermo Scientific, USA).

Осадок клеток ресуспендировали в среде для анализа (RPMI, 10% FCS) и проводили подсчет клеток. Концентрацию клеток доводили до 5×10⁶/мл для мечения хромом-51.

5×10⁶ клеток метили 3,7 МБк хрома-51 (⁵¹Cr) (PerkinElmer, Netherlands) в объеме 1 мл при 37°C в течение 1 часа. Меченые клетки три раза промывали центрифугированием в DPBS с 2% FCS (2000 оборотов в минуту, 5 мин).

Меченые клетки разделяли на аликвоты равного объема для связывания 20 мкг/мл HH1 мыши, 20 мкг/мл ритуксимаба, 20 мкг/мл chHH1.1 (изотип IgG1) или комбинацией 20 мкг/мл ритуксимаба и 20 мкг/мл chHH1.1, в том числе для контроля без антител. Все образцы инкубировали при 37°C в течение 10 мин, затем центрифугировали и дважды промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин).

Эффекторные клетки культивировали с клетками-мишенями в соотношении 40:1, 20:1 или 10:1 в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах в конечном объеме 200 мкл. Сначала высевали 10000 клеток-мишеней в объеме 100 мкл в среде для анализа, а затем PBMC человека в объеме 100 мкл. В качестве контроля клетки-мишени культивировали только в среде для анализа (спонтанный лизис) и в среде для анализа с 1% Triton X-100 (максимальный лизис, общее выделение).

Все образцы изготовили в трех повторностях. Совместную культуру инкубировали при 37°C в CO₂-инкубаторе с увлажнением в течение 4 часов. Цитотоксический эффект измеряли по выделению ⁵¹Cr в супернатант. В конце инкубации клетки удаляли из среды для культивирования центрифугированием (1500 оборотов в минуту, 5 минут) при комнатной температуре. Свободные от клеток супернатанты (150 мкл/лунку) переносили в соответствующие 96-луночному планшету микропробирки 0,2 мл. Количество выделенного ⁵¹Cr измеряли с помощью гамма-счетчика (Cobra II, Packard, land).

% специфического лизиса рассчитывали по следующей формуле: 100 × (экспериментальное выделение - спонтанное выделение)/(общее выделение - спонтанное выделение). Экспериментальное выделение является средним значением повторностей обработанных образцов. Для каждой обработки антителом делали три повторности образцов для спонтанного выделения и полного выделения, и использовали средние значения для экспериментальных образцов с обработкой соответствующим антителом.

Результаты:

Фигура 4 показывает, что chHH1.1 было настолько же эффективно при индукции специфического лизиса путем ADCC на клетках Rec-1, что и ритуксимаб, и немного более эффективно, чем HH1 мыши. Сочетание chHH1 и ритуксимаба привело к немного более высокой эффективности специфического лизиса, чем обработка одним из двух антител.

Вывод:

ADCC является активным механизмом действия для chHH1.1 на клетках Rec-1. Комбинированная обработка ритуксимабом и chHH1.1 привела к немного более высокой ADCC, чем каждым из антител по отдельности.

Пример 11: CDC chHH1.1 на клетках Rec-1 в качестве клеток-мишеней

Материалы и методы:

Кровь отбирали у трех здоровых индивидуумов и сыворотку отделяли центрифугированием.

В качестве клеток-мишеней для анализа цитотоксичности использовали клетки лимфомы мантийной зоны Rec-1 (LG Standards, Boras, Sweden). Их выращивали во флаконах для культивирования тканей (175 см²) с использованием RPMI-1640 (Hyclone, Thermo Scientific, USA) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (РАА, Thermo Scientific, USA).

Клеточный осадок ресуспендировали в среде для анализа (RPMI, 10% FCS) и проводили подсчет клеток. Концентрацию клеток доводили до 5×10⁶/мл для мечения хромом-51.

5×10⁶ клеток метили 3,7 МБк хрома-51 (⁵¹Cr) (PerkinElmer, Netherlands) в объеме 1 мл при 37°C в течение 1 часа. Меченые клетки три раза промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин). Меченые клетки разделяли на аликвоты равного объема для связывания 20 мкг/мл HH1 мыши, 20 мкг/мл ритуксимаба, 20 мкг/мл chHH1.1 (изотип IgG1) или комбинацией 20 мкг/мл ритуксимаба и 20 мкг/мл chHH1.1, в том числе для контроля без антител. Все образцы инкубировали при 37°C в течение 10 мин, затем центрифугировали и дважды промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин).

Клетки-мишени культивировали с 10% сывороткой в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах в конечном объеме 200 мкл. В качестве контроля клетки-мишени культивировали только в среде для анализа (спонтанный лизис) и в среде для анализа с 1% Triton X-100 (максимальный лизис, общее выделение).

Все образцы изготовили в трех повторностях. Совместную культуру инкубировали при 37°C в CO₂-инкубаторе с увлажнением в течение 2 часов. Цитотоксический эффект измеряли по выделению ⁵¹Cr в супернатант. В конце инкубации клетки удаляли из среды для культивирования центрифугированием (1500 оборотов в минуту, 5 минут) при комнатной температуре. Свободные от клеток супернатанты (150 мкл/лунку) переносили в сответствующие 96-луночному планшету микропробирки 0,2 мл. Количество выделенного ⁵¹Cr измеряли с помощью гамма-счетчика (Cobra II, Packard, land).

% специфического лизиса рассчитывали по следующей формуле: 100 × (экспериментальное выделение - спонтанное выделение)/(общее выделение - спонтанное выделение). Экспериментальное выделение является средним значением повторностей обработанных образцов. Для каждой обработки антителом делали три повторности образцов для спонтанного выделения и полного выделения, и использовали средние значения для экспериментальных образцов с обработкой соответствующим антителом.

Результаты:

На фигуре 5 показано, что отдельно chHH1.1 не работает через механизм CDC, но chHH1.1 и ритуксимаб вместе имели больший эффект на специфический лизис, чем суммарный эффект ритуксимаба и chHH1.1 по отдельности.

Выводы:

CDC не является активным механизмом действия для chHH1.1 отдельно. Однако, обнаружили синергический эффект совместной обработки chHH1.1 и ритуксимабом.

Пример 12: Связывание ¹²⁵I-chHH1.3 с клетками Ramos Материалы и методы:

Химерное HH1 изотипа IgG3 (chHHl.3) и HH1 мыши (mHH1) метили ¹²⁵I с применеием метода непрямого йодирования в соответствии с методикой, описанной производителем пробирок для йодирования (Pierce, UK). В одном эксперименте клетки Ramos блокировали 20 мг chHH1.3 или mHH1 и метили радиоактивным изотопом I-chHH1.3 для измерения неспецифического связывания.

В другом эксперименте клетки Ramos блокировали 20 мг chHH1.3, mHH1 или chHH1.1, а затем метили радиоактивным изотопом с ¹²⁵I-mHH1 для измерения неспецифического связывания. Связывание с незаблокированными клетками в обоих экспериментах использовали для измерения общего связывания.

Последовательность ДНК полноразмерной тяжелой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 10.

Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 11.

Последовательность ДНК полноразмерной тяжелой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 12.

Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи Fc chHH1.3 с мутацией представлена в SEQ ID NO: 13.

Последовательность Fc chHH1.3 без мутации (константная область) представлена в SEQ ID NO: 14.

Результаты:

Когда незаблокированные клетки Ramos метили радиоактивным изотопом с помощью ¹²⁵I-chHH1.3, общее связывание составило 81%, а когда клетки Ramos метили радиоактивным изотопом с помощью ¹²⁵I-mHH1, общее связывание составило 77%. Однако когда заблокированные chHH1.3 или mHH1 клетки метили радиоактивным изотопом с помощью ¹²⁵I-chHH1.3, неспецифическое связывание составило 0,8% и 44% соответственно, что указывает, что chHH1.3 имеет более высокое сродство к антигену CD37, чем mHH1. Кроме того, когда блокированные chHH1.3, mHH1 или chHH1.1 клетки метили радиоактивным изотопом с помощью ¹²⁵I-mHH1, неспецифическое связывание составило 0,3%, 0,5% и 0,7%, соответственно, что означает, что три антитела связываются с тем же эпитопом на антигене CD37.

Выводы:

Результаты показали, что mHH1, chHH1.1 и chHH1.3 связываются с одинаковым эпитопом на CD37. Неожиданно, сродство chHH1.3 было выше, чем у mHH1.

Пример 13: Биораспределение ¹²⁵I-chHH1.3 в голых мышах

Материалы и методы:

Химерное HH1 изотипа IgG3 (chHH1.3) метили ¹²⁵I с применением метода непрямого йодирования в соответствии с методикой, описанной производителем пробирок для йодирования (Pierce, UK).

Препараты вводили в хвостовую вену инъекцией 100 мкл раствора для каждого животного. В мышей вводили дозу с активностью 600 кБк. Для одной временной точки использовали двух животных. Вскрытие проводили после цервикальной дислокации через 24 часа и 48 часов после инъекции. Определяли вес каждого образца ткани и измеряли активность I в каждом образце ткани с помощью калиброванного гамма-счетчика (Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA). Образцы вводимого раствора использовали в качестве контроля при измерении. Для каждой временной точки корректировали процент распада введенной дозы на грамм ткани (% ID/г).

Результаты и выводы:

Антитело ChHH1.3 продемонстрировало соответствующее распределение в голых мышах (фигура 6).

Фигура 6. Биораспределение (% ID/г) ¹²⁵I-chHH1.3 в женских особях голых мышей через 24 и 48 часов после инъекции.

Пример 14: ADCC и CDC активность chHHl.3 на клетках Daudi

Материалы и методы:

Для экспериментов по определению ADCC и CDC проводили те же процедуры, что описаны в примерах 10 и 11, кроме того, что использовали коммерчески доступную сыворотку для анализа CDC и РВМС стимулировали в течение ночи 25 нг/мл рекомбинантного IL-2 человека (eBiosciences) перед выделением натуральных киллеров, с применением того же подхода, что и в примере 7. Для выделения PBMC кровь отбирали у двух индивидуумов в пробирки с ЭДТА.

В качестве клеток-мишеней для анализа цитотоксичности использовали клетки лимфомы линии Daudi (LG standards, Boras, Sweden) (клетки-мишени). Их выращивали во флаконах для культивирования тканей (175 см²) с использованием RPMI-1640 (Hyclone, Thermo Scientific, USA) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (PAA, Thermo Scientific, USA).

Клеточный осадок ресуспендировали в среде для анализа (RPMI, 10% FCS) и проводили подсчет клеток. Концентрацию клеток доводили до 5×10⁶/мл для мечения хромом-51.

5×10⁶ клеток Daudi метили 4 МБк хрома-51 (⁵¹Cr) (PerkinElmer, Netherlands) в объеме 1 мл при 37°C в течение 1 часа. Меченые клетки три раза промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин). Меченые клетки разделяли на аликвоты равного объема для связывания 20 мг/мл антитела chHH1.3 или комбинации chHH1.3 и ритуксимаба, каждого по 20 мг/мл, а также для контроля без антитела. Все образцы инкубировали при 37°C в течение 10 мин, затем центрифугировали и дважды промывали DPBS с 2% FCS центрифугированием (2000 оборотов в минуту, 5 мин).

Для анализа CDC клетки-мишени Daudi культивировали с 10 и 30% сывороткой в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах в конечном объеме 200 мкл. Для ADCC эффекторные NK клетки культивировали с клетками-мишенями Daudi в соотношении 10:1 (индивидуум 1) или 15:1 (индивидуум 2) в 96-луночных круглодонных микротитрационных планшетах в конечном объеме 200 мкл.

В качестве контроля клетки-мишени культивировали только в среде для анализа (спонтанный лизис) и в среде для анализа с 1% Triton X-100 (максимальный лизис, общее выделение).

Все образцы изготовили в трех повторностях. Совместную культуру инкубировали при 37°C в CO₂-инкубаторе с увлажнением в течение 2 часов. Цитотоксический эффект измеряли по выделению ⁵¹Cr в супернатант. В конце инкубации клетки удаляли из среды для культивирования центрифугированием (1500 оборотов в минуту, 5 минут) при комнатной температуре. Свободные от клеток супернатанты (150 мкл/лунку) переносили в соответствующие 96-луночному планшету микропробирки 0,2 мл. Количество выделенного ⁵¹Cr измеряли с помощью гамма-счетчика (Cobra II, Packard, land).

% специфического лизиса рассчитывали по следующей формуле: 100 × (экспериментальное выделение - спонтанное выделение)/(общее выделение - спонтанное выделение). Экспериментальное выделение является средним значением повторностей обработанных образцов. Для каждой обработки антителом делали три повторности образцов для спонтанного выделения и полного выделения и использовали средние значения для экспериментальных образцов с обработкой соответствующим антителом.

Результаты:

Антитело chHH1.3 не вызвало специфического лизиса клеток B-клеточной лимфомы линии Daudi по механизму CDC. Однако наблюдали четкий эффект антитела chHH1.3 на специфический лизис клеток Daudi по механизму ADCC (фигура 7).

Выводы:

CDC не является активным механизмом, в то время как ADCC является активным механизмом для chHHl.3 с клетками Daudi в качестве мишени.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложена молекула антитела, связывающегося с CD37 человека и имеющего константные области человеческого происхождения. Также рассмотрена молекула ДНК, кодирующая такое антитело, экспрессионный вектор, клетка-хозяин и способ получения антитела. Кроме того, описаны радиоиммуноконъюгат на основе упомянутого антитела и набор для его получения, а также фармацевтические композиции, способ элиминации В-клеток и способ лечения В-клеточных злокачественных новообразований. Химерное антитело по настоящему изобретению вызывает антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в большей степени по сравнению с антителом Ритуксимаб. Благодаря способности связывать CD37 человека и вызывать ADCC предложенное антитело может найти дальнейшее применение в терапии. 11 н.п. ф-лы, 7 ил., 14 пр., 3 табл.

1. Молекула антитела, которая связывается с CD37 человека и которая является химерным антителом, которое определяется

i) вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1;

ii) вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3,

iii) константными областями тяжелой и легкой цепей, которые имеют человеческое происхождение, причем указанная константная область тяжелой цепи i) содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, и при этом указанная константная область легкой цепи ii) содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 9.

2. Молекула ДНК, кодирующая антитело по п. 1, причем участок, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, соединен с областью, кодирующей константную область тяжелой цепи человеческого происхождения, и при этом указанная константная область тяжелой цепи человека представляет собой IgG1 и указанный IgG1 кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

3. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу ДНК по п. 2.

4. Клетка-хозяин, несущая один или более векторов по п. 3.

5. Способ получения антитела по п. 1, включающий трансфекцию клетки-хозяина млекопитающего одним или более векторами по п. 3, культивирование указанной клетки-хозяина и выделение и очистку молекулы антитела.

6. Фармацевтическая композиция для лечения В-клеточных злокачественных новообразований, содержащая в качестве активного ингредиента одну или более молекул антитела против CD37 по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель, причем количество антитела НН1 составляет по меньшей мере 0,5 мг и не более 1 г.

7. Способ элиминации экспрессирующих CD37 В-клеток из популяции клеток, включающий введение к указанной популяции клеток молекулы антитела по п. 1 или фармацевтической композиции, содержащей такую молекулу антитела, по п. 6.

8. Радиоиммуноконъюгат для лечения В-клеточных злокачественных новообразований, который связывает СD37 человека, содержащий:

а) антитело по п. 1,

б) линкер и

в) радионуклид, выбранный из группы, состоящей из ²¹¹At, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ¹⁹⁴Ir, ¹⁶⁶Ho, ¹⁵⁹Gd, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹¹¹Ag, ¹⁰⁹Pd, ⁷⁷As, ⁶⁷Cu, ⁴⁷Sc и ¹⁷⁷Lu.

9. Фармацевтическая композиция для лечения В-клеточных злокачественных новообразований, содержащая радиоиммуноконъюгат по п. 8 и фармацевтически приемлемый носитель, причем количество антитела НН1 составляет по меньшей мере 0,5 мг и не более 1 г.

10. Способ лечения В-клеточных злокачественных новообразований, выбранных из группы, состоящей из В-клеточной неходжкинской лимфомы, В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы и миеломной болезни, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 6 и 9.

11. Набор для получения радиоиммуноконъюгата по п. 8, содержащий два или более флакона, причем один флакон содержит конъюгат, содержащий хелатирующий агент, связанный с антителом по п. 1, и второй флакон содержит радионуклид.