АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУКТА ДЛЯ АДРЕСНОЙ ДОСТАВКИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА Российский патент 2018 года по МПК C07K16/28 

Данное изобретение относится к новому антигенсвязывающему белку, в частности к моноклональному антителу, способному специфически связываться с белком Axl, а также к аминокислотной и нуклеотидной последовательностям, кодирующим указанный белок. В одном аспекте изобретение относится к новому антигенсвязывающему белку или антигенсвязывающим фрагментам, способным специфически связываться с Axl и, вызывая интернализацию Axl, подвергаться интернализации в клетку. Изобретение также относится к применению указанного антигенсвязывающего белка в качестве продукта для адресной доставки при конъюгации с другими противоопухолевыми соединениями, такими как токсины, радиоактивные элементы или лекарственные средства, а также его применению при лечении некоторых форм рака.

"Axl" (также обозначаемый "Ufo", "Ark" или "Tyro7") был клонирован из клеток пациентов с хроническим миелоидным лейкозом как онкоген, который при сверхэкспрессии в мышиных NIH3T3 вызывал трансформацию этих клеток. Он относится к семейству рецепторов, обладающих тирозинкиназной активностью (RTK, от англ. receptor tyrosine kinases), носящему название семейства ТАМ (Tyro3, Axl, Mer), включающему Tyro3 (Rse, Sky, Dtk, Etk, Brt, Tif), Axl и Mer (Eyk, Nyk, Tyro-12) [Lemke G. Nat. Rev. Immunol. (2008).8, 327-336].

Человеческий белок Axl представляет собой белок, состоящий из 894 аминокислот, последовательность которого представлена последовательностью SEQ ID NO. 29. Аминокислоты 1-25 соответствуют сигнальному пептиду, а человеческий белок Axl, без указанного сигнального пептида, представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO. 30.

Gas6, первоначально выделенный как ген блокировки роста, является общим лигандом для представителей семейства ТАМ [Varnum B.C. et al. Nature (1995).373, 623-626]. Gas6 обладает наибольшей аффинностью к Axl, за ним следует Tyro3 и, наконец, Mer [Nagata K. et al. J. Biol. Chem. (1996).271, 30022-30027]. Gas6 содержит домен, богатый γ-карбоксиглутаминовой кислотой (Gla), который опосредует связывание с фосфолипидными мембранами, четыре домена, подобных эпидермальному фактору роста, и два ламинин G-подобных (LG, от англ. laminin G-like) домена [Manfioletti G., Brancolini, C, Avanzi, G. & Schneider, С. Mol. Cell Biol. (1993).13, 4976-4985]. Как и у многих других RTK, связывание лиганда приводит к димеризации рецептора и аутофосфорилированию остатков тирозина (тирозиновые остатки 779, 821 и 866 рецептора Axl), которые служат сайтами присоединения множества внутриклеточных сигнальных молекул [Linger R.M. Adv. Cancer Res. (2008).100, 35-83]. Кроме того, рецептор Axl может активироваться при лиганд-независимых процессах. Такая активация может иметь место при сверхэкспрессии рецептора Axl.

Известно, что сигнальный путь Gas6/Axl регулирует различные клеточные процессы у целого ряда клеток in vitro, включая клеточную пролиферацию, адгезию, миграцию и выживаемость [Hafizi S. & Dahlback. B. FEBS J. (2006).273, 5231-5244]. Кроме того, рецепторы ТАМ участвуют в контролировании врожденного иммунитета; они ингибируют воспалительные ответы на патогены у дендритных клеток (ДК) и макрофагов. Они также способствуют фагоцитозу апоптотических клеток этими клетками иммунной системы и необходимы для созревания и цитолитической активности естественных киллерных (NK, от англ. natural killer) клеток [Lemke G. Nat. Rev. Immunol. (2008).8, 327-336].

При слабой экспрессии нормальными клетками, он преимущественно обнаруживается на фибробластах, миелоидных клетках-предшественниках, макрофагах, нервной ткани, сердечной и скелетной мускулатуре, где он преимущественно поддерживает выживаемость клеток. Система Gas6/Axl играет важную роль в сосудистой биологии, регулируя гомеостаз гладкомышечных клеток сосудистой стенки [Korshunov V.Α., Mohan, A.M., Georger, M.A. & Berk, B.C. Circ. Res. (2006).98, 1446-1452; Korshunov V.A., Daul, M., Massett, MP. & Berk, B.C. Hypertension (2007).50, 1057-1062].

Axl играет важную роль в регуляции инвазии и миграции опухолевых клеток. Сверхэкспрессия Axl ассоциирована не только с неблагоприятным прогнозом, но также с повышенной опухолевой инвазией при различных формах рака человека, что описано для рака молочной железы, толстой кишки, карциномы пищевода, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, глиомы, рака легкого, меланомы, остеосаркомы, рака яичников, предстательной железы, рабдомиосаркомы, рака почки, щитовидной железы и рака эндометрия матки [см. обзоры Linger R.M. Adv. Cancer Res. (2008).100, 35-83 and Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011).10, 1763-1773]. При раке молочной железы Axl является мощным эффектором эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП); механизм ЭМП играет важную роль в миграции и диссеминации опухолевых клеток в организме [Thiery J.P. Curr. Opin. Cell Biol. (2003).15, 740-746].

Также было показано, что Axl регулирует ангиогенез. Действительно, инактивация (нокдаун) Axl в эндотелиальных клетках нарушает формирование микротрубочек и миграцию [Holland S.J. et al. Cancer Res. (2005).65, 9294-9303], а также нарушает работу определенных сигнальных путей, участвующих в регуляции ангиогенеза [Li Y. et al. Oncogene (2009).28, 3442-3455].

Совсем недавно в нескольких исследованиях с использованием ряда клеточных моделей было продемонстрировано, что сверхэкспрессия Axl связана с феноменом резистентности к лекарственным препаратам. В приведенной ниже Таблице 1 обобщены данные этих исследований.

В Таблице 1 процитированы следующие публикации:

- Macleod, K. et al. Cancer Res. (2005).65, 6789-6800

- Mahadevan D. et al. Oncogene (2007).26, 3909-3919

- Lay J.D. et al. Cancer Res. (2007).67, 3878-3887

- Hong С.C. et al. Cancer Lett. (2008).268, 314-324

- Liu L. et al. Cancer Res. (2009).69, 6871-6878

- Keating A.K. et al. Mol. Cancer Ther. (2010).9, 1298-1307

- Ye X. et al. Oncogene (2010).29, 5254-5264

В связи с этим, Axl RTK является мишенью, представляющей интерес для онкологии. Несколько групп исследователей уже разработали противоопухолевые стратегии, нацеленные на ось gas6/Axl, в которых используются голые моноклональные антитела или низкомолекулярные ингибиторы [Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011).10, 1763-1773].

В первом воплощении изобретение относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, который i) специфически связывается с человеческим белком Axl и ii) подвергается интернализации после его связывания с указанным человеческим белком Axl.

В общем, изобретение относится к применению белка Axl для отбора антигенсвязывающего белка или его антигенсвязывающего фрагмента, способного подвергаться интернализации после связывания с указанной мишенью Axl. Более конкретно, указанная мишень представляет собой внеклеточный домен Axl.

Таким образом, этот конкретный аспект данного изобретения относится к способу проведения скрининга in vitro в отношении соединения или его связывающего фрагмента, способных осуществлять доставку в клетки млекопитающих или интернализацию клетками млекопитающих молекулы, представляющей интерес, указанная молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с указанным соединением, при этом указанный способ включает следующие этапы:

a) отбор соединения, способного специфически связываться с белком Axl или его внеклеточным доменом (ECD) или его эпитопом;

b) возможно, ковалентное связывание указанной молекулы, представляющей интерес, или молекулы, служащей в качестве контроля, с указанным соединением, отобранным на этапе а), с образованием комплекса;

c) приведение в контакт указанного соединения, отобранного на этапе а), или указанного комплекса, полученного на этапе b), с клеткой млекопитающего, предпочтительно, с жизнеспособной клеткой, экспрессирующей на своей поверхности белок Axl или его функциональный фрагмент;

d) определение, были ли указанное соединение или указанная молекула, представляющие интерес, или указанный комплекс доставлены внутрь клетки или подверглись ли интернализации указанной клеткой млекопитающего; и

e) отбор указанного соединения в качестве соединения, способного обеспечивать доставку в жизнеспособную клетку млекопитающего или интернализацию жизнеспособной клеткой млекопитающего молекулы, представляющей интерес.

В предпочтительном воплощении указанное соединение, способное обеспечивать доставку в жизнеспособную клетку млекопитающего или интернализацию жизнеспособной клеткой млекопитающего молекулы, представляющей интерес, представляет собой белок (также обозначаемый в данном документе полипептидом или пептидом) или подобное белку соединение, имеющее пептидную структуру, в частности, аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5, 10, 15 или более аминокислотных остатков, указанный аминокислотные остатки могут быть гликозилированы.

Когда указанное соединение, способное обеспечивать доставку в жизнеспособную клетку млекопитающего или интернализацию жизнеспособной клеткой млекопитающего молекулы, представляющей интерес, представляет собой белок или подобное белку соединение, указанное соединение в данном документе также обозначается "антигенсвязывающим белком", указанный антигенсвязывающий белок или его связывающий фрагмент способны:

- i) специфически связываться с белком Axl, предпочтительно с человеческим белком Axl, и

- ii) подвергаться интернализации в клетку млекопитающего после связывания с указанным белком Axl, когда указанный белок Axl экспрессируется на поверхности указанной клетки млекопитающего.

В предпочтительном воплощении указанная жизнеспособная клетка млекопитающего представляет собой человеческую клетку, предпочтительно, клетку, характеризующуюся естественной экспрессией белкового рецептора Axl.

В конкретном воплощении жизнеспособные клетки млекопитающих на этапе с) представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие на своей поверхности рекомбинантный(ые) белок(белки) Axl.

В другом предпочтительном воплощении указанная молекула, представляющая интерес, представляет собой цитотоксическую молекулу (также обозначаемую в данном документе цитотоксическим или цитостатическим агентом).

В другом предпочтительном воплощении указанная молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с указанным соединением, способным связывать белок Axl, при помощи линкера, более предпочтительно, пептидного линкера, более предпочтительно расщепляемого пептидного линкера, более предпочтительно, линкера, который может расщепляться под воздействием естественных внутриклеточных компонентов, содержащихся в клетках млекопитающих, в частности, в цитозоле указанных клеток млекопитающих.

В еще одном предпочтительном воплощении указанное соединение, способное связывать белок Axl, представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент, специфические в отношении белка Axl или в отношении его эпитопа, расположенного в составе внеклеточного домена Axl.

Этап отбора согласно е) можно осуществлять любым способом, известным специалистам в данной области, для оценки внутриклеточной доставки или интернализации. Исследование или анализ, способные продемонстрировать или оценить наличие, отсутствие или активность указанного соединения, способного специфически связывать белок Axl, или указанного комплекса, образованного указанным соединением и указанной молекулой, представляющей интерес, или указанной молекулы, представляющей интерес, ковалентно связанной с указанным соединением, хорошо известны специалистам (см. некоторые примеры таких анализов или исследований, раскрытые ниже, но не являющиеся исчерпывающими).

Более конкретно, эти анализы или исследования можно осуществлять с использованием метода FACS (от англ. fluorescence-activated cell sorting, флуоресцентная сортировка клеток), иммунофлуоресцентных методов, проточной цитомерии, вестерн-блоттинга, исследования цитотоксического/цитостатического эффекта и т.д.

В данном аспекте настоящее изобретение также относится к способу получения in vitro цитотоксического или цитостатического комплекса, способного обеспечивать доставку цитотоксического компонента в клетку млекопитающего, предпочтительно жизнеспособную клетку, указанный способ включает этапы:

- ковалентного связывания цитотоксического агента с соединением, которое:

- i) способно специфически связывать белок Axl, предпочтительно белок Axl человека и

- ii) подвергается интернализации клеткой млекопитающего после связывания с указанным белком Axl, причем указанный белок Axl экспрессируется на поверхности указанной клетки млекопитающего.

Предпочтительно, указанное соединение представляет собой подобное белку соединение, более предпочтительно, антитело, которое является специфическим в отношении белка Axl или в отношении его эпитопа, расположенного во внеклеточном домене Axl, или функционального связывающего фрагмента указанного антитела.

В предпочтительном воплощении указанный цитотоксический агент ковалентно связан с указанным антителом к Axl или его функциональным фрагментом при помощи линкера, более предпочтительно пептидного линкера, более предпочтительно расщепляемого пептидного линкера, более предпочтительно линкера, который может быть расщеплен, например, под воздействием естественных внутриклеточных соединений, что не имеет ограничительного характера.

Как и у других представители семейства ТАМ, внеклеточный домен (ECD) Axl имеет строение, близкое к строению внеклеточного домена адгезивных молекул. Внеклеточный домен Axl содержит два иммуноглобулин-подобных домена, к которым примыкает два фибронектин III-подобных домена_[O'Bryan J.P. et al. Mol. Cell Biol. (1991).11, 5016-5031]. Для связывания лиганда Gas6 достаточно двух N-концевых иммуноглобулин-подобных доменов [Sasaki T. et al. EMBO J. (2006).25, 80-87].

Внеклеточный домен человеческого белка Axl представляет собой фрагмент из 451 аминокислотного остатка, соответствующих аминокислотам 1-451 последовательности SEQ ID NO. 29, эта последовательность представлена в перечне последовательностей как SEQ ID NO. 31. Аминокислоты 1-25 соответствуют сигнальному пептиду, внеклеточный домен человеческого белка Axl без сигнального пептида соответствует аминокислотам 26-451 последовательности SEQ ID NO.29 и представлен последовательностью SEQ ID NO. 32.

На данный момент выявлено несколько способов интернализации. Они определяют путь белков или белковых комплексов, подвергшихся интернализации, в клетке. После эндоцитоза большинство мембранных белков или липидов возвращаются на клеточную поверхность (рециркуляция), но некоторые мембранные компоненты поступают в поздние эндосомы или комплекс Гольджи [Maxfield F.R. & McGraw, Т.Е. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2004).5, 121-132].

В предпочтительном воплощении изобретение относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, который i) специфически связывается с человеческим белком Axl, и ii) подвергается интернализации после связывания с указанным человеческим белком Axl, указанный антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs. 1-14 или любой последовательности, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 1-14.

В наиболее предпочтительном воплощении изобретение относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, который

i) специфически связывается с человеческим белком Axl, предпочтительно имеющим последовательность SEQ ID NO. 29 или 30 или естественный вариант его последовательности, и

ii) подвергается интернализации после связывания с указанным человеческим белком Axl,

указанный антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 1-14.

"Связывающий белок" или "антигенсвязывающий белок" представляет собой пептидную цепь, обладающую специфической или общей аффинностью к другому белку или молекуле (которая обычно обозначается антиген). Белки приходят в контакт и образуют комплекс, когда связывание является возможным. Антигенсвязывающий белок по изобретению предпочтительно может быть антителом, фрагментом или производным антитела, белка или пептида, но не исчерпывается этими примерами.

Под "антигенсвязывающим фрагментом" антигенсвязывающего белка по изобретению подразумевают любой пептид, полипептид или белок, сохраняющий способность специфически связываться с мишенью (как правило, также обозначаемой антигеном) и содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере из 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности антигенсвязывающего белка.

В предпочтительном воплощении, в котором антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, такие "антигенсвязывающие фрагменты" выбраны из группы, состоящей из Fv, scFv (sc обозначает одноцепочечный, от англ. single chain), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc фрагментов или диател или любых фрагментов, время полужизни которых увеличено путем химической модификации, например, такой как добавление поли(алкилен)гликоля, такого как поли(этилен)гликоль ("пегилирование") (пегилированные фрагменты обозначают Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')₂-ПЭГ или Fab'-ПЭГ) ("ПЭГ обозначает Поли(Этилен)Гликоль), или путем включения в липосомы, при этом указанные фрагменты содержат по меньшей мере один из CDR, присущих антителу по изобретению. Предпочтительно, указанные "антигенсвязывающие фрагменты" будут состоять из или будут содержать часть вариабельного участка последовательности тяжелой или легкой цепи антитела, из которого они получены, указанная часть последовательности достаточна для сохранения той же специфичности связывания, что и у антитела, из которого они происходят, и достаточной аффинности к мишени, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100, более предпочтительно по меньшей мере 1/10 от аффинности антитела, из которого они происходят. Такой функциональный фрагмент будет содержать как минимум 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 последовательных аминокислот последовательности антитела, из которого он происходит.

Термин "эпитоп" обозначает участок антигена, связанный с антигенсвязывающим белком, включая антитела. Эпитопы можно охарактеризовать как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы обычно представляют собой подгруппу структурных эпитопов и имеют остатки, которые вносят непосредственный вклад в аффинность связывания. Эпитопы могут также быть конформационными, т.е. состоящими из аминокислот, расположенных нелинейно. В некоторых воплощениях эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, углеводные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы и, в некоторых воплощениях, могут обладать определенной трехмерной структурой и/или определенным зарядом.

В данном описании эпитоп локализуется во внеклеточном домене человеческого белка Axl.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене человеческого белка Axl, предпочтительно имеющем последовательность SEQ ID NO. 31 или 32 или естественный вариант его последовательности.

Понятия "специфическое связывание", "специфически связывается" и т.п. означают, что антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, являющийся относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать равновесной константой диссоциации, равной по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 M или менее. Способы определения специфического связывания двух молекул хорошо известны в области техники и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Во избежание сомнений, это не означает, что указанный антигенсвязывающий фрагмент не может связываться или взаимодействовать с другим антигеном в низких концентрациях. Тем не менее, в предпочтительном воплощении указанный антигенсвязывающий фрагмент связывается только с указанным антигеном.

В этом контексте "ЕС₅₀" обозначает 50% эффективную концентрацию. Более конкретно термин полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС₅₀) соответствует концентрации лекарства, антитела или токсического вещества, которая вызывает ответ, находящийся посередине между базовой линией и максимумом после некоторого определенного времени воздействия. Его часто используют как показатель эффективности лекарства. Таким образом, значение ЕС₅₀ непрерывной кривой «доза-эффект» представляет концентрацию соединения, при которой наблюдается эффект, составляющий 50% от максимального. ЕС₅₀ дискретной кривой «доза-эффект» представляет концентрацию соединения, вызывающую ожидаемый эффект у 50% особей популяции после определенной длительности воздействия. Зависимость эффекта от концентрации, как правило, описывается сигмоидной кривой, и эффективность резко возрастает при относительно небольшом изменении концентрации. Ее можно вывести математически при проведении линии наилучшего соответствия.

В предпочтительном воплощении данного изобретения определение ЕС₅₀ характеризует эффективность связывания антитела с внеклеточным доменом Axl, экспрессируемого опухолевыми клетками. Показатель ЕС₅₀ определяют с помощью FACS-анализа. Показатель ЕС₅₀ отражает концентрацию антитела, при которой связывание с человеческим Axl, экспрессируемым опухолевыми клетками, составляет 50% от максимально возможного. Каждое значение ЕС₅₀ определяют как среднюю точку на кривой зависимости «доза-эффект», с помощью программы для построения четырех-параметрической регрессионной модели (Prism Software). Этот показатель выбран как репрезентативный для физиологических/патологических состояний.

В воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент связываются со своим эпитопом со значением ЕС₅₀, равным по меньшей мере 10^-9 М, предпочтительно между 10^-9 и 10^-12 М.

Другое воплощение изобретения представляет собой процесс или способ для отбора антигенсвязывающего белка или его антигенсвязывающего фрагмента, способных подвергаться внутриклеточной интернализации клеткой млекопитающего, предпочтительно человеческой клеткой, предпочтительно жизнеспособной клеткой, включающий этапы:

- i) отбора антигенсвязывающего белка, специфически связывающегося с Axl, предпочтительно с его внеклеточным доменом или его эпитопом; и

- ii) отбора указанного антигенсвязывающего белка из предыдущего этапа i) который подвергается интернализации клеткой млекопитающего после связывания с белком Axl, экспрессирующимся на поверхности указанной клетки млекопитающего.

В конкретном воплощении указанная клетка млекопитающего естественным образом экспрессирует белковый рецептор Axl на своей поверхности или представляет собой клетку млекопитающего, экспрессирующую рекомбинантный белок Axl на своей поверхности, предпочтительно человеческую клетку.

Такой способ или процесс может включать этапы i) отбора антигенсвязывающего белка, специфически связывающегося с Axl со значением ЕС₅₀, равным по меньшей мере 10^-9 M и ii) отбора антигенсвязывающего белка из предыдущего этапа, который подвергается интернализации после связывания с Axl. Этап отбора согласно ii) можно осуществлять способом для оценки интернализации, известным специалисту в данной области. Более конкретно, исследования можно осуществлять с использованием метода FACS, иммунофлуоресцентных методов, проточной цитомерии, вестерн-блоттинга, исследования цитотоксического/цитостатического эффекта и т.д.

Другой характерной особенностью антигенсвязывающего белка согласно изобретению является то, что он не проявляет существенной активности в отношении пролиферации опухолевых клеток. Более конкретно, как показано в следующих примерах, антигенсвязывающий белок по изобретению не проявляет какой-либо существенной активности in vitro в отношении пролиферации на модели клеток SN12C.

В онкологии существует множество механизмов, в соответствии с которыми моноклональные антитела (МкАт) могут проявлять свое терапевтическое действие, но зачастую их активность является недостаточной для обеспечения долговременного эффекта. В связи с этим было разработано несколько стратегий для усиления их активности, в частности их комбинирование с такими лекарствами, как химиотерапевтические агенты. Иммунотоксины представляют собой новый возможный метод лечения рака, являющийся эффективной альтернативой комбинированной терапии [Beck A. et al. Discov. Med. (2010).10, 329-339; Alley S.C. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009).330, 932-938]. Конъюгаты антитело-лекарство (ADC, от англ. antibody-drug conjugate) представляют собой один из подходов, при котором возможность использовать специфичность МкАт и осуществлять направленную доставку цитотоксического агента к опухоли могут существенно повысить активность как МкАт, так и лекарственного средства. Предпочтительно, МкАт будет специфически связываться с антигеном, характеризующимся значительной экспрессией на опухолевых клетках, но низким уровнем экспрессии на нормальных клетках.

Данное изобретение относится к специфическому белку, связывающемуся с Axl, более конкретно, к специфическому антителу, направленному против Axl, обладающему высокой способностью подвергаться интернализации после связывания с Axl. Такой антигенсвязывающий белок представляет интерес в качестве одного из компонентов иммуноконъюгата с лекарственным средством, поскольку он осуществляет адресную доставку присоединенного цитотоксического агента в опухолевые клетки-мишени. После интернализации цитотоксический агент запускает гибель опухолевой клетки.

Важной составляющей успеха терапии иммуноконъюгатами считается специфичность к антигену-мишени и интернализация комплексов антигенсвязывающий белок опухолевыми клетками. Очевидно, что антигены, не подвергающиеся интернализации, менее эффективно осуществляют доставку цитотоксических агентов по сравнению с антигенами, которые подвергаются интернализации. Процессы интернализации могут варьироваться в зависимости от антигена и зависят от множества парамеров, на которые могут оказывать влияние присоединяемые белки. RTK клеточной поверхности являются семейством антигенов, представляющим интерес для исследования этого подхода.

Цитотоксический агент в составе биомолекулы обеспечивает цитотоксическую активность, а антигенсвязывающий белок обеспечивает ее специфичность в отношении опухолевых клеток, и служит вектором, проникающим в клетки и обеспечивающим надлежащую адресную доставку цитотоксического агента.

Таким образом, для улучшения свойств молекулы иммуноконъюгата белок, связывающийся с носителем, должен проявлять выраженную способность к интернализации опухолевыми клетками-мишенями. Эффективность, с которой связывающиеся белки опосредуют интернализацию, существенно отличается в зависимости от эпитопа, являющегося мишенью. Для отбора белков, эффективно связывающихся с Axl и подвергающихся интернализации, требуется экспериментальное изучение не только снижения уровня экспрессии Axl, но и отслеживание прохождения Axl-связывающих белков в клетки.

В предпочтительном воплощении интернализацию антигенсвязывающего белка согласно изобретению предпочтительно оценивают методом иммунофлуоресценции (как показано в Примере, приведенном ниже в данном документе) или другим способом или процессом, специфическим в отношении механизма интернализации, известным специалисту в данной области.

В другом предпочтительном воплощении комплекс Axl-антигенсвязывающий белок, согласно изобретению, подвергается интернализации после присоединения связывающего белка по изобретению к внеклеточному домену указанного Axl, вызывая снижение количества Axl на поверхности клеток. Это снижение можно оценить любым способом, известным специалисту в данной области (вестерн-блоттинг, FACS, иммунофлуоресценция, и т.д.).

В воплощении изобретения данное снижение, отражающее интернализацию, предпочтительно оценивают методом FACS и выражают как разницу или показатель дельта между средней интенсивностью флуоресценции (MFI, от англ. Mean Fluorescence Intensity) необработанных клеток и MFI клеток после воздействия антигенсвязывающего белка по изобретению.

Неисчерпывающим примером данного изобретения является определение показателя дельта на основе MFI, полученной с необработанными клетками и клетками после воздействия антигенсвязывающего белка по изобретению в соответствии с описанием в Примере 9 с использованием i) опухолевых клеток почки человека SN12C через 24 часа инкубации с антигенсвязывающим белком по изобретению и ii) вторичного антитела, меченного Alexa488. Этот параметр рассчитывают по следующей формуле:

Δ (MFI_24ч необработанных клеток - MFI_24ч клеток после воздействия антигенсвязывающего белка).

Это различие между MFI отражает снижение уровня экспрессии Axl, поскольку значения MFI пропорциональны экспрессии Axl на клеточной поверхности.

В более предпочтительном и преимущественном аспекте антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению представляют собой моноклональное антитело, предпочтительно выделенное МкАт, обусловливающее различие между MFI_24ч необработанных клеток и MFI_24ч обработанных клеток (значение Δ), составляющее по меньшей мере 200, предпочтительно по меньшей мере 300.

Антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению вызывают снижение MFI, составляющее по меньшей мере 200.

Более конкретно, вышеупомянутое значение дельта можно определить согласно следующему способу, который следует рассматривать как иллюстративный и неисчерпывающий пример:

a) обработка и инкубация опухолевых клеток, представляющих интерес, с антигенсвязывающим белком по изобретению;

b) воздействие антигенсвязывающего белка по изобретению на клетки, обработанные на этапе а) и, параллельно, на необработанные клетки,

c) измерение MFI обработанных и необработанных клеток (репрезентативных в отношении количества Axl, присутствующего на поверхности) с использованием вторичного антитела, способного связываться с антигенсвязывающим белком, и

d) расчет значения дельта при вычитании значения MFI, полученного для обработанных клеток, из значения MFI, полученного для необработанных клеток.

Термины "антитело", "антитела" или "иммуноглобулины" используются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают моноклональные антитела, предпочтительно выделенные МкАт, (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультивалентные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, проявляющие желаемую биологическую активность).

Более конкретно, такая молекула представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок (или домен) тяжелой цепи (в данном документе обозначается аббревиатурой HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (в данном документе обозначается аббревиатурой LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен, CL. Участки VH и VL можно дальше подразделить на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR, от англ. complementarity determining regions), перемежающиеся более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR, от англ. framework regions). Каждый участок VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент классического пути активации комплемента (C1q).

Антитела по изобретению также включают некоторые фрагменты антител. Указанные фрагменты антител проявляют необходимую специфичность и аффинность связывания, независимо от источника или типа иммуноглобулина (т.е., IgG, IgE, IgM, IgA, и т.д.), т.е. они способны специфически связываться с белком Axl с аффинностью, которая сопоставима с аффинностью полноразмерных антител по изобретению.

Как правило, для получения моноклональнх антител или их функциональных фрагментов, особенно имеющих мышиное происхождение, возможно обращаться к методам, описанным, в частности в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) или к методике получения с использованием гибридом, описанной Kohlerand Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

Термин "моноклональное антитело" или "МкАт" в данном документе обозначает молекулу антитела, направленную против специфического антигена, которую может продуцировать один клон В клеток или гибридома. Моноклональные антитела также могут быть рекомбинантными, т.е. полученными методами белковой инженерии. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, как правило, содержащими различные антитела, направленные против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена. Изобретение относится к антителам, выделенным или полученным путем очистки из природных источников, или полученных рекомбинантным методом или при помощи химического синтеза.

Предпочтительное воплощение изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему или представляющему собой антитело, указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3 или любые последовательности, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6 или любые последовательности, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 4, 5 и 6.

В более предпочтительном воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело, указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6.

В предпочтительном аспекте участками CDR или CDR(s) обозначают гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, в соответствии с IMGT. Без какого-либо противоречия, в данной заявке CDR определяют в соответствии с системой нумерации IMGT.

Единая нумерация IMGT была разработана для сравнения вариабельных доменов любых антигенных рецепторов, типов цепей или видов [Lefranc M.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. В единой нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда занимают одинаковое положение, например, цистеин 23 (1-й CYS), триптофан 41 (консервативный TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-й CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Единая нумерация IMGT позволяет стандартным образом установить границы каркасных участков (FR1-IMGT: позиции 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и участков, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Поскольку разрывы обозначают незанятые позиции, длина CDR-IMGT (показана в скобках и разделена точками, например, [8.8.13]) приобретает принципиальное значение. Единая нумерация IMGT используется для двумерных графических изображений, носящих название IMGT Colliers de Perles («жемчужные бусы») [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] и для трехмерных структур в базе данных IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Τ cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Следует понимать, что в данной заявке, не вызывая противоречий, участки, определяющие комплементарность, или CDR, обозначают гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов в соответствии с системой нумерации IMGT.

Однако устанавливать границы CDR можно и в соответствии с системой нумерации Kabat (Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, и более поздние издания). Существует три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. В данном документе термины "CDR" и "CDRs" используются для обозначения, в зависимости от обстоятельств, одного или более, или даже всех участков, содержащих большинство аминокислотных остатков, отвечающих за аффинность связывания антитела с антигеном или эпитопом, которые он распознает.

В соответствии с системой нумерации Kabat, данное изобретение относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, представляющим собой антитело, указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, границы которых установлены согласно системе нумерации Kabat, включающие последовательности SEQ ID NOs. 9, 10 и 11, или любые последовательности, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 9, 10 и 11; и три CDR тяжелой цепи, границы которых установлены согласно системе нумерации Kabat, включающие последовательности SEQ ID NOs. 12, 13 и 14, или любые последовательности, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 12, 13 и 14.

В данном изобретении выраженный в процентах показатель "идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот обозначает процентное содержание идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков для двух сравниваемых последовательностей, полученный при оптимальном выравнивании, этот показатель является исключительно статистическим и различия между двумя последовательностями распределены в последовательностях случайным образом. Сравнение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей как правило осуществляют путем сравнения последовательности после их оптимального выравнивания, указанное сравнение можно выполнять с использованием "окна сравнения". Оптимальное выравнивание сравниваемых последовательностей можно осуществлять, кроме сравнения вручную, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Смита и Уотермана (Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2: 482]), с помощью алгоритма поиска локальной гомологии Нидлмана и Вунша (Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]), с помощью поиска сходства методом Пирсона и Липмана (Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]) или с помощью компьютерной программы, использующей эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, или с помощью программ для сравнения BLAST NR или BLAST Ρ).

Выраженный в процентах показатель идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяют путем сравнения двух оптимальным образом выровненных последовательностей, причем сравниваемые нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут иметь вставки или делеции относительно референсной последовательности для достижения оптимального выравнивания двух последовательностей. Выраженный в процентах показатель идентичности рассчитывают, определяя число позиций, в которых аминокислотные остатки или нуклеотиды идентичны между двумя последовательностями, предпочтительно между двумя полными последовательностями, путем деления числа идентичных позиций на общее число позиций в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения выраженного в процентах показателя идентичности между двумя последовательностями.

Например, можно использовать программы BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174: 247-250) доступ к которым предоставляется на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с настройками по умолчанию (в частности, с параметрами "штраф за введение разрыва": 5 и "штраф за продолжение разрыва": 2; например, с выбором матрицы "BLOSUM 62", предлагаемой программой); выраженный в процентах показатель идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями рассчитывается непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 30%, 95% и 98%) референсной аминокислотной последовательности, предпочтительные примеры включают такие, которые имеют определенные модификации в сравнении с референсной последовательностью, в частности, делеции, вставки или замены по меньшей мере одной аминокислоты, укорочение или удлинение. В случае замены одного или более расположенных последовательно или нет аминокислотных остатков, предпочтительны замены, в которых замещенные аминокислоты заменены "эквивалентными" аминокислотами. В данном описании выражение "эквивалентные аминокислоты" обозначает любые аминокислоты, которые могут быть замещены одной из основных аминокислот без какой-либо модификации биологической активности соответствующих антител и в соответствии с конкретными примерами, приведенными ниже.

Эквивалентные аминокислоты можно определить либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которыми они замещены, либо на основании результатов сравнения биологической активности различных антигенсвязывающих белков, которые могут образовываться.

В качестве примера, не являющегося исчерпывающим, в Таблице 2 ниже приведены возможные замены, при осуществлении которых, как полагают, не происходит существенной модификации биологической активности соответствующего модифицированного антигенсвязывающего белка; разумеется, при тех же условиях возможны и обратные замены.

Воплощение изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 7; и три CDR тяжелой цепи, содержащих последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 4, 5 и 6.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO.7; три CDR тяжелой цепи, содержащих последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения, антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7, или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO.7.

Другое воплощение изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему три CDR легкой цепи, содержащих последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NOs. 1, 2 и 3; и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8, или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 8.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3; и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO. 8.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения, антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO.8.

Другое воплощение изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 7; и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8, или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 8.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO. 7, и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO. 8.

Для большей ясности, в Таблице 3а ниже приведены различные аминокислотные последовательности, соответствующие антигенсвязывающему белку по изобретению (Mu = мышиный).

Конкретный аспект данного изобретения относится к мышиному антителу или производным от него компонентам или антигенсвязывающим фрагментам, отличающимся тем, что указанное антитело также содержит константные участки легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела биологического вида, гетерологичного для мыши, в частности, человека.

Другой конкретный аспект данного изобретения относится к химерному антителу или производным от него компонентам или антигенсвязывающим фрагментам, отличающимся тем, что указанное антитело также содержит константные участки легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела биологического вида, гетерологичного для мыши, в частности, человека.

Еще один конкретный аспект данного изобретения относится к гуманизированному антителу или производным от него компонентам или антигенсвязывающим фрагментам, отличающимся тем, что константные участки легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из человеческого антитела, являются, соответственно, участками типа лямбда или каппа или участками гамма-1, гамма-2 или гамма-4.

Другой аспект изобретения относится к антигенсвязывающему белку, представляющему собой моноклональное антитело 1613F12, полученное из гибридомы I-4505, депонированной в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) в институте Пастера, Франция 28 июля 2011, или его антигенсвязывающему фрагменту.

Согласно другому аспекту изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать антигенсвязывающий белок согласно изобретению, в частности, гибридоме мышиного происхождения, депонированной во Французской коллекции культур микроорганизмов (CNCM, институт Пастера, Париж, Франция) 28 июля 2011, под номером I-4505. Указанная гибридома была получена при слиянии спленоцитов/лимфоцитов иммунизированных мышей Balb/C и клеток миеломы линии Sp 2/0-Ag 14.

Согласно другому аспекту изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать антитело, содержащее три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6, указанная гибридома была депонирована в CNCM, институт Пастера, Париж, Франция, 28 июля 2011 под номером I-4505. Указанная гибридома была получена при слиянии спленоцитов/лимфоцитов иммунизированных мышей Balb/C и клеток миеломы линии Sp 2/O-Ag 14.

Объектом изобретения является мышиная гибридома I-4505, депонированная в CNCM, институт Пастера, Париж, Франция, 28 июля 2011.

Антигенсвязывающий белок по изобретению также включает химерные или гуманизированные антитела.

Химерное антитело представляет собой антитело, имеющее в своем составе вариабельный участок естественного происхождения (легкой цепи и тяжелой цепи), полученный из антитела определенного биологического вида в комбинации с константными участками легкой цепи и тяжелой цепи антитела биологического вида, гетерологичного для указанного заданного вида.

Антитела или их химерные фрагменты можно получать при помощи рекомбинантных генетических методов. Например, химерное антитело можно получать путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельный участок моноклонального антитела по изобретению, не имеющего человеческого происхождения, в частности мышиного, и последовательность, кодирующую константный участок человеческого антитела. Химерное антитело согласно изобретению кодируется одним из таких рекомбинантных генов, может, например, быть химерным антителом мыши-человека, специфичность такого антитела определяется вариабельным участком, кодируемым ДНК мыши, а его изотип определятся константным участком, кодируемым ДНК человека. Способы получения химерных антител описаны Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).

В другом аспекте изобретения описан связывающий белок, представляющий собой химерное антитело.

В конкретном предпочтительном воплощении химерное антитело по изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный участок легкой цепи, последовательность которого содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 7, а также содержат вариабельный участок тяжелой цепи, последовательность которого содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 8.

В другом аспекте изобретения описан связывающий белок, представляющий собой гуманизированное антитело.

"Гуманизированное антитело" обозначает антитело, содержащее участки CDR, полученные из антитела, не имеющего человеческого происхождения, и другие части молекулы антитела, происходящие из одного (или нескольких) человеческих антител. Кроме того, некоторые остатки сегментов скелета (обозначаемые FR) могут быть модифицированы для сохранения аффинности связывания (Jones et al, Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al, Nature, 332: 323-327, 1988).

Гуманизированные антитела по изобретению или их фрагменты можно получить с помощью методов, известных специалистам в данной области (например, таких, которые описаны в публикациях Singer et al, J. Immun., 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; и Bebbington et al, Bio/Technology, 10: 169-175, 1992). Такие гуманизированные антитела предпочтительны для применения в способах, включающих диагностику in vitro или превентивное и/или терапевтическое применение in vivo. Можно упомянуть и другие способы гуманизации, также известные специалистам в данной области, например, такие как методика "пересаживания CDR", описанная заявителем Protein Design Labs в патентах ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0566647 или US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 и US 5,693,761. Также можно процитировать патенты США US 5,639,641 или 6,054,297, 5,886,152 и 5,877,293.

Кроме того, изобретение также относится к гуманизированным антителам, полученным на основе мышиных антител, описанных выше.

Предпочтительно, константные участки легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из человеческого антитела, соответственно являются участками типа лямбда или каппа и гамма-1, гамма-2 или гамма-4.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к антигенсвязывающему белку, представляющему собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO. 36 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 36; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 4, 5 и 6.

Другое воплощение изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO. 37-47, или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NO. 37-47; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6.

"Любая последовательность, идентичная по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NO. 36 или 37-47" обозначает последовательности, содержащие последовательности трех CDR легкой цепи SEQ ID NOs. 1, 2 и 3 и, кроме этого, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% полноразмерным последовательностям SEQ ID NO. 36 или 37-47 за пределами последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO. 1, 2 и 3).

Для большей ясности в Таблице 3б ниже приведены различные аминокислотные последовательности, соответствующие вариабельному домену легкой цепи (VL) гуманизированного антигенсвязывающего белка по изобретению (Hz = гуманизированный).

В воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из:

i) вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO. 7,

ii) вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 36 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO. 36; и

iii) вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 37-47 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательностям SEQ ID NO. 37-47.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к антигенсвязывающему белку, представляющему собой гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO. 48 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 48; и три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 1, 2 и 3.

Другое воплощение изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 49-68 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NO. 49-68; и три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3.

"Любая последовательность, идентичная по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NO. 48 и 49-68" обозначает последовательности, содержащие три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NOs. 4, 5 и 6 и, кроме того, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% полноразмерным последовательностям SEQ ID NO. 48 и 49-68 за пределами последовательностей, соответствующих CDR (т.е. SEQ ID NO. 4, 5 и 6).

Для большей ясности в Таблице 3в ниже приведены различные аминокислотные последовательности, соответствующие вариабельному домену тяжелой цепи (VH) гуманизированного антигенсвязывающего белка по изобретению (Hz = гуманизированный).

В воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из:

i) вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO.8;

ii) вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 48 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO. 48; и

iii) вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 49-68 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательностям SEQ ID NO. 49-68.

В воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 36 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 36; и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 48 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности SEQ ID NO. 48.

В другом воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельный домен легкой цепи с последовательностью, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO. 37-47, или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NO. 37-47; и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 49-68, или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательностям SEQ ID NO. 49-68.

В воплощении изобретения антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

i) вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7, 36 или 37-47 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательностям SEQ ID NO. 7, 36 или 37-47; и

ii) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8, 48 или 49-68 или любой последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80% последовательностям SEQ ID NO. 8, 48 или 49-68.

Новый аспект данного изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, отличающейся тем, что она выбрана из следующих нуклеиновых кислот (включающих любой вырожденный генетический код):

a) нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению;

b) нуклеиновой кислоты, содержащей:

- нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NOs. 15-28 и 69-99, или

- нуклеотидную последовательность, содержащую 6 нуклеотидных последовательностей SEQ ID NOs.: 15-20, или

- нуклеотидную последовательность, содержащую две нуклеотидные последовательности SEQ ID NOs.: 21, 22, или две нуклеотидные последовательности, выбранные с одной стороны из SEQ ID NOs.: 69-79, а с другой стороны из SEQ ID NOs: 80-99;

c) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте, определение которой приведено в пунктах а) или b); и

d) нуклеиновой кислоты, предпочтительно содержащей по меньшей мере 18 нуклеотидов, способной гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой с последовательностью, определение которой приведено в пунктах a) или b), или с последовательностью, идентичной при оптимальном выравнивании по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% последовательности нуклеиновой кислоты, определение которой приведено в пунктах a) или b).

В Таблице 4а ниже приведены различные нуклеотидные последовательности, относящиеся к связывающему белку по изобретению (Mu = мышиный).

Для большей ясности в Таблице 4б ниже приведены различные нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельному домену легкой цепи (VL) гуманизированного антигенсвязывающего белка по изобретению (Hz = гуманизированный).

Для большей ясности в Таблице 4в ниже приведены различные нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельному домену тяжелой цепи (VH) гуманизированного антигенсвязывающего белка по изобретению (Hz = гуманизированный).

Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеиновая последовательность", "последовательность нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность" в данном описании используются взаимозаменяемо, обозначают точную последовательность нуклеотидов, модифицированных или немодифицированных, описывающих фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотиды, встречающиеся или не встречающиеся в природе, и являющийся двуцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК или продуктами транскрипции указанных ДНК.

Последовательности по данному изобретению были выделены и/или очищены, т.е., их отобрали напрямую или опосредовано, например через копии, их окружение было по меньшей мере частично модифицировано. К ним также относятся выделенные нуклеиновые кислоты, полученные рекомбинантными генетическими методами, например, из клеток-хозяев, или полученные методом химического синтеза.

"Нуклеиновые последовательности, идентичные по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% после оптимального выравнивания с предпочтительной последовательностью" обозначают нуклеиновые последовательности, имеющие в сравнении с референсной нуклеиновой последовательностью некоторые модификации, в частности, такие как делеция, укорочение, удлинение, химеризация и/или замена, в частности точечная. Предпочтительно, это последовательности, кодирующие те же аминокислотные последовательности, что и референсная последовательность, вследствие вырожденности генетического кода, или комплементарные последовательности, которые могут специфически гибридизоваться с референсной последовательностью, предпочтительно в жестких условиях, в частности, описанных ниже.

Гибридизация в жестких условиях означает, что условия, относящиеся к температуре и ионной силе, выбраны таким образом, что они обеспечивают гибридизацию двух комплементарных фрагментов ДНК. Исключительно в иллюстративных целях ниже приведены жесткие условия для этапа гибридизации с целью характеристики полинуклеотидных фрагментов, описанных выше.

Гибридизация ДНК-ДНК или ДНК-РНК осуществляется в два этапа: (1) прегибридизация при 42°C в течение трех часов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,5) содержащем 5Х SSC (1Х SSC соответствует раствору 0,15 M NaCl + 0,015 M цитрата натрия), 50% формамид, 7% додецил сульфат натрия (ДСН), 10Х раствор Денхардта, 5% сульфат декстрана и 1% ДНК молок лососевых; (2) первичная гибридизация в течение 20 часов при температуре, зависящей от длины зонда (т.е. 42°С для зонда длиной >100 нуклеотидов) с последующими двумя 20-минутными отмывками при 20°С в 2Х SSC + 2% ДСН, одной 20-минутной отмывкой при 20°С в 0,1Х SSC + 0,1% ДСН. Последнюю отмывку осуществляют в 0,1Х SSC + 0,1% ДСН в течение 30 минут при 60°С для зонда длиной >100 нуклеотидов. Жесткие условия гибридизации, описанные выше для полинуклеотида определенного размера, специалист в данной области может адаптировать для более длинных или более коротких олигонуклеотидов, в соответствии с протоколами, описанными Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).

Изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, описанную в изобретении.

Изобретение, в частности, относится к клонирующим и/или экспрессирующим векторам, содержащим такую нуклеотидную последовательность.

Векторы по изобретению предпочтительно содержат элементы, обеспечивающие экспрессию и/или секрецию нуклеотидной последовательности в заданной клетке-хозяине. Таким образом, вектор должен содержать промотор, сигнал инициации и терминации трансляции, а также подходящие области, регулирующие транскрипцию. Он должен сохранять стабильность в клетке-хозяине и возможно нести определенные сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию транслированного белка. Специалисты в данной области выбирают и оптимизируют эти различные элементы в зависимости от используемой клетки-хозяина. Для этой цели нуклеотидные последовательности можно встраивать в самореплицирующиеся векторы, содержащиеся в выбранных хозяевах, или векторы, интегрирующие в геном клетки-хозяина.

Такие векторы получают способами, стандартно используемыми специалистами в данной области, а полученные клоны можно вводить в подходящую клетку-хозяина с использованием стандартных способов, таких как липофекция, электропорация, тепловой шок или химические методы.

Векторы, например, могут быть созданы на основе плазмид или вирусов. Их используют для трансформации клеток-хозяев для клонирования или экспрессии нуклеотидных последовательностей по изобретению.

Изобретение также относится к выделенным клеткам-хозяевам, трансформированным или содержащим вектор, описанный в данном изобретении.

Клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических систем, например, таких как бактериальные клетки, а также клетки дрожжей или клетки животных, в частности, клетки млекопитающих (за исключением человека). Также можно применять клетки насекомых или растений.

Изобретение также относится к животным, отличным от человека, имеющим трансформированные клетки согласно изобретению.

Другой аспект изобретения относится к способу получения антигенсвязывающего белка по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, отличающемуся тем, что указанный способ включает следующие этапы:

a) культивирование в среде при условиях культивирования, подходящих для клетки-хозяина согласно изобретению; и

b) выделение антигенсвязывающего белка или одного из его антигенсвязывающих фрагментов, полученных таким образом из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.

Трансформированные клетки по изобретению применяют в способах получения рекомбинантных антигенсвязывающих белков по изобретению. Способы получения антигенсвязывающих белков по изобретению в рекомбинантой форме, отличающиеся тем, что в указанных способах используют вектор и/или клетку, трансформированную вектором по изобретению, также находятся в рамках данного изобретения. Предпочтительно, клетки, трансформированные вектором по изобретению, культивируют в условиях, обеспечивающих экспрессию вышепомянутого антигенсвязывающего белка и выделение указанного рекомбинантного белка.

Как уже упоминалось выше, клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических систем. В частности, можно установить нуклеотидные последовательности по изобретению, облегчающие секрецию в таких прокариотических или эукариотических системах. Вектор по изобретению, несущий такую последовательность, можно успешно применять для получения секретируемых рекомбинантных белков. Действительно, очистка таких рекомбинантных белков, представляющих интерес, будет облегчена, поскольку они будут находиться в надосадочной культуральной жидкости, а не внутри клеток-хозяев.

Антигенсвязывающий белок по изобретению можно также получать при помощи химического синтеза. Один из таких способов получения также представляет собой объект изобретения. Специалисту в данной области известны способы химического синтеза, такие как методы твердофазного синтеза (в частности, см. Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., pp. 71-95) или методы конвергентного твердофазного синтеза с конденсацией фрагментов или стандартного синтеза в растворе. Полипептиды, полученные методом химического синтеза, которые могут иметь в своем составе соответствующие аминокислоты, не встречающиеся в природе, также находятся в рамках изобретения.

Антигенсвязывающий белок или его антигенсвязывающие фрагменты, которые возможно получить способом по изобретению, также находятся в рамках данного изобретения.

Конкретный аспект изобретения относится к антигенсвязывающему белку или его антигенсвязывающему фрагменту, описанным выше, для применения в качестве продукта для адресной доставки цитотоксического агента в сайт-мишень хозяина, указанный сайт-мишень имеет в своем составе эпитоп, находящийся во внеклеточном домене белка Axl, предпочтительно во внеклеточном домене человеческого белка Axl, более предпочтительно во внеклеточном домене человеческого белка Axl, имеющего последовательность SEQ ID NO. 31 или 32, или естественные варианты его последовательности.

В предпочтительном воплощении указанный сайт-мишень хозяина представляет собой сайт-мишень клетки млекопитающего, более предпочтительно клетки человека, более предпочтительно клеток, которые естественным образом или в результате генетической рекомбинации экспрессируют белок Axl.

Изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антигенсвязывающий белок, описанный в данной заявке, конъюгированный с цитотоксическим агентом.

В данном изобретении выражение "иммуноконъюгат" или "иммуноконъюгат" обозначает соединение, по меньшей мере содержащее продукт для адресной доставки, физически связанный с одним или более терапевтическим(и) агентом(ами), что таким образом позволяет получить высокоспецифические соединения.

В предпочтительном воплощении такие терапевтические агенты представляют собой цитотоксические агенты.

Под "цитотоксическим агентом" или "цитотоксическим соединением" понимают агент, который при введении субъекту воздействует на клеточную пролиферацию или или предотвращает ее, предпочтительно воздействует или предотвращает развитие рака в организме субъекта, путем ингибирования или предупреждения реализации клеточной функции и/или вызывая гибель клетки.

Выделено или синтезировано множество цитотоксических агентов, подавляющих клеточную пролиферацию или вызывающих разрушение или сокращение числа опухолевых клеток, если не абсолютное, то по меньшей мере существенное. Однако, токсическая активность этих агентов не ограничена опухолевыми клетками, и клетки, не являющиеся опухолевыми, также подвергаются воздействию и могут разрушаться. В частности, побочные эффекты касаются быстро обновляющихся клеток, таких как гемопоэтические клетки или клетки эпителия, в частности эпителия слизистых оболочек. В качестве иллюстрации можно привести клетки - желудочно-кишечного тракта, которые подвергаются значительному воздействию при применении таких цитотоксических агентов.

Одной из целей данного изобретения является создание цитотоксического агента, который позволит сократить побочные эффекты в отношении нормальных клеток при сохранении высокой цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток.

В частности, цитотоксический агент предпочтительно может иметь в своем составе, помимо прочего, лекарственное средство (т.е. "конъюгат антитело-лекарственное средство"), токсин (т.е. "иммунотоксин" или "конъюгат антитело-токсин"), радиоизотоп (т.е. "радиоиммуноконъюгат" или "конъюгат антитело-радиоизотоп") и т.д.

В первом предпочтительном воплощении изобретения иммуноконъюгат имеет в своем составе связывающий белок, соединенный по меньшей мере с лекарственным средством или лекарственным препаратом. Такой иммуноконъюгат обозначается конъюгат антитело-лекарственное средство (или "ADC", от англ. antibody-drug conjugate), в котором связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В первом воплощении такие лекарства можно описать с учетом их способа действия. В качестве примера, не являющегося исчерпывающим, можно привести алкилирующие агенты, такие как азотистый иприт (мехлорэтамин), алкилсульфонаты, нитрозомочевину, оксазофорины, азиридины или иминоэтилены, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы митоза, ингибиторы функционирования хроматина, антиангиогенные агенты, антиэстрогены, антиандрогены, хелатирующие агенты, стимуляторы абсорбции железа, ингибиторы циклооксигеназы, ингибиторы фосфодиэстеразы, ингибиторы ДНК, ингибиторы синтеза ДНК, стимуляторы апоптоза, ингибиторы синтеза тимидилата, ингибиторы Т-клеток, агонисты интерферона, ингибиторы рибонуклеотизд-трифосфат-редуктазы, ингибиторы ароматазы, антагонисты эстрогеновых рецепторов, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы клеточного цикла, таксаны, ингибиторы тубулина, ингибиторы ангиогенеза, стимуляторы макрофагов, антагонисты нейрокининовых рецепторов, агонисты каннабиноидных рецепторов, агонисты допаминовых рецепторов, агонисты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, агонисты рецепторов эритропоэтина, агонисты рецепторов соматостатина, агонисты ЛГРГ, кальциевые сенситайзеры (повышающие чувствительность к ионам кальция), антагонисты рецепторов фактора роста сосудистого эндотелия, антагонисты интерлейкиновых рецепторов, ингибиторы остеокластов, стимуляторы образования свободных радикалов, антагонисты рецепторов эндотелина, алкалоид барвинка, антигормоны или иммуномодуляторы или любые другие новые лекарства, соответствующие критериям, предъявляемым к активности цитотоксического агента или токсина.

Такие лекарственные средства, например, упомянуты в справочнике VIDAL 2010, на странице, посвященной соединениям, относящимся к разделу «цитотоксические препараты» в канцерологии и гематологии, эти цитотоксические соединения, перечисленные со ссылкой на данный документ, упоминаются в данной заявке в качестве предпочтительных цитотоксических агентов.

Более конкретно, среди прочих, предпочтительными согласно изобретению являются следующие лекарственные средства: мехлорэтамин, хлорамбукол, мелфалан, хлоргидрат, пипоброман, преднимустин, динатрий-фосфат, эстрамустин, циклофосфамид, алтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид, ифосфамид, тиотепа, триэтиленамин, алтретамин, кармустин, стрептозоцин, фотемустин, ломустин, бусульфан, треосульфан, импросульфан, дакарбазин, цисплатин, оксалиплатин, лобаплатин, гептаплатин, мириплатина гидрат, карбоплатин, метотрексат, пеметрексед, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозин-арабинозид, 6-меркаптопурин (6-МП), неларабин, 6-тиогуанин (6-ТГ), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, дезоксикоформицин, тегафур, пентостатин, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, валрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин, прокарбазин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, топотекан, иринотекан, этопозид, валрубицин, амрубицина гидрохлорид, пирарубицин, эллиптиния ацетат, зорубицин, эпирубицин, идарубицин и тенипозид, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023A, галофугинон, COL-3, неовастат, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, интерферон-альфа, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол, экземестан, флутамид, нилутамид, спиронолактон, ципротерона ацетат, финастерид, цимитидин, бортезомиб, велкейд, бикалутамид, ципротерон, флутамид, фулвестрант, экземестан, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, сорафениб, сунитиниб, ретиноид, рексиноид, метоксален, метиламинолевулинат, алдеслейкин, ОСТ-43, денилейкин дифтитокс, интерлейкин-2, тазонермин, лентинан, сизофилан, роквинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли И/Ц (полиинозиновая - полицитидиловая кислота, прокодазол, Тайс БЦЖ, corynebacterium parvum, NOV-002, украин, левамизол, 1311-chTNT, Н-101, целмолейкин, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, интерферон гамма-Ia, интерлейкин-2, мобенакин, рексин (Rexin-G), тецелейкин, акларубицин, актиномицин, арглабин, аспарагиназа, карцинофилин, хромомицин, дауномицин, лейковорин, масопрокол, неокарциностатин, пепломицин, саркомицин, соламаргин, трабектедин, стрептозоцин, тестостерон, кунекатехины (kunecatechins), синекатехины, алитретиноин, белотекан гидрохлорид, калустерон, дромостанолон, эллиптиния ацетат, этинил эстрадиол, этопозид, флюоксиместерон, форместан, фосфэтрол, гозерелина ацетат, гексил-аминолевулинат, гистрелин, гидроксипрогестерон, иксабепилон, лейпролид, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, милтефозин, митобронитол, надролона фенилпропионат, норэтиндрона ацетат, преднизолон, преднизон, темсиролимус, тестолактон, триамцинолон, трипторелин, вапреотида ацетат, циностатин-стималамер, амсакрин, триоксид мышьяка, бизантрена гидрохлорид, хлорамбуцил, хлортрианизен, цис-диамино-дихлоро-платина, циклофосфамид, диэтилстилбестрол, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, леналидомид, лонидамин, мехлорэтамин, митотан, недаплатин, нимустина гидрохлорид, памидронат, пипоброман, порфимер натрий, ранимустин, разоксан, семустин, собузоксан, мезилат, триэтиленмеламин, золедроновая кислота, камостат мезилат, фадрозол HCl, нафоксидин, аминоглутетимид, кармофур, клофарабин, цитозина арабинозид, децитабин, доксифлуридин, эноцитабин, флударабина фосфат, фторурацил, фторафур, урамустин, абареликс, бексаротен, ралтитрексид, тамибаротен, темозоломид, вориностат, мегестрол, динатрия клодронат, левамизол, ферумокситол, железа изомальтозид, целекоксиб, ибудиласт, бендамустин, алтретамин, митолактол, темсиролимус, пралатрексат, TS-1, децитабин, бикалутамид, флутамид, летрозол, динатрия клодронат, дегареликс, торемифена цитрат, гистамина дигидрохлорид, DW-166HC, нитракрин, децитабин, иринотекана гидрохлорид, амсакрин, ромидепсин, третиноин, кабазитаксел, вандетаниб, леналидомид, ибандроновая кислота, милтефозин, витеспен, мифамуртид, надропарин, гранисетрон, ондансетрон, трописетрон, ализаприд, рамосетрон, доласетрона месилат, фосапрепитанта димеглумин, набилон, апрепитант, дронабинол, TY-10721, лизурида водородистый малеат, эпицерам, дефибротид, дабигатрана этексилат, филграстим, пэгфилграстим, редитукс, эпоэтин, молграмостим, опрелвекин, сипулейцел-Т, M-Vax, ацетил L-карнитин, донепезила гидрохлорид, 5-аминолевулиновая кислота, метил-аминолевулинат, цетрореликса ацетат, икодекстрин, лейпрорелин, метилфенидат, октреотид, амлексанокс, плериксафор, менатетренон, анетола дитиол-тион, доксеркальциферол, цинакальцета гидрохлорид, алефацепт, ромиплостим, тимоглобулин, тимальфазин, убенимекс, имиквимод, эверолимус, сиролимус, Н-101, лазофоксифен, трилостан, инкадронат, ганглиозиды, октанатрия пегаптаниб, вертопорфин, минодроновая кислота, золедроновая кислота, галлия нитрат, натрия алендронат, динатрия этидронат, динатрия памидронат, дутастерид, натрия стибоглюконат, армодафинил, дексразоксан, амифостин, WF-10, темопорфин, дарбэпоэтин альфа, анцестим, сарграмостим, палифермин, R-744, непидермин, опрелвекин, денилейкин дифтитокс, крисантаспаза, бусерелин, деслорелин, ланреотид, октреотид, пилокарпин, бозентан, калихимицин, майтанзиноиды и циклоникат.

Для более подробной информации специалисты в данной области могут обратиться к руководству под ред. Французской ассоциации преподавателей медицинской химии, озаглавленному «Трактат по медицинской химии» ("traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003").

Второе предпочтительное воплощение изобретения относится к иммуноконъюгату, который имеет в своем составе связывающий белок, по меньшей мере связанный с радиоизотопом. Такой иммуноконъюгат обозначают конъюгатом антитело-радиоизотоп (или "ARC", от англ. antibody-radioisotope conjugate), в котором связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Для избирательного разрушения опухоли антитело может содержать высокорадиоактивные атомы. Для получения ARC существует ряд радиоактивных изотопов, включающий At²¹¹, С¹³, N¹⁵, О¹⁷, FI¹⁹, I¹²³, I¹³¹, I¹²⁵, In¹¹¹, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, tc⁹⁹m, Bi²¹², P³², Pb²¹², радиоактивные изотопы Lu, гадолиния, марганца или железа, но не ограничивающийся ими.

Для инкорпорирования этих радиоизотопов в состав ARC можно применять любые способы или процессы, известные специалистам в данной области техники (см., например, "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", Chatal, CRC Press 1989). В качестве примера, не являющегося исчерпывающим, tc⁹⁹m или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ и In¹¹¹ могут быть присоединены по остаткам цистеина. Y можно присоединять по остаткам лизина. I¹²³ можно присоединять при помощи способа IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57).

Для иллюстрации известного уровня техники можно привести несколько примеров ARC, таких как Зевалин®, который представляет собой ARC, состоящий из моноклонального антитела к CD20 и радиотопов In¹¹¹ или Y⁹⁰, связанных с хелатообразующим комплексом тиомочевина-линкер (Wiseman et at (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7): 766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12): 4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69); или Милотарг®, состоящий из антитела к CD33, связанного с калихимицином (US 4,970,198; 5,079,233; 5,585,089; 5,606,040; 5,693,762; 5,739,116; 5,767,285; 5,773,001). Можно также упомянуть конъюгат «антитело-лекарственное средство», носящее название Адцетрис (или брентуксимаб ведотин), недавно одобренный

Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств для лечения лимфомы Ходжкина (Nature, vol. 476, рр. 380-381, 25 August 2011).

В третьем предпочтительном воплощении изобретения иммуноконъюгат имеет в своем составе связывающий белок, связанный по меньшей мере с токсином. Такой иммуноконъюгат обозначают конъюгат «антитело-токсин» (или "АТС", от англ. antibody-toxin conjugate), в котором связывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Токсины представляют собой эффективные и специфические яды, производимые живыми организмами. Они как правило представляют собой аминокислотную цепь, молекулярный вес которой может варьироваться между парой сотен (пептиды) и одной сотней тысяч (белки). Они также могут представлять собой низкомолекулярные органические соединения. Токсины продуцируют множество микроорганизмов, например, бактерии, грибы, водоросли и растения. Многие из них чрезвычайно ядовиты, их токсичность на несколько порядков превышает токсичность отравляющих веществ нервно-паралитического действия.

Токсины, применяемые в составе АТС, могут включать все виды токсинов, у которых механизм цитотоксического действия включает связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы, но не ограничиваются ими.

Применяемые энзиматически активные токсины и их фрагменты включают А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, А-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.

Низкомолекулярные токсины, такие как доластатины, ауристатины, трихотецен и СС1065 и производные этих токсинов, обладающие токсической активностью, также находятся в рамках данного описания. Было показано, что доластатины и ауристатины нарушают динамику микротрубочек, препятствуют гидролизу ГТФ и ядерному и клеточному делению и обладают противоопухолевой и противогрибковой активностью.

"Линкер", "линкерное звено" или "связующее звено" обозначают химическую группу, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, ковалентно присоединяющие связывающий белок по меньшей мере к одному цитотоксическому агенту.

Линкеры могут быть получены с применением различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональных производных имидоэфиров (таких как диметил-адипимидат HCl), активных эфиров (таких как дисукцинимидил-суберат), альдегидов (таких как глутаральдегид), бис-азидо соединений (таких как бис-(p-азидобензоил)-гександиамин), производных бисдиазония (таких как бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуол-2,6-диизоцианат) и соединений с двумя активными атомами фтора (таких как 1,5-дифлуоро-2,4-динитробензол). Примером хелатирующего агента для конъюгирования цитотоксических агентов с системой для адресной доставки является меченая углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен-триаминопентауксусная кислота (MX-DTPA). Другими сшивающими агентами могут быть BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфо)-бензоат), доступные из коммерческих источников (например, в компании Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, 111., U.S.A).

Линкер может быть "нерасщепляемым" или "расщепляемым".

В предпочтительном воплощении он представляет собой "расщепляемый линкер", способствующий высвобождению цитотоксического агента в клетке. Например, можно применять чувствительный к кислотам линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер, В предпочтительном воплощении линкер представляет собой расщепляемый во внутриклеточных условиях линкер, так что расщепление линкера приводит к отделению цитотоксического агента от связывающего белка во внутриклеточное пространство.

Например, в некоторых воплощениях линкер расщепляется расщепляющим агентом, присутствующим во внутриклеточном окружении (например, внутри лизосом или эндосом или кавеол). Линкер может быть, например, пептидным линкером, расщепляемым внутриклеточными пептидазами или протеазами, включая лизосомальные или эдосомальные протеазы, но не ограничиваясь ими. Как правило, пептидный линкер состоит по меньшей мере из двух аминокислот или по меньшей мере из трех аминокислот. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, известные своей способностью гидролизовать дипептидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активных агентов внутри клеток-мишеней. Например, можно применять пептидный линкер, расщепляемый тиол-зависимой протеазой катепсином-В, высокий уровень экспрессии которой наблюдается в опухолевых тканях (например, линкер Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). В определенных воплощениях пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой линкер Val-Cit или линкер Phe-Lys. Одним из преимуществ использования цитотоксических агентов, высвобождающихся при внутриклеточном протеолизе, является то, что токсичность агента, как правило, снижается при конъюгации, а стабильность конъюгатов в сыворотке, как правило, является высокой.

В других воплощениях расщепляемый линкер является pH-чувствительным, т.е. подвергается гидролизу при определенных значениях pH. Как правило, pH-чувствительный линкер гидролизуется в кислой среде. Например, можно использовать чувствительный к кислотам линкер, гидролизуемый в лизосомах (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь и т.п.). Такие линкеры могут быть относительно стабильными при нейтральных значениях pH, таких, которые характерны для крови, но нестабильны при pH ниже 5,5 или 5,0, приблизительных значениях pH в лизосомах. В определенных воплощениях гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (например, такой как тиоэфир, присоединенный к терапевтическому агенту через ацилгидразоновую связь.

В других воплощениях линкер расщепляется в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). В области техники известно множество дисульфидных линкеров, включая, например, такие, которые могут быть образованы с использованием SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетата), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)-пропионата), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)-бутирата) и SMPT (N-сукцинимидил-оксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)-толуола), SPDB и SMPT.

В качестве не являющегося исчерпывающим примера нерасщепляемых или "невосстанавливаемых" линкеров можно упомянуть иммуноконъюгат Трастузумаб-DM1 (TDM1), в котором объединены трастузумаб и химиотерапевтический агент майтанзин (Cancer Research 2008; 68: (22). November 15, 2008).

В предпочтительном воплощении иммуноконъюгат по изобретению может быть получен любым способом, известным специалистам в данной области, например, таким как i) реакция нуклеофильной группы антигенсвязывающего белка с бивалентным связующим реагентом с последующей реакций с цитотоксическим агентом или ii) реакция нуклеофильной группы цитотоксического агента с бивалентным связующим реагентом с последующей реакций с нуклеофильной группой антигенсвязывающего белка.

Нуклеофильные группы антигенсвязывающего белка включают N-концевые аминогруппы, аминогруппы боковых цепей, например, лизина, тиоловые группы боковых цепей и гидроксильные или аминогруппы углеводов в случае, если антигенсвязывающий белок гликозилирован, но не ограничиваются ими. Аминогруппы, тиоловые группы и гидроксильные группы являются нуклеофильными группами и способны вступать в реакцию с образованием ковалентных связей с электрофильными группами линкерных компонентов и линкерных реагентов, которые включают активные сложные эфиры, такие как N-гидроксисукцинимидные эфиры, гидроксибензотриазольные эфиры, галогенформиаты и галогенангидриды; алкилгалогениды и бензилгалогениды, такие как галоацетамиды; альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы, но не ограничиваются ими. Антигенсвязывающий белок может иметь восстанавливаемые внутрицепочечные дисульфидные связи, т.е. цистеиновые мостики. При воздействии восстанавливающего агента, такого как ДТТ (дитиотрейтол), антигенсвязывающим белкам можно придать способность вступать в реакцию конъюгации с линкерными реагентами. Таким образом, каждый цистеиновый мостик теоретически способен образовывать две реакционноспособных тиоловых нуклеофильных группы. Дополнительные нуклеофильные группы можно вводить в антигенсвязывающий белок при помощи любой реакции, известной специалистам в данной области техники. В качестве примера, не являющегося исчерпывающим, можно привести введение реакционноспособных тиоловых групп в антигенсвязывающий белок за счет введения одного или более остатков цистеина.

Иммуноконъюгаты также можно получать путем модификации антигенсвязывающего белка с введением электрофильных компонентов, способных вступать в реакцию с нуклеофильными замещающими группами линкерных реагентов или цитотоксических агентов. Углеводные компоненты гликозилированных антигенсвязывающих белков могут быть окисленными и образовывать альдегидные или кетонные группы, способные вступать в реакцию с аминными группами линкерных реагентов или цитотоксических агентов. Образующиеся в результате иминогруппы Шиффовых оснований могут образовывать стабильные связи или могут восстанавливаться с образованием стабильных аминных связей. В одном воплощении реакция углеводной части гликозилированного антигенсвязывающего белка с галактозооксидазой или мета-периодатом натрия могут давать карбонильные (альдегидные и кетонные) группы белка, которые могут вступать в реакцию с соответствующими группами лекарственного средства. В другом воплощении белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут вступать в реакцию с мета-периодатом натрия с образованием альдегида на месте первой аминокислоты.

В некоторых предпочтительных воплощениях линкерное звено может иметь следующую общую формулу:

-Ta-Ww-Yy- где:

-Т- представляет собой удлиняющее звено;

а представляет собой 0 или 1;

-W- представляет собой аминокислотное звено;

w независимо представляет собой целое число от 1 до 12;

-Y- представляет собой спейсерное звено;

y представляет собой 0, 1 или 2.

Удлиняющее звено (-Т-), при наличии, соединяет антигенсвязывающий белок с аминокислотным звеном (-W-). Подходящие функциональные группы, которые могут присутствовать в антигенсвязывающем белке либо естественным образом, либо в результате химических манипуляций, включают сульфгидрильные, аминные, гидроксильные, аномерные гидроксильные и карбоксильные группы углеводов. Подходящими функциональными группами являются сульфгидрильные и аминные. Сульфгидрильные группы могут быть получены при восстановлении внутримолекулярных дисульфидных связей антигенсвязывающего белка, при наличии таковых. В альтернативном случае сульфгидрильные группы могут быть получены при реакции аминогруппы лизина антигенсвязывающего белка с 2-иминотиоланом или другим реагентом, образующим сульфгидрильные группы. В определенных воплощениях антигенсвязывающий белок представляет собой рекомбинантное антитело и создается таким образом, что несет один или более лизинов. Более предпочтительно, антигенсвязывающий белок создается таким образом, что несет один или более цистеинов (ср. ThioMabs).

В некоторых определенных воплощениях удлиняющее звено образует связь с атомом серы антигенсвязывающего белка. Атом серы может происходить из сульфгидрильной (-SH) группы восстановленного антигенсвязывающего белка.

В некоторых других определенных воплощениях удлиняющее звено связано с антигенсвязывающим белком при помощи дисульфидной связи между атомом серы антигенсвязывающего белка и атомом серы удлиняющего звена.

В других определенных воплощениях реакционноспособная группа удлиняющего звена содержит реакционноспособный центр, который может вступать в реакцию с аминогруппой антигенсвязывающего белка. Аминогруппа может быть аминогруппой аргинина или лизина. Подходящие реакционноспособные аминные группы включают активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные эфиры, 4-нитрофениловые эфиры, пентафторфениловые эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты, но не ограничиваются ими.

В другом аспекте реакционноспособная группа удлинителя содержит реакционноспособный центр, который способен вступать в реакцию с модифицированными углеводными группами, которые могут присутствовать в антигенсвязывающем белке. В определенном воплощении антигенсвязывающий белок подвергают ферментативному гликозилированию с образованием углеводного компонента (следует отметить, что когда антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, указанное антитело, как правило, бывает естественным образом гликозилировано). Под воздействием такого реагента, как периодат натрия может происходить неполное окисление углевода, и образующийся в результате карбонильный компонент окисленного углевода может вступать в реакцию конденсации с удлинителем, содержащем такую функциональную группу, как гидразид, оксим, реакционноспособный амин, гидразин, тиосемикарбазид, гидразин карбоксилат или арилгидразид.

Аминокислотное звено (-W-) соединяет удлиняющее звено (-Т-) со спейсерным звеном (-Y-), если спейсерное звено присутствует, и соединяет удлиняющее звено с цитотоксическим агентом, если спейсерное звено отсутствует.

Как указано выше, -Ww- может быть дипептидом, трипептидом, тетрапептидом, пентапептидом, гексапептидом, гептапептидом, октапептидом, нонапептидом, декапептидом, ундекапептидом или додекапептидом.

В некоторых воплощениях аминокислотное звено может содержать аминокислотные остатки, такие как аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, лизин с ацетильной или формильной защитной группой, аргинин, аргинин с защитной тозильной группой или нитрогруппой, гистидин, орнитин, орнитин с ацетильной или формильной защитной группой и цитруллин, но не ограничиваться ими. Иллюстративные примеры аминокислотных линкерных компонентов предпочтительно включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид.

Иллюстративные примеры дипептидов включают: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala- Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg.

Иллюстративные примеры трипептидов включают: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

Иллюстративные примеры тетрапептидов включают: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 33), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO. 34).

Иллюстративные примеры пентапептидов включают: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO. 35).

Аминокислотные остатки, которые составляют аминокислотный линкерный компонент, включают те, что существуют в природе, а также минорные аминокислоты и аналоги аминокислот, не встречающиеся в природе, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты можно конструировать и оптимизировать в отношении их избирательности для ферментативного расщепления конкретными ферментами, например, опухоль-ассоциированными протеазами, катепсином В, С и D или протеазой плазмином.

Аминокислотное звено линкера может подвергаться ферментативному расщеплению для высвобождения цитотоксического агента под действием ферментов, включающих опухоль-ассоциированную протеазу, но не ограничивающихся ими.

Аминокислотное звено можно создавать и оптимизировать в отношении его избирательности для ферментативного расщепления конкретными опухоль-ассоциированными протеазами. Подходящие звенья представляют собой такие, расщепление которых катализируется протеазами катепсином В, С и D и плазмином.

Спейсерное звено (-Y-), при наличии, соединяет аминокислотное звено с цитотоксическим агентом. Спейсерные звенья относятся к двум основным типам: саморазрушающиеся спейсеры и спейсеры, которые не подвергаются саморазрушению. Спейсерное звено, не подвергающееся саморазрушению, остается частично или полностью связанным с цитотоксическим агентом после ферментативного отщепления аминокислотного звена от иммуноконъюгата. Примеры спейсерных звеньев, не подвергающихся саморазрушению, включают спейсерные звенья (глицин-глицин) и глициновые спейсерные звенья, но не ограничиваются ими. Для высвобождения цитотоксического агента необходимо осуществление независимой реакции гидролиза внутри клетки-мишени для расщепления связи между глицином и лекарственным компонентом.

В другом воплощении не подвергающееся саморазрушению спейсерное звено (-Y-) представляет собой -Gly-.

В одном воплощении иммуноконъюгат не имеет спейсерного звена (y=0). В альтернативном случае, иммуноконъюгат, содержащий саморазрушающееся спейсерное звено, может высвобождать цитотоксический агент без необходимости в проведении отдельного этапа гидролиза. В этих воплощениях -Y- представляет собой р-аминобензиловый спирт (РАВ), соединенный с -Ww- через атом азота группы РАВ и присоединенный непосредственно к -D через карбонатную, карбаматную или эфирную группу.

Другие примеры саморазрушающихся спейсеров включают ароматические соединения, которые являются электронно-сходными с группой РАВ, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола и орто- или пара-аминобензилацетали, но не ограничиваются ими. Можно применять спейсеры, которые легко подвергаются циклизации при гидролизе амидных связей, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминобутировой кислоты, соответствующим образом замещенные циклические системы бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты.

В альтернативном воплощении спейсерное звено представляет собой разветвленный бис-(гидроксиметил)-стирол (BHMS), который можно применять для инкорпорирования дополнительных цитотоксических агентов.

Наконец, изобретение относится к иммуноконъюгату, описанному выше, для применения в лечении рака.

Рак предпочтительно может быть выбран из Axl-зависимых форм рака, включая опухолевые клетки, которые характеризуются экспрессией или сверхэкспрессией белка Axl или его части на своей поверхности.

Более конкретно, указанный рак представляет собой рак молочной железы, толстой кишки, карциному пищевода, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, глиому, рак легкого, меланому, остеосаркому, рак яичников, предстательной железы, рабдомиосаркому, рак почки, щитовидной железы и рак эндометрия матки, а также любой феномен лекарственной устойчивости. Другой объект изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую иммуноконъюгат, описанный в данной заявке.

Более конкретно, изобретение относится к фармацевтической композиции, имеющей в своем составе иммуноконъюгат по изобретению по меньшей мере с одним эксципиентом и/или фармацевтически приемлемым носителем.

В данном описании выражение "фармацевтически приемлемый носитель" или "эксципиент" предназначено для обозначения соединения или комбинации соединений, вводимых в фармацевтическую композицию, не вызывающих побочных реакций и позволяющих, например, облегчить введение действующих(его) веществ(а), увеличить длительность его нахождения и/или эффективность в организме, увеличить его растворимость в растворе или улучшить его сохранность. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны и могут быть адаптированы специалистом в данной области в зависимости от природы выбранных(ого) действующих(его) веществ(а) и способа их введения.

Предпочтительно, эти иммуноконъюгаты вводят системно, в частности, внутривенным, внутримышечным, внутрикожным, внутрибрюшинным или подкожным путем или оральным путем. Более предпочтительно, композицию, содержащую иммуноконъюгаты согласно изобретению, вводят несколько раз, последовательно.

Способы введения, дозировки и оптимальные лекарственные формы можно установить согласно критериям, обычно принимаемым во внимание при подборе лечения, подходящего для конкретного пациента, например, возраста или массы тела пациента, тяжести его/ее общего состояния здоровья, переносимости лечения и отмеченных побочных эффектов.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны в продолжении описания, в Примерах и графических материалах, подписи к которым приведены ниже.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1: исследование цитотоксичности в отношении клеток SN12C in vitro с применением конъюгированного вторичного антитела Mab-zap.

Фиг. 2А, 2В и 2С: определение специфичности связывания 1613F12 с иммобилизованными белками rhAxl-Fc (2А), rhDtk-Fc (2В) или rhMer-Fc (2С) при помощи твердофазного ИФА.

Фиг. 3: FACS-анализ связывания 1613F12 с человеческими опухолевыми клетками.

Фиг. 4: твердофазный ИФА с использованием иммобилизованного белка rmAxl-Fc ("rm" означает мышиный рекомбинантный).

Фиг. 5: определение связывания 1613F12 с клетками COS7 методом непрямой иммунофлуоресенции с оценкой результатов при помощи проточной цитометрии.

Фиг. 6: исследование связывания Gas6 методом конкурентного ИФА с использованием 1613F12.

Фиг. 7: анализ эпитопов методом вестерн-блоттинга с применением лизата клеток SN12C. NH (без нагревания); NR (в невосстанавливающих условиях); H (с нагреванием); R (в восстанавливающих условиях). Для подтверждения того, что в гель загружено одинаковое количество образцов использовали GAPDH.

Фиг. 8А и 8В: исследование снижения уровня экспрессии Axl после связывания 1613F12 с клетками SN12C методом вестерн-блоттинга. Фиг. 8А: репрезентативный вестерн-блот для 3 независимых экспериментов (исследование методом вестерн-блоттинга проводили через 4 ч и 24 ч инкубации 1613F12 с клетками SN12C); Фиг. 8В: для измерения оптической плотности проявленной пленки использовали программное обеспечение "QuantityOne".

Фиг. 9А, 9В и 9С: иммунофлуоресцентная микроскопия клеток SN12C после инкубации с 1613F12. Фиг. 9А: изотипический контроль mlgG1 для оценки неспецифического поверхностного и внутриклеточного окрашивания. Фиг. 9В: окрашивание клеточной мембраны. Фиг. 9С: внутриклеточное окрашивание рецептора Axl с использованием 1613F12, а также ранних эндосом с использованием маркера ЕЕА1. Ниже представлены совмещенные изображения, а участки колокализации указаны стрелками.

Фиг. 10: влияние 1613F12 на пролиферацию клеток SN12C in vitro в сравнении с влиянием антитела mlgG1, служившего изотипическим контролем.

Фиг. 11А-11K: исследование прямого цитотоксического эффекта иммуноконъюгата 1613F12-сапорин с использованием различных линий опухолевых клеток человека. А - SN12C, В - Calu-1, С - А172, D - А431, Ε - DU 145, F - MD A-MB435 S, G - MD A-MB231, H - PC3, I - NCI-H226, J - NCI-H125, K - Pancl.

Фиг. 12: исследование связывания белка rhAxl-Fc с антителами m1613F12 и hz1613F12 методом твердофазного ИФА.

Фиг. 13: сравнение связывания мышиного, химерного и гуманизированного антител 1613F12 с клетками SN12C.

Фиг. 14: исследование прямого цитотоксического эффекта в присутствии иммуноконъюгата мышиного и гуманизированного 1613F12 с сапорином и изотипических контролей с использованием линии опухолевых клеток почки человека SN12C.

Фиг. 15: исследование прямого цитотоксического эффекта в присутствии иммуноконъюгата мышиного и гуманизированного 1613F12 с сапорином и изотипических контролей с использованием линии клеток карциномы легких человека Calu-1.

Описание примеров осуществления изобретения

В следующих ниже Примерах экспрессия антител 1613F12 или m1613F12 означает мышиную форму антитела 1613F12. Гуманизированные формы антитела 1613F12 обозначены hz1613F12.

Аналогично, антитело, использованное в качестве изотипического контроля, представляет собой lgG1 мыши и обозначается 9G4. Это означает, что в следующих ниже Примерах экспрессия контрольного антитела mlgG1 и 9G4 обозначает одно и то же.

Пример 1. Интернализация рецептора Axl

Поскольку использование иммуноконъюгата более эффективно в случае, если целевой антиген является белком, который подвергается интернализации, изучали интернализацию рецептора Axl путем исследования цитотоксичности в отношении линий опухолевых клеток человека с использованием реагента Mab-Zap. Более конкретно, реагент Mab-Zap представляет собой химический конъюгат, имеющий в своем составе аффинно очищенное антитело козы к IgG мыши и инактивирующий рибосомы белок сапорин. При интернализации иммунного комплекса сапорин отделяется от агента, обеспечивающего адресную доставку, и инактивирует рибосомы, что в результате приводит к подавлению синтеза белка и, в конечном счете, к клеточной гибели. Определение жизнеспособности клеток через 72 часа инкубации клеток, положительных по Axl, с 1613F12 или с антителом, представляющим собой изотипический контроль (mlgG1), позволяет сделать вывод о том, что 1613F12 индуцирует интернализацию рецептора Axl.

В данном примере использовали клетки, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии Axl, согласно результатам определения с использованием реагента Qifikit (Dako). Результаты представлены ниже в Таблице 5.

В этом Примере клетки SN12C использовали в качестве примера, не являющегося исчерпывающим. Можно использовать любые другие клеточные линии, экспрессирующим достаточное количество рецепторов Axl на своей 30 поверхности.

Антитела 1613F12 или изотипический контроль mlgG1 в различных концентрациях преинкубировали со вторичным антителом Mab-Zap (Advanced targeting systems) в количестве 100 нг в среде для культивирования клеток в течение 30 мин при комнатной температуре. Эту смесь добавляли к субконфлюентным клеткам SN12C, высаженным в белые 96-луночные планшеты для микротитрования. Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37°С в присутствии 5% CO₂. Жизнеспособность клеток определяли с помощью набора для исследования клеточной пролиферации Cell Titer Glo согласно инструкциям производителя (Promega). Использовали несколько контролей: i) без вторичного иммуноконъюгата и ii) без первичного антитела. Параллельно проводили исследования с изотипическим контролем mlgGI.

Полученные результаты представлены на Фиг. 1.

Максимальный цитотоксический эффект 1613F12 в отношении клеток SN12C составлял ~36%. В присутствии антитела 9G4, использовавшегося в эксперименте в качестве изотипического контроля, цитотоксический эффект не наблюдался. В лунках, содержащих только первичные антитела, цитотоксичность не наблюдалась (результаты не приведены). Таким образом, рецептор Axl является подходящим антигеном для создания иммуноконъюгатов, поскольку иммунный комплекс, содержащий Axl-1613F12-MabZap, оказывает выраженное цитотоксическое действие на целевые клетки.

Пример 2. Получение антитела, направленного против внеклеточного домена rhAxl

Для получения мышиных моноклональных антител (МкАт), направленных против внеклеточного домена (ECD) человеческого рецептора Axl, 5 мышей BALB/c иммунизировали 5-кратно п/к клетками CHO-Axl в количестве 15-20×10⁶ и двукратно rhAxlECD в количестве 20 мкг. Первую иммунизацию проводили в присутствии полного адъюванта Фрейнда (Sigma, St Louis, MD, USA). Для последующих иммунизаций использовали неполный адъювант Фрейнда (Sigma).

За три дня до осуществления слияния, иммунизированные мыши получали бустерную инъекцию клеток CHO-Axl в количестве 20×10⁶ и rhAxl ECD в количестве 20 мкг вместе с неполным адъювантом Фрейнда.

Для получения гибридом выделяли спленоциты и лимфоциты путем перфузии селезенки и измельчении проксимальных лимфоузлов, соответственно, забранных у 1 из 5 иммунизированных мышей (отобранной по результатам титрования сыворотки) и сливали с клетками миеломы SP2/0-Agl4 (АТСС, Rockville, MD, USA). Протокол слияния описан Kohler and Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

Затем проводили отбор гибридных клеток в селективной среде, содержащей гипоксантит, аминоптерин и тимидин. Как правило, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, в частности, мышиного происхождения, можно использовать методики, описанные, в частности, в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988).

Приблизительно через 10 дней после процедуры слияния проводили скрининг колоний гибридных клеток. При первичном скрининге в супернатанте гибридом определяли уровень секреции МкАт, направленных против внеклеточного домена белка Axl при помощи твердофазного ИФА. Параллельно проводили FACS-анализ для отбора МкАт, способных связывать клеточную форму Axl, присутствующего на поверхности клеток, с использованием клеток СНО дикого типа и клеток СНО, экспрессирующих Axl (АТСС).

Отобранные гибридомы как можно раньше клонировали путем предельного разведения и затем проводили скрининг их способности взаимодействовать с внеклеточным доменом белка Axl. Затем определяли изотип клонированных МкАт с использованием набора для изотипирования антител (cat #5300.05, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). Для каждой гибридомы отбирали и культивировали один клон.

Твердофазный ИФА выполняли, как описано ниже, с использованием неразведенного супернатанта гибридом или, после определения содержания IgG в супернатанте, выполняли титрование, начиная с концентрации 5 мкг/мл. Затем выполняли последовательные разведения ½ в следующих 11 рядах. Вкратце, 96-луночные планшеты для ИФА (Costar 3690, Corning, NY, USA) покрывали белком Axl-Fc в количестве 50 мкл/лунку (R and D Systems, кат. №154-AL) или rhAxI ECD в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали ФСБ, содержащим 0,5% желатин (#22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) в течение 2 ч при 37°С. После удаления блокирующего буфера путем постукивания планшетов, в планшеты для ИФА добавляли 50 мкл неразведенного супернатанта гибридом или 50 мкл раствора с концентрацией 5 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После трех отмывок добавляли по 50 мкл поликлонального антитела козы к IgG мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) в разведении 1/5000 в ФСБ, содержащем 0,1% желатин и 0,05% Tween 20 (вес.:вес.) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем планшеты для ИФА отмывали 3 раза и добавляли субстрат ТМВ (#UP664782, Uptima, Interchim, France). После 10-минутной инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 1 M серной кислоты и определяли оптическую плотность при 450 нм.

Для отбора методом проточной цитометрии 10⁵ клеток (СНО wt или CHO-Axl) высаживали в каждую лунку 96-луночного планшета в ФСБ, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,01% азида натрия (буфер FACS) при 4°С. После центрифугирования в течение 2 мин при 2000 об/мин буфер удаляли и добавляли исследуемые супернатанты гибридом или очищенные МкАт (1 мкг/мл). Через 20 мин инкубации при 4°С клетки дважды отмывали и добавляли конъюгированное с Alexa 488 антитело козы к иммуноглобулинам мыши, разведенное 1/500 в буфере FACS (#А1 1017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA) и инкубировали в течение 20 мин при 4°С. После финальной отмывки буфером FACS клетки анализировали на проточном цитометре (Facscalibur, Becton-Dickinson) после добавления в каждую пробирку пропидия иодида в конечной концентрации 40 мкг/мл. Лунки, содержащие только клетки и клетки, инкубировавшиеся со вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, служили негативным контролем. В каждом эксперименте использовали изотипический контроль (Sigma, ref M90351MG). Для расчета средних значений интенсивности флуоресценции (MFI, от англ. mean fluorescence intensity) анализировали по меньшей мере 5000 клеток.

Более конкретно, для слияния использовали 300×10⁶ полученных спленоцитов и 300×10⁶ клеток миеломы (соотношение 1:1). Двести клеток из полученной клеточной суспензии высаживали в концентрации 2×10⁶ клеток/мл в 30 96-луночных планшетов.

Первый скрининг (приблизительно на 14 день после слияния) при помощи твердофазного ИФА с использованием белка rhAxlECD и при помощи FACS-анализа с использованием клеток СНО дикого типа и клеток СНО, экспрессирующих Axl, позволил отобрать 10 гибридом, у которых значения оптической плотности (OD) при покрытии rh AxlECD превышали 1, а значения MFI составляли менее 50 для клеток СНО дикого типа и свыше 200 для клеток CHO-Axl.

Эти 10 гибридом культивировали и клонировали методом предельного разведения. Каждый 96-луночный планшет имел кодовое обозначение. Через 9 дней после высаживания супернатанты из планшетов, в которых осуществляли клонирование, подвергали скринингу методом ИФА в отношении специфичности связывания с внеклеточным доменом белка rh AxlECD. Для каждого планшета с одним кодовым обозначением отбирали три клона и осуществляли их культивирование и изотипирование. После получения антител к Axl изучали их способность подвергаться интернализации при связывании с Axl на клеточной поверхности.

Пример 3. Специфичность связывания Axl

В данном Примере вначале изучали связывание 1613F12 с белком rhAxl-Fc. Затем изучали его связывание с двумя другими представителями семейства ТАМ, rhDtk-Fc и rhMer-Fc.

Вкратце, рекомбинантные человеческие белки Axl-Fc (R and D systems, кат. №154AL/CF), rhDtk (R and D Systems, кат. №859-DK) или rhMer-Fc (R and D Systems, кат. №891-MR) наносили на 96-луночные планшеты Immulon II и оставляли при 4°С в течение ночи. После блокирования в течение 1 ч 0,5% раствором желатина добавляли очищенное антитело 1613F12 в начальной концентрации 5 мкг/мл (3,33×10^-8 М) и инкубировали еще 1 ч при 37°С. Затем выполняли последовательные разведения ½ в 12 рядах. Планшеты отмывали и добавляли антитело козы, специфическое к иммуноглобулинам мыши, конъюгированное с пероксидазой хрена (Jackson) на 1 ч при 37°С. Для развития окраски использовали раствор субстрата ТМВ. Параллельно также использовали изотипический контроль (mlgG1) и доступное для приобретения антитело Mab 154, направленное против Axl. Для подтверждения того, что планшеты были покрыты исследуемым белком, использовали меченное HRP антитело козы, направленное против IgG человека, специфическое к фрагменту Fc (Jackson, ref 109-035-098) и/или конъюгированное с HRP антитело, направленное против гистидина (R and D Systems, ref: MAB050H). Результаты представлены на Фиг. 2А, 2В и 2С, соответственно.

В данном Примере показано, что антитело 1613F12 связывается только с белком rhAxl-Fc и не связывается с двумя другими представителями семейства ТАМ, rhDtk или rhMer. Перекрестной специфичности связывания антитела 1613F12 с представителями семейства ТАМ не наблюдалось. В отсутствие первичного антитела (дилюент) неспецифического связывания не наблюдалось. В присутствии изотипического контрольного антитела связывания не наблюдалось.

Пример 4: 1613F12 распознает клеточную форму Axl, экспрессируемую опухолевыми клетками

Уровень экспрессии Axl на поверхности опухолевых клеток человека вначале определяли с использованием доступного для приобретения антитела против Axl (R and D Systems, ref: MAB 154) одновременно с использованием калибровочных частиц для количественной оценки уровня экспрессии Axl. Затем изучали связывание Axl, присутствующего на клеточной поверхности, с использованием 1613F12.

Для исследования поверхностного связывания готовили последовательные двукратные разведения раствора первичного антитела с концентрацией 10 мкг/мл (6,66×10^-8 M) (1613F12, антитело МАВ154 или изотипический контроль (mlgG1) МкАт 9G4) и добавляли к клеткам в количестве 2×10⁵ на 20 мин при 4°С. После 3 отмывок фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с добавлением 1% БСА и 0,01% NaN₃, клетки инкубировали со вторичным антителом козы, направленным против иммуноглобулинов мыши, конъюгированным с Alexa 488 (в разведении 1/500) в течение 20 минут при 4°С. После 3 дополнительных отмывок ФСБ с добавлением 1% БСА и 0,1% NaN₃, клетки анализировали на проточном цитометре (Facscalibur, Becton-Dickinson). Для расчета средних значений интенсивности флуоресценции анализировали по меньшей мере 5000 клеток.

Для количественного определения антигенов клеточной поверхности в единицах ABC (от англ. antibody binding capacity, антитело-связывающая способность) с использованием антитела МАВ 154 применяли калибровочные частицы QIFIKIT®. Затем клетки инкубировали одновременно с частицами QIFIKIT® и поликлональным антителом козы (F(ab')₂) к иммуноглобулинам мыши, конъюгированным с FITC, в насыщающей концентрации. Затем определяли количество антигенных сайтов на поверхности клеток в исследуемом образце при интерполяции калибровочной кривой (зависимости интенсивности флуоресценции отдельных популяций частиц от числа молекул МкАт на частицах).

4.1. Количественное определение уровня экспрессии Axl на клеточной поверхности

Уровень экспрессии Axl на поверхности опухолевых клеток человека определяли непрямым иммунофлуоресцентным методом при помощи проточной цитометрии с использованием набора для количественного определения антигенов клеточной поверхности (QIFIKIT®, Dako, Denmark). Построение графика зависимости средней интенсивности флуоресценции (MFI) от антитело-связывающей способности калибровочных частиц позволяет определить количество антигенных сайтов у клеточных линий.

В Таблице 6 представлен уровень экспрессии Axl, измеренный на поверхности различных линий клеток опухолей человека (SN12C, Calu-1, А172, А431, DU 145, MDA-MB435S, MDA-MB231, РС3, NCI-H226, NCI-Η 125, MCF7, Panel) (АТСС, NCI) с использованием набора QIFIKIT® и доступного для приобретения антитела МАВ154 (R and D Systems). Значения выражены в виде антитело-связывающей способности (ABC).

Результаты, полученные с доступным для приобретения моноклональным антителом, направленным против Axl (МАВ154), показали, что рецептор Axl экспрессируется на различном уровне, в зависимости от изучаемых человеческих опухолевых клеток.

4.2. Детекция Axl на человеческих опухолевых клетках с использованием 1613F12

Более конкретно, связывание Axl изучали с использованием 1613F12.

Строили кривые зависимости доза-эффект для 1613F12. Значения MFI, полученные для различных человеческих опухолевых клеток, анализировали в программе Prism. Результаты представлены на Фиг. 3.

Результаты показывают, что 1613F12 специфически связывается с мембранным рецептором Axl, что подтверждается профилем кривой насыщенности. Однако, наблюдается различная интенсивность мечения, отражающая различный уровень экспрессии поверхностного рецептора Axl на человеческих опухолевых клетках. При использовании линии опухолевых клеток молочной железы человека MCF7 связывания с рецептором Axl не наблюдалось.

Пример 5: Межвидовая перекрестная специфичность 1613F12

Межвидовую перекрестную специфичность 1613F12 изучали с использованием двух биологических видов: мыши и обезьяны. Вначале исследовали связывание рекомбинантного мышиного (rm) рецептора Axl методом твердофазного ИФА (Фиг. 4). Затем выполняли исследование методом проточной цитометрии с использованием клеток обезьяны COS7, поскольку эти клетки экспрессируют на своей поверхности рецептор Axl (Фиг. 5). Клеточная линия COS7 была получена путем иммортализации клеток линии CV-1, полученных из клеток почек африканской зеленой мартышки, с помощью вируса SV40 с версией генома, обеспечивающей продукцию большого Т-антигена, но дефектной по репликации.

Иммуноферментный анализ rmAxl-Fc

Вкратце, рекомбинантные мышиные белки Axl-Fc (R and D systems, кат. №854-АХ /CF) наносили на 96-луночные планшеты Immulon II и оставляли при 4°С в течение ночи. После блокирования в течение 1 ч 0,5% раствором желатина добавляли очищенное антитело 1613F12 еще на 1 ч при 37°С в начальной концентрации 5 мкг/мл (3,33×10^-8 М). Затем выполняли последовательные разведения ½ в 12 рядах. Планшеты отмывали и добавляли антитело козы, специфическое к иммуноглобулинам мыши, конъюгированное с пероксидазой хрена (Jackson) на 1 ч при 37°С.Для развития окраски использовали раствор субстрата ТМВ. Параллельно также использовали изотипический контроль (mlgG1) и доступное для приобретения антитело Mab 154. Для подтверждения того, что планшеты были покрыты исследуемым белком, использовали меченное HRP антитело козы, направленное против IgG человека, специфическое к фрагменту Fe (Jackson, ref 109-035-098) и/или конъюгированное с HRP антитело, направленное против гистидина (R and D Systems, ref: MAB050H).

Результаты представлены на Фиг. 4. На данной Фиг. показано, что 1613F12 не связывается с внеклеточным доменом Axl мыши. В отсутствие первичного антитела (дилюент) специфического связывания не наблюдалось.

FACS COS7

Для исследования связывания с клетками 1613F12 использовали клетки COS7, 2×10⁵ клеток инкубировали с антителом в диапазоне концентраций, полученных при последовательном разведении ½ (12 точек) раствора антитела 1613F12 с концентрацией 10 мкг/мл (6,66×10^-8 М) или изотипического контроля (mlgG1) в течение 20 мин при 4°С. После 3 отмывок фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с добавлением 1% БСА и 0,01% NaN₃, клетки инкубировали со вторичным антителом козы, направленным против иммуноглобулинов мыши, конъюгированным с Alexa 488 (в разведении 1/500) в течение 20 минут при 4°С. После 3 дополнительных отмывок ФСБ с добавлением 1% БСА и 0,1% NaN₃, клетки анализировали на проточном цитометре (Facscalibur, Becton-Dickinson). Для расчета средних значений интенсивности флуоресценции анализировали по меньшей мере 5000 клеток. Данные анализировали в программе Prism.

Результаты представлены на Фиг. 5. Кривая титрования, построенная для клеток COS7 с использованием 1613F12, подтверждает, что антитело 1613F12 способно распознавать клеточную форму рецептора Axl обезьян, экспрессируемую на поверхности клеток COS7. Плато достигается при концентрациях 1613F12 свыше 0,625 мкг/мл (4,2×10^-10). В присутствии изотипического контроля (mlgG1) связывания не наблюдалось.

Данный Пример иллюстрирует тот факт, что 1613F12 не обладает перекрестной реактивностью в отношении рецептора Axl мыши. Напротив, он прочно связывается с рецептором Axl обезьяны, экспрессирующимся на поверхности клеток COS7.

Пример 6. Анализ конкурентного связывания Gas6, проводившийся в присутствии 1613F12

Для дальнейшей характеристики 1613F12 исследовали его конкуренцию с Gas6. В данном исследовании свободный белок rhAxl-Fc и 1613F12 инкубировали для образования комплекса антиген-антитело и затем комплексы наносили на поверхность аналитических планшетов, покрытых Gas6. Несвязанные комплексы антиген-антитело затем отмывали перед добавлением меченного ферментом вторичного антитела, направленного против Fc-части белка rhAxl-Fc, имеющей человеческое происхождение. Затем добавляли субстрат и определяли концентрацию антигена по величине сигнала, развивающегося в результате реакции фермент-субстрат.

Вкратце, реакционную смесь, содержащую белок rhAxl-Fc в присутствии или отсутствии исследуемых моноклональных антител к Axl, готовили в отдельных планшетах, заблокированных 0,5% раствором желатина в ФСБ 1Х. Выполняли последовательные разведения 1: 2 мышиных антител к Axl (в 12 рядах, начиная с 80 мкг/мл). Затем добавляли белок rhAxl-Fc в концентрации 0,5 мкг/мл (R and D Systems, ref. 154AL/CF) за исключением ряда, служившего в качестве отрицательного контроля, в котором находился только дилюент (0,1% желатин, 0,05% Tween 20 в ФСБ 1Х). После перемешивания образцы для проведения конкурентного анализа добавляли в планшеты, покрытые Gas6 с использованием раствора rhGas6 в ФСБ (R and D Systems кат. № 885-GS-CS/CF) в концентрации 6 мкг/мл. После инкубации и нескольких отмывок связавшийся белок rhAxl-Fe детектировали с использованием конъюгированного с HRP антитела козы к IgG человека (Jackson, ref. 109-035-098). После связывания в планшеты добавляли субстрат ТМВ. Реакцию останавливали добавлением 1М раствора H₂SO₄ и измеряли полученную оптическую плотность при 450 нм с помощью планшетного спектрофотометра.

Данный эксперимент показывает (Фиг. 6), что 1613F12 конкурирует с иммобилизованным лигандом за связывание rhAxl-Fc. Конкуренция с Gas6 за связывание наблюдается в присутствии антитела 1613F12 в концентрациях выше 2,5 мкг/мл (1,67×10^-8 М). Связывания rhAxl-Fc с иммобилизованным Gas6 в присутствии 1613F12 в концентрациях выше 10 мкг/мл (6,67×10⁸ М) уже не наблюдалось. 1613F12 блокирует связывание Gas6 с rhAxl-Fc.

Пример 7. Исследование эпитопов методом вестерн-блоттинга

Для определения, распознает ли 1613F12 линейный или конформационный эпитоп, проводили анализ методом вестерн-блоттинга с использованием лизатов клеток SN12C. Образцы обрабатывали в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях. Если обнаруживается полоса, соответствующая восстановленной форме образца, исследуемое антитело распознает линейный эпитоп внеклеточного домена, в противном случае оно направлено против конформационного домена Axl ECD.

Клетки SN12C высаживали в среде RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, от англ. fetal bovine serum) +2 мМ L-глутамина в концентрации 5×10⁴ клеток/см² во флаконах Т162 см² на 72 ч при 37°С в атмосфере с содержанием 5% CO₂. Затем клетки дважды отмывали фосфатным солевым буфером (ФСБ) и лизировали в 1,5 мл ледяного лизирующего буфера [50 мМ Tris-HCl (pH 7,5); 150 мМ NaCl; 1% Nonidet Р40; 0,5% дезоксихолат и 1 таблетка полного коктейля ингибиторов протеаз +1% антифосфатаз]. Клеточные лизаты перемешивали в течение 90 мин при 4°С и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин для удаления клеточного дебриса. Концентрацию белка определяли методом с бицинхониновой кислотой. Загружали различные образцы. Вначале готовили 10 мкг клеточного лизата (10 мкг в 20 мкл) в восстанавливающих условиях (1х буфер для внесения образцов (BIORAD) + 1х восстанавливающий агент (BIORAD)) и после 2 мин инкубации при 96°С загружали в ДСН-ПАГ. Затем в невосстанавливающих условиях (только в 1х буфере для внесения образцов (BIORAD)) готовили два других образца клеточного лизата по 10 мкг. До загрузки в ДСН-ПАГ, один из этих двух последних образцов нагревали в течение 2 мин при 96°С; другой оставляли на льду. После окончания миграции белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью TBS-tween 20 0,1% (TBST) с 5% обезжиренного молока и инкубировали с 1613F12 в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи при 4°С.Антитела разводили в Трис-солевом буфере с добавлением 0,1% tween 20 (об/об) (TBST) с 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембраны отмывали TBST и инкубировали со вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой (разведение 1/1000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для обнаружения иммунореактивных белков использовали ECL (Pierce #32209). После визуализации Axl мембраны снова промывали однократно TBST и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мышиным антителом к GAPDH (в разведении 1/200 000). Затем мембраны отмывали TBST и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны отмывали и для обнаружения GAPDH использовали ECL.

Результаты представлены на Фиг. 7.

1613F12 преимущественно распознает информационный эпитоп, поскольку специфическая полоса в основном наблюдается в невосстанавливающих условиях. Однако, слабый сигнал наблюдается при миграции лизата клеток SN12C в денатурирующих условиях, что указывает на то, что 1613F12 обладает способностью слабо связываться с линейным эпитопом.

Пример 8. Исследование снижения экспрессии Axl, вызванного 1613F12, методом вестерн-блоттинга

В следующем Примере для изучения активности антител, направленных против Axl, в отношении экспрессии рецептора Axl выбрали линию клеток карциномы почки человека SN12C (АТСС). Клетки линии SN12C характеризуются повышенной экспрессией рецептора Axl. Снижение экспрессии Axl изучали методом вестерн-блоттинга с использованием клеточных экстрактов, как показано на Фиг. 8А-8В.

Клетки SN12C инкубировали в среде RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS и 2 мМ L-глутамина в концентрации 6×10⁴ клеток/см² в 6-луночных планшетах в течение 48 ч при 37°С в атмосфере с содержанием 5% CO₂. После двух отмывок фосфатно-солевым буфером (ФСБ) клетки подвергали сывороточному голоданию в среде, содержащей либо лиганд-рекомбинантный gas6 мыши в концентрации 800 нг/мл (R and D Systems, ref: 986-GS/CF), либо антитело 9G4 в концентрации 10 мкг/мл, использовавшееся в качестве изотипического контроля (mlgG1), либо антитело к Axl по настоящему изобретению в концентрации 10 мкг/мл и инкубировали дополнительно в течение 4 ч или 24 ч. Затем среду аккуратно удаляли, а клетки дважды промывали холодным ФСБ. Клетки лизировали в 200 мкл ледяного лизирующего буфера [50 мМ Tris-HCl (pH 7,5); 150 мМ NaCl; 1% Nonidet Р40; 0,5% дезоксихолат и 1 таблетка полного коктейля ингибиторов протеаз + 1% антифосфатаз]. Клеточные лизаты перемешивали в течение 90 мин при 4°С и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин для удаления клеточного дебриса. Концентрацию белка определяли методом с бицинхониновой кислотой. Клеточные лизаты (10 мкг в 20 мкл) разделяли в ДСН-ПАГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью TBS-Tween 20 0,1% (TBST) с 5% обезжиренного молока и инкубировали с доступным для приобретения антителом М02, направленным против Axl, в концентрации 0,5 мкг/мл (AbNova Н00000558-М02) в течение ночи при 4°С. Антитела разводили в Трис-солевом буфере с добавлением 0,1% tween 20 (об/об) (TBST) с 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембраны отмывали TBST и инкубировали со вторичным антителом, конъюгированным с перокидазой (разведение 1/1000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для обнаружения иммунореактивных белков использовали ECL (Pierce #32209). После визуализации Axl мембраны снова промывали однократно TBST и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мышиным антителом к GAPDH (в разведении 1/200000). Затем мембраны отмывали TBST и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны отмывали и для обнаружения GAPDH использовали ECL. Интенсивность сигнала определяли при помощи денситометрии.

Результаты, представленные на Фиг. 8А и 8В, являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов и показывают, что 1613F12 снижает уровень экспрессии Axl в опухолевых клетках человека, характеризующихся сверхэкспрессией Axl. Через 4 ч 1613F12 снижает уровень экспрессии Axl на 66%, а через 24 ч инкубации с 1613F12 - на 87%.

Пример 9. Исследование влияния 1613F12 на экспрессию Axl на поверхности клеток методом проточной цитометрии

Методика проточной цитометрии позволяет детектировать поверхностные рецепторы Axl. Применение этой методики позволяет продемонстрировать влияние антител на экспрессию Axl на клеточной мембране. В данном примере использовали опухолевые клетки почки человека SN12C, экспрессирующие высокий уровень Axl.

Опухолевые клетки линии SN12C культивировали в среде RMPI1640 с добавлением 1% L-глутамина и 10% FCS в течение 3 дней до начала эксперимента. Затем клетки трипсинизировали и высаживали в 6-луночные планшеты в среде RPMI1640 с добавлением 1% L-глутамина и 5% FBS. На следующий день добавляли исследуемые антитела в концентрации 10 мкг/мл. Несколько лунок оставляли необработанными. Клетки инкубировали при 37°С, 5% CO₂. Через 24 часа клетки отмывали ФСБ, снимали и инкубировали с теми же исследуемыми антителами в буфере FACS (ФСБ, 1% БСА, 0,01% азид натрия). Необработанные лунки также окрашивали тем же антителом для сравнения интенсивности сигнала, полученного с тем же МкАт у обработанных и необработанных клеток. Клетки инкубировали в течение 20 минут при 4°С и отмывали три раза буфером FACS. Меченное Alexa 488 антитело козы к IgG мыши инкубировали в течение 20 минут и клетки отмывали три раза перед проведением FACS-анализа клеточной популяции, негативной по пропидий йодиду.

Определяли два показателя: (i) разницу между флуоресцентым сигналом на поверхности необработанных (без антитела) клеток в сравнении с обработанными антителом клетками через 24 ч и (ii) процентное содержание оставшегося Axl на клеточной поверхности. Процентное содержание оставшегося Axl рассчитывали следующим образом:

% оставшегося Axl=(MFI_cAT24ч/MFI_{безАт24ч})×100

В Таблице 7 представлены результаты одного эксперимента, являющегося репрезентативным. Результаты воспроизводились в трех независимых экспериментах.

Разница в значениях MFI при окрашивании МкАт необработанных клеток и окрашивания тем же антителом в условиях воздействия отражает снижение уровня экспрессии белка Axl на поверхности клеток вследствие связывания изучаемого МкАт. В условиях без антитела и в присутствии изотипического контрольного антитела (m9G4) были получены схожие результаты.

Результаты показывают, что средняя интенсивность флуоресцентного сигнала, зарегистрированного на поверхности клеток, обработанных 1613F12 в течение 24 часов, снижена (-514) по сравнению с MFI, полученной у необработанных клеток, меченных 1613F12. Через 24 ч инкубации с антителом 1613F12 на поверхности клеток SN12C остается 45,2% рецепторов Axl клеточной поверхности.

Пример 10. Изучение интернализации 1613F12 иммуногистохимическим методом с флуоресцентной детекцией

Дополнительные результаты были получены при изучении интернализации методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием конфокальной микроскопии.

Вкратце, опухолевые клетки линии SN12C культивировали в среде RMPI1640 с добавлением 1% L-глутамина и 10% FCS в течение 3 дней до начала эксперимента. Затем клетки снимали при помощи трипсина и высаживали в 6-луночные планшеты с покровным стеклом, содержащие RPMI1640 с добавлением 1% L-глутамина и 5% FCS. На следующий день добавляли 1613F12 в концентрации 10 мкг/мл. Кроме того, использовали клетки, обработанные нерелевантным антителом. Затем клетки инкубировали в течение 1 ч и 2 ч при 37°С, 5% CO₂. Для временной точки 0 ч клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°С для определения связывания антитела с клеточной поверхностью. Клетки отмывали ФСБ и фиксировали параформальдегидом в течение 15 минут. Для детекции антитела, оставшегося на клеточной поверхности, клетки промывали и инкубировали с антителом козы, направленным против IgG мыши, конъюгированным с Alexa 488, в течение 60 минут при 4°С. Для регистрации проникновения антитела внутрь клеток, клетки фиксировали и пермеабилизовали сапонином. Для окрашивания антитела на поверхности мембраны и внутри клетки использовали антитело козы, направленное против IgG мыши, меченное Alexa 488 (Invitrogen). Ранние эндосомы идентифицировали с помощью поликлонального кроличьего антитела, направленного против ЕЕА1 и антитела козы, направленного против IgG кролика, меченного Alexa 555 (Invitrogen). Клетки отмывали три раза и окрашивали ядра Draq5. После окрашивания клетки заключали в гистологическую среду Prolong Gold (Invitrogen) и анализировали с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 510.

Фотографии представлены на Фиг. 9А-9С.

Изображения были получены при помощи конфокальной микроскопии. В присутствии изотипического контроля mlgG1 (9G4) не наблюдалось ни мембранного, ни внутриклеточного окрашивания (Фиг. 9А). Уже через 1 ч инкубации клеток SN12C с 1613F12 наблюдалось постепенное снижение интенсивности окрашивания мембраны на Axl (Фиг. 9В). Через 1 ч и 2 ч отчетливо наблюдалось накопление антитела 1613F12 внутри клеток (Фиг. 9С). Отмечалась колокализация антитела внутри клеток с маркером ранних эндосом ЕЕА1. Эти снимки подтверждают, что имеет место интернализация 1613F12 клетками SN12C.

Пример 11. Противоопухолевая активность in vitro, опосредованная антителом, направленным против Axl

Исследование пролиферации SN12C

Клетки SN12C в количестве 10000 на лунку высаживали в среде, не содержащей FCS, в 96-луночные планшеты на ночь при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂. На следующий день клетки предварительно инкубировали с каждым антителом в концентрации 10 мкг/мл в течение 1 ч при 37°С. Клетки обрабатывали в присутствии или в отсутствие rmGas6 (R and D Systems, кат. № 986-GS/CF), добавляя лиганд непосредственно в лунку, а затем оставляли расти в течение 72 ч. Пролиферацию оценивали по включению ³Н тимидина.

Результаты представлены на Фиг. 10. При добавлении 1613F12 к клеткам SN12C эффект не наблюдался.

Пример 12. Цитотоксичность иммуноконъюгата 1613F12-сапорин в отношении различных линий опухолевых клеток человека

Данный Пример демонстрирует цитотоксичность 1613F12, связанного с сапорином. С этой целью исследовали прямой цитотоксический эффект in vitro с использованием большой панели линий опухолевых клеток человека (Фиг. 11А-11K). Данная панель опухолевых клеточных линий характеризуется различной экспрессией Axl на клеточной поверхности.

Вкратце, 5000 клеток высаживали в 96-луночные культуральные планшеты в 100 мкл соответствующей среды для культивирования, содержащей 5% FBS (день 0). Через 24 часа инкубации в атмосфере с содержанием 5% CO₂ при 37°С, к клеткам добавляли различные концентрации иммуноконъюгата (1613F12-сапорин или 9G4-сапорин) или голого антитела (1613F12 или 9G4). Затем культуральные планшеты инкубировали при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, в течение 72 часов.

На 4 день оценивали жизнеспособность клеток люминесцентным методом с помощью набора CellTiter-Glo® (Promega Corp., Madison, Wis.), позволяющего определить число жизнеспособных клеток в культуре по количеству АТФ, как индикатора метаболически активных клеток. Люминесценцию регистрировали при помощи люминометра.

По величине люминесцентного сигнала рассчитывали цитотоксичность, выраженную в процентах, по следующей формуле:

цитотоксичность (%)=100 - [(RLU_Aт-сап×100)/RLU_безAт]

На Фиг. 11А-11K представлены графики, отображающие цитотоксичность, выраженную в процентах, в зависимости от концентрации иммуноконъюгатов, полученную в отдельных исследованиях цитотоксичности in vitro в отношении опухолевых клеток (A) SN12C, (В) Calu-1, (С) А 172, (D) А431, (Е) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (H) РС3, (I) NCI-H226, (J) NCI-H125 или (K) Panel, обработанных различными концентрациями иммуноконъюгата 1613F12-сапорин.

На Фиг. 11А-11K показано, что иммуноконъюгат 1613F12-сапорин обладает цитотоксичностью в отношении этих различных линий опухолевых клеток человека. Выраженность цитотоксического эффекта зависит от линии опухолевых клеток человека.

Пример 13. Гуманизация вариабельных доменов антитела 1613F12

Применение мышиных антител (МкАт) в терапевтических целях у людей, как правило, связано с серьезным неблагоприятным воздействием, у пациентов развивается иммунный ответ на мышиные антитела (НАМА-ответ, от англ. human anti-mouse antibody), что таким образом снижает эффективность лечения и делает невозможным длительное введение. Одним из подходов к преодолению данной проблемы является гуманизация мышиных МкАт путем замены мышиных последовательностей их эквивалентами человеческого происхождения без изменения антигенсвязывающей активности. Этого можно достичь двумя способами: (i) путем конструирования химерных антител мышь/человек, в которых мышиные вариабельные участки присоединены к человеческим константным участкам (Boulianne et al., 1984) и (ii) путем пересаживания участков, определяющих комплементарность (CDR), из вариабельных участков мыши на тщательно выбранные человеческие вариабельные участки и затем присоединения этих "реконструированных человеческих" вариабельных участков к человеческим константным участкам (Riechmann et al., 1988).

13.1. Создание гуманизированных версий антитела 1613F12

13.1.1 Гуманизация вариабельного домена легкой цепи VL

На предварительном этапе нуклеотидную последовательность 1613F12 VL сравнивали с последовательностями мышиных генов зародышевой линии из базы данных IMGT (http://www.imgt.org). Были идентифицированы мышиные гены зародышевой линии IGKV16-104*01 и IGKJ5*01. Для идентификации наилучших человеческих кандидатных последовательностей для пересаживания CDR проводили поиск человеческих генов зародышевой линии, обладающих наибольшей идентичностью с последовательностью 1613F12 VL мыши. С помощью опции для анализа базы данных IMGT идентифицировали возможные акцепторные человеческие V-участки для мышиных CDR 1613F12 VL: IGKV 1-27*01 и IGKJ4*02. Для гуманизации вариабельного домена легкой цепи все остатки, различающиеся между человеческой и мышиной последовательностями, были проранжированы по значимости. Эти порядковые номера (1-4) использовали для создания 11 различных гуманизированных вариантов вариабельного участка легкой цепи, имеющих до 14 обратных мутаций.

67

13.1.2 Гуманизация вариабельного домена тяжелой цепи VH

Для идентификации наилучших человеческих кандидатных последовательностей для пересаживания CDR, проводили поиск мышиных и человеческих генов зародышевой линии, обладающих наибольшей идентичностью с последовательностью 1613F12 VH. Нуклеотидную последовательность 1613F12 VH сопоставляли с последовательностями генов зародышевой линии мыши и человека с помощью программы для выравнивания последовательностей "IMGT ACQUEST", являющейся частью базы данных IMGT. Также осуществляли выравнивание аминокислотных последовательностей для верификации выравнивания нуклеотидных последовательностей с помощью программы "Align X" пакета программ VectorNTI. Выравнивание с мышиными генами зародышевой линии показало, что мышиные зародышевые V-ген IGHV14-3*02 и J-ген IGHJ2*01 являются наиболее гомологичными мышиными генами зародышевой линии. С помощью базы данных IMGT мышиный зародышевый D-ген IGHD1-1*01 идентифицировали как гомологичную последовательность. Для отбора подходящих человеческих генов зародышевой линии для пересаживания CDR идентифицировали человеческие гены зародышевой линии, обладающих наибольшей гомологией с последовательностью мышиного 1613F12 VH. Используя базу данных и опции для анализа IMGT, в качестве человеческой акцепторной последовательности для мышиных CDR 1613F12 VH выбрали человеческий ген зародышевой линии IGHVI-2*02 и человеческий зародышевый J-ген IGHJ5*01. Для гуманизации вариабельного домена тяжелой цепи все остатки, различающиеся между человеческой и мышиной последовательностями, были проранжированы по значимости. Эти порядковые номера (1-4) использовали для создания 20 различных гуманизированных вариантов вариабельного участка тяжелой цепи, имеющих до 18 обратных мутаций.

13.2. Валидация hz1613F12 в сравнении с m1613F12

Для сравнения гуманизированного 1613F12 с мышиной формой 1613F12 исследовали связывание при помощи ИФА с использованием белка rhAxl-Fc, а также при помощи FACS-анализа с использованием клеток SN12C. Дополнительно исследовали прямой цитотоксический эффект in vitro с использованием опухолевых клеток почки человека SN12C и линии клеток карциномы легких человека Calu-1.

Вначале осуществляли иммуноферментный анализ. Для эксперимента в 96-луночные планшеты (Immulon II, Thermo Fisher) вносили раствор 1613F12 в 1х ФСБ с концентрацией 5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. После этапа блокирования в покрытые планшеты вносили белок rh Axl-Fc (R and D Systems, ref: 154-AL) в диапазоне концентраций от 5 мкг/мл до 0,02 мкг/мл) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Для детекции добавляли биотинилированное антитело, направленное против Axl (приготовленное в лаборатории), в концентрации 0,85 мкг/мл на 1 ч при 37°С. Данное антитело к Axl распознает другие антигенные детерминанты. Затем в лунки добавляли раствор пероксидазы хрена, конъюгированной с авидином, в разведении 1/2000 в разводящем буфере. Затем добавляли раствор субстрата ТМВ на 5 мин. После добавления раствора, останавливающего пероксидазу, измеряли оптическую плотность при 405 нм с помощью планшетного спектрофотометра.

На Фиг. 12 показано, что и мышиное, и гуманизированное антитела 1613F12 одинаково связываются с белком rhAxl-Fc.

Для FACS-анализа клетки SN12C культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10% сыворотки. Клетки трипсинизировали и доводили концентрацию клеток до 1×10⁶ клеток/мл в буфере FACS. Клеточную суспензию в объеме 100 мкл инкубировали с возрастающими концентрациями изотипического контроля или антител, направленных против Axl, в течение 20 мин при 4°С. Затем клетки отмывали три раза буфером FACS и инкубировали в течение 20 мин либо со вторичным антителом, распознающим IgG мыши, меченным Alexa488, либо со вторичным антителом, распознающим IgG человека, меченным Alexa488, при 4°С в темноте. Клетки отмывали три раза буфером FACS и ресуспенд провал и в 100 мкл буфера FACS перед добавлением пропидия иодида.

Клетки инкубировали с возрастающими концентрациями изотипического контроля или антител к Axl. m1613F12 соответствует мышиному 1613F12, C1613F12 соответствует химерному 1613F12, a hzl613F12 соответствует гуманизированному антителу. Значения ЕС₅₀ определяли с использованием программы Prism.

Как показано на Фиг. 13, связывание гуманизированной формы 1613F12 с клетками SN12C характеризовалось значением ЕС₅₀, эквивалентным для химерной и мышиной форм 1613F12. Эти результаты указывали, что hz1613F12 по способности распознавать и связывать антиген Axl сопоставимо с мышиным 1613F12.

Эксперименты для оценки прямого цитотоксического эффекта in vitro были описаны ранее в Примере 12. В данном Примере готовили четыре иммуноконъюгата с сапорином: m9G4-сапорин, ch9G4-сапорин, 1613F12-сапорин и hz1613F12-сапорин, и исследовали на двух клеточных моделях (опухолевые клетки почки человека SN12C и клетки карциномы легких человека Calu-1).

На Фиг. 14 показано, что изотипические контроли для антител m9G4-сапорин и ch9G4-сапорин были неактивными, а гуманизированное антитело 1613F12-сапорин, направленное против Axl, вызывало схожий цитотоксический эффект в отношении клеток SN12C, что и иммуноконъюгат мышиного антитела 1613F12 с сапорином.

На Фиг. 15 показано, что иммуноконъюгат гуманизированного антитела 1613F12 с сапорином вызывает схожий цитотоксический эффект в отношении клеток Calu-1, что и иммуноконъюгат мышиного антитела 1613F12 с сапорином. Напротив, изотипические контроли m9G4-сапорин и ch9G4-сапорин обладали слабой активностью (~10% макс. цитотоксического эффекта) при концентрациях антитела выше 10^-9 М.

Пример 14. Кинетика связывания 1613F12 с внеклеточным доменом человеческого Axl

Затем определяли аффинность 1613F12 с помощью инструмента Biacore. Для определения кинетики связывания 1613F12 с внеклеточным доменом человеческого Axl использовали Biacore X.

Инструмент, принцип работы которого основан на оптическом феномене поверхностного плазмонного резонанса (SPR), выпускаемый компанией Biacore systems, позволяет детектировать и оценивать взаимодействия белок-белок в реальном времени, без использования меток.

Вкратце, для проведения экспериментов в качестве биосенсора использовали чип СМ5. В проточных ячейках 1 и 2 чипа СМ5 иммобилизовали IgG кролика (FC1 и FC2) до уровня 9300-10000 единиц RU (от англ. response units, единиц ответа), присоединяя антитела через аминогруппы.

Связывание оценивали в нескольких циклах. В каждом цикле измерения проводили при скорости потока 30 мкл/мин в буфере HBS-EP. Затем на поверхности чипа иммобилизовали исследуемое антитело, направленное против Axl, в течение 1 мин только в проточной ячейке FC2 до достижения среднего уровня иммобилизации 1613F12, составляющего 311,8 RU (SD=5,1 RU). Инъекции аналита (антиген Axl ECD) начинали с концентрации 200 нМ и выполняли двукратные последовательные разведения для определения приблизительных значений ka и kd в реальном времени.

В конце каждого цикла поверхности регенерировали, пропуская 10 мМ раствор гидрохлорида глицина с pH 1,5 для удаления комплексов антитело-антиген, а также захватывающего антитела. Наблюдавшийся сигнал соответствует разнице между сигналами, полученными в ячейках FC1 и FC2 (FC2-FC1). Константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) рассчитывали с использованием модели связывания один-к-одному по Ленгмюру. Равновесную константу диссоциации (KD) определяли как соотношение ka/kd. Экспериментальные значения анализировали в программе Biaevaluation версии 3.0. Соответствие модели экспериментальным данным оценивали с помощью критерия χ².

Результаты представлены ниже в Таблице 8.

Для получения внеклеточного домена (ECD) человеческого Axl вначале клонировали кДНК человека, кодирующую растворимый человеческий рецептор AXL, в экспрессирующий вектор рСЕР4 при помощи ПЦР. Очищенный продукт затем подвергали расщеплению рестрикционными ферментами HindIII и BamHI и лигировали в экспрессирующий вектор рСЕР4, который разрезали теми же ферментами. Наконец, получение рекомбинантной плазмиды pCEP[AXL]His6 подтверждали при помощи секвенирования ДНК.

Затем клетки НЕК293Е, адаптированные для роста в суспензии, культивировали в среде Ex-cell 293 (SAFC Biosciences) с добавлением 4 мМ глутамина. Все трансфекции осуществляли с использованием линейного полиэтиленимина (ПЭИ) 25 кДа. Трансфецированные клетки поддерживали при 37°С в шейкер-инкубаторе с содержанием 5% CO₂ в атмосфере при перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 6 дней. Клетки собирали путем центрифугирования и супернатант, содержащий рекомбинантный белок с гистидиновой меткой, подготавливали для очистки на колонке с агарозой, модифицированной никель-нитрилотриацетатом (Ni-NTA-агарозой).

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой антитело, способное специфически связываться с белком Axl, а также подвергаться интернализации после связывания. Изобретение относится также к конъюгату, содержащему такое антитело. Изобретение также охватывает применение указанного антитела и конъюгата для лечения рака. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией белка Axl. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 15 ил., 12 табл., 14 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое:

i) специфически связывается с человеческим белком Axl, и

ii) подвергается интернализации после связывания с указанным человеческим белком Axl,

где указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NOs. 4, 5 и 6.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что человеческий белок Axl имеет последовательность SEQ ID NO. 29 или 30.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что оно специфически связывается с эпитопом, расположенным во внеклеточном домене человеческого белка Axl.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, отличающееся тем, что внеклеточный домен человеческого белка Axl имеет последовательность SEQ ID NO. 31 или 32.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что оно вызывает снижение средней интенсивности флуоресценции (MFI), составляющее по меньшей мере 200.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельный домен легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из:

i) вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7,

ii) вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 36; и

iii) вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 37-47.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из:

i) вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8;

ii) вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO.48; и

iii) вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 49-68.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит:

i) вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7, 36 или 37-47; и

ii) вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8, 48 или 49-68.

10. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело 1613F12, полученное из гибридомы I-4505, депонированной в Национальной коллекции культур микроорганизмов в Институте Пастера, Франция, или его антигенсвязывающий фрагмент.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 для применения в качестве продукта для адресной доставки цитотоксического агента в сайт-мишень хозяина, где указанный сайт-мишень хозяина представляет собой эпитоп, расположенный во внеклеточном домене белка Axl.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения по п. 11, отличающееся тем, что внеклеточный домен белка Axl представляет собой внеклеточный домен человеческого белка Axl.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения по п. 11, отличающееся тем, что внеклеточный домен белка Axl имеет последовательность SEQ ID NO. 31 или 32.

14. Иммуноконъюгат для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией белка Axl, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, конъюгированный с цитотоксическим агентом.

15. Иммуноконъюгат по п. 14, где цитотоксический агент представляет собой лекарственное средство, радиоизотоп или токсин.

16. Иммуноконъюгат по п. 15, где указанное лекарственное средство выбрано из группы: алкилирующие агенты, такие как азотистый иприт, алкилсульфонаты, нитрозомочевину, оксазофорины, азиридины или иминоэтилены, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы митоза, ингибиторы функционирования хроматина, антиангиогенные агенты, антиэстрогены, антиандрогены, хелатирующие агенты, стимуляторы абсорбции железа, ингибиторы циклооксигеназы, ингибиторы фосфодиэстеразы, ингибиторы ДНК, ингибиторы синтеза ДНК, стимуляторы апоптоза, ингибиторы синтеза тимидилата, ингибиторы Т-клеток, агонисты интерферона, ингибиторы рибонуклеотизд-трифосфат-редуктазы, ингибиторы ароматазы, антагонисты эстрогеновых рецепторов, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы клеточного цикла, таксаны, ингибиторы тубулина, ингибиторы ангиогенеза, стимуляторы макрофагов, антагонисты нейрокининовых рецепторов, агонисты каннабиноидных рецепторов, агонисты допаминовых рецепторов, агонисты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, агонисты рецепторов эритропоэтина, агонисты рецепторов соматостатина, агонисты ЛГРГ, кальциевые сенситайзеры, антагонисты рецепторов фактора роста сосудистого эндотелия, антагонисты интерлейкиновых рецепторов, ингибиторы остеокластов, стимуляторы образования свободных радикалов, антагонисты рецепторов эндотелина, алкалоид барвинка, антигормон и иммуномодуляторы.

17. Иммуноконъюгат по п. 15, где указанный радиоизотоп выбран из группы: At²¹¹, С¹³, N¹⁵, О¹⁷, FI¹⁹, I¹²³, I¹³¹, I¹²⁵, In¹¹¹, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, tc⁹⁹m, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu, гадолиния, марганца или железа.

18. Иммуноконъюгат по п. 15, где указанный токсин выбран из группы: А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трихотецены, доластатины, ауристатины, СС1065 и производные этих токсинов.

19. Иммуноконъюгат по п. 14, где указанный иммуноконъюгат дополнительно содержит линкер.

20. Иммуноконъюгат по п. 19, где указанный линкер представляет собой расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер.

21. Иммуноконъюгат по п. 19, где указанный расщепляемый линкер представляет собой чувствительный к кислотам линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер.

22. Применение иммуноконъюгата по п. 14 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

23. Фармацевтическая композиция для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией белка Axl, содержащая иммуноконъюгат по п. 14 и по меньшей мере эксципиент и/или фармацевтически приемлемый носитель.

24. Мышиная гибридома I-4505, депонированная в Национальной коллекции культур микроорганизмов в Институте Пастера, Франция, для получения антитела по п. 1.