ГИСТИДИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/16 A61K48/00 A61K38/17 A61P29/00 A61P37/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) заявки США № 61/725414, поданной 12 ноября 2012 года, заявки США № 61/655358, поданной 4 июня 2012 года, и заявки США № 61/599802, поданной 16 февраля 2012 года, каждая из которых полностью включена посредством ссылки.

Положение относительно списка последовательностей

Список последовательностей, связанный с настоящей заявкой, предоставлен в машиночитаемом формате вместе с бумажной копией и включен, таким образом, в описание посредством ссылки. Имя машиночитаемого файла, содержащего список последовательностей, представляет собой ATYR_110_03WO_ST25.txt. Размер машиночитаемого файла составляет приблизительно 258 KB, файл был создан 15 февраля 2013 года и предоставлен в электронном виде посредством EFS-Web.

Предшествующий уровень техники

Область техники, к которой относится изобретение

Варианты осуществления настоящего изобретения относятся в основном к полипептидам гистидил-тРНК-синтетазы с улучшенными характеристиками, композициям, содержащим полипептиды HRS, и соответствующим способам использования полипептидов HRS или композиций для лечения различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний, включая способы лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, связанных с антителом против Jo-1.

Описание связанной области техники

Физиокрины, как правило, представляют собой небольшие, природные белковые домены, обнаруженные в семействе генов аминоацил-тРНК-синтетаз (AARS) высших организмов, которые не являются необходимыми для хорошо установленной роли аминоацил-тРНК-синтетаз в синтезе белка. До тех пор, пока не была разработана парадигма физиокринов, аминоацил-тРНК-синтетазы, семейство приблизительно из 20 ферментов, были известны только по их убиквитарной экспрессии во всех живых клетках и их основной роли в процессе синтеза белка. Однако в настоящее время более поздние научные открытия позволяют предположить, что аминоацил-тРНК-синтетазы играют дополнительные роли помимо синтеза белка и фактически эволюционировали в многоклеточных организмах, чтобы играть важные гомеостатические роли в физиологии и заболевании тканей.

Подтверждение существования неканонической функции AARS включает хорошо установленные сравнения последовательностей, при которых устанавливают, что в ходе эволюции от простых одноклеточных организмов в более сложные формы жизни, AARS эволюционировали до более структурно сложных путем добавления присоединяемых доменов без потери способности облегчать синтез белка.

В соответствии с этой гипотезой у высших эукариотов выявили богатый и разнообразный набор расширенных функций AARS, и, в частности, для тРНК-синтетаз человека. Эти данные, которые основаны как на прямом анализе индивидуальных доменов, а также на открытии мутаций в генах тРНК-синтетаз, которые причинно связаны с заболеванием, но не влияют на аминоацилирование или активность синтеза белка, позволяют предположить, что эти недавно присоединные домены, или физиокрины, занимают центральное место в недавно приобретенных неканонических функциях AARS.

Кроме того, в настоящее время все более широкое признание получает тот факт, что конкретные тРНК-синтетазы, такие как гистидил-тРНК-синтетаза (HARS, HRS или HisRS) могут выделяться или секретироваться живыми клетками и могут обеспечивать важные локально действующие сигналы, в числе прочего, с иммуномодулирующими, хемотаксическими и ангиогенными свойствами. Прямое подтверждение роли AARS в качестве внеклеточных сигнальных молекул было получено в исследованиях, демонстрирующих секрецию и внеклеточное выделение конкретных тРНК-синтетаз, а также непосредственной демонстрацией, что добавление фрагментов тРНК-синтетаз, содержащих недавно присоединенные домены (физиокрины), но не другие фрагменты, не содержащие этих доменов, является активными в диапазоне внеклеточных путей передачи сигнала. Эти физиокрины, включая физиокрины, получаемые из HRS, предоставляют новую и ранее неиспользованную возможность разработки новых лучших в своем классе терапевтических белков для лечения заболевания человека.

В недавних исследованиях также было установлено, что некоторые тРНК-синтетазы содержат новые регуляторные генетические элементы, включая ALU-элементы (Rudinger-Thirion et al., PNAS USA, 108(40):E794-E802, 2011), которые обеспечивают повышенную специфическую для типа клеток экспрессию или альтернативный сплайсинг конкретных тРНК-синтетаз в конкретных тканях или в связи с конкретными заболеваниями. Кроме того, некоторые физиокрины продуцируются протеолитически в ответ на конкретные стимулы специфическим для типа клеток образом. В соответствии со специфической для типа клеток сверхэкспрессией и внеклеточным выделением физиокринов некоторые аутоиммунные заболевания (как правило, обозначаемые как синдромы анти-синтетазы) ассоциированы с продукцией антител к определенной группе тРНК-синтетаз (Tzioufas Orphanet (2001) 1-5; Park et al., Rheumatol. Int., 31:529-532, 2011).

Аутоиммунные нарушения возникают, когда иммунная система реагирует против своих собственных тканей. Аутоиммунные заболевания, как правило, классифицируют в зависимости от того, поражается ли один орган или ткань, или поражаются многие органы или ткани. Генерализованные или системные аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка (SLE), характеризующиеся поражением многих органов и тканей, как правило, ассоциированы с наличием аутоантител к основным клеточным компонентам. Другие аутоиммунные заболевания характеризуются аутоантителами против антигенов, ассоциированных с единственным органом или тканью.

Системные аутоиммунные заболевания, как правило, характеризуются наличием аутоантител. Некоторые из аутоантител, ассоциированные с конкретным заболеванием, могут являться специфическими для заболевания, а другие могут являться общими для многих аутоиммунных заболеваний. Например, SLE, которая представляет собой классическое иммунное нарушение, характеризуется наличием аутоантител, которые можно детектировать при другом аутоиммунном заболевании, таких как антитела к одноцепочечной ДНК, антитела к гистонам и антитела к рибонуклеарным частицам (RNP), а также наличием аутоантител, которые являются специфическими для SLE, таких как антитела к двухцепочечной ДНК. Другие системные аутоиммунные нарушения, такие как ревматоидный артрит и (идиопатические) воспалительные миопатии, также характеризуются наличием в сыворотке пациентов аутоантител, которые взаимодействуют с основными ядерными и цитоплазматическими внутриклеточными компонентами. Как и в случае SLE некоторые из этих аутоантител ассоциированы с другими аутоиммунными нарушениями, а некоторые специфически ассоциированы с аутоиммунным миозитом.

(Идиопатические) воспалительные миопатии, полимиозит, дерматомиозит и родственные нарушения, такие как перекрестный синдром полимиозит-склеродермия, представляют собой воспалительные миопатии, которые характеризуются хроническим воспалением мышц и слабостью проксимальных мышц. Воспаление мышц вызывает болезненность мышц, мышечную слабость и в конечном итоге атрофию мышц и фиброз, как описано, Plotz et al., Annals of Internal Med., 111:143-157, 1989, и Wallace et al., J. Musculoskelat Med., 27 (12) 470-479, 2010. С воспалением мышц также ассоциированы повышенные уровни альдолазы, креатининкиназы, трансаминаз (таких как аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза) и молочной дегидрогеназы в сыворотке. При этих состояниях кроме мышечной системы могут поражаться другие системы, приводя к артриту, феномену Рейно и интерстициальной легочной болезни. С клинической точки зрения полимиозит и дерматомиозит различаются по наличию характерных высыпаний у пациентов с дерматомиозитом. Отличия миозита от этих состояний можно устанавливать в некоторых исследованиях мышечной патологии.

Интерстициальная легочная болезнь (ILD) включает гетерогенную группу нарушений, при которых фиброз и воспаление возникают в альвеолярных стенках или в рыхлой ткани, окружающей перибронхосудистые пучки, междольковой перегородке и висцеральной плевре. Известны различные формы ILD, которые наряду с миозитом включают или являются ассоциированными с различными аутоиммунными заболеваниями, включая, например, гиперчувствительный пневмонит, склеродермию, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, синдром Черджа-Строса, гранулематоз Вегенера и синдром Гудпасчера.

Воспалительное заболевание мышц (IMD) и интерстициальная легочная болезнь (ILD) представляют собой серьезные хронические потенциально опасные для жизни аутоиммунные заболевания, при которых современный стандарт лечения включает введение неспецифических противовоспалительных лекарственных средств, таких как кортикостероиды, с возможностью развития серьезных побочных эффектов. Причина начала этих заболеваний еще не установлена, хотя аутоантитела можно детектировать приблизительно у 90% пациентов с полимиозитом и дерматомиозитом согласно Reichlin and Arnett, Arthritis and Rheum., 27:1150-1156, 1984. Сыворотка приблизительно 60% таких пациентов образует преципитаты с экстрактами из тимуса крупного рогатого скота или селезенки человека при иммунодиффузии по Оухтерлони (ID), тогда как сыворотка приблизительно 80% таких пациентов окрашивает субстраты тканевой культуры, такой как клетки HEp-2, при опосредованной иммунофлуоресценции (IIF) (Targoff and Reichlin, Arthritis and Rheum., 28:796-803, 1985; Nishikai and Reichlin, Arthritis and Rheum., 23:881-888, 1980, и Reichlin et al., J. Clin. Immunol., 4:40-44, 1984). Существуют множественные специфичности преципитирующих аутоантител у пациентов с миозитом, но индивидуальную специфичность каждого антитела наблюдают только у части пациентов.

Были идентифицированы многие аутоантитела, ассоциированные с миозитом или миозитом-перекрестным синдромом, и в некоторых случаях были идентифицированы антитела (см. патент США № 6610823, Antigens associated with polymyositis and with dermatomyositis). Они включают антитела, которые присутствуют при других нарушениях, а также специфичные для заболевания антитела, как описано Targoff and Reichlin, Mt. Sinai J. of Med., 55:487-493, 1988.

Например, идентифицировали группу ассоциированных с миозитом аутоантител, которые направлены на цитоплазматические белки, которые связаны с тРНК и синтезом белка, в частности аминоацил-тРНК-синтетазы. Они включают антитело к Jo-1, которое направлено против гистидил-тРНК-синтетазы и представляет собой наиболее распространенное аутоантитело, ассоциированное с аутоиммунными нарушениями типа миозит (приблизительно от 20 до 40% таких пациентов согласно Nishikai and Reichlin, Arthritis Rheum., 23:881-888, 1980), антитело к PL-7, которое направлено против треонил-тРНК синтетазы, антитело к PL-12, которое направлено против аланил-тРНК-синтетазы, антитело к OJ, которое направлено против изолейцил-тРНК-синтетазы, антитело к EJ, которое направлено против глицил-тРНК-синтетазы, антитело к KS, которое направлено против аспарагил-тРНК-синтетазы (см. в общем и в частности Targoff, Curr. Opin. Rheumatol., 12 475-481, 2000) и против фенилаланин-тРНК-синтетазы (Betteridge et al., Rheumat., 46 1005-1008, 2007). Характерная группа признаков, как правило, ассоциирована с антителами против синтетаз (Love et al., Medicine., 70:360-374, 1991).

Антитело к U1 RNP, которое часто выявляют у пациентов с SLE, также можно выявлять при смешанном заболевании соединительной ткани, перекрестных синдромах, включая миозит, или в некоторых случаях только при миозите. Это антитело взаимодействует с белками, которые содержаться исключительно в малом ядерном рибонуклеопротеине U1, одном из ядерных RNP, который участвует в сплайсинге мРНК. У пациентов с перекрестным синдромом в некоторых случаях выявляют аутоантитела, которые ассоциированы с другими состояниями, такие как антитело к Sm, антитело к Ro/SSA и антитело к La/SSB. Антитело к Ku выявляли при перекрестном синдроме миозит-склеродермия и при SLE. Антиген Ku представляет собой комплекс ДНК-связывающего белка с двумя полипептидными компонентами, каждый из которых был клонирован. Антитело к Jo-1 и другие антитела к синтетазам являются специфичными для заболевания. Другие ассоциированные с миозитом антитела представляют собой антитело к PM-Scl, которое присутствует приблизительно у 5-10% пациентов с миозитом, многие из которых страдают перекрестным синдромом полимиозит-склеродермия, и антитело к Mi-2, которое присутствует приблизительно у 8% пациентов с миозитом, практически исключительно при дерматомиозите. Антитело к Mi-2 с высоким титром выявляли приблизительно у 20% всех пациентов с дерматомиозитом и с низким титром, только посредством ELISA, менее чем у 5% пациентов с полимиозитом (Targoff and Reichlin, Mt. Sinai J. of Med., 55:487-493, 1988).

Как правило, пациенты с воспалительным заболеванием мышц (IMD) и интерстициальной легочной болезнью (ILD), когда они относительно молоды и в остальном здоровы, к сожалению, входят в подгруппу пациентов, где прогрессирование заболевания может приводить к значительной инвалидизации и высокой смертности. Кроме того, в настоящее время не существует лекарственных средств конкретно одобренных для лечения общей популяции IMD и ILD. Существующий в настоящее время стандарт лечения сводится к введению неспецифических противовоспалительных и иммуномодулирующих лекарственных средств, таких как метотрексат или азатиоприн, и если симптомы не уменьшаются, циклоспорин (Wallace et al., J. Musculoskelat Med., 27:470-479, 2010). Эти лекарственные средства несут существенный риск побочных эффектов, которые при продолжительном введении могут быть тяжелыми. При тяжелом прогрессирующем заболевании индивидуумов можно лечить внутривенным введением иммунного глобулина (IVIG). Нагрузка и затраты на лечение пациентов с IVIG являются значительными (не менее 10000 долларов на одного пациента за месяц лечения), и для значительной части пациентов лечение является безрезультатным, и они погибают.

Таким образом, сохраняется значительная нереализованная потребность в улучшенных способах лечения воспалительного заболевания мышц и родственных патологических состояний, которые являются терапевтически и экономически эффективными.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлены потенциальные противовоспалительные свойства иллюстративных получаемых из HRS полипептидов на индуцированной TNBS модели колита. Исследования проводили на самцах мышей BDF-1 с 12 мышами/группе; TNBS и будезонид добавляли при 5 мг/кг в воду. Резокин (HisRS^N4, HRS(1-60)) вводили ежесуточно посредством в/в инъекции, начиная с 3 суток до обработки TNBS, в концентрации 1 или 5 мг/кг.

На фигуре 2 представлен анализ SDS-PAGE полноразмерной HRS и HRS(1-506) в невосстановительных и восстановительных условиях. На гелях продемонстрировано, что полноразмерная HRS представляет собой ~50:50 смесь нековалентно связанного и SS-связанного димера в нормальных и восстановительных условиях, и что для HRS(1-506) выявляют значительно сниженное образование SS-связанного димера, повышенную однородность и монодисперсность относительно полноразмерного белка.

На фигуре 3 представлена конкуренция содержащей антитело к Jo-1 сыворотки с полноразмерной HRS посредством анализа ELISA, в котором полноразмерная HisRS дикого типа является связанной с поверхностью 96-луночного планшета. На фигуре представлены данные трех разведений сыворотки, получаемой из образца сыворотки человека.

На фигуре 4 представлена конкуренция содержащей антитело к Jo-1 сыворотки с резокином (HisRS^N4, HRS(1-60)) по сравнению с полноразмерной HisRS человека (FL-hu HisRS) посредством анализа ELISA, в котором полноразмерная HisRS дикого типа связана с поверхностью 96-луночного планшета. Данные демонстрируют, что резокин существенно не конкурирует за связывание антитела с полноразмерной HisRS до тех пор, пока содержится в концентрациях более приблизительно 1×10^-7 M, когда полноразмерная гистидил-тРНК-синтетаза связана с поверхностью планшета.

На фигуре 5 представлена конкуренция содержащей антитело к Jo-1 сыворотки с HisRS^N8 (HRS(1-506)) по сравнению с полноразмерной HisRS человека посредством анализа ELISA, в котором полноразмерная HisRS человека дикого типа связана с поверхностью 96-луночного планшета. Данные демонстрируют, что HisRS^N8 и полноразмерная HisRS обладают фактически идентичными кривыми конкурентного связывания с антителами к Jo-1.

На фигуре 6 представлен стандартный титровальный ELISA антител к Jo-1 с использованием по существу полноразмерной HARS или HisRS^N4 (HRS(1-60)), связанной с поверхностью планшета. Данные демонстрируют, что, когда анализ проводят в этих условиях соответствующие титры антител к HisRS^N4 в содержащей антитело к Jo-1 сыворотке являются сравнимыми с полноразмерной HisRS.

На фигуре 7 представлено схематическое представление варианта сплайсинга HRS и других конструкций HRS, используемых в исследованиях картирования эпитопов.

На фигуре 8 представлены результаты исследований картирования эпитопов и представлена селективность антитела диапазона положительных образцов по антителам к Jo-1 по отношению связыванию с доменом WHEP (HisRS^N4, SV9 или HRS(1-60)), или конструкция HisRS с делецией (содержащая аминокислоты 54-506 SEQ ID NO: 1) (dWHEP), которая не содержит домен WHEP.

На фигуре 9 представлены результаты исследований иммунной элиминации с использованием полноразмерной HRS и HRS(1-506). Результаты демонстрируют, что полноразмерная HARS и HRS(1-506) являлись эффективными для иммунной элиминации антител к Jo-1 из образцов сыворотки человека и что HRS(1-506) была способна удалять до 99% детектируемых антител к Jo-1.

На фигуре 10A представлена схема принципа дозирования, используемого для оценки эффектов HRS(1-506) (или ATYR1940) на модели индуцируемого статином миозита на крысах.

На фигуре 10B представлены эффекты HRS(1-506) на снижение уровней тропонина в мышцах на модели индуцируемого статином миозита на крысах.

На фигурах 11A-11B представлены эффекты HRS(1-506) на уровнях CK на модели индуцируемого статином миозита на крысах.

На фигуре 12 продемонстрировано, что эндогенные уровни HRS в сыворотке повышались у крыс, обрабатываемых статином, относительно крыс, не получавших обработку. Этот результат позволяет предположить, что выделение эндогенной HRS может играть определенную роль в регуляции воспаления мышц.

На фигуре 13 представлено окрашивание H&E мышц задней поверхности бедра на модели индуцируемого статином миозита на крысах. Эти результаты демонстрируют сниженные баллы мышечной дегенерации/некроза и воспаления у крыс, индуцированных статином, которых обрабатывали 1 мг/кг и 3 мг/кг HRS(1-506), относительно крыс, обрабатываемых носителем и 0,3 мг/кг HRS(1-506).

На фигуре 14 представлены результаты РНК-профилирования, проводимые на мышцах задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс, которых обрабатывали увеличивающимися количествами HRS(1-506). Эти результаты демонстрировали, что все 13 генов, которые повышались более чем в 5 раз в ответ на обработку статином, снижались в результате обработки HRS(1-506).

На фигуре 15A представлены результаты РНК-профилирования, проводимые на мышцах задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс, и на фигуре 15B представлены результаты для индуцированных статином крыс, обрабатываемых HRS(1-506).

На фигуре 16 представлено транскрипционное профилирование мышц задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс. Эти результаты демонстрировали, что на экспрессию 10 генов, связанных с диабетом/метаболическим синдром, и нескольких генов домашнего хозяйства (данные не показаны) обработка HRS(1-506) не оказывала значительного влияния.

На фигуре 17 представлено транскрипционное профилирование мышц задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс. Эти результаты демонстрировали, что экспрессия многих маркерных генов иммунных клеток снижалась в результате обработки HRS(1-506).

На фигурах 18A-18D продемонстрировано, что обработка HRS(1-506) снижает экспрессию маркерных генов иммунных клеток ITGAL(CD11a) (фигура 18A), CD11b (фигура 18B), CD8a (фигура 18C), CD8b (фигура 18D).

На фигурах 19A-19C продемонстрировано, что обработка HRS(1-506) снижает экспрессию маркерных генов иммунных клеток CD18 (фигура 19A), CCR5 (фигура 19B) и PTPPC (CD45R) (фигура 19C).

На фигуре 20 представлено транскрипционное профилирование мышц задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс. Эти результаты демонстрировали, что экспрессия многих маркерных генов воспаления снижалась в результате обработки HRS(1-506).

На фигурах 21A-21D продемонстрировано, что обработка HRS(1-506) приводила к снижению экспрессии маркерных генов воспаления IL-6 (фигура 21A), MCP1 (фигура 21B), IL-10 (фигура 21C) и IFN-гамма (фигура 21D).

На фигурах 22-23 представлено транскрипционное профилирование мышц задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс. Эти результаты демонстрировали, что экспрессия различных генов, связанных с адгезией, развитием и фиброзом, изменялась в результате обработки HRS(1-506).

На фигурах 24-25 представлено транскрипционное профилирование мышц задней поверхности бедра у индуцированных статином крыс. Эти результаты демонстрировали, что экспрессия различных генов, ассоциированных с мышечной слабостью, атрофией мышц и миогенезом, изменялась в результате обработки HRS(1-506). На фигуре 24B представлены результаты для MMP3, и на фигуре 24C представлены результаты для MMP9.

На фигурах 26A-26B представлены эффекты HRS(1-506) на модели мышечной дистрофии Дюшена (DMD) на мышах mdx. Снижение CK (фигура 26A), AST (фигура 26B) и LDH (фигура 26C) в сыворотке наблюдали у мышей, обрабатываемых HRS(1-506) или дексаметазоном, относительно контролей носителем.

На фигурах 27A-27B представлены эффекты иммунизации полноразмерной HRS мыши (mHRS) у мышей SJL/J. Эти мыши имеют делецию внутри рамки считывания 171 п.н. в 3'-точке сплайсинга экзона 45 дисферлина, и у них развивается спонтанная миопатия, которая ассоциирована с воспалением мышц. Мыши представляют собой генетическую модель миопатий человека вследствие дефицита дисферлина, таких как тазово-плечевая мышечная дистрофия типа 2B (LGMD2B). На фигуре 27A продемонстрировано, что у мышей SJL/J, иммунизированных подкожно mHisRS, развивалось устойчивое образование антител в ответ на полноразмерную HisRS. Как представлено на фигуре 27B, в мышечной ткани от иммунизированных HisRS мышей выявляли области клеточной инфильтрации и миозит, и в соответствии с этими данными гистопатологии, две иммунизированные мыши проявляли признаки миозита.

На фигурах 28A-28B представлен анализ дифференциальной сканирующей флуорометрии (DSF) полноразмерных HRS и HRS(1-506). На фигуре 28A продемонстрировано, что существовало два тепловых перехода для полноразмерной HRS после инкубации при pH 7-7,5, первый переход происходил при 48°C, на что указывает стрелка, и основной переход происходил при ~54°C . На фигуре 28B представлена термостабильность или температура плавления HRS(1-506) в диапазоне концентраций гистидинового буфера. Результаты демонстрируют, что гистидиновый буфер может в значительной степени стабилизировать конформацию полипептидов HRS, таких как HRS(1-506).

Краткое описание сущности изобретения

Варианты осуществления настоящего изобретения частично основаны на неожиданном открытии, что специфическое блокирование активности, связывания или продукции иным образом патогенных антител к Jo-1 (также называемых антитела против Jo-1), например, с использованием полипептидов HRS или других специфических к антителу блокирующих средств, может быть пригодной для лечения индивидуумов с воспалительными или аутоиммунными заболеваниями, и может предотвращать или значительно замедлять прогрессирование заболевания. Одно из преимуществ этого открытия заключается в том, что можно устранять отрицательное влияние антител к Jo-1 с небольшим ослаблением или без него иммунной системы индивидуума, что приводит к значительному улучшению профилей побочных эффектов. Кроме того, подход можно широко применять к другим заболеваниям, включая воспалительные заболевания и родственные нарушения, при наличии локальной или временной недостаточности гистидил-тРНК-синтетазы.

Таким образом, определенные варианты осуществления относятся к терапевтическим композициям, содержащим полипептид гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) длиной приблизительно 20-90 аминокислот, который является по меньшей мере на 90% идентичным SEQ ID NO: 1, где композиция/полипептид HRS является: a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистой(ым); b) менее чем приблизительно на 5% агрегированной(ым) и c) по существу не содержит эндотоксинов. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере 20 аминокислот полипептида HRS взяты из области, определяемой остатками 1-67 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 40 аминокислот полипептида HRS взяты из области, определяемой остатками 1-67 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 60 аминокислот полипептида HRS взяты из области, определяемой остатками 1-67 SEQ ID NO: 1.

Также раскрыты терапевтические композиции, содержащие полипептид гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) длиной по меньшей мере приблизительно 400 аминокислот, который содержит 80 или более смежных аминокислот, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными SEQ ID NO: 1, где композиция/полипептид HRS является: a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистой(ым); b) менее чем приблизительно на 5% агрегированной(ым) и c) по существу не содержит эндотоксины. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS содержит 200 или более аминокислот, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит 400 или более аминокислот, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления длина полипептида HRS составляет по меньшей мере приблизительно 500 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит последовательность полноразмерной HRS человека (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS является усеченным по остатку 505 (HRS(1-505)) или 506 (HRS(1-506)) SEQ ID NO: 1.

Определенные варианты осуществления относятся к терапевтическим композициям, содержащим полипептид гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) длиной по меньшей мере приблизительно 400 аминокислот, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными SEQ ID NO: 1, где композиция/полипептид HRS является: a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистой(ым); b) менее чем приблизительно на 5% агрегированной(ым) и c) по существу не содержит эндотоксинов. В некоторых вариантах осуществления длина полипептида HRS составляет по меньшей мере приблизительно 500 аминокислот, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS содержит последовательность SEQ ID NO: 1 (полноразмерная HRS человека). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS является усеченным по остатку 505 (HRS(1-505)) или 506 (HRS(1-506)) SEQ ID NO: 1.

Также раскрыты терапевтические композиции, содержащие полипептид гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) длиной 500-506 аминокислот, который является по меньшей мере на 90% идентичным SEQ ID NO: 70 (HRS(1-506)) и не содержит остатки 507-509 SEQ ID NO: 1, где композиция/полипептид HRS является: a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистой(ым), b) менее чем приблизительно на 5% агрегированной(ым) и c) по существу не содержит эндотоксинов. В определенных вариантах осуществления длина полипептида HRS составляет 505-506 аминокислот, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления длина полипептида HRS составляет 506 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS состоит по существу из SEQ ID NO: 70. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS состоит из SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления длина полипептид HRS составляет 505 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит остатки 2-506 SEQ ID NO: 70 (HRS(2-506)). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS состоит по существу из остатков 2-506 SEQ ID NO: 70 (HRS(2-506)). В конкретных вариантах осуществления полипептид HRS состоит из остатков 2-506 SEQ ID NO: 70 (HRS(2-506)).

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит мутацию по меньшей мере одного остатка цистеина. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один остаток цистеина выбран из Cys174, Cys191, Cys224, Cys235 и Cys455.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS (например, не содержащий остатки 507-509 SEQ ID NO: 1) обладает повышенной биологической активностью, стабильностью и/или однородностью относительно полипептида SEQ ID NO: 1 (полноразмерной HRS человека) в сравнимых условиях, в диапазоне приблизительно 4-40°C и при pH приблизительно 6,0-8,0. В некоторых вариантах осуществления условия включают температуру приблизительно 20-25°C (комнатную температуру) и pH приблизительно 7,0-7,5 необязательно в течение периода приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. В определенных вариантах осуществления условия включают температуру приблизительно 37°C и pH приблизительно 7,0-7,5 необязательно в течение периода приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток.

В некоторых вариантах осуществления повышенная активность включает абсолютное повышение неканонической биологической активности по меньшей мере приблизительно на 10%. В некоторых вариантах осуществления неканоническая активность представляет собой противовоспалительную активность или специфическое связывание с антителом к Jo-1. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS характеризуется сниженным образованием межцепочечных дисульфидных связей в восстановительных условиях относительно полипептида SEQ ID NO: 1 (полноразмерной HRS). В определенных вариантах осуществления полипептид HRS обладает сниженной (зарядом) гетерогенностью относительно полипептида SEQ ID NO: 1 (полноразмерной HRS). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS характеризуется сниженным образованием высокомолекулярных агрегатов в растворе относительно полипептида SEQ ID NO: 1 (полноразмерной HRS). В определенных вариантах осуществления повышенная однородность включает по меньшей мере 10% увеличение монодисперсности полипептида HRS относительно полипептида SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS характеризуется повышенным выходом продукта растворимого белка при рекомбинантном получении в E. Coli относительно полипептида SEQ ID NO: 1 (полноразмерной HRS).

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS сливают с гетерологичным партнером по слиянию, необязательно T-клеточным лигандом. В конкретных вариантах осуществления полипептид HRS содержит по меньшей мере одну D-аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит буфер в концентрации в диапазоне приблизительно от 0,03 мМ приблизительно до 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит буфер в концентрации в диапазоне приблизительно от 2 мМ приблизительно до 50 мМ. В определенных вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит буфер в концентрации в диапазоне приблизительно от 40 мМ приблизительно до 60 мМ. В определенных вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит буфер в концентрации в диапазоне приблизительно от 45 мМ приблизительно до 55 мМ. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит буфер в концентрации приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер, цитратный буфер или фосфатный буфер.

В определенных вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер, и где полипептид HRS обладает повышенной стабильностью относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции без указанного гистидинового буфера в сравнимых условиях в диапазоне приблизительно от 4-40°C и при pH приблизительно 7,0-7,5.

В определенных вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер, и где полипептид HRS обладает повышенной стабильностью относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции без указанного цитратного буфера в сравнимых условиях в диапазоне приблизительно от 4-40°C и при pH приблизительно 6,5-7,5.

В определенных вариантах осуществления буфер представляет собой фосфатный буфер, и где полипептид HRS обладает повышенной стабильностью относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции без указанного фосфатного буфера в сравнимых условиях в диапазоне приблизительно от 4-40°C и при pH приблизительно 7,0-7,5.

В некоторых вариантах осуществления условиях (например, для сравнения) включают температуру приблизительно 5°C необязательно в течение периода приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. В некоторых вариантах осуществления условия включают температуру приблизительно 20-25°C (комнатную температуру) необязательно в течение периода приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток. В определенных вариантах осуществления условия включают температуру приблизительно 37°C необязательно в течение периода приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток.

В некоторых вариантах осуществления повышенная стабильность включает термостабильность, где температура плавления (T_m) полипептида HRS является по меньшей мере приблизительно на 5°C выше, чем температура плавления соответствующего полипептида HRS в композиции без указанного буфера и/или вне указанного диапазона pH. В некоторых вариантах осуществления повышенная стабильность включает термостабильность, где температура плавления полипептида HRS изменяется со скоростью, которая является по меньшей мере на 10% ниже, чем скорость соответствующего полипептида HRS в композиции без указанного буфера и/или вне указанного диапазона pH.

В определенных вариантах осуществления композиция характеризуется пониженной агрегаций и/или осаждением относительно композиции без указанного буфера и/или вне указанного диапазона pH, в сравнимых иным образом условиях. В некоторых вариантах осуществления агрегация снижается по меньшей мере приблизительно на 10%, как измеряют по оптической плотности при A340. В определенных вариантах осуществления композиция содержит сниженное количество высокомолекулярных агрегатов относительно композиции без указанного буфера и/или вне указанного диапазона pH, в сравнимых иным образом условиях.

В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер, и полипептид HRS является по меньшей мере на 90% идентичным остаткам 1-506 или 2-506 SEQ ID NO: 1 и не содержит остатки 507-509 SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер, и полипептид HRS является по меньшей мере на 90% идентичным остаткам 1-506 или 2-506 SEQ ID NO: 1 и не содержит остатки 507-509 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS представляет собой HRS(1-506) или HRS(2-506).

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит хлорид натрия (NaCl) в концентрация в диапазоне приблизительно от 100-300 мМ, необязательно приблизительно 140 мМ-240 мМ или необязательно приблизительно 140 мМ. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS является по меньшей мер на 90% идентичным остаткам 1-506 или 2-506 SEQ ID NO: 1 и не содержит остатки 507-509 SEQ ID NO: 1, необязательно где температура плавления (T_m) полипептида HRS составляет по меньшей мере приблизительно 60°C. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS представляет собой HRS(1-506) или HRS(2-506), необязательно где температура плавления (T_m) полипептида HRS составляет по меньшей мере приблизительно 60°C.

В определенных вариантах осуществления композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. В некоторых вариантах осуществления один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, выбранных из сахарозы, маннита, трегалозы, сорбита, аргинина, глицина и глицерина. В некоторых вариантах осуществления один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов содержатся в концентрации в диапазоне приблизительно 0,2-5,0%. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой приблизительно 1-3% сахарозу, необязательно приблизительно 2% сахарозу. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой приблизительно 1-3% трегалозу, необязательно приблизительно 2% трегалозу.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит одно или более поверхностно-активных веществ. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат или полоксамер. В некоторых вариантах осуществления полисорбат представляет собой полисорбат 20 (PS20), полисорбат 40 (PS40), полисорбат 60 (PS60) или полисорбат 80 (PS80). В определенных вариантах осуществления полисорбат представляет собой PS20. В определенных вариантах осуществления полоксамер представляет собой плюроник F68. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество содержится в диапазоне приблизительно 0,1-5,0% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления PS20 составляет приблизительно 0,05% (масс./об.).

В определенных вариантах осуществления композиция содержит одно или более антиоксидантных соединений или восстановителей. В некоторых вариантах осуществления антиоксидантное соединение или восстановитель выбран из цистеина, метионина и N-ацетилцистеина (NAC). В некоторых вариантах осуществления антиоксидантное соединение или восстановитель содержится в диапазоне концентраций приблизительно 0,1-5,0 мМ.

В определенных вариантах осуществления композиция содержит одно или более хелатирующих средств. В некоторых вариантах осуществления хелатирующее средство представляет собой этилендиаминтетраацетат (EDTA). В некоторых вариантах осуществления хелатирующее средство содержится в диапазоне концентраций приблизительно 0,1-2,0 мМ.

В определенной композиции полипептид HRS содержится в концентрации по меньшей мере приблизительно 10 мг/мл. В некоторой композиции полипептид HRS содержится в концентрации по меньшей мере приблизительно 25 мг/мл. В некоторых композициях полипептид HRS содержится в концентрации по меньшей мере приблизительно 50 мг/мл.

В определенных вариантах осуществления мутность композиции составляет менее приблизительно 0,5, как измеряют по оптической плотности при A340. В некоторых вариантах осуществления оптическую плотность при A340 измеряют после по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток инкубации при 37°C. В некоторых вариантах осуществления оптическую плотность при A340 измеряют после по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток инкубации при комнатной температуре. В определенных вариантах осуществления оптическую плотность при A340 измеряют после замораживания-оттаивания композиции по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 раз.

В некоторых вариантах осуществления опалесценция композиции составляет менее приблизительно 0,6, как измеряют по оптической плотности при A580. В некоторых вариантах осуществления оптическую плотность при A580 измеряют после по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток инкубации при 37°C. В некоторых вариантах осуществления оптическую плотность при A580 измеряют после по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток инкубации при комнатной температуре. В определенных вариантах осуществления оптическую плотность при A580 измеряют после замораживания-оттаивания композиции по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 раз.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит менее приблизительно 3% высокомолекулярных агрегатов. В некоторых вариантах осуществления агрегацию высокомолекулярных соединений (HM_W) измеряют после по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток инкубации при 37°C. В определенных вариантах осуществления агрегацию высокомолекулярных соединений (HM_W) измеряют после по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток инкубации при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления агрегацию высокомолекулярных соединений измеряют после замораживания-оттаивания композиции по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 раз.

В определенных вариантах осуществления температура плавления (T_m) полипептида HRS в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 50°C. В некоторых вариантах осуществления температура плавления (T_m) полипептида HRS в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 55°C. В некоторых вариантах осуществления температура плавления (T_m) полипептида HRS в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 60°C.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS является по меньшей мере приблизительно на 90% или на 95% монодисперсным.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 50 мМ L-гистидина, приблизительно 140 мМ NaCl, приблизительно 2% трегалозы, приблизительно 0,05% полисорбатв 20 (PS20) и имеет pH приблизительно 7,0-7,4. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 50 мМ L-гистидина, приблизительно 140 мМ NaCl, приблизительно 2% сахарозы, приблизительно 0,05% полисорбата 20 (PS20) и имеет pH приблизительно 7,0-7,4. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS представляет собой HRS(1-506) или HRS(2-506) и имеет температуру плавления (T_m) в композиции по меньшей мере приблизительно 60°C. В определенных вариантах осуществления мутность композиции составляет менее приблизительно 0,1 или менее приблизительно 0,05, как измеряют по оптической плотности при A340. В некоторых вариантах осуществления опалесценция композиции составляет менее приблизительно 0,1 или менее приблизительно 0,05, как измеряют по оптической плотности при A580. В определенных вариантах осуществления композиция содержит менее приблизительно 2% или менее приблизительно 1% высокомолекулярных агрегатов.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пригодной для медицинских целей композиции, содержащей полипептид приблизительно от 20 и 90 аминокислот по меньшей мере с 90% идентичностью с HRS человека (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 20-40 аминокислот входят в аминокислоты 1-67 HRS человека (SEQ ID NO: 1). В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота представляет собой D-аминокислоту. В некоторых аспектах полипептид является: a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистым, b) менее чем приблизительно на 5% агрегированным и C) по существу не содержит эндотоксинов.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к пригодной для медицинских целей композиции, содержащей полипептид по меньшей мере приблизительно из 400 аминокислот полипептида HRS, где полипептид является: a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистым, b) менее чем приблизительно на 5% агрегированным и C) по существу не содержит эндотоксинов.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к пригодной для медицинских целей композиции, содержащей полипептид по меньшей мере приблизительно из 400 аминокислот, где полипептид является: a) по меньшей мере на 80% идентичным HRS человека (SEQ ID NO: 1), b) по меньшей мере приблизительно на 95% чистым, C) менее чем приблизительно на 5% агрегированным и d) по существу не содержит эндотоксинов.

В некоторых аспектах любой из этих пригодных для медицинских целей или терапевтических композиций полипептид содержит полноразмерный полипептид HRS. В некоторых аспектах полипептид HRS является усеченным приблизительно по остатку 505 или 506. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке цистеина. В некоторых аспектах остаток цистеина выбран из Cys174, Cys191, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 и Cys509. В некоторых аспектах полипептид содержит по меньшей мере одну D-аминокислоту. В некоторых аспектах полипептид содержит домен WHEP. В некоторых аспектах полипептид содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182, или аминокислотную последовательность, перечисленную или получаемую из любой из таблиц 1-9. В некоторых аспектах полипептид является слитым с гетерологичным белком. В некоторых аспектах гетерологичный белок содержит T-клеточный лиганд. В некоторых аспектах композицию формулируют для доставки посредством перорального, интраназального, легочного или парентерального введения.

В некоторых аспектах пригодная для медицинских целей или терапевтическая композиция предназначена для применения при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунных заболевания, воспалительных заболеваний, воспалительных миопатий, включая (идиопатические) воспалительные миопатии, полимиозита, дерматомиозита и родственных нарушений, перекрестного синдрома полимиозит-склеродермия, миозита с тельцами включения (IBM), синдрома анти-синтетазы, интерстициальной легочной болезни, артрита, синдрома Рейно, синдрома Перро и синдрома Ушера. В некоторых аспектах эпитоп представляет собой иммунодоминантный эпитоп, распознаваемый антителами в сыворотке у индивидуума. В некоторых аспектах полипептид HRS связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II человека молекула. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями, и где экспрессия нуклеиновой кислоты вызывает толеризацию. В некоторых аспектах терапевтическая композиция содержит систему доставки, выбранную из группы, состоящей из липосом, мицелл, эмульсий и клеток.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для применения при лечении заболеваний, ассоциированных с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы, содержащей по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS способен замещать по меньшей мере одну каноническую или неканоническую функцию гистидил-тРНК-синтетазы. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS существенно не конкурирует за связывание ассоциированного с заболеванием аутоантитела с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентном ELISA до концентрации приблизительно 5×10^-7M.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для применения при лечении заболеваний, ассоциированных с аутоантителом, специфическим к гистидил-тРНК-синтетазе, содержащей по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где полипептид HRS способен вызывать толеризацию.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для применения при лечении заболеваний, ассоциированных с аутоантителом, специфическим к гистидил-тРНК-синтетазе, где композиция содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид HRS млекопитающего, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями, и где экспрессии нуклеиновой кислоты вызывает толеризацию.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для применения при лечении заболеваний, ассоциированных с аутоантителом, специфическим к гистидил-тРНК-синтетазе, где композиция содержит рекомбинантную клетку-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, содержащий по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями для обеспечения экспрессии HRS в клетке-хозяине.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической композиции для применения при лечении заболеваний, ассоциированных с аутоантителом, специфическим к гистидил-тРНК-синтетазе, где композиция содержит антитело или связывающий белок, специфический к аутоантителу, где антитело или связывающий белок блокируют связывание аутоантитела с нативной гистидил-тРНК-синтетазой.

Некоторые варианты осуществления относятся к терапевтическим композициям для применения при лечении воспалительного заболевания, содержащим по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS обладает по меньшей мере одним видом неканонической активности.

Также раскрыты терапевтические композиции для применения при лечении мышечной дистрофии, содержащие по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS обладает по меньшей мере одним видом неканонической активности. В некоторых аспектах мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Дюшена, мышечной дистрофии Беккера, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, тазово-плечевой мышечной дистрофии, плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофии, миотонической дистрофии, окулофарингеальной мышечной дистрофии, дистальной мышечной дистрофии и наследственной мышечной дистрофии.

Определенные варианты осуществления включают терапевтические композиции для применения при лечении рабдомиолиза, мышечной атрофии, кахексии, воспаления мышц или повреждения мышц, содержащие по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS обладает по меньшей мере одним видом неканонической активности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию полипептида HRS для получения лекарственного средства для лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию полипептида HRS для получения лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы.

В некоторых аспектах любой из таких терапевтических композиций или применений полипептид HRS индуцирует толерантность. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 10 приблизительно до 60 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 60 приблизительно до 120 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 120 приблизительно до 200 аминокислот. В некоторых аспектах полипептид HRS является полноразмерным. В некоторых аспектах полипептид HRS является усеченным приблизительно по остатку 505 или 506. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке цистеина. В некоторых аспектах остаток цистеина выбран из Cys174, Cys191, C224, Cys235, Cys455, Cys507 и Cys509. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну D-аминокислоту. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит домен WHEP. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182, или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, 90% или 95% идентичную любой из последовательностей в таблицах D1, D3-D6 или D8. В некоторых аспектах полипептид HRS является слитым с гетерологичным белком. В некоторых аспектах гетерологичный белок содержит T-клеточный лиганд. В некоторых аспектах композицию формулируют для доставки посредством перорального, интраназального, легочного или парентерального введения. В некоторых аспектах терапевтическая композиция содержит систему доставки, выбранную из группы, состоящей из липосом, мицелл, эмульсий и клеток.

Также раскрыты способы лечения заболевания, ассоциированного с аутоантителом, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, или d) антитела или связывающего белка, специфического к аутоантителу.

В некоторых аспектах терапевтическую композицию вводят индивидууму до появления симптомов заболевания. В некоторых аспектах аутоантитело является специфическим для гистидил-тРНК-синтетазы. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп гистидил-тРНК-синтетазы, распознаваемый специфическим для заболевания аутоантителом. В некоторых аспектах полипептид HRS блокирует связывание аутоантитела с нативной гистидил-тРНК-синтетазой. В некоторых аспектах полипептид HRS вызывает клональную делецию аутореактивных T-клеток. В некоторых аспектах полипептид HRS вызывает функциональную инактивацию T-клеток, участвующих в аутоиммунном ответе. В некоторых аспектах полипептид HRS приводит к уменьшению воспаления мышц или легких. В некоторых аспектах полипептид HRS индуцирует толерантность. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 10 приблизительно до 60 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 60 приблизительно до 120 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 120 приблизительно до 200 аминокислот. В некоторых аспектах полипептид HRS является полноразмерным. В некоторых аспектах полипептид HRS является усеченным приблизительно по остатку 505 или 506. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке цистеина. В некоторых аспектах остаток цистеина выбран из Cys174, Cys191, Cys224, Cys235, C455, Cys507 и Cys509. В некоторых аспектах остатки 507, 508 и 509, соответствующие полноразмерной HRS (SEQ ID NO: 1) удалены. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну D-аминокислоту. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит домен WHEP. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182, или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, 90% или 95% идентичную любой из последовательностей в таблицах D1, D3-D6 или D8. В некоторых аспектах полипептид HRS является слитым с гетерологичным белком. В некоторых аспектах гетерологичный белок содержит T-клеточный лиганд. В некоторых аспектах композицию формулируют для доставки посредством перорального, интраназального, легочного или парентерального введения.

В некоторых аспектах заболевание выбрано из группы, состоящей из воспалительных миопатий, включая воспалительные миопатии, полимиозит, дерматомиозит и родственные нарушения, перекрестный синдром полимиозит-склеродермия, миозит с тельцами включения (IBM), синдром анти-синтетазы, интерстициальнаую легочную болезнь, артрит и синдром Рейно наряду с другими заболеваниями или состояниями, описываемыми в настоящем описании. В некоторых аспектах эпитоп представляет собой иммунодоминантный эпитоп, распознаваемый антителами в сыворотке у индивидуума. В некоторых аспектах полипептид HRS связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II человека. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями, и где экспрессия нуклеиновой кислоты вызывает толеризацию. В некоторых аспектах терапевтическая композиция содержит систему доставки, выбранную из группы, состоящей из липосом, мицелл, эмульсий и клеток.

Также раскрыты способы уменьшения воспаления тканей, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантой клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. В некоторых аспектах ткань выбрана из мышцы, легких и кожи.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам уменьшения воспаления мышц или легких, где указанный способ включает введение индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантой нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантой клетки-хозяини, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Также раскрыты способы лечения мышечной дистрофии, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. В некоторых аспектах мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Дюшена, мышечной дистрофии Беккера, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, тазово-плечевой мышечной дистрофии, плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофии, миотонической дистрофии, окулофарингеальной мышечной дистрофии, дистальной мышечной дистрофии и наследственной мышечной дистрофии.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам лечения рабдомиолиза, мышечной атрофии, кахексии, воспаления мышц или повреждения мышц, включающим введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Определенные варианты осуществления относятся к способам индукции толерантности к аутоантигену гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS), где указанный способ включает введение индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантную клетку-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где введение композиции вызывает толеризацию к аутоантигену.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам элиминации популяции или субпопуляции T-клеток, участвующих в аутоиммунном ответе к аутоантигену гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS), где способ включает введение индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантную клетку-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где введение композиции вызывает клональную делецию аутореактивных T-клеток.

Также раскрыты способы индукции анергии T-клеток, участвующих в аутоиммунном ответе к аутоантигену гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS), где способ включает введение индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS; b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где введение композиции вызывает функциональную инактивацию T-клеток, участвующих в аутоиммунном ответе.

Некоторые варианты осуществления относятся к видам заместительной терапии для лечения заболевания, ассоциированного с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы, включающим введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, или d) антитела или связывающего белка, специфического к аутоантителу, где полипептид HRS функционально компенсирует недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы.

Также раскрыты способы лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере один полипептид HRS.

В некоторых аспектах полипептид HRS по существу не конкурирует за связывание ассоциированного с заболеванием аутоантитела с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентном ELISA до концентрации приблизительно 5×10^-7M.

В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 10 приблизительно до 60 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 60 приблизительно до 120 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 120 приблизительно до 200 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 200 приблизительно до 400 аминокислот. В некоторых аспектах длина полипептида HRS составляет приблизительно от 400 приблизительно до 500 аминокислот. В некоторых аспектах полипептид HRS является полноразмерным. В некоторых аспектах полипептид HRS является усеченным приблизительно по остатку 505 или 506. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну мутацию в остатке цистеина. В некоторых аспектах остаток цистеина выбран из Cys174, Cys191, Cys224, Cys235, C455, Cys507 и Cys509. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит по меньшей мере одну D-аминокислоту. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит домен WHEP. В некоторых аспектах полипептид HRS содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182, или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, 90% или 95% идентичную любой из последовательностей в таблицах D1, D3-D6 или D8. В некоторых аспектах полипептид HRS является слитым с гетерологичным белком. В некоторых аспектах гетерологичный белок содержит T-клеточный лиганд. В некоторых аспектах композицию формулируют для доставки посредством перорального, интраназального, легочного или парентерального введения. В некоторых аспектах заболевание выбрано из группы, состоящей из воспалительных миопатий, включая воспалительные миопатии, полимиозит, дерматомиозит и родственные нарушения, перекрестный синдром полимиозит-склеродермия, миозит с тельцами включения (IBM), синдром анти-синтетазы, интерстициальную легочную болезнь, артрит и синдром Рейно. В некоторых аспектах эпитоп представляет собой иммунодоминантный эпитоп, распознаваемый антителами в сыворотке у индивидуума. В некоторых аспектах полипептид HRS связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II человека. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями, и где экспрессия нуклеиновой кислоты вызывает толеризацию. В некоторых аспектах терапевтическая композиция содержит систему доставки, выбранную из группы, состоящей из липосом, мицелл, эмульсий и клеток.

Также раскрыты способы определения наличия или уровней полипептида HRS, или его фрагмента в образце, включающие приведение образца в контакт с один или более связывающих средств, которые специфически связываются с полипептидом HRS, и определения наличия или отсутствия связывающего средства, и таким образом, определения наличия или уровней полипептида HRS.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам определения эпитопной специфичности антител против полипептида HRS к конкретному полипептиду HRS, где способ включает приведение антитела в контакт с одним или более полипептидов HRS, и детекцию наличия или отсутствия связывающего средства, и таким образом, определения эпитопной специфичности антитела. В некоторых аспектах этого способа полипептид HRS составляет до приблизительно до 80 аминокислот длиной и содержит домен WHEP.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам лечения заболеваний, ассоциированных с аутоантителом, специфическим к гистидил-тРНК-синтетазе, где способ включает введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS по существу не конкурирует за связывание ассоциированного с заболеванием аутоантитела с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентном ELISA до концентрации приблизительно 1×10^-7M.

В другом аспекте изобретения полипептиды HRS можно использовать для составления профиля пациентов для идентификации их тяжести заболевания на основании антитела к Jo-1. Такие профили обеспечивают возможность отбора пациентов в субпопуляциях, которые получать благоприятное действие от лечения полипептидом HRS, прогнозирование вероятностного терапевтического исхода и/или идентификации полипептида(в) HRS наиболее пригодных для использования в качестве терапевтических средств.

Таким образом, определенные варианты осуществления относятся к способам идентификации являющегося человеком индивидуума, подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, включающим a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела против гистидил-тРНК-синтетазы у индивидуума и b) и идентификацию индивидуума, как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума выявляют детектируемые антитела к гистидил-тРНК-синтетазе или полипептид HRS. В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител против гистидил-тРНК-синтетазы в его сыворотке составляет более приблизительно 2 микромоль. В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител против гистидил-тРНК-синтетазы в его сыворотке составляет более приблизительно 4 микромоль.

Также раскрыты способы выбора полипептида HRS для лечения являющегося человеком индивидуума с аутоиммунным или воспалительным состоянием, включающие a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела против гистидил-тРНК-синтетазы у индивидуума и b) выбор полипептида HRS, который обладает сниженной аффинностью к антителу против гистидил-тРНК-синтетазы по сравнению с гистидил-тРНК-синтетазой дикого типа.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам прогнозирования прогрессирования заболевания являющегося человеком индивидуума, включающим a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела против гистидил-тРНК-синтетазы у индивидуума и b) идентификацию индивидуума, как подвергающегося риску развития более тяжелого заболевания, если у индивидуума выявляют детектируемые антитела к гистидил-тРНК-синтетазе или полипептид HRS.

Также раскрыты способы прогнозирования реакций индивидуума в ответ на введение полипептида HRS, включающие a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела против гистидил-тРНК-синтетазы у индивидуума и b) идентификацию индивидуума как подходящего для введения полипептида HRS, если у индивидуума не выявляют детектируемые антитела к гистидил-тРНК-синтетазе или полипептид HRS.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подходящего для введения полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в его сыворотке составляет менее приблизительно 1 микромоль.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подходящего для введения полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в его сыворотке составляет менее приблизительно 0,1 микромоль.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подходящего для введения полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в его сыворотке составляет более приблизительно 0,01 микромоль.

Также раскрыты способы экстракорпоральной иммуноадсорбции антител против гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) из внеклеточной жидкости организма, включающие (a) предоставление внеклеточной жидкости организма, которую получают у индивидуума, приведение внеклеточной жидкости организма с биосовместимой твердой подложкой, содержащей по меньшей мере один полипептид гистидил-тРНК-синтетазы, связанный с ней, таким образом, обеспечивая захват антител к HRS на твердой подложке, и (C) реинфузию внеклеточной жидкости организма из этапа (b) индивидууму. В некоторых аспектах антитела к HRS включают антитело к Jo-1.

Подробное описание изобретения

В практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если конкретно не указано иное, общепринятые способы молекулярной биологии и технологии рекомбинантной ДНК в данной области техники, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие техники полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook et al., MoleCular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd Edition, 2000); DNA Cloning: A PraCtiCal ApproaCh, vol. I & II (D. Glover, ed.), OligonuCleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984), OligonuCleotide Synthesis: Methods and AppliCations (P. Herdewijn, ed., 2004), NuCleiC ACid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985), NuCleiC ACid Hybridization: Modern AppliCations (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009), TransCription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984), Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986), Freshney R.I., (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of BasiC TeChnique, 5^th Ed. Hoboken N.J., John Wiley & Sons, B. Perbal, A PraCtiCal Guide to MoleCular Cloning (3^rd Edition 2010), Farrell R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and CharaCterization (3^rd Edition 2005). Poly(ethylene glyCol), Chemistry and BiologiCal AppliCations, ACS, Washington, 1997, Veronese, F., and J.M. Harris, Eds., Peptide and protein PEGylation, AdvanCed Drug Delivery Reviews, 54(4) 453-609 (2002), Zalipsky S. et al., "Use of funCtionalized Poly(Ethylene GlyCols) for modifiCation of polypeptides" in Polyethylene GlyCol Chemistry: BioteChniCal and BiomediCal AppliCations. Указанные выше публикации предоставлены только для их описания перед датой подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не следует интерпретировать как допущение, что изобретение не может иметь приоритет перед таким раскрытием на основании предшествующего изобретения.

Определения

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как общепринято понимают специалисты в данной области, к которой принадлежит изобретение. Несмотря на то, что в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные таким, как описываемые в настоящем описании, описаны предпочтительные способы и вещества. Для целей настоящего изобретения следующие термины определены ниже.

Формы единственного числа применяют в настоящем описании для обозначения одного или более одного (например, по меньшей мере одного) грамматического объекта. Например, "элемент" означает один элемент или более одного элемента.

Под "приблизительно" подразумевают количественную величину, уровень, значение, число, частоту, процентное содержание, величину, размер, количество, массу или длину, которая изменяется не более чем на 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от эталонной количественной величины, уровня, значения, числа, частоты, процентного содержания, величины, размера, количества, массы или длины.

Термин "анергия" относится к функциональной инактивации ответа T-клеток или B-клеток на повторную стимуляцию антигеном.

Как используют в настоящем описании, термин "аминокислота" означает как природные, так и неприродные аминокислоты, а также аналоги и миметики аминокислот. Природные аминокислоты включают 20 (L)-аминокислот, используемых при биосинтезе белка, а также другие, например, такие как 4-гидроксипролин, гидроксилизин, десмозин, изодесмозин, гомоцистеин, цитруллин и орнитин. Неприродные аминокислоты включают, например, (D)-аминокислоты, норлейцин, норвалин, пара-фторфенилаланин, этионин и т.п., которые известны специалисту в данной области. Аналоги аминокислот включают модифицированные формы природных и неприродных аминокислот. Такие модификации могут включать, например, замену или замещение химических группы и функциональных группы в аминокислоте или посредством дериватизации аминокислоты. Миметики аминокислот включают, например, органические структуры, которые проявляют функционально сходные свойства, такие как характеристика заряда и расстояние между зарядами, эталонной аминокислоты. Например, органическая структура, которая имитирует аргинин (Arg или R) содержит положительно заряженную группу, локализованную в аналогичном молекулярном пространстве и обладающую такую же степенью подвижности как e-аминогруппа боковой цепи природной аминокислоты Arg. Миметики также включают структуры с ограниченной конформационной свободой, таким образом, чтобы поддерживать оптимальные пространственные взаимодействия и взаимодействия заряда аминокислоты или функциональной группы аминокислоты. Специалистам в данной области известно, или они могут определять, какие структуры являются функциональными эквивалентами аналогов аминокислот и миметиков аминокислот.

Как используют в настоящем описании, индивидуум, "подвергающийся риску" развития заболевания или неблагоприятной реакции может страдать детектируемым заболеванием или симптомами заболевания или может не страдать им, или у него могут выявлять детектируемое заболевание или симптомы заболевания или могут не выявлять их до лечения способами, описываемыми в настоящем описании. "Подвергающийся риску" означает, что индивидуум подвергается одному или более факторам риска, которые представляют собой измеряемые параметры, коррелирующие с развитием заболевания, как описано в настоящем описании и известно в данной области. Для индивидуума, подвергающегося одному или более таким факторам риска, существует более высокая вероятность развития заболевания или неблагоприятной реакции по сравнению с индивидуумом без одного или более таких факторов риска.

"Аутоиммунное заболевание", как используют в настоящем описании, представляет собой заболевание или нарушение, обусловленное и направленное против собственных тканей индивидуума. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают, но не ограничиваются ими, воспалительные ответы, такие как воспалительные заболевания кожи, включая псориаз и дерматит (например, атопический дерматит); системную склеродермию и склероз; реакции, ассоциированные с воспалительным заболеванием кишечника (таким как болезнь Крона и язвенный колит); респираторный дистресс-синдром (включая респираторный дистресс-синдром взрослых, ARDS); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма, и другие состояния, включая инфильтрацию T-клеток и хронические воспалительные ответы; атеросклероз; нарушение адгезии лейкоцитов; ревматоидный артрит; системную красную волчанку (SLE); сахарный диабет (например, сахарный диабет I типа или сахарный инсулинзависимый диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; Синдром Шегрена; ювенильный диабет и иммунные ответы, ассоциированные с острой и замедленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и T-лимфоцитами, как правило, встречающейся при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, воспалительных миопатиях, интерстициальной легочной болезне, гранулематозе и васкулите; пернициозную анемию (болезнь Аддисона); заболевания, включающие диапедез лейкоцитов; воспалительное нарушение центральной нервной системы (ЦНС); синдром полиорганной недостаточности; гемолитическую анемию (включая, но, не ограничиваясь ими, криоглобулинемию или анемию с положительной пробой Кумбса); миастения gravis; заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело; гломерулонефрит с образованием антител к базальной мембране; антифосфолипидный синдром; аллергический неврит; болезнь Грейвса; миастенический синдром Ламберта-Итона; пузырчатку; пемфигус; аутоиммунные полиэндокринопатии; болезнь Рейтера; синдром скованного человека; болезнь Бехчета; гигантоклеточный артериит; иммунный комплексный нефрит; нефропатию IgA-типа; полинейропатии IgM-типа; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP) или аутоиммунную тромбоцитопению и т.д.

Термин "связывание" относится к прямой ассоциации между двумя молекулами, например, вследствие ковалентных, электростатических, гидрофобных и ионных взаимодействий и/или взаимодействий водородных связей, включая взаимодействия, такие как солевые мостики и водные мостики. Связывающие белки включают, например, антитела и альтернативные антитела, включая связывающие средства, как описано в настоящем описании.

Термин "клональная делеция" относится к делеции (например, потери или гибели) аутореактивных T-клеток. Клональную делецию можно получать централизовано в тимусе или на периферии или и тот и другой вариант.

На всем протяжении настоящего описания, если из контекста не следует иное, слова "содержать", "содержит" и "содержащий" следует понимать как подразумевающие включение указанного этапа или элемента, или группы этапов или элементов, но не исключение какого-либо другого этапа или элемента, или группы этапов или элементов. Под "состоящий из" подразумевают включающий и ограниченный тем, что следует после фразы "состоящий из". Таким образом, фраза "состоящий из" означает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что другие элементы не могут содержаться. Под "состоящий по существу из" подразумевают включающий любые элементы, перечисленные после фразы и ограниченными другими элементами, которые не нарушают или не способствуют активности или действию, указанному в описании для перечисленных элементов. Таким образом, фраза "состоящий по существу из" означает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что другие элементы являются необязательными и могут содержаться или не содержаться в зависимости от того, оказывают ли они существенное влияние или не оказывают на активность или действие перечисленных элементов.

Под "непрерывным процессом" подразумевают процесс, который можно определить постоянной функцией, применяемой в начальный момент времени процесса и заканчивающейся в конечной точке процесса. Таким образом, в контексте настоящего изобретения характерный пример постоянного процесса представляет собой способ, при котором определенный тип жидкости организма, как правило, кровь, удаляется при постоянном потоке (т.е. по существу непрерывном потоке) у пациента, а также вводится пациенту при аналогичном постоянным потоке. Такой способ следует понимать в отличие от любого другого "поэтапного" способа, при котором у пациента получают жидкость организма в одном независимом способе в один момент времени, необязательно хранят и приводят в контакт с адсорбентом в периодическом режиме в другой момент времени и повторно вводят пациенту еще в один другой момент времени, выбираемый совершенно независимо от двух первых способов.

Термин "не содержащая эндотоксин" или "по существу не содержит эндотоксин", как правило, относится к композициям, растворителям и/или сосудам, которые содержат не более чем следовые количества (например, количества, не вызывающие клинически неблагоприятные физиологические эффекты у индивидуума) эндотоксина и предпочтительно недетектируемые количества эндотоксина. Эндотоксины представляют собой токсины, ассоциированные с определенными микроорганизмами, такими как бактерии, как правило, грамотрицательные бактерии, хотя эндотоксины можно найти в грамположительных бактериях, таких как Listeria monoCytogenes. Наиболее распространенные эндотоксины представляют собой липополисахариды (LPS) или липоолигосахариды (LOS), встречающиеся на наружной мембране различных грамотрицательных бактерий, и которые представляют собой основное патогенное свойство в способности этих бактерий вызывать заболевание. Небольшие количества эндотоксина могут индуцировать у людей наряду с другими неблагоприятными физиологическими эффектами лихорадку, понижение артериального давления и активацию воспаления и коагуляции.

Таким образом, при фармацевтическом производстве, как правило, желательно удалять большую часть или все следовые количества эндотоксина из лекарственных продуктов и/или контейнеров для лекарственного средства, т.к. даже небольшие количества могут вызывать неблагоприятные эффекты у людей. Для этой цели, как правило, можно использовать депирогенизацию, т.к. для разрушения большинства эндотоксинов, как правило, необходимы температуры более 300°C. Например, в случае материалов первичной упаковки, такой как шприцы или флаконы, для получения 3-кратное логарифмического уменьшения уровней эндотоксинов часто достаточной является сочетание температуры стеклования 250°C и времени удержания 30 минут. Предусматривают другие способы удаления эндотоксинов, включая, например, способы хроматографии и фильтрования, как описано в настоящем описании и известно в данной области. Для снижения или даже устранения риска содержания эндотоксинов в композиции по изобретению также раскрыты способы получения полипептидов HRS и их выделения из эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих. Предпочтительными являются способы получения полипептидов HRS и их выделения из не содержащих сыворотки клеток.

Эндотоксины можно детектировать общепринятыми способами, известными в данной области. Например, анализа с использованием лизата амебоцитов мечехвоста лизат, в котором используют кровь мечехвоста, является очень чувствительным анализом детекции наличия эндотоксина. В этом тесте очень низкие уровни LPS могут вызывать детектируемую конъюгацию лизата мечехвоста вследствие мощного каскада ферментативных реакций, происходящих при такой реакции. Эндотоксины также можно количественно оценивать твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA). Для того чтобы эндотоксинов по существу не содержались, уровни эндотоксинов могут составлять менее приблизительно 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ЕЭ/мг белка. Как правило, 1 нг липополисахарида (LPS) соответствует приблизительно до 1-10 ЕЭ.

"Эпитоп" относится к участку антигена или другой макромолекулы, способной образовывать связывающее взаимодействие, которое обеспечивает взаимодействие с вариабельной областью антитела (или подобного белка), альтернативного антитела, связывающего средства или T-клеточного рецептора. В случае антител такие связывающие взаимодействия могут проявляться в виде межмолекулярного контакта одного или более аминокислотных остатков CDR. Связывающий антиген может содержать CDR3 или пару CDR3. Эпитоп может представлять собой линейную пептидную последовательность (например, "непрерывную") или может состоять из прерывистой аминокислотной последовательности (например, "конформационных" или "прерывистых" последовательностей, которые могут раздельно или совместно образовывать распознаваемую форму). Связывающий белок может распознавать одну или более аминокислотных последовательностей, таким образом, эпитоп может определять более одной отдельной аминокислотной последовательности. Эпитопы, распознаваемые связывающим белком, можно определять пептидным картированием и способами анализа последовательностей, хорошо известными специалисту в данной области. "Скрытый эпитоп" или "скрытый участок связывания" представляет собой эпитоп или участок связывания последовательности белка, для которого не происходит экспозиции или который является по существу защищенным от распознавания в немодифицированном полипептиде или белковом комплексе, или мультимере, но который может распознаваться связывающим белком к подвергнутому протеолизу полипептиду или не образующему комплекс, диссоциированному полипептиду. Аминокислотные последовательности, для которых не происходит экспозиции или существует только частичная экспозиция в немодифицированной мультимерной полипептидной структуре, представляют собой потенциальные скрытые эпитопы. Если не происходит экспозиции эпитопа или происходит только частичная экспозиция, то, вероятнее всего, он погружен во внутреннюю область полипептида или является замаскированным в полипептидном комплексе в результате связывания с другими белками или факторами. Можно идентифицировать скрытие эпитопы-кандидаты, например, посредством исследования трехмерной структуры немодифицированного полипептида.

"Контролирующие экспрессию последовательности" представляют собой регуляторные последовательности нуклеиновых кислот или соответствующих аминокислот, такие как промоторы, лидерные последовательности, энхансеры, интроны, РНК-распознающие мотивы или ДНК-связывающие белки, сигналы полиаденилирования, терминаторы, внутренние участки связывания рибосом (IRES), сигналов секреции, сигналов субклеточной организации и т.п., которые обладают возможностью влиять на транскрипцию или трансляцию, или субклеточную или клеточную локализацию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Иллюстративные контролирующие экспрессию последовательности описаны в Goeddel, Gene Expression TeChnology: Methods in Enzymology 185, ACademiC Press, San Diego, Calif. (1990).

Термин "внеклеточные жидкости организма" относится к внеклеточным жидкостям организма млекопитающего. Примеры включают кровь, асцит, плазму, лимфу, амниотическую жидкость, мочу, слюну и цереброспинальную жидкость.

Термин "гетерологичная" относится к нуклеиновой кислоте или белку, который вводят в организм (такой как растение, животное или прокариотическая клетка) или молекулу нуклеиновой кислоты (такую как хромосома, вектор или конструкция нуклеиновой кислоты), который получают из другого источника или который является из того же самого источника, но располагается в другом (т.е. ненативном) контексте.

"Гомология" относится к процентному числу аминокислот, которые являются идентичными или представляют собой консервативные замены. Гомологию можно определять с использованием программ для сравнения последовательностей, таких как GAP (Deveraux et al., 1984, NuCleiC ACids ResearCh 12, 387-395), включенных в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, последовательности аналогичной или по существу различной длины с последовательностями, цитируемыми в настоящем описании, можно сравнивать путем внесения пропусков в выравнивание, где такие пропуски определяют, например, посредством алгоритма сравнения, используемого в программе GAP.

Термин "полумаксимальная эффективная концентрация" или "EC₅₀" относится к концентрации средства (например, полипептида HRS или другого средства), как описано в настоящем описании, при которой оно индуцирует реакцию, которая находится посередине между исходной и максимальной реакцией после некоторого определенного периода времени воздействия, EC₅₀ кривой зависимости эффект-возрастающие дозы, таким образом, представляет собой концентрацию соединения, при которой наблюдают 50% его максимального эффекта. EC₅₀ также представляет собой концентрацию в плазме, необходимую для получения 50% от максимального эффекта in vivo. Аналогично, "EC₉₀" относится к концентрации средства или композиции, при которой наблюдают 90% от его максимального эффекта. "EC₉₀" можно рассчитывать из "EC₅₀" и переменного наклона или ее можно определять непосредственно из данных с использованием общепринятых сведений в данной области. В некоторых вариантах осуществления EC₅₀ блокирующего средства антитела составляет менее приблизительно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 или 500 нМ. В некоторых вариантах осуществления значение EC₅₀ биотерапевтической композиции составляет приблизительно 1 нМ или менее.

"Иммуногенная композиция" по изобретению, как используют в настоящем описании, относится к любой композиции, которая вызывает иммунный ответ у животного, такого как млекопитающее. "Иммунный ответ" представляет собой реакцию организма на чужеродные вещества, не вызывая физиологического или патологического последствия такой реакции, т.е. не обязательно обеспечивая защитный иммунитет животному. Иммунный ответ может включать один или более из следующих: (a) опосредованного клетками иммунного ответа, который включает продукцию лимфоцитов тимусом (T-клетки) в ответ на воздействие антигена, и/или (b) гуморальный иммунный ответ, который включает продукцию лимфоцитов (B-клеток) в плазме в ответ на воздействие антигена с последующей продукцией антител.

Под "выделенным" подразумевают вещество, которое по существу или в основном не содержит компонентов, которые обычно окружают его в его нативном состоянии. Например, "выделенный пептид" или "выделенный полипептид" и т.п., как используют в настоящем описании, включает выделение и/или очистку пептида или полипептидной молекулы in vitro от его природного клеточного окружения и от связи с другими компонентами клетки, например, указанная молекула в значительной степени не связана с веществами in vivo.

Термин "модулирование" включает "увеличение", "усиление" или "стимуляцию", а также "уменьшение" или "снижение", как правило, статистически значимого или физиологически значимого количества по сравнению с контролем. "Повышенное", "стимулируемое" или "увеличенное" количество, как правило, приставляет собой "статистически значимое" количество и может включать повышение, которое составляет 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные дроби между ними и выше 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т.д.) количества, продуцируемого в отсутствие композиции (например, в отсутствие любого из полипептидов HRS по изобретению) или контрольной композицией, образцом или у тестируемого индивидуума. "Уменьшенное" или "сниженное" количество, как правило, представляет собой "статистически значимое" количество и может включать 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% уменьшение количества, продуцируемого в отсутствие композиции (в отсутствие средства или соединения) или контрольной композицией, включая все целые числа между ними.

Термины "функционально связанный", "функциональным образом связанный" или "функционально соединенный", как взаимозаменяемо используют в настоящем описании, относится к расположению двух или более нуклеотидных последовательностей или элементов последовательности таким способом, который обеспечивает их функционирование надлежащим образом. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит один или более элементов ДНК, способных раскрывать хроматин и/или поддерживать хроматин в открытом состоянии, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью, кодирующей рекомбинантный белок. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать одну или более нуклеотидных последовательностей ДНК или РНК, выбранных из: (a) нуклеотидной последовательности, способной увеличивать трансляцию; (b) нуклеотидной последовательности, способной повышать секрецию рекомбинантного белка вне клетки; (C) нуклеотидной последовательности, способной повышать стабильность мРНК, и (d) нуклеотидной последовательности, способной связываться с транс-активным фактором, модулируя транскрипцию или трансляцию, где такие нуклеотидные последовательности являются функционально связанными с нуклеотидной последовательностью, кодирующей рекомбинантный белок. Как правило, но не обязательно, нуклеотидные последовательности, которые функционально связаны, являются смежными и при необходимости находятся в рамке считывания. Однако хотя функционально связанный элемент ДНК, способный раскрывать хроматин и/или поддерживать хроматин в открытом состоянии, как правило, располагается выше нуклеотидной последовательности, кодирующей рекомбинантный белок, он не обязательно является смежным с ней. Функциональное связывание различных нуклеотидных последовательностей проводят рекомбинантными способами, хорошо известными в данной области, например, способом ПЦР, лигированием в подходящих участках рестрикции или отжигом. В соответствии с общепринятой практикой можно использовать синтетические олигонуклеотидные линкеры или адапторы, если подходящие участки рестрикции не представлены.

"Неканоническая" активность, как используют в настоящем описании, как правило, относится к i) новой не относящейся к аминоацилированию биологической активности, которой обладает полипептид HRS по изобретению, которой не обладает в какой-либо существенной степени интактный нативный полноразмерный исходный белок, или ii) к активности, которой обладает интактный нативный полноразмерный исходный белок, где полипептид HRS проявляет a) значительно более высокую (например, по меньшей мере на 20% выше) специфическую активность относительно неканонической активности по сравнению с интактным нативным полноразмерным исходным белком, или b) проявляет активность в новом контексте, например, в результате выделения активности из других видов активности, которыми обладает интактный нативный полноразмерный исходный белок, или в отношении внеклеточного окружения по сравнению с классическим цитоплазматическим внутриклеточным компартментом.

"Промотор" представляет собой регуляторную область ДНК, способную связываться с РНК-полимеразой в клетке и инициировать транскрипцию расположенной ниже (3'-направление) кодирующей последовательности. Как используют в настоящем описании, промоторная последовательность связана на своем 3'-конце участком инициации транскрипции и располагается против хода транскрипции (5'-направление), включая минимальное число оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, детектируемых выше фонового уровня. Участок инициации транскрипции (подходящим способом определяемый путем картирования нуклеазой S1) может располагаться в промоторной последовательности, так же как и домены связывания белка (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы, как правило, но не всегда, могут содержать "TATA"-боксы и "CAT"-боксы. Прокариотические промоторы содержат последовательности Шайна-Дальгарно в дополнение к -10 и -35 консенсусным последовательностям.

В данной области хорошо известно большое число промоторов, включая конститутивные, индуцируемые и репрессируемые промоторы, из различных источников. Характерные источники включают, например, вирусы, клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные, дрожжевые и бактериальные типы клеток, и подходящие промоторы из этих источников являются легкодоступными, или их можно получать синтетически на основании последовательностей, общедоступных в режиме онлайн или, например, из хранилищ, таких как ATCC, а также других коммерческих или индивидуальных источников. Промоторы могут быть однонаправленными (т.е. инициировать транскрипцию в одном направлении) или двунаправленными (т.е. инициировать транскрипцию в 3'- или 5'-направлении). Неограничивающие примеры промоторов включают, например, бактериальную экспрессирующую систему T7, бактериальную экспрессирующую систему pBAD (araA), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV. Индуцибельные промоторы включают Tet-систему (патенты США 5464758 и 5814618), экдизон-индуцируемую систему (No et al., ProC. Natl. ACad. SCi., (1996) 93 (8):3346-3351), систему T-RE_x™ (Invitrogen Carlsbad, CA), LaCSwitCh® (Stratagene, (San Diego, CA) и тамоксифен-индуцибельную рекомбиназную систему Cre-ER^T (Indra et al. NuC. ACid. Res., (1999) 27 (22):4324-4327; NuC. ACid. Res. (2000) 28 (23): e99, патент США № 7112715, и Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., (2005) 308: 123-144) или любой промотор, известный в данной области, подходящий для экспрессии в желаемых клетках.

В определенных вариантах осуществления может быть конкретно определена "чистота" данного средства (например, полипептида HRS) в композиции. Например, определенные композиции могут содержать средство, которое является по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% чистым, включая все десятичные дроби между ними, как измеряют, например, и не ограничиваясь ими, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), хорошо известной формой колоночной хроматографии, часто используемой в биохимии и аналитической химии для выделения, идентификации и количественного определения соединений.

Термины "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения полимера аминокислотных остатков и их вариантов и синтетических аналогов. Таким образом, эти термины применяют для аминокислотных полимеров, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой синтетические неприродные аминокислоты, такие как химические аналоги соответствующей природной аминокислоты, а также природных аминокислотных полимеров.

Термин "прогноз" применяют в настоящем описании для обозначения прогнозирование вероятности развития симптомов заболевания, включая, например, рецидив, обострение и устойчивость к лекарственному средству заболевания. Термин "прогнозирование" применяют в настоящем описании для обозначения вероятности того, что индивидуум или пациент будет реагировать благоприятно или неблагоприятно на лекарственное средство или набор лекарственных средств, например, полипептидов HRS, или других средств. В одном из вариантов осуществления прогнозирование относится к выраженности таких реакций. В одном из вариантов осуществления прогнозирование относится к тому, выживет ли пациент или испытает улучшение, и/или к вероятности этого после лечения, например, конкретным терапевтическим средством и в течение определенного периода времени без рецидива заболевания. Способы прогнозирования по изобретению можно использовать в клинике для принятия решений касательно лечения путем выбора наиболее подходящих способов лечения для любого конкретного пациента. Способы прогнозирования по настоящему изобретению представляют собой ценное средство прогнозирования, будет ли с большей вероятностью пациент благоприятно реагировать на схему лечения, такую как данная схема лечения, включая, например, введение данного терапевтического средства или комбинации, хирургическое вмешательство, лечение стероидами и т.д., или какова вероятность длительного выживания пациента после схемы лечения.

"Субпопуляция пациентов" или, альтернативно, "субпопуляция индивидуумов" и грамматические варианты этого выражения, как используют в настоящем описании, относятся к подвыборке пациентов, которые характеризуются тем, что обладают одной или более отдельных измеряемых и/или идентифицируемых характеристик, которые отличают подвыборку пациентов или индивидуумов от других в более широкой категории заболевания, к которой они принадлежат. Такие характеристики включают подкатегории заболевания, пол, образ жизни, историю болезни, пораженные органы/ткани, историю лечения и т.д. В одном из вариантов осуществления субпопуляция пациентов или индивидуумов отличается по уровням аутоантител.

"Реакцию пациента" или, альтернативно, "реакцию индивидуума" можно оценивать с использованием любой конечной точки, указывающей на благоприятное действие для пациента, включая без ограничения, (1) ингибирование до некоторой степени прогрессирования заболевания, включая замедление и полный арест; (2) уменьшение числа эпизодов и/или симптомов заболевания; (3) уменьшение размера повреждения; (4) ингибирование (т.е. уменьшение, замедление или полное блокирование) инфильтрации пораженных клеток в прилежащие периферические органы и/или ткани; (5) ингибирование (т.е. уменьшение, замедление или полное блокирование) распространения заболевания; (6) уменьшение аутоиммунного ответа, которое может, но не обязательно приводит к регрессии или удалению очага заболевания; (7) ослабление до некоторой степени одного или более симптомов, ассоциированных с нарушением; (8) увеличение продолжительности выживания без заболевания после лечения и/или (9) снижение смертности в данный момент времени после лечения.

Термин "специфический" применяют в ситуации, при которой для одного участника пары специфического связывания не выявляют какого-либо значительного связывания с молекулами, отличными от его специфического партнера(ов) по связыванию. Термин также применяют, когда, например, антигенсвязывающий домен является специфическим по отношению к конкретному эпитопу, который состоит из ряда антигенов, в случае которого участник специфического связывания, несущий антигенсвязывающ домен, способен связываться с различными антигенами, несущими эпитоп.

Под "статистически значимым" подразумевают, что результат является случайным с малой вероятностью. Статистическую значимость можно определять любым известным в данной области способом. Широко используемые измерения значимости включают p-значение, которое представляет собой частоту или вероятность, с которой происходит наблюдаемое событие, если нулевая гипотеза являлась верной. Если наблюдаемое p-значение является меньше, чем уровень значимости, то нулевую гипотезу отклоняют. В простых случаях уровень значимости определяют при p-значении 0,05 или менее.

Термин "растворимость" относится к свойству блокирующего антитело средства, предоставленного в настоящем описании, растворяться в жидком растворителе и образовывать гомогенный раствор. Растворимость, как правило, выражают в виде концентрации в пересчете на массу растворенного вещества на единицу объема растворителя (г растворенного вещества на кг растворителя, г на дл (100 мл), мг/мл и т.д.), молярности, моляльности, молярной доли или других аналогичных описаний концентрации. Максимальное равновесное количество растворенного вещества, которое может растворяться, на количество растворителя представляет собой растворимость этого растворенного вещества в этом растворителе в конкретных условиях, включая температуру, давление, pH и природу растворителя. В определенных вариантах осуществления растворимость измеряют при физиологическом pH или другом pH, например, при pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 или pH 7,4. В определенных вариантах осуществления растворимость измеряют в воде или физиологическом буфере, таком как PBS или NaCl (с NaP или без него). В конкретных вариантах осуществления растворимость измеряют при относительно низком pH (например, pH 6,0) и при относительно более высоком содержании соли (например, 500 мМ NaCl и 10 мМ NaP). В определенных вариантах осуществления растворимость измеряют в биологической жидкости (растворитель), такой как кровь или сыворотка. В определенных вариантах осуществления температура может быть равна приблизительно комнатной температуре (например, приблизительно 20, 21, 22, 23, 24, 25°C) или приблизительно температуре тела (37°C). В определенных вариантах осуществления растворимость полипептида HRS составляет по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мл при комнатной температуре или при 37°C.

"Индивидуум", как используют в настоящем описании, включает любое животное, которое проявляет симптом или находится в группе риска проявления симптома, который можно лечить или диагностировать полипептидом HRS или блокирующим антитело средством по изобретению. Подходящие индивидуумы (пациенты) включают лабораторных животных (таких как мышь, крыса, кролик, или морская свинка), сельскохозяйственных животных и домашних животных или животных-компаньонов (таких как кошка или собака). Включают не являющихся человеком приматов и предпочтительно являющиеся человеком пациенты.

"По существу" или "в основном" означает почти целиком или полностью, например, 95% или более от определенного указанного количества.

"Терапевтический ответ" относится к улучшению симптомов (устойчивому или не устойчивому) на основании введения терапевтического средства (независимо от того индуцируется толерантность или не индуцируется).

Термин "толерантность" относится к устойчивой (например, один месяц или более) специфической сниженной реактивности иммунной системы к антигену (например, аутоантигену) в условиях иным образом по существу нормальной иммунной системы. Толерантность отличается от генерализованной иммуносупрессии, при которой все виды или все виды из класса, такого как виды иммунного ответа, опосредуемые B-клеткам, иммунного ответа снижаются. "Толеризация" относится к процессу, приводящему к состоянию толерантности.

Как используют в настоящем описании, термины "терапевтически эффективное количество", "терапевтическая доза", "профилактически эффективное количество" или "диагностически эффективное количество" представляет собой количество лекарственного средства, например, полипептида HRS или антитела, необходимое для индукции желаемого биологического ответа после введения. Аналогично, термин "терапия на основе полипептида HRS" относится к терапии, которая поддерживает среднюю равновесную концентрацию полипептид HRS в плазме пациента выше минимального эффективного терапевтического уровня.

"Лечение" или "проведение лечения", как используют в настоящем описании, включает любое желаемое действие на симптомы или патологию заболевания или состояния, и может включать даже минимальные изменения или улучшения одного или более измеряемых маркеров заболевания или состояния, подлежащего лечению. "Лечение" или "проведение лечения" не обязательно означает полное устранение или излечение заболевания или состояния, или ассоциированных с ним симптомов. Индивидуум, получающий такое лечение, представляет собой любого нуждающегося в этом индивидуума. Иллюстративные маркеры клинического улучшения будут понятны специалистам в данной области.

Термин "вакцина", как используют в настоящем описании, в широком смысле относится к любым композициям, которые можно вводить животному для индукции защитного иммунного ответа на вакцину или совместно вводимый антиген. Термины "защищать", "защитный иммунный ответ" или "защитный иммунитет", как используют в настоящем описании, описывает формирование антител или клеточных систем, которые специфически распознают антиген вакцины.

Термины "вектор", "клонирующий вектор" и "экспрессирующий вектор" означает носитель, посредством которого можно вводить последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген) в клетку-хозяина, таким образом, чтобы трансформировать хозяина и способствовать экспрессии (например, транскрипции и трансляции) водимых последовательностей. Векторы могут включать плазмиды, фаги, вирусы и т.д. и более подробно описаны ниже.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как общепринято понимает специалист в данной области, к которой принадлежит изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании изобретения можно использовать любые способы, композиции, реагенты, клетки, аналогичные или эквивалентные тем, которые описываются в настоящем описании, предпочтительные способы и вещества описаны в настоящем описании. Все публикации и ссылочные материалы, включая, но, не ограничиваясь ими, патенты и патентные заявки, цитируемые в этом описании, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы конкретно и отдельно указывали, что отдельная публикация или ссылочный материал включен посредством ссылки в настоящем описании, как полностью указанный. Любая патентная заявка, к которой по настоящей заявке испрашивается приоритет, также полностью включена в настоящее описание посредством ссылки способом, описанным выше для публикаций и ссылочных материалов.

Обзор

Настоящее изобретение относится к разработке улучшенных терапевтических композиций, диагностике и способам лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, и в некоторых аспектах к лечению воспалительных миопатий и родственных заболеваний и нарушений, включая заболевания легких, ассоциированные с формированием аутоантител к гистидил-тРНК-синтетазе, родственным белкам и других антител.

Настоящее изобретение также относится к разработке улучшенных терапевтических композиций, способов диагностики и способов лечения заболеваний с вторичным воспалительным компонентом, которые иным образом усугубляют, обеспечивают или приводят к прогрессированию заболевания и которые могут быть обусловлены не связанным генетически дефектом или повреждением.

В некоторых аспектах такие виды лечения обеспечивают улучшенную эффективность относительно существующих способов лечения и обладают значительно улучшенным профилем побочных эффектов.

"Воспаление", как правило, относится к биологическому ответу тканей на повреждающие стимулы, такие как патогены, поврежденные клетки (например, раны) и раздражающие факторы. Термин "воспалительный ответ" относится к конкретным механизмам, посредством которых развивается и регулируется воспаление, включая только в качестве иллюстрации, активацию или миграцию иммунных клеток, продукцию цитокинов, расширение сосудов, включая высвобождение кинина, фибринолиз и коагуляцию, наряду с другими описываемыми в настоящем описании и известными в данной области.

Клинические признаки хронического воспаления в зависимости от продолжительности заболевания представляют собой очаги воспаления, причины и поврежденной анатомической области. (См., например, Kumar et al., Robbins BasiC Pathology-8^th Ed., 2009 Elsevier, London; Miller, LM, Pathology LeCture Notes, AtlantiC Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canada). Хроническое воспаление ассоциировано с рядом патологических состояний или заболеваний, включая, наряду с другими описываемыми в настоящем описании и известными в данной области, например, аутоиммунную реакцию, аллергии, болезнь Альцгеймера, анемию, стеноз аортального клапана, артрит, такой как ревматоидный артрит и остеоартрит, злокачественную опухоль, застойную сердечную недостаточность, фибромиалгию, фиброз, инфаркт миокарда, почечную недостаточность, волчанку, панкреатит, инсульт, послеоперационные осложнения, воспаление легких, воспалительное заболевание кишечника, атеросклероз, неврологические нарушения, диабет, нарушения обмена веществ, ожирение и псориаз. Таким образом, полипептиды HRS можно использовать для лечения или ведения хронического воспаления, модуляции любых одного или более индивидуальных хронических воспалительных ответов или лечения любых одного или более заболеваний или состояний, ассоциированных с острым или хроническим воспалением.

Критерии оценки признаков и симптомов воспалительных и других состояний, включая с целью проведения дифференциальной диагностики, а также мониторинга лечения, такие как определение была ли введена терапевтически эффективная доза во время курса лечения, например, путем определения улучшения в соответствии с принятыми клиническими критериями, будут понятны специалистам в данной области и проиллюстрированы посредством, указаний, например, Berkow et al., eds., The MerCk Manual, 16^th edition, MerCk и Co., Rahway, N.J., 1992; Goodman et al., eds., Goodman и Gilman's, The PharmaCologiCal Basis of TherapeutiCs, 10^th edition, Pergamon Press, InC., Elmsford, N.Y., (2001); Avery's Drug Treatment: PrinCiples and PraCtiCe of CliniCal PharmaCology and TherapeutiCs, 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD. (1987); Ebadi, PharmaCology, Little, Brown and Co., Boston, (1985); OsolCi al., eds., Remington's PharmaCeutiCal SCienCes, 18^th edition, MaCk Publishing Co., Easton, PA (1990); Katzung, BasiC and CliniCal PharmaCology, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992).

Таким образом, некоторые аспекты включают способы уменьшения воспаления ткани, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. В некоторых вариантах осуществления ткань выбрана из мышцы, легкого и кожи.

Определенные аспекты включают способы уменьшения воспаления мышц или легких, ассоциированного с аутоиммунным заболеванием, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина; где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Также раскрыты способы лечения ассоциированного с аутоантителом заболевания, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, или d) антитела или связывающего белка, специфического к аутоантителу, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом.

Некоторые аспекты включают способы индукции толерантности к антигену гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS), где указанный способ включает введение индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где введение композиции вызывает толеризацию к аутоантигену.

Определенные аспекты включают способы уменьшения или элиминации популяции или субпопуляции T-клеток, участвующих в аутоиммунном ответе к аутоантигену гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS), где способ включает введение индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где введение композиции вызывает клональную делецию аутореактивных T-клеток.

Также раскрыты способы индукции анергии в T-клетках, участвующих в аутоиммунном ответе к аутоантигену гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS), где способ включает введение индивидууму композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, специфически распознаваемый аутоантителом, и где введение композиции вызывает функциональную инактивацию T-клеток, участвующих в аутоиммунном ответе. Некоторые такие и родственные варианты осуществления включают способы снижения содержания или уровней "T-клеток, активируемых аутоантигеном" гистидил-тРНК-синтетазы и/или "B-клеток, активируемых аутоантигеном" гистидил-тРНК-синтетазы.

В некоторых вариантах осуществления индивидуум, страдающий заболеванием, ассоциированным с аутоантителом, имеет генетическую предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям или нарушениям. Например, в определенных вариантах осуществления индивидуум имеет аллотип MHC класса II, такой как HLA DR2, HLA DR3, HLA DR4, мутации в белке тирозинфосфатазе нерецепторного типа 22 (PTPN22), и нарушенную регуляцию путей, таких как рецепторы распознавания патогена врожденной иммунной системы и суперсемейства TNF (см., например, Rai and Wakeland, Semin. Immunology, 23:67-83, 2011), каждый из которых коррелирует с определенными аутоиммунными нарушениями.

Некоторые аспекты включают виды заместительной терапии для лечения заболевания, ассоциированного с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы, предусматривающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции, содержащей один или более из: a) полипептида HRS, b) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, C) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, или d) антитела или связывающего белка, специфического к аутоантителу, где полипептид HRS функционально компенсирует недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы.

При некоторых видах заместительной терапии недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы вызвана наличием антитела к Jo-1. В некоторых аспектах такой заместительной терапии недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы вызвана мутациями эндогенной гистидил-тРНК-синтетазы, которые модулируют активность, экспрессию или клеточное распределение эндогенной гистидил-тРНК-синтетазы. В некоторых аспектах недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы является ассоциированной с синдромом Перро или синдромом Ушера. В некоторых аспектах недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы является ассоциированной с недостаточностью локальной продукции гистидил-тРНК-синтетазы в ткани или в участке повреждения или воспаления. В определенных аспектах недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы ассоциирована с одним или более из рабдомиолиза, кахексии и/или повреждения мышц.

Термин "толерантность", как используют в настоящем описании, относится к устойчивому снижению или отсутствию иммунного ответа к контурному антигену у млекопитающего, в частности у человека. Толерантность отличается от генерализованной иммуносупрессии, при которой все виды или все виды из конкретного класса иммунных клеток, таких как виды иммунного ответа, опосредованного B-клетками, иммунного ответа ослабляются или устраняются. За развитием толерантности можно общепринято наблюдать по отсутствию или снижению концентрации антител к полипептидам HRS в сыворотке индивидуума-хозяина после введения в однократной или последующих дозах рассматриваемого полипептида HRS. Развитие толерантности, как правило, будет достаточным для уменьшения симптомов аутоиммунного заболевания у пациента, например, у пациента можно наблюдать достаточное улучшение, чтобы поддерживать виды нормальной активности в отсутствие или в присутствии сниженных количеств общих иммуносупрессоров, например, кортикостероидов.

В любых из этих способов или композиций толерантность, как правило, является устойчивой, что означает, что ее длительность составляет приблизительно один месяц, приблизительно два месяцы, приблизительно три месяцы, приблизительно 4 месяца, приблизительно 5 месяцев или приблизительно 6 месяцев или более. Толерантность может приводить к селективной анергии B-клеток или анергии T-клеток или той и другой.

В любых из этих способов, видов лечения и терапевтических композиций термин "заболевание, ассоциированное с аутоантителами, специфическими к гистидил-тРНК-синтетазе" относится к любому заболеванию или нарушению, при котором детектируют антитела к гистидил-тРНК-синтетазе, или они являются детектируемыми независимо от того, детектируют ли также другие аутоантитела или предполагают, что они играют роль в прогрессировании или причине заболевания. Способы детекции антител в образцах у пациента можно проводить любой стандартной процедурой, включая, например, RIA, ELISA, посредством иммунопреципитации, окрашиванием тканей или клеток (включая трансфицированные клетки), посредством микропанелей антигена, масс-спектрометрическим анализом, анализом специфической нейтрализации или одним из ряда других известных в данной области способов идентификации желаемой антигенной специфичности. В некоторых аспектах специфичность антитела можно дополнительно характеризовать путем определения способности антител избирательно связываться с различными формами варианта сплайсинга и усеченными или протеолитическими формами гистидил-тРНК-синтетазы. Относительно хорошо известное аутоантитело человека к гистидил-тРНК-синтетазе включает, например, антитела к Jo-1.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит эпитоп из гистидил-тРНК-синтетазе, который дает специфическую перекрестную реакцию с аутоантителом к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированным с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления любого из заявленных способов и композиций полипептид HRS содержит эпитоп из гистидил-тРНК-синтетазы, который дает специфическую перекрестную реакцию с аутореактивными T-клетками к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированными с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит эпитоп, который дает специфическую перекрестную реакцию с ассоциированным с заболеванием аутоантителом к другой тРНК-синтетазе или с аутоантителом не к тРНК-синтетазе.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит иммунодоминантный эпитоп, который специфически распознают многие антитела из сыворотки пациента с заболеванием, ассоциированным с аутоантителами к гистидил-тРНК синтетазе. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит иммунодоминантный эпитоп, который специфически распознают многие аутореактивные T-клетки из сыворотки пациента с заболеванием, ассоциированным с аутоантителами к гистидил-тРНК синтетазе.

В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержится в домене WHEP полипептида HRS (приблизительно аминокислоты 1-43 SEQ ID NO: 1), домене аминоацилирования (приблизительно аминокислоты 54-398 SEQ ID NO: 1) или антикодон-связывающем домене (приблизительно аминокислоты 406-501 SEQ ID NO: 1) или любом их сочетании.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS не содержит эпитоп, который дает перекрестную реакцию с аутоантителом к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированным с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS существенно не конкурирует за связывание антитела, ассоциированного с заболеванием, с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентом ELISA до концентрации приблизительно 1×10^-7M. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS существенно не конкурирует за связывание аутоантитела, ассоциированного с заболеванием, с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентом ELISA до концентрации приблизительно 5×10^-7M. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS существенно не конкурирует за связывание аутоантитела, ассоциированного с заболеванием, с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентом ELISA до концентрации приблизительно 1×10^-6M.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает более низкой аффинностью к ассоциированному с заболеванием аутоантителу чем гистидил-тРНК-синтетаза дикого типа (SEQ ID NO: 1), как измеряют в конкурентном ELISA. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает кажущейся аффинностью к ассоциированному с заболеванием аутоантителу, которая является по меньшей мере приблизительно в 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно в 20 раз ниже, или по меньшей мере приблизительно в 50 раз ниже, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз ниже чем аффинность ассоциированного с заболеванием аутоантитела к гистидил-тРНК-синтетазе человека дикого типа (SEQ ID NO: 1). В некоторых аспектах аутоантитело к гистидил-тРНК-синтетазе направлено к антигену Jo-1.

Примеры заболеваний, ассоциированных с аутоантителами, специфическими к гистидил-тРНК-синтетазе (а также заболеваний, ассоциированных с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы) включают без ограничения аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания и воспалительные миопатии, включая воспалительные миопатии, полимиозит, миопатии, индуцируемые статином, дерматомиозит, интерстициальную легочную болезнь (и другие фиброзные состояния легких) и родственные нарушения, такие как перекрестный синдром полимиозит-склеродермия и миозит с тельцами включения (IBM), и состояния, такие как состояния, встречающиеся при синдромах анти-синтетазы, включая, например, интерстициальную легочную болезнь, артрит, пищеводную дискинезию, сердечно-сосудистое заболевание и другие сосудистые проявления, такие как синдром Рейно, другие примеры заболеваний, ассоциированных с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы включают генетические нарушения, которые приводит к недостаточности активной гистидил-тРНК-синтетазы, включая синдром Ушера и синдром Перро. Дополнительные примеры заболеваний, связанных с недостаточности гистидил-тРНК-синтетазы, включают воспалительные заболевания и нарушения, ассоциированные с недостаточностью локальной продукции гистидил-тРНК-синтетазы в ткани или в участке повреждения или воспаления. В некоторых аспектах недостаточность гистидил-тРНК-синтетазы ассоциирована с одним или более из рабдомиолиза, кахексии и/или повреждения мышц.

В определенных вариантах осуществления для лечения широкого спектра аутоиммунных и воспалительных заболеваний и нарушений, ассоциированных с антителами против гистидил-тРНК-синтетазы, другими аутоантителами, а также заболеваний, ассоциированных с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы, пригодными являются блокирование связывания, действия или индукции антител против гистидил-тРНК-синтетазы, композиции и способы, описываемые в настоящем описании.

Кроме того, введением полипептидов HRS по изобретению посредством восстановления концентрации гистидил-тРНК-синтетазы (в отсутствие антител против гистидил-тРНК-синтетазы) можно модулировать местные воспалительные ответы, что является эффективным для лечения широкого спектра воспалительных заболеваний и нарушений, а также заболеваний, при которых воспаление является вторичным по отношению к первичному заболеванию, как в случае, например, с мышечными дистрофиями.

Определенные варианты осуществления включают способы лечения миозита, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. В некоторых вариантах осуществления миозит представляет собой полимиозит. В некоторых вариантах осуществления миозит представляет собой дерматомиозит.

Некоторые варианты осуществления включают способы лечения миозита с тельцами включения (IBM), включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Также раскрыты способы лечения ювенильного миозита, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Определенные варианты осуществления включают способы лечения миопатии, индуцируемой статином, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. В некоторых вариантах осуществления статин представляет собой церивастатин.

Некоторые варианты осуществления включают способы лечения интерстициальной легочной болезни (ILD), включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Определенные варианты осуществления включают способы лечения синдрома Ушера, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. Определенные варианты осуществления включают способы лечения синдрома Ушера 1 типа. Некоторые варианты осуществления включают способы лечения синдрома Ушера 2 типа. Определенные варианты осуществления включают способы лечения синдрома Ушера 3 типа.

Некоторые варианты осуществления включают способы лечения синдрома Перро (PS), включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Также раскрыты способы лечения мышечной дистрофии, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS. В некоторых аспектах мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Дюшена, мышечной дистрофии Беккера, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, тазово-плечевой мышечной дистрофии, плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофии, миотонической дистрофии, окулофарингеальной мышечной дистрофии, дистальной мышечной дистрофии и наследственной мышечной дистрофии.

Также раскрыты способы лечения кахексии, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Также раскрыты способы лечения рабдомиолиза, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более из: i) полипептида HRS, ii) рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид HRS, или iii) рекомбинантной клетки-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS.

Определенные иллюстративные воспалительные или аутоиммунные нарушения более подробно описаны ниже.

Полимиозит поражает скелетные мышцы (участвующие в движении) на обеих сторонах организма. Его редко наблюдают у лиц моложе 18 лет; большинство случаев наблюдают у людей в возрасте от 31 до 60 лет. В дополнение к перечисленным выше симптомам, прогрессирующая мышечная слабость приводит к затруднению при глотании, разговоре, вставании из положения сидя, поднятии по лестнице, поднятии тяжестей или вытягивании вверх. Люди с полимиозитом также могут страдать артритом, отдышкой и нарушениями сердечного ритма.

Дерматомиозит характеризуется кожной сыпью, которая предшествует или сопровождает прогрессирующую мышечную слабость. Сыпь выглядит пятнистой с багровой или красной окраской и характерным образом развивается на веках и на мышцах, используемых для распрямления или разгибания суставов, включая суставы пальцев, локти, колени и пальцы ног. Красная сыпь также может возникать на лице, шее, плечах, верхней части грудной клетки, спине и других участках, и в пораженных областях также может развиваться отек. Иногда сыпь возникает без заметного поражения мышц. Взрослые с дерматомиозитом могут страдать потерей массы или слабым проявлением лихорадки, страдать воспалением легких и являться чувствительными к свету. Дерматомиозит взрослых в отличие от полимиозита может сопутствовать опухолям молочной железы, легких, женских половых органов или кишечника. У детей и взрослых с дерматомиозитом может происходить отложения кальция, которые проявляются в виде твердых бугорков под кожей или в мышцах (называемое кальцинозом). Кальциноз, как правило, возникает через 1-3 года после начала заболевания, но может возникать через многие годы спустя. Такие отложения более часто наблюдают при детском дерматомиозите, чем при дерматомиозите, который начинается у взрослых. Дерматомиозит может быть ассоциирован с коллагенозом сосудов или аутоиммунными заболеваниями.

В некоторых случаях полимиозита и дерматомиозита при прогрессировании заболевания могут поражаться дистальные мышцы (удаленные от торса отделы организма, такие как мышцы в предплечье и вокруг голеностопного сустава и запястья). Полимиозит и дерматомиозит могут быть ассоциированы с коллагенозом или аутоиммунными заболеваниями. Полимиозит также может быть ассоциирован с инфекционными заболеваниями.

Миозит с тельцами включения (IBM) характеризуется прогрессированием мышечной слабости и атрофии. Начало мышечной слабости, как правило, является постепенным (в течение месяцев или лет), и поражаются как проксимальные, так и дистальные мышцы. Мышечная слабость может поражать только одну сторону тела. В клетках пораженных мышечных волокон иногда наблюдают небольшие впадины, называемые вакуолями. Усталость и спотыкание представляют собой, как правило, первые заметные симптомы IBM. Для некоторых индивидуумов нарушение начинается со слабости в запястье и пальцах кисти, которые вызывают трудности с захватом, застегиванием и зажиманием объектов. Может присутствовать слабость мышц запястья и пальцев кисти и атрофия (истоньшение или потеря мышечной массы) мышц предплечья и четерехглавой мышцы бедра на ногах. Трудности при глотании возникают приблизительно в половине случаев IBM. Симптомы заболевания, как правило, начинаются в возрасте после 50 лет, хотя заболевание может возникать раньше. В отличие от полимиозита и дерматомиозита IBM возникает чаще у мужчин, чем у женщин.

Ювенильный миозит имеет некоторые сходства с дерматомиозитом и полимиозитом взрослых. Он, как правило, поражает детей в возрасте от 2 до 15 лет с симптомами, которые включают слабость и воспаление проксимальных мышц, отек (аномальное накопление жидкостей в тканях организма, что вызывает отек), мышечную боль, усталость, высыпания на коже, боль в животе, лихорадку и контрактуры (хроническое уменьшение длины мышц или сухожилий вокруг суставов, вызываемое воспалением в сухожилиях мышц, которое нарушает свободное движение пальцев). Дети с ювенильным миозитом также могут иметь трудности при глотании и дыхании, и может поражаться сердце. Приблизительно у 20-30 процентов детей с ювенильным дерматомиозитом развивается кальциноз. У пораженных детей могут не выявлять превышающие норму уровни мышечного фермента креатининкиназы в крови, но уровни других мышечных ферментов у них могут являться выше нормы.

Миопатии, индуцируемые статином, ассоциированы с длительным применением статинов, которые действуют путем ингибирования 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермента A редуктазы (HMGCR). Как правило, хорошо переносимые эти лекарственные средства были описаны как индукторы миотоксичности. В последнее время поступали сообщения от пациентов, у которых статиновые миопатии сохраняются даже после отмены лекарственного средства, для которых предполагают, что они имеют аутоиммунную причину. Благоприятное действие статинов является неоспоримым при снижении риска ишемической болезни сердца и прогрессировании коронарного атеросклероза. Однако сопутствующие осложнения могут быть опасны для жизни. Насчитывают, что в настоящее время более 38 миллионов человек в США принимают статины, и до 7% (>2,6 миллионов) у таких людей прогнозируют возникновение мышечных симптомов, где до 0,5% (>190000) у таких людей потенциально будут развиваться опасные для жизни миопатии.

Все статины могут вызывать проблемы с мышцами, и риск повышается наряду с увеличением их липофильности, снижающей холестерин активности и дозированием. В частности, предполагают, что церивастатин обладает повышенным риском, и он был отозван с рынка США. Из оставшихся статинов аторвастатин и симвастатин обладают наиболее высокими показателями миотоксичности. Другие нестатиновые снижающие уровень липидов средства, такие как ниацин и фибраты, также несут риски возникновения мышечных проблем, в частности при комбинации со статинами. Хотя невозможно прогнозировать, у каких пациентов возникнут мышечные проблемы, индуцируемые статином, предшествующие мышечные проблемы могут являться фактором риска, и их следует учитывать при начале лечения статинами. Семейный анамнез миопатии является полезным, в случае если пациент может являться носителем наследственной миопатии, т.к. она может проявляться в результате увеличенного стресса лечения статинами. Другие факторы риска могут включать возраст более 80 лет, низкую массу тела, женский пол, гипотиреоз, определенные генетически дефекты и азиатское происхождение, а также одновременное использование определенных лекарственных средств, включая блокаторы кальциевых каналов, макролидные антибиотики, омепразол, амиодарон, азольные фунгициды, антагонисты H₂-гистаминовых рецепторов, нефазодон, циклоспорин, ингибиторы протеаз ВИЧ, варфарин и грейпфрутовый сок.

Наиболее распространенный мышечный симптом, вызываемый статинами, представляет собой мышечную боль или миалгию, и он встречается приблизительно у 7% лиц, использующих статины. Миалгия может быть любой формы от легкой до тяжелой и, как правило, усугубляется мышечной активностью. Если симптом является переносимым, а показание к лечению статинами является веским, например, у пациента с гиперхолестеринемией и недавним инфарктом миокарда, длительное лечение статинами может являться подходящим.

Организации, регулирующие лечение статинами однозначно не рекомендуют определять фоновые уровни креатининкиназы (CK) перед началом лечения статинами, но уровни CK могут предоставлять очень полезную информацию, если мышечные симптомы развиваются в дальнейшем. Также может возникать мышечная слабость, и, как правило, она является утомляющей по природе и сочетается с болью и повышенными уровнями CK. Как и большинство миопатий, слабость наиболее ярко выражена в проксимальных отделах. При терапии статинами также возникают редкие случаи рабдомиолиза, они возникают гораздо реже, но также могут, возможно, являться смертельными. Изменения, которые можно наблюдать в гистологии мышц, которые являются наиболее характерными для статиновой миопатии, представляют собой волокна с низким содержанием цитохромоксидазы, повышенное содержание липидов и разорванные красные волокна. Аутоиммунная некротизирующая миопатия представляет собой редкую форму статиновой миопатии. У таких пациентов отмена лекарственного средства на основе статинов не приводит к восстановлению даже после нескольких месяцев прекращения приема лекарственного средства. У пациентов наблюдают преимущественно в проксимальных отделах, как правило, безболевую слабость.

Диагностика основана на истории болезни (анамнезе) индивидуума, результатах физикального обследования и тестов мышечной силы, и образцах крови, в которых выявляют повышенные уровни различных мышечных ферментов и аутоантител. Диагностические средства включают электромиографию для регистрации электрической активности, которая контролирует мышцы во время сокращения и при покое, ультразвуковое исследование для поиска воспаления мышц и магнитно-резонансную визуализацию для выявления аномальной мышцы и оценки мышечного заболевания. Биопсию мышц можно исследовать посредством микроскопии на признаки хронического воспаления, гибели мышечного волокна, деформаций сосудов или изменений, характерных для диагноза IBM. Биопсия кожи может выявлять изменения слоя кожи у пациентов с дерматомиозитом.

Интерстициальная легочная болезнь (ILD) представляет собой обширную категорию заболеваний легких, которая включает более 130 нарушений, характеризующихся рубцеванием (например, "фиброзом") и/или воспалением легких. ILD составляет 15 процентов случаев, наблюдаемых пульмонологами. Интерстициальная легочная болезнь (ILD) может развиваться вследствие различных причин, начиная с других заболеваний, и заканчивая факторами окружающей среды. Некоторые из известных причин ILD включают: заболевание соединительной ткани или аутоиммунное заболевание, включая, например, склеродермию/прогрессирующий системный склероз, волчанку (системную красную волчанку), ревматоидный артрит и полимиозит/дерматомиозит, воздействия факторов профессиональной и окружающей среды, включая, например, воздействие пыли и определенных газов, ядов, химиотерапии и лучевой терапии.

При ILD ткань в легких становится воспаленной и/или рубцеватой. Интерстиция легкого включает область в и вокруг небольших кровеносных сосудов и альвеол (альвеолярные мешочки), где происходит обмен изменение кислорода и диоксида углерода. Воспаление и рубцевание приводит к разрывам интерстиции такой ткани и приводит к снижению способности легких выделять кислорода из воздуха.

Прогрессирование ILD изменяется от заболевания к заболеванию и от индивидуума к индивидууму. Вследствие того, что интерстициальная легочная болезнь нарушает перенос кислорода и диоксида углерода в легких, ее симптомы, как правило, проявляются в виде проблем с дыханием. Два наиболее распространенных симптома ILD представляют собой отдышку при физических упражнениях и непродуктивный кашель.

Синдрома Ушера представляет собой наиболее распространенное состояние, которое поражает слух и зрение. Основные симптомы синдрома Ушера представляют собой потерю слуха и пигментную дегенерацию сетчатки (RP). RP вызывает ночную слепоту и потерю периферического зрения (боковое зрение) в результате прогрессирования дегенерации сетчатки. По мере прогрессирования RP поле зрения сужается до тех пор, паке не остается только центральное зрение. Многие люди с синдромом Ушера также страдают серьезными нарушениями равновесия. Приблизительно от 3 до 6 процент всех детей, которые являются глухими, и другие от 3 до 6 процентов детей, которые являются слабослышащими, страдают синдром Ушера. В развитых странах, таких как США, приблизительно четыре новорожденных ребенка на каждые 100000 рожденных страдают синдром Ушера. Синдром Ушера наследуется как аутосомно-рецессивный признак. Некоторые генные локусы были ассоциированы с синдром Ушера, включая гистидил-тРНК-синтетазу (Puffenberger et al., (2012) PLoS ONE 7 (1) e28936 doi: 10,1371/journal. pone.0028936).

Существует три клинических типа синдрома Ушера: 1 тип, 2 тип и 3 тип. В Соединенных Штатах Америки 1 и 2 типы представляют собой наиболее распространенные типы. Совместно они составляют приблизительно от 90 до 95 процентов всех классов детей, которые страдают синдром Ушера.

Дети с 1 типом синдрома Ушера являются глубоко глухими при рождении и страдают серьезными нарушениями равновесия. Вследствие того, что нарушение равновесия ассоциировано с синдром Ушера 1 типа, дети с таким нарушением медленно учатся сидеть без поддержки и, как правило, не ходят самостоятельно до возраста 18 месяцев. У таких детей, как правило, начинают развиваться расстройства зрения в раннем детстве, почти всегда до момента, когда они достигают возраста 10 лет. Нарушения зрения наиболее часто начинаются с затрудненной способности видеть в темноте, но, как правило, быстро прогрессируют до тех пор, пока индивидуум полностью не теряет зрение.

Дети с синдром Ушера 2 типа рождаются с потерей слуха от умеренной до тяжелой и нормальным равновесием. Хотя тяжесть потери слуха варьирует, многие из таких детей могут извлекать пользу из слуховых аппаратов и могут устно общаться. Нарушения зрения при синдроме Ушера 2 типа, как правило, прогрессируют медленнее, чем нарушения при 1 типе с началом RP часто не выраженном до подросткового возраста.

Дети с синдромом Ушера 3 типа имеют нормальный слух при рождении. Несмотря на то, что большинство детей с нарушением имеет нормальное или почти нормальное равновесие, у некоторых детей в дальнейшем могут развиваться нарушения равновесия. Со временем ухудшаются слух и зрение, но скорость, с которой они снижаются, может изменяться от индивидуума к индивидууму, даже в одной и той же семье. У индивидуума с синдромом Ушера 3 типа может происходить потеря слуха в подростковом возрасте, и ему или ей, как правило, требуются слуховые аппараты в среднем или позднем взрослом возрасте. Ночная слепота, как правило, начинается иногда во время пубертатного периода. Слепые пятна возникают в период от позднего подросткового возраста до раннего взрослого возраста и к среднему взрослому возрасту индивидуум, как правило, является официально признанным слепым.

Синдром Перро (PS) характеризуется связью дисплазии яичников у женщин с нейросенсорным нарушением слуха и у некоторых индивидуумов с неврологическими расстройствами, включая прогрессирующую мозжечковую атаксию и интеллектуальный дефицит. Точная распространенность синдрома Перро неизвестна и, вероятно, не диагностируется, в частности у мужчин, в случае, когда гипогонадизм не является признаком, и синдром остается недетектируемым. У женщин с нейросенсорной тугоухостью средний возраст при диагностировании составляет 22 года после манифестации с задержкой полового созревания. Дефекты слуха отмечали во всех, кроме одного из зарегистрированных случаев (средний возраст при диагностировании 8 лет). Потеря слуха всегда является нейросенсорной и двусторонней, но тяжесть варьирует (от легкой до глубокой), даже у пораженных пациентов из одной и той же семьи. Дисплазию яичников отмечали во всех случаях у женщин, но не детектировали дефекты половых желез у мужчин. Аменорея, как правило, является первичной, но также отмечали вторичную аменорею. Замедленный рост (высота ниже третьего процентиля) отмечали в половине задокументированных случаев. Точная частота возникновения неврологический расстройств не известна, но были описаны девять женщин и два мужчины (16-37 лет), не страдающие неврологическими расстройствами. Неврологические признаки прогрессируют и, как правило, появляются в пожилом возрасте, однако замедление ходьбы или частые ранние падения отмечали у молодых пациентов с PS. Распространенные неврологические признаки представляют собой атаксию, диспраксию, ограниченное движение глазных яблок и полинейропатию. Также были описаны некоторые случаи со сколиозом. Передача PS является аутосомно-рецессивной, и недавно определили, что мутации митохондриальной гистидил-тРНК-синтетазы вызывают дисплазию яичников и нейросенсорную потерю слуха, ассоциированные с синдром Перро. (PierCe et al., (2011) PNAS USA, 108(16) 6543-6548).

Мышечная дистрофия относится к группе наследственных нарушений, при которых сила и мышечная масса постепенно снижаются. Все мышечные дистрофии характеризуются мышечной слабостью, которая обусловлена первичным генетическим дефектом в одном или более специфических для мышц генов. Дополнительно мышечные дистрофии, как правило, характеризуются изменяющимся воспалительным компонентом, который вызывает воспаление мышц и в конечном итоге усиливает дегенерацию мышечных тканей. Общепризнанными являются по меньшей мере девять типов мышечных дистрофий.

Мышечная дистрофия Дюшена (DMD): DMD поражает молодых мальчиков, вызывая прогрессирующую мышечную слабость, как правило, начинающуюся в ногах. Она представляет собой наиболее тяжелую форму мышечной дистрофии. DMD встречается приблизительно у 1 из 3500 новорожденных мальчиков и поражает приблизительно 8000 мальчиков и молодых мужчин в Соединенных Штатах Америки. Более слабая форма возникает у немногих носителей женского пола.

DMD обусловлена мутациями гена, кодирующего дистрофин, субсарколеммный белок, функционирующий в ассоциированным с дистрофином гликопротеиновом комплексе (DGC), который препятствует продукции функционального белка. Количество дистрофина коррелирует с тяжестью заболевания (т.е. чем меньше дистрофина содержится, тем более тяжелым является фенотип). Комплекс DGC соединяет внутриклеточный цитоскелет с внеклеточным матриксом. DGC концентрируется в Z-линиях саркомеров и обеспечивает передачу усилия через мышечное волокно. Нарушение такой связи приводит к нестабильности мембраны, которая в итоге приводит к разрывам сарколеммы. Приток внеклеточного кальция изменяет молекулярные процессы, такие как сокращение мышц, и активирует протеолитическую активность. Пораженные мышечные волокна подвергаются некрозу и апоптозу и выделяют митогенные хемоаттрактанты, которые инициируют воспалительные процессы. Циклы дегенерации и регенерации в конечном итоге приводят к необратимой мышечной атрофии и замене на фиброзную и жировую ткань.

У мальчика с мышечной дистрофией Дюшена, как правило, начинают проявляться симптомы в дошкольном возрасте. Сначала поражаются ноги, что делает ходьбу затруднительной и вызывает нарушения равновесия. Большинство пациентов начинают ходить от трех до шести месяцев позже, чем предполагалось, и испытывают трудности с бегом. Контрактуры (постоянное мышечное напряжение), как правило, начинаются в возрасте пяти или шести лет, наиболее тяжелые в икроножных мышцах. Частые падения и переломы костей обычно начинаются в этом возрасте. В возрасте девяти или десяти лет невозможными могут становиться подъем по лестницам и подъем без помощи, и многие мальчики используют инвалидную коляску для передвижения в возрасте 12 лет. Приблизительно в этом возрасте слабость мышц торса часто приводит к сколиозу (боковое искривление позвоночника) и кифозу (передне-заднее искривление).

Одной из наиболее серьезных слабостей DMD является слабость диафрагмы, слоя мышц в верхней части брюшного отдела, которые выполняют основную работу при дыхании и кашле. Слабость диафрагмы приводит к сниженной энергии и выносливости, и повышенной инфекции легких вследствие неспособности эффективно кашлять. Молодые мужчины с DMD могут доживать до своего двадцатилетия и больше, при условии, что им обеспечена вспомогательная искусственная вентиляция легких и хорошая гигиена дыхательных путей.

В некоторых вариантах осуществления индивидуум с DMD характеризуется одним или более из следующих признаков: положительный симптом Говерса, соответствующее поражение мышц нижних конечностей, высокие уровни креатининкиназы (CPK-MM) в крови, генетические ошибки в гене Xp21 или сниженные уровни или отсутствие дистрофина, например, как измерено посредством биопсии мышц.

Композиции HRS можно использовать при лечении DMD отдельно или в комбинации с другими видами терапии, такими как антисмысловые олигонуклеотиды (например, виды терапии на основе выбрасывания экзонов, такие как этеплирсен), кортикостероиды, бета-2-агонисты, физиотерапия, вспомогательная искусственная вентиляция легких, терапия на основе стволовых клеток и виды генно-заместительной терапии. В некоторых вариантах осуществления введение полипептидов HRS приводит к статистически значимым улучшениям в тесте ходьбы в течение 6 минут.

Мышечная дистрофия Беккера (BMD): BMD поражает мальчиков в более старшем возрасте и молодых мужчин с более мягким течением по сравнению с DMD. BMD встречается приблизительно у 1 из 30000 новорожденных мальчиков. Мышечная дистрофия Беккера представляет собой менее тяжелый вариант мышечной дистрофии Дюшена и обусловлена продукцией усеченной, но частично функциональной формы дистрофина.

Симптомы BMD, как правило, возникают в период от позднего детства до начала взрослой жизни. Полагают, что прогрессирование симптомов можно сравнивать с прогрессированием DMD, симптомы, как правило, являются более умеренными, и течение более вариабельным. Может возникать сколиоз, но, как правило, является легким и прогрессирует более медленно. При BMD более часто возникает заболевание сердечной мышцы (кардиомиопатия). Нарушения могут включать нерегулярное сердцебиение (аритмии) и застойную сердечную недостаточность. Симптомы могут включать усталость, отдышку, боль в груди и головокружение. Также возникает слабость респираторной системы и может приводить к необходимости искусственной вентиляции легких.

Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (EDMD): EDMD поражает молодых мальчиков, вызывая контрактуры и слабость в икрах, слабость в лопатках и плечах и нарушения пути проводимости электрических импульсов, проходящие в сердце, заставляя его биться (нарушения проводимости сердца). Существует три подтипа мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, выделяемые по их характеру наследования: X-связанные, аутосомно-доминантные и аутосомно-рецессивные. X-связанная форма является наиболее распространенной. Каждый тип различается по распространенности и симптомам. Заболевание обусловлено мутациями в гене LMNA или более часто в гене EMD. Оба гена кодируют белковые компоненты ядерной оболочки.

EDMD, как правило, начинается в раннем детстве часто с контрактурами, предшествующими мышечной слабости. Изначально слабость поражает мышцы лопатки и плеча наряду с икроножными мышцами, приводя к свисанию стопы. Большинство мужчин с EDMD доживают до среднего возраста, хотя нарушение сердечного ритма (блокада сердца) может являться фатальным при отсутствии лечения с использованием кардиостимулятора.

Тазово-плечевая мышечная дистрофия (LGMD): LGMD начинается в период от позднего детства до раннего взрослого возраста и поражает как мужчин, так и женщин, вызывая слабость в мышцах вокруг тазобедренного сустава и плеч. Она представляет собой наиболее изменяющуюся форму мышечных дистрофий, и существует несколько различных форм заболеваний, распознаваемых в настоящее время. У многих людей, у которых подозревали LGMD, в прошлом ошибочно ставили диагноз, и, таким образом, трудно оценить распространенность заболевания. Число пораженных людей в Соединенных Штатах Америки может составлять по меньшей мере тысячи.

Несмотря на то, что существует по меньшей мере полдюжины генов, которые обуславливают различные типы LGMD, как правило, распознают две основные клинические формы LGMD. Тяжелая детская форма по внешнему проявлению является сходной с DMD, но наследуется как аутосомно-рецессивный признак.

Тазово-плечевая мышечная дистрофия 2B типа (LGMD2B) обусловлена потерей функциональных мутаций в гене дисферлина. Дисферлин преимущественно экспрессируется в скелетной и сердечной мышце, а также в моноцитах, макрофагах и других тканях, где он локализован в цитоплазматических визикулах и клеточной мембране. Вероятно, что дисферлин участвует в слиянии мембран и направленной миграции, а также процессах восстановления. LGMD2B представляет собой мышечное заболевание с поздним началом (подростки/молодые взрослые), которое характеризуется прогрессирующей симметричной мышечной слабостью и заметно агрессивной иммунной/воспалительной патологией. Биопсии мышц, как правило, выявляют заметную инфильтрацию воспалительных клеток, состоящих преимущественно из макрофагов/маркеров активации макрофагов (HLA-DR, HLA-ABC, CD86), CD8⁺ цитотоксических T-клеток и CD4⁺ T-клеток, наряду с дегенерацией/регенерацией мышечного волокна.

Симптомы LGMD с началом во взрослом возрасте, как правило, проявляются у индивидуумов подросткового возраста или у двадцатилетних и характеризуются прогрессирующей слабостью и истощением мышц, близкорасположенных к корпусу. Могут возникать контрактуры и способность передвигаться, как правило, утрачивается приблизительно через 20 лет после начала заболевания. У некоторых людей с LGMD развивается дыхательная слабость, которая требует использования устройства для искусственной вентиляции легких. Продолжительность жизни может до некоторой степени сокращаться. (Аутосомно-доминантные формы, как правило, возникают в пожилом возрасте и прогрессируют относительно медленно).

Плече-лопаточно-лицевая мышечная дистрофия (FSH): FSH, также известная как болезнь Ландузи-Дежерина, начинается в период от позднего детства до раннего взрослого возраста и поражает как мужчин, так и женщин, вызывая слабость мышц лица, лопаток и плеча. Также могут поражаться бедра и ноги. FSH встречается приблизительно у 1 на каждые 20000 человек, и поражает приблизительно 13000 человек в Соединенных Штатах Америки.

Тяжесть и возраст начала FSH варьирует даже среди членов той же самой семьи. Чаще всего симптомы проявляются у подростков или в начале двадцатилетия, полагают, что также возможным является начало в младенческом или детском возрасте. Симптомы, как правило, являются более тяжелыми у индивидуумов с ранним началом заболевания. Заболевание названо по отделам организма наиболее тяжело поражаемым заболеванием: мышцы лица (лицевая-), плеч (лопаточная-) и плеча (плечевая). Также могут поражаться бедра и ноги. У детей с FSH часто развивается частичная или полная тугоухость.

Для FSHD необходимы два дефекта, первый представляет собой делецию повторов D4Z4, и второй представляет собой "приобретение токсической функции" гена DUX4. Первый отмечаемый симптом часто представляет собой трудность при поднятии объектов выше плеч. Слабость может являться больше с одной стороны, чем с другой. Слабость в лопатках также приводит к тому, что лопатки выступают назад, так называемое крылообразное отстояние лопатки.

Миотоническая дистрофия: миотоническая дистрофия, также известная как болезнь Штейнерта, поражает как мужчин, так и женщин, вызывая общую слабость, сначала проявляемую в лице, ступне и руках. Она сопровождается неспособностью расслаблять пораженные мышцы (миотония). Симптомы могут проявляться с рождения до взрослого возраста. Миотоническая мышечная дистрофия 1 типа (DM1) представляет собой наиболее распространеную форму мышечной дистрофии, поражающей более 30000 человек в Соединенных Штатах Америки. Она обусловлена экспансией короткого повтора (CTG) в последовательности ДНК гена DMPK (протеинкиназа миотонической дистрофии). Миотоническая мышечная дистрофия 2 типа (DM2) является более редкой и обусловлена экспансией повтора CCTG в гене ZNF9 (белок 9 с цинковыми пальцами).

Симптомы миотонической дистрофии включают слабость лицевых мышц и отвисшую челюсть, опущение верхних век (птоз) и атрофию мышц в предплечьях и икрах. Индивидуум с такой дистрофией испытывает трудности ослабления сжатия, в частности, если объект является холодным. Миотоническая дистрофия поражает мышцы сердца, вызывая аритмии и блокаду сердца, и мышцы пищеварительной системы, приводя к нарушениям моторики и запору. Также поражаются другие системы организма: миотоническая дистрофия может вызывать катаракты, дегенерацию сетчатки, низкий IQ, фронтальное облысение, поражения кожи, атрофию яичек, приступы апноэ во сне и резистентность к инсулину. Часто встречается повышенная потребность во сне или желание спать, также как и снижение мотивации. Тяжелая форма инвалидности поражает большинство людей с таким типом дистрофии в течение 20 лет после начала заболевания, хотя для большинства из них не требуется инвалидное кресло даже в пожилом возрасте. Композиции HRS можно использовать для лечения миотонической дистрофии, например, посредством уменьшения воспаления, ассоциированного с мышечной тканью, включая в числе прочих тканей скелетную мышцу (например, четырехглавые мышцы бедра) и/или ткань сердца.

Окулофарингеальная мышечная дистрофия (OPMD): OPMD поражает взрослых обоих полов, вызывая слабость мышц глаз и гортани. Она наиболее распространена среди канадских семей французского происхождения в Квебеке и в испанско-американских семьях на юго-западе США.

OPMD, как правило, начинается у индивидуумов в возрасте тридцати или сорока лет со слабости мышц, контролирующих глаза и гортань. Симптомы включают опущение верхних век, трудности проглатывания (дисфагию) и слабость, прогрессирующую на другие мышцы лица, шеи и иногда на верхние конечности. Трудности проглатывания могут вызывать аспирацию или попадание еды или слюны в дыхательные пути. Может развиваться пневмония.

Дистальная мышечная дистрофия (DD): DD начинается в среднем возрасте или позже, вызывая слабость мышц ступни и рук. Она наиболее часто встречается в Швеции и редко в других частях света. DD, как правило, начинается в возрасте двадцати или тридцати лет со слабости в руках, предплечьях и голени. Первые симптомы могут представлять собой трудности с точными движениями, такими как печатание или застегивание пуговиц. Симптомы прогрессируют медленно и заболевание, как правило, не влияет на продолжительность жизни.

Наследственная мышечная дистрофия (CMD): CMD представлена с рождения, приводит к общей слабости и, как правило, медленно прогрессирует. Подтип, называемый CMD Фукуямы, также включает задержку умственного развития. Обе формы являются редкими; CMD Фукуямы наиболее распространена в Японии.

CMD характеризуется тяжелой мышечной слабостью с рождения, где у новорожденных детей выявляют "мышечную вялость" и очень небольшой диапазон произвольных движений. Несмотря на это, ребенок с CMD может научиться ходить с использованием некоторого вспомогательного средства или без него и доживать до раннего взрослого возраста или дольше. В противоположность этому дети с CMD Фукуямы редко способны ходить и страдают тяжелой задержкой умственного развития. Большинство детей с этим типом CMD умирают в детстве.

Кахексия: Кахексия (или синдром истощения), как правило, характеризуется потерей массы, атрофией мышц, усталостью, слабостью и значительной потерей аппетита у тех, кто активно пытается сбросить массу. Формальное определение кахексии представляет собой потерю массы тела, которую невозможно восстановить путем питания. Даже если пораженный пациент потребляет больше калорий, безжировая масса тела теряется, свидетельствуя о существовании первичной патологии.

Кахексией страдают пациенты со злокачественной опухолью, СПИД, хроническим обструктивным заболеванием легких, рассеянным склерозом, застойной сердечной недостаточностью, туберкулезом, семейной амилоидной полинейропатией, отравлением ртутью (акродинией) и гормональным дефицитом наряду с другими заболеваниями.

Кахексия также может являться признаком различных сопутствующих нарушений, включая злокачественную опухоль, метаболический ацидоз (т.е. сниженный синтез белков и повышенный катаболизм белков), определенные инфекционные заболевания (например, туберкулез, СПИД), хронический панкреатит, аутоиммунные нарушения или злоупотребление амфетаминами. Кахексия физически ослабляет пациентов до состояния неподвижности, возникающего в результате потери аппетита, астении и анемии, и реакция на стандартное лечение, как правило, является слабой.

Приблизительно 50% всех пациентов со злокачественными опухолями страдают кахексией. Пациенты со злокачественными опухолями верхних отделов желудочно-кишечного тракта и раком поджелудочной железы имеют самую высокую частоту возникновения симптомов кахексии. Наряду с повышенной заболеваемостью и смертностью, отягощающими побочными эффектами химиотерапии и сниженным качеством жизни кахексию считают непосредственной причиной смерти большой популяции пациентов со злокачественными опухолями в диапазоне от 22% до 40% пациентов. Симптомы кахексии при злокачественной опухоли включают прогрессирующую потерю массы и истощение запасов хозяина жировой ткани и скелетных мышц. Общепринятое подходы лечения включают применение стимуляторов аппетита, антагонистов 5-HT₃, питательных добавок и ингибиторов COX-2.

Хотя патогенез кахексии плохо изучен, предполагают, что вовлеченными являются многие биологические пути, включая провоспалительные цитокины, такие как TNF-α, нейроэндокринные гормоны, IGF-1 и опухолеспецифичные факторы, такие как индуцирующий протеолиз фактор.

Таким образом, композиции HRS можно использовать для лечения кахексии и любых из ее родственных, сопутствующих или вторичных нарушений или осложнений. Композиции HRS можно использовать отдельно или в комбинации с другими видами терапии, такими как пищевая добавка в комбинации с высоким содержанием белка, лейцина и рыбьего жира, антиоксидантов, прогестерона (мегестрола ацетата, медроксипрогестерона ацетата) и лекарственными средствами на основе антициклооксигеназы-2, стимуляторами аппетита и антагонистами 5-HT₃ наряду с другими.

Рабдомиолиз. Рабдомиолиз представляет собой разрушение мышечных волокон в ткани скелетных мышц. Продукты разрушения выделяются в кровоток, и некоторые из этих продуктов, такие как миоглобин, являются опасными для почек и могут приводить к почечной недостаточности.

Симптомы включают мышечную боль, рвоту, спутанность сознания, кому или аномальную частоту сердечных сокращения и ритма, и их тяжесть, как правило, зависит от степени повреждения мышц и от того, развивается ли почечная недостаточность. Поражение почек может вызывать сниженную продукцию мочи или ее отсутствие, как правило, приблизительно от 12 до 24 часов после первичного повреждения мышц. Опухание поврежденной мышцы может вызывать синдром повышенного давления или сдавливания окружающих тканей, таких как нервы и кровеносные сосуды, в том же самом фасциальном влагалище и приводить к потере крови и повреждению (например, потере функции) пораженных частей тела. Симптомы такого осложнения включают боль или сниженную чувствительность в пораженной конечности. Другие осложнения включают диссеминированное внутрисосудистое свертывание (DIC), серьезное нарушение тромбообразования, которое может приводить к нерегулируемому кровотечению.

Первичное повреждение мышц может быть вызвано, например, физическим факторами (например, повреждением с размозжением тканей, интенсивной физической нагрузкой), нарушенным кровоснабжением (например, артериальным тромбозом, эмболией), нарушенным метаболизмом (например, гипергликемическим гиперосмолярным состоянием, гипер- и гипонатриемией, гипокалиемией, гипокальциемией, гипофосфатемией, кетоацидозом, гипотиреозом), измененной температурой тела (гипертермией, гипотермией), лекарственными препаратами и токсинами (например, статинами, антипсихотическими лекарственными препаратами, нервно-мышечными блокаторами, диуретиками, тяжелыми металлами, алкалоидами болиголова, ядами насекомых или змеиными ядами), злоупотреблением лекарственным средством (например, спиртом, амфетамином, кокаином, героином, кетамином, LDS, MDMA), инфекциями (например, вирусом коксаки, вирусом гриппа A, вирусом гриппа B, вирусом Эпштейна-Барр, первичной инфекцией ВИЧ, Plasmodium falCiparum, вирусами герпеса, Legionella pneumophila, сальмонеллой) и аутоиммунным повреждение мышц (например, полимиозитом, дерматомиозитом). Также определенные наследственные состояния повышают риск рабдомиолиза, включая дефекты гликолиза и гликогенолиза (например, болезнь Мак-Ардла, недостаточность фосфофруктокиназы, болезни накопления гликогена VIII, IX, X и XI), нарушения метаболизм липидов (например, недостаточность карнитинпальмитоилтрансферазы I и II, недостаточность подтипов ацил-CoA дегидрогеназы (например, недостаточность LCAD, SCAD, MCAD, VLCAD, 3-гидроксиацил-кофермент A-дегидрогеназы), недостаточность тиолазы), митохондриальные миопатии (например, недостаточность сукцинатдегидрогеназы, цитохром C оксидазы и кофермента Q10) и другие, такие как недостаточность глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы, недостаточность миоаденилатдезаминазы и мышечные дистрофии.

Рабдомиолиз, как правило, диагностируют с использованием тестов крови и анализа мочи, и о нем может свидетельствовать аномально повышенные или повышающиеся уровни креатинина и мочевины, снижение диуреза или изменение окраски мочи на красновато-коричневую. Виды первичного лечения включают внутривенные инфузии, диализ и гемофильтрацию.

Таким образом, композиции HRS можно использовать для лечения рабдомиолиза и любых из его родственных, вторичных или сопутствующих нарушений или осложнений. Композиции HRS можно использовать отдельно или в комбинации с другими видами терапии, включая такие, как предназначенные для лечения шока и сохранения функции почек. Иллюстративные виды терапии включают введение внутривенных инфузий, как правило, изотонического физиологического раствора (0,9% массы на объем раствора хлорида натрия) и заместительную почечную терапию (RRT), такую как гемодиализ, непрерывная гемофильтрация и перитонеальный диализ.

В более общем смысле полипептиды HRS, описываемые в настоящем описании, могут снижать воспалительный ответ, таким образом, как путем снижения миграции или инфильтрации иммунных клеток в выбранные ткани, повышая продукцию противовоспалительных цитокинов или снижая продукцию или активность провоспалительных цитокинов наряду с другими механизмами.

Таким образом, полипептиды HRS по изобретению можно использовать для модуляции острого воспаления, хронического воспаления или того и другого. Определенные варианты осуществления относятся к увеличению острого воспаления или острых воспалительных ответов, и определенные варианты осуществления относятся к увеличению хронического воспаления или хронических воспалительных ответов. В зависимости от потребностей индивидуума определенные варианты осуществления относятся к уменьшению острого воспаления или воспалительных ответов, и определенные варианты осуществления относятся к уменьшению хронического воспаления или хронических воспалительных ответов.

Острое воспаление относится к первичной реакции организма на предположительно вредные стимулы и включает повышенное движение плазмы и лейкоцитов из крови в поврежденные ткани. Это является краткосрочным процессом, как правило, начинающимся в течение минут или часов и заканчивающимся после устранения вредного стимула. Острое воспаление можно охарактеризовать любым одним или более из покраснения, повышенной температуры, отека, боли и потери функции. Покраснение и теплота обусловлены в основном увеличенным кровотоком при внутренней температуре организма к воспаленному участку, отек обусловлен накоплением жидкости, боль, как правило, обусловлена высвобождением химических веществ, которые стимулируют нервные окончания, и потеря функции имеет множество причин.

Острые воспалительные ответы инициируются в основном местными иммунными клетками, такими как резидентные макрофаги, дендритные клетки, лимфоциты, клетки Купфера и T-клетки. В начале инфекции, ожога или других повреждений эти клетки претерпевают активацию и выделяют воспалительные медиаторы, ответственные за клинические симптомы воспаления, такие как вазоактивные амины и эйкозаноиды. Вазодилятация и обусловленный ее увеличенный кровоток вызывают покраснение и повышенную температуру. Повышенная проницаемость кровеносных сосудов приводит к экссудации или просачиванию белков плазмы и жидкости в ткань, что вызывает отек. Определенные выделяющиеся медиаторы, такие как брадикинин, повышают чувствительность к боли, и изменяют кровеносные сосуды, обеспечивая возможность миграции или экстравазации лейкоцитов, таких как нейтрофилы, которые, как правило, мигрируют по хемотаксическому градиенту, создаваемому местными иммунными клетками.

Острые воспалительные ответы также включают одну или более бесклеточных биохимических каскадных систем, состоящих из преформированных белков плазмы, которые действуют одновременно для инициации и распространения воспалительного ответа. Такие системы включают систему комплемента, которая в основном активируется бактериями, и коагулирующую систему и систему фибринолиза, которые в основном активируются некрозом, таким как тип повреждения ткани, который обусловлен определенными инфекциями, ожогами или другой травмой. Таким образом, полипептиды HRS можно использовать для модуляции острого воспаления или любых одного или более индивидуальных острых воспалительных ответов.

Хроническое воспаление, пролонгированный и замедленный воспалительный ответ, характеризуется постепенным изменением типа клеток, которые содержатся в участке воспаления, и часто приводит к одновременному или почти одновременному разрушению и заживлению ткани в результате воспалительного процесса. На клеточном уровне хронические воспалительные ответы включают различные иммунные клетки, такие как моноциты, макрофаги, лимфоциты, плазматические клетки и фибробласты, хотя в отличие от острого воспаления, которое обусловлено в основном гранулоцитами, хроническое воспаление обусловлено в основном мононуклеарными клетками, такими как моноциты и лимфоциты. Хроническое воспаление также включает различные воспалительные медиаторы, такие как IFN-γ и другие цитокины, факторы роста, активные формы кислорода и гидролитические ферменты. Хроническое воспаление может длиться в течение многих месяцев или лет и может приводить к нежелательному разрушению ткани и фиброзу.

Клинические признаки хронического воспаления зависят от длительности заболевания, очагов воспаления, причины и пораженной анатомической области (см., например, Kumar et al., Robbins BasiC Pathology-S^iA Ed., 2009 Elsevier, London; Miller, LM, Pathology LeCture Notes, AtlantiC Veterinary College, Charlottetown, PEI, Canada). Хроническое воспаление ассоциировано с рядом патологических состояний или заболеваний, включая наряду с другими, описываемыми в настоящем описании и известными в данной области, например, аллергии, болезнь Альцгеймера, анемию, стеноз аортального клапана, артрит, такой как ревматоидный артрит и остеоартрит, злокачественную опухоль, застойную сердечную недостаточность, фибромиалгию, фиброз, инфаркт миокарда, почечную недостаточность, волчанку, панкреатит, инсульт, послеоперационные осложнения, воспалительное заболевание легких, воспалительное заболевание кишечника, атеросклероз и псориаз. Таким образом, полипептиды HRS можно использовать для лечения или ведения хронического воспаления, модуляции любых одного или более индивидуальных хронических воспалительных ответов, или лечения любых одного или более заболеваний или состояний, ассоциированных с хроническим воспалением.

Полипептиды HRS также могут модулировать пролиферативное воспаление, воспалительный процесс, характеризующийся увеличением числа клеток ткани. Такие состояния могут включать кожные заболевания, такие как псориаз, себорея или экзема, или также можно рассматривать с точки зрения злокачественных опухолей и видов аномального роста, в частности в свете накопленных данных на основе более эффективных молекулярных способах документации даже незначительное хроническое воспаление.

В определенных вариантах осуществления полипептиды HRS могут модулировать воспалительные ответы на клеточном уровне, таким образом, как путем модуляции активности, секреции воспалительных молекул (например, секреции цитокинов или кининов), пролиферации, активности, миграции или адгезии различных клеток, участвующих в воспалении. Примеры таких клеток включают иммунные клетки и клетки сосудов. Иммунные клетки включают, например, гранулоциты, такие как нейтрофилы, эозинофилы и базофилы, макрофаги/моноциты, лимфоциты, такие как B-клетки, киллерные T-клетки (т.е. CD8+ T-клетки), хелперные T-клетки (т.е. CD4+ T-клетки, включая T1- и T2-клетки), естественные киллерные клетки, γδ-T-клетки, дендритные клетки и тучные клетки. Примеры клеток сосудов включают гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты. Также раскрыты способы модуляции воспалительного состояния ассоциированного с одной или более иммунными клетками или клетками сосудов, включая опосредованные нейтрофилами, опосредованные макрофагами и опосредованными лимфоцитами воспалительные состояния.

В определенных вариантах осуществления полипептиды HRS модулируют местное воспаление, системное воспаление или то и другое. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS может уменьшать или поддерживать (т.е. предотвращать дальнейшее увеличение) местное воспаление или местные воспалительные ответы. В определенных вариантах осуществления в зависимости от потребностей индивидуума полипептиды HRS можгут увеличивать местное воспаление или местные воспалительные ответы. В определенных вариантах осуществления полипептиды HRS могут уменьшать или поддерживать (т.е. предотвращать дальнейшее увеличение) системное воспаление или системные воспалительные ответы. В определенных вариантах осуществления в зависимости от потребностей индивидуума полипептиды HRS могут увеличивать системное воспаление или системные воспалительные ответы.

В определенных вариантах осуществления модуляция воспаления или воспалительных ответов может быть ассоциирована с одной или более тканями или органами. Неограничивающие примеры таких тканей или органов включают кожу (например, дерму, эпидерму, подкожный слой), волосяные фолликулы, нервную систему (например, головной мозг, спинной мозг, периферические нервы), слуховую систему или органы равновесия (например, внутреннее ухо, среднее ухо, наружное ухо), дыхательную систему (например, нос, трахею, легкие), ткани желудочно-пищеводного перехода, желудочно-кишечную систему (например, ротовую полость, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, прямую кишку), сосудистую систему (например, сердце, кровеносные сосуды и артерии), печень, желчный пузырь, лимфатическую/иммунную систему (например, лимфоузлы, лимфоидные фолликулы, селезенку, тимус, костный мозг), урогенитальную систему (например, почки, мочеточник, мочевой пузырь, уретру, шейку матки, фаллопиевы трубы, яичники, матку, наружные половые органы, предстательную железу, бульбоуретральные железы, эпидидимис, предстательную железу, семенные пузырьки, семенник), скелетно-мышечную систему (например, скелетные мышцы, гладкие мышцы, кость, хрящи, сухожилия, связки), жировую ткань, молочные железы и эндокринную систему (например, гипоталамус, гипофиз, щитовидную железу, поджелудочную железу, надпочечники). Таким образом, полипептиды HRS можно использовать для модуляции воспаления, ассоциированного с любой из этих тканей или органов, таким образом, для лечения состояний или заболеваний, которые ассоциированы с воспалением этих тканей или органов.

Как указано выше, в определенных вариантах осуществления могут применять полипептиды HRS для уменьшения или ведения (т.е. предотвращения дальнейших увеличений) воспаления или воспалительных ответов, ассоциированных с конкретными тканями или органами. Включены воспалительные ответы и состояния, ассоциированные с кожей, включая воспаление, инфекции и злокачественные опухоли, ассоциированные с дермальным, эпидермальным и подкожным слоями кожи. Примеры ассоциированных с кожей воспалительных состояний включают без ограничения дерматит, такой как псориаз, раздражительный дерматит, себорейный дерматит, атопический дерматит (экзему), аллергический контактный дерматит, индуцированный теплом дерматит, индуцированный лекарственными средствами дерматит, дисгидротический дерматит, крапивницу, аутоиммунный дерматит, рак кожи, такой как меланома, и буллезный дерматит. Также включены бактериальные, вирусные и паразитарные инфекции, полиморфная эритема, узловатая эритема, анулярная гранулема, сумах укореняющийся/сумах ядоносный и токсический эпидермальный некролиз.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с нервной системой, включая воспаление, инфекции и злокачественную опухоль, ассоциированную с головным мозгом и спинным мозгом, центральной нервной системой, периферической нервной системой и оболочками головного мозга. Экспрессия воспалительных медиаторов, включая комплемент, молекулы адгезии, ферменты циклооксигеназы и их продукты и цитокины, повышается при экспериментальном и клиническом нейродегенеративном заболевании, и интервенционные исследования на экспериментальных животных позволяют предположить, что некоторые из этих факторов непосредственно способствуют нейрональному повреждению. Например, конкретные цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1), в значительной степени участвуют в острой нейродегенерации, такой как инсульт и травмы головы.

Примеры ассоциированных с нервной системой воспалительных состояний включают без ограничения менингит (т.е. воспаление защитных оболочек, покрывающих головной мозг и спинной мозг), миелит, энцефаломиелит (например, миалгический энцефаломиелит, острый рассеянный энцефаломиелит, рассеянный энцефаломиелит или рассеянный склероз, аутоиммунный энцефаломиелит), арахноидит (т.е. воспаление паутинной оболочки, одной из оболочек, окружающих и защищающих нервы центральной нервной системы), гранулему, индуцированное лекарственными средствами воспаление или менингит, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, инсульт, ВИЧ-деменция, синдром Слая, CMT, ретинопатию, нейросенсорную потерю слуха, спинальную мышечную атрофию, энцефалит ALS, такой как вирусный энцефалит и бактериальный энцефалит, паразитарные инфекции, воспалительные демиелинизирующие заболевания и аутоиммунные нарушения, такие как аутоиммунные заболевания ЦНС, опосредованные CD8+ T-клетками. Дополнительные примеры включают болезнь Паркинсона, тяжелую миастению, двигательную нейропатию, синдром Гийена-Барре, аутоиммунную нейропатию, миастенический синдром Ламберта-Итона, паранеопластическое неврологическое заболевание, паранеопластическую атрофию мозжечка, непаранеопластический синдром скованного человека, прогрессирующую атрофию мозжечка, энцефалит Расмуссена, боковой амиотрофический склероз, хорею Сиденгама, синдром Жилль де ла Туретта, аутоиммунную полиэндокринопатию, дизиммунную нейропатию, приобретенную нейромиотонию, множественный артрогрипоз, неврит зрительного нерва и синдром скованного человека.

Как указано выше, также включено воспаление, ассоциированное с инфекциями нервной системы. Конкретные примеры бактериальных инфекций, ассоциированных с воспалением нервной системы включают без ограничения стрептококковую инфекцию, такую как стрептококки группы B (например, подтипы III) и StreptoCoCCus pneumoniae (например, серотипы 6, 9, 14, 18 и 23), EsCheriChia Coli (например, несущие антиген Kl), Listeria monoCytogenes (например, серотип IVb), инфекцию, обусловленную нейссерией, такую как Neisseria meningitidis (менингококк), стафилококковую инфекцию, гемофильную инфекцию, такую как Haemophilus influenzae типа B, клебсиелла и MyCobaCterium tuberCulosis. Также включены инфекции стафилококками и синегнойной палочкой и другими грамотрицательными бациллами, в основном в отношении травмы черепа, которая обеспечивает возможность бактериям в носовой полости поникать в менингеальное пространство, или у лиц с шунтом головного мозга или соответствующим устройством (например, внежелудочковый дренаж, резервуар Оммайя). Конкретные примеры вирусных инфекций, ассоциированных с воспалением нервной системы включают без ограничения энтеровирусы, вирус простого герпеса 1 и 2 типа, T-лимфотропный вирус человека, вирус ветряной оспы (ветрянка и опоясывающий герпес), вирус эпидемического паротита, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирус лимфатического хориоменингита (LCMV). Менингит также может возникать в результате инфекции спирохетами, такими как Treponema pallidum (сифилис) и Borrelia burgdorferi (болезнь Лайма), паразитами, такими как малярия (например, церебральная малярия), грибами, такими как CryptoCoCCus neoformans, и амебами, такими как Naegleria fowleri.

Менингит или другие формы воспаления нервной системы также ассоциированы с распространением злокачественной опухоли на оболочки головного мозга (злокачественный менингит), определенными лекарственными средствами, такими как нестероидные противовоспалительные лекарственны средства, антибиотиками и внутривенными иммуноглобулинами, саркоидозом (или нейросаркоидозом), нарушениями соединительной ткани, такими как системная красная волчанка, и определенными формами васкулита (воспалительных состояний стенки кровеносных сосудов), такого как болезнь Бехчета. Эпидермоидные кисты и дермоидные кисты также могут вызывать менингит посредством выделения раздражающего вещества в субарахноидальное пространство. Таким образом, полипептиды HRS можно использовать для лечения или ведения любых одного или более из этих состояний.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных со слуховой системой или органами равновесия, такими как внутреннее ухо, среднее ухо и наружное ухо. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных со слуховой системой или органами равновесия, включают без ограничения воспаление наружного уха (например, инфекции уха), воспаление среднего уха, которое может приводить к накоплению жидкости в пространстве, в норме заполненном воздухом, и ассоциированную кондуктивную тугоухость, лабиринтит, инфекцию внутреннего уха или воспаление, вызывающее головокружение (вертиго) и потерю слуха, вестибулярный нейронит, инфекцию вестибулярного нерва, как правило, вызываемое вирусом вертиго, и слуховой нейронит, инфекцию кохлеарного нерва, как правило, вызываемую вирусов внезапную тугоухость, но не вертиго. Реципиенты кохлеарного имплантата для тугоухости подвергаются повышенному риску пневмококкового менингита и ассоциированного с ним воспаления.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с дыхательной системой, включая воспаление, инфекции и злокачественную опухоль, ассоциированную с носом, трахеей и легкими. Примеры ассоциированных с дыхательной системой воспалительных состояний включают без ограничения воспалительные заболевания легких, атопическую астму, неатопическую астму, аллергическую астму, атопическую IgE-опосредованную астму, бронхиальную астму, эссенциальную астму, истинную астму, наследственную астму, вызываемую патофизиологическими нарушениями, приобретенную астму, вызываемую факторами окружающей среды, эссенциальную астму неизвестной или скрытой причины, неатопическую астму, бронхиальную астму, эмфизематозную астму, вызываемую физической нагрузкой астму, индуцируемую аллергеном астму, индуцируемую холодным воздухом астму, профессиональную астму, инфекционную астму, вызываемую бактериальной, грибковой, протозойной или вирусной инфекцией, неаллергическую астму, астму на ранней стадии, синдром бронхита новорожденных и бронхиолит, хроническую или острую бронхоконстрикцию, хронический бронхит, обструкцию малых дыхательных путей и эмфизему. Дополнительные примеры включают обструктивные или воспалительные заболевания дыхательных путей, такие как хроническая эозинофильная пневмония, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), COPD, которое включает хронический бронхит, эмфизему легких или диспноэ, ассоциированное с COPD или не ассоциированное с ним, COPD, которое характеризуется необратимой, прогрессирующей обструкцией дыхательных путей, и респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS).

Дополнительные примеры состояний, ассоциированных с воспалением легких включают состояния, родственные обострению повышенной реактивности дыхательных путей в результате терапии другим лекарственным средством, заболевание дыхательных путей, которое ассоциировано с легочной гипертензией, бронхит, такой как острый бронхит, острый гортанно-трахеальный бронхит, арахиновый бронхит, катаральный бронхит, крупозный бронхит, сухой бронхит, инфекционный астматический бронхит, продуктивный бронхит, вызываемый стафилококками или стрептококками бронхит и везикулярный бронхит, острое поражение легких и бронхоэктаз, такой как цилиндрический бронхоэктаз, мешотчатый бронхоэктаз, веретенообразный бронхоэктаз, капиллярный бронхоэктаз, кистозный бронхоэктаз, сухой бронхоэктаз и фолликулярный бронхоэктаз.

В частности, COPD относится к группе заболеваний легких, которые блокируют проходимость дыхательных путей и взывают все большее затруднение пораженным индивидуумам нормально дышать. Эмфизема и хронический бронхит представляют собой два основных состояния в группе заболеваний COPD, но COPD также может относиться к повреждению, вызываемому хроническим астматическим бронхитом наряду с другими состояниями, известными в данной области. В большинстве случаев поражение дыхательных путей в конечном итоге вызывает трудности обмена кислорода и диоксида углерода в легких. Виды стандартного лечения в основном сфокусированы на контроле симптомов и сведения к минимуму дальнейшего поражения.

Эмфизема представляет собой один из аспектов COPD. Эмфизема приводит к воспалению в хрупких стенках альвеол, которое может разрушать некоторые из стенок и эластичные волокна, приводя к спадению малых дыхательных путей при выдыхании и нарушению движения потока воздуха из легких. Признаки и симптомы эмфиземы включают, например, отдышку, в частности, во время физической активности, свистящее дыхание и стеснение в груди.

Хронический бронхит представляет собой другой аспект COPD. Хронический бронхит характеризуется постоянным кашлем и приводит к воспалению и сужению бронхиальных трубок. Это состояние также вызывает повышенную продукцию слизи, которая может дополнительно блокировать суженные трубки. Хронический бронхит возникает в основном у курильщиков, и, как правило, его устанавливают как кашель, который длиться в течение по меньшей мере трех месяцев в году в течение двух последующих лет. Признаки и симптомы хронического бронхита включают, например, необходимостью первым делом прочищать горло по утрам, особенно для курильщиков, хроническим кашлем, при котором образуется желтоватая мокрота, отдышкой на более поздних стадиях и частыми респираторными инфекциями. Как указано выше, COPD относится преимущественно к обструкции легких, обусловленной двумя указанными выше хроническими патологическими состояниями легких. Тем не менее многие индивидуумы с COPD страдают обоими такими состояниями.

Хронический астматический бронхит представляет собой другой аспект COPD, который, как правило, характеризуется хроническим бронхитом в сочетании с астмой (бронхоспазмом). Астма может возникать, когда воспаленные и инфицированные секреты раздражают гладкие мышцы в дыхательных путях. Симптомы являются сходными с симптомами хронического бронхита, а также включают периодические или даже ежесуточные эпизоды свистящего дыхания.

В определенных вариантах осуществления COPD также может включать аутоиммунный компонент. Например, легкое и T-клетки периферической крови у пациентов с тяжелой эмфиземой секретируют Thl-цитокины и хемокины при стимуляции пептидами эластина in vitro, и у таких пациентов выявляют повышенные уровни антитела к эластину по сравнению с контролями (см. Goswami et al., The Journal of Immunology, 178:130,41, 2007). Также аутоантитела IgG с авидностью к легочному эпителию, и потенциал опосредовать цитотоксичность преобладает у пациентов с COPD (см. Feghali-BostwiCk et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 177:156-63, 2008). Вследствие того, что аутореактивные иммунные ответы могут являться важными в этиологии этого заболевания, включая, например, аутореактивные ответы на аутоантигены, такие как эластин, которые могут играть роль при COPD, использование полипептидов AARS для десенсибилизации иммунных клеток к этим антигенам может уменьшать воспаление легких.

Как указано выше, определенные варианты осуществления относятся к использованию полипептидов HRS для десенсибилизации иммунных клеток к выбранным антигенам, включая аутоантигены и чужеродные антигены, раздражители, аллергены или возбудители инфекции, связанные с воспалением легких. Путем десенсибилизации таких иммунных клеток к выбранному антигену, полипептиды HRS могут снижать миграцию или рекрутинг этих клеток в легких, и, таким образом, снижать воспаление. Примеры иммунных клеток включают лимфоциты, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и гранулоциты, такие как нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Примеры антигенов включают без ограничения дым, такой как сигаретный дым, загрязнение воздуха, дым, такой как дым от сварки, пыль, включая пыль диоксида кремния и производственную пыль, такую как пыль, встречающуюся при добыче угля и добыче золота, химические вещества, такие как кадмий и изоцианаты. Также сюда входят известные аллергены и возбудители инфекции, такие как бактериальные и вирусные или антигены, включая липополисахарид (LPS), которые могут обострять COPD у чувствительных индивидуумов.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с желудочно-кишечной системой, включая воспаление, инфекции и злокачественную опухоль, ассоциированную с ротовой полостью, пищеводом, желудком, тонким кишечником, толстым кишечником и прямой кишкой. "Желудочно-кишечное воспаление", как используют в настоящем описании, относится к воспалению слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и включает острые и хронические воспалительные состояния. Острое воспаление, как правило, характеризуется кратковременным началом и инфильтрацией или миграцией нейтрофилов. Хроническое воспаление, как правило, характеризуется относительно более длительным периодом начала и инфильтрацией или миграцией мононуклеарных клеток. Хроническое воспаление также может, как правило, характеризоваться периодами спонтанной ремиссии и спонтанного рецидива.

Подразумевают, что "слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта" включает слизистую оболочку кишечника (включая тонкий кишечник и толстую кишку), прямой кишки, слизистую оболочку желудка (желудочную), ротовой полости и т.п. "Хроническое желудочно-кишечное воспаление" относится к воспалению слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, которое характеризуется относительно более длительным периодом начала, является продолжительным (например, от нескольких суток, недель, месяцев или лет до периода на протяжении всей жизни индивидуума), и часто является ассоциированным с инфильтрацией или миграцией мононуклеарных клеток и может быть дополнительно ассоциировано с периодами спонтанной ремиссии и спонтанного рецидива. "Состояния хронического желудочно-кишечного воспаления" (также обозначаемые как "хронические желудочно-кишечные воспалительные заболевания") с таким хроническим воспалением включают, но не ограничиваются ими, воспалительное заболевание кишечника (IBD), колит, индуцированный неблагоприятными факторами окружающей среды (например, желудочно-кишечное воспаление, ассоциированное со схемой лечения, такой как химиотерапия, лучевая терапия и т.п.), колит при состояниях, таких как хроническая грануломатозная болезнь (см., например, SChappi et al., ArCh. Dis. Child., 84:147-151, 2001), глютеиновая болезнь, целиакия (т.е. наследственное заболевание, при котором слизистая оболочка кишечника воспаляется в ответ на потребление белка, известного как глютен), пищевые аллергии, гастрит, инфекционный гастрит или энтероколит (например, хронический активный гастрит с инфекцией HeliCobaCter pylori) и другие формы желудочно-кишечного воспаления, вызываемые возбудителем инфекции, и другие сходные состояния.

Как используют в настоящем описании, "воспалительное заболевание кишечника" или "IBD" относится к любому из ряда заболеваний, характеризующихся воспалением всего или части кишечника. Примеры воспалительных заболеваний кишечника включают, но не ограничиваются ими, болезнь Крона и язвенный колит. Термин IBD включает псевдомембранозный колит, гемоколит, колит при гемолитико-уремическом синдроме, коллагенозный колит, ишемический колит, лучевой колит, индуцированный лекарственным средством и химически индуцированный колит, воспаление в отключенной кишке, язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, синдром повышенной раздражимости толстой кишки и болезнь Крона, и при болезни Крона все подтипы, включая активный, рефрактерный и фистулизирующий, и болезнь Крона. Таким образом, полипептиды HRS можно применять для лечения или ведения любых одного или более из этих состояний.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с сосудистой системой или сосудистым воспалением, таким как воспаление, ассоциированное с кровеносными сосудами и сердцем. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных с сосудистыми системами включают без ограничения миокардит, перикардит, окклюзионную болезнь, атеросклероз, инфаркт миокарда, тромбоз, аутоиммунную энтеропатию, кардиомиопатию, болезнь Кавасаки, ювенильный идиопатический артрит, гранулематоз Вегенера, артериит Такаясу, синдром Кавасаки, аутоиммунное заболевание, вызванное антителами к фактору VIII, некротизирующий васкулит мелких сосудов, микроскопический полиангиит, синдром Чарга-Стросса, малоиммунный фокальный некротизирующий гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит, антифосфолипидный синдром, индуцированную антителом сердечную недостаточность, тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунные реакции против сердечной мышцы при болезни Чагаса и аутоиммунные реакции против хелперных T-лимфоцитов. Также сюда входят эндокардит или инфекция клапанов сердца с распространением малых кластеров бактерией через кровоток, флебит или васкулит, воспаление одной или более вен и тромбофлебит, воспаление вен, связанное с тромбом. Тромбофлебит может возникать повторно в различных локализациях, и также его обозначают как мигрирующий флебит или мигрирующий тромбофлебит. Флебит может быть ассоциирован с различными причинами, такими как бактериальная инфекция, воздействие химическими средствами, такими как раздражающие или вызывающие нарывы растворы, физическая травма в результате пункции кожи, такой как движение канюли в вену во время введения, лекарственные средства, такие как целебрекс, оланзепин, антидепрессанты и другие, и злоупотребление спиртом. Определенные варианты осуществления могут относиться к лечению или ведению воспаления сердца, вызываемого любыми одной или более из острой ревматической лихорадки, врожденного токсоплазмоза, энтеровирусной внутриутробной инфекции, болезни Лайма и ревматической лихорадки.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с печенью или желчным пузырем, включая острое и хроническое воспаление печени и острый и хронический холецистит. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных с воспалением печени или желчного пузыря, включают без ограничения аутоиммунный гепатит, вирусный гепатит (например, вирус гепатита A, вирус гепатита B, вирус гепатита C, вирус гепатита D, вирус гепатита E, мононуклеоз, краснуху, вирус Эпштейна-Баррв и цитомегаловирус), другие причины гепатита, такие как тяжелая бактериальная инфекция, амебные инфекции, лекарственные препараты (например, агомелатин, аллопуринол, амитриптилин, амиодарон, азатиоприн, парацетамол, галотан, ибупрофен, индометацин, изониазид, рифампицин, пиразинамид, кетоконазол, лоратадин, метотрексат, метилдопа, миноциклин, нифедипин, нитрофурантоин, фенитоин, вальпроевая кислота, троглитазон, зидовудин), токсины (например, спирт, грибковые токсины) и нарушения обмена веществ (например, болезнь Вильсона, нарушение метаболизма меди в организме, гемохроматоз, нарушение метаболизма железа в организме, неалкогольный стеатогепатит, недостаточность альфа-1-антитрипсина). Дополнительные примеры включают заболевание неалкогольного ожирения печени, цирроз, такой как первичный биллиарный цирроз, обструктивную желтуху, ишемический гепатит и заболевание желчного пузыря.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с лимфатической/иммунной системой. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных с лимфатической/иммунной системой, включают без ограничения аутоиммунные заболевания, такие как болезнь Чагаса, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), болезнь Крона, дерматомиозит, сахарный диабет I типа, эндометриоз, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гнойный гидраденит, болезнь Кавасаки, IgA-нефропатию, (идиопатическую) тромбоцитопеническую пурпуру, интерстициальный цистит, красную волчанку, смешанное заболевание соединительной ткани, кольцевидную склеродермию, тяжелую миастению, нарколепсию, нейромиотонию, обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, псориаз, псориатический артрит, полимиозит, первичный биллиарный цирроз, ревматоидный артрит, шизофрению, склеродермию, синдром Шегрена, синдром скованного человека, височный артериит, язвенный колит, витилиго и гранулематоз Вегенера наряду с аутоиммунной гемолитической анемией и различными лимфаденопатиями.

Также рассматривают связанные с иммунитетом воспалительные состояния, ассоциированные с пересадкой трансплантата, ткани, клетки или органа, такие как отторжение трансплантата, хроническое отторжение трансплантата, подострое отторжение трансплантата, сверхострое отторжение трансплантата, острое отторжение трансплантата и реакция "трансплантат против хозяина". В определенных вариантах осуществления полипептиды AARS можно вводить донору трансплантата до или во время извлечения ткани. Для уменьшения связанных с воспалением осложнений терапии с трансплантацией в определенных вариантах осуществления полипептиды HRS можно вводить реципиенту трансплантата до, во время и/или после терапии с трансплантацией. Примеры видов терапии с трансплантацией включают трансплантацию костного мозга, стволовой клетки, периферической крови, печени, легкого, сердца, кожи и почки наряду с другими известными в данной области. Дополнительные примеры включают воспалительные состояния, ассоциированные с аллергиями, такие как астма, аллергическая сыпь, крапивница, аллергия на пыльцу, аллергия на клещей домашней пали, аллергия на яды, аллергия на косметические средства, аллергия на латекс, аллергия на химические вещества, аллергия на, лекарственные средства, аллергия на укусы насекомых, аллергия на перхоть животных, аллергия на ожоги от растений, аллергия на сумах ядовитый и пищевая аллергия.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с мочеполовой системой. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных с мочеполовой системой, включают без ограничения воспаления, инфекции или злокачественные опухоли мочеточника, мочевого пузыря, уретры, шейки матки, фаллопиев труб, яичников, матки, женских наружных половых органов, предстательной железы, бульбоуретральных желез, эпидидимиса, предстательной железы, семенных пузырьков, семенников или почек. Также включены аутоиммунный интерстициальный нефрит, почечный абсцесс (интраренальный или экстраренальный), острый простатит, гематурия, уретрит (например, хламидии и другие заболевания, передающиеся половым путем), воспалительное заболевание органов таза (PID) и абсцедирующий простатит. Также включен нефрит, ассоциированный с одним или более из гломерулонефритов, волчаночный нефрит, нефропатия, подагра, яды или химические вещества (например, простой эфир, сульфат таллия), определенные лекарственные препараты (например, пироксикам, кандил, гель фелден, фенсаид, пирокс), синдром Германа, желтая лихорадка, болезни иммунных комплексов, тифоидная лихорадка, стриктура уретры, туберкулез почки и постстрептококковый гломерулонефрит.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с скелетно-мышечной системой. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных со скелетно-мышечной системой, включают без ограничения артрит, такой как ревматоидный артрит и псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, аутоиммунный миозит, первичный синдром Шегрена, аутоиммунное заболевание гладких мышц, миозит, полимиозит, тендинит, воспаление связок, воспаление хрящей, воспаление суставов, синовиальное воспаление, синдром запястного канала, хроническое воспаление мышц и воспаление костей, включая воспаление костей, ассоциированное с остеопорозом и остеоартритом. Также включены синдром Титце, доброкачественная опухоль, болезненная безгнойный локализованный отек реберно-грудинных, грудино-ключичных или реберно-хрящевых суставов, реберный хондрит, синдром малой грудной мышцы, ксифоидалгия, самопроизвольный подвывих грудиноключичного сустава, грудинно-реберный-ключичный гиперостоз, фибромиалгия, тендинит или бурсит плеча, подагрический артрит, ревматическая полимиалгия, красная волчанка, костный нарост, переломы, такие как стрессовые переломы, кахексия, саркопения, мышечная слабость, заболевание, приводящее к мышечной атрофии, повреждение мышц, миалгия, спорадическая миопатия с тельцами включения, наследственная миопатия с тельцами включения и недостаточность саркогликана. Также включены мышечные дистрофии (например, DMD), миотоническая дистрофия, рабдомиолиз и другие воспалительные заболевания мышц, описываемые в настоящем описании.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с эндокринной системой. Примеры воспалительных состояний, ассоциированных с эндокринной системой, включают без ограничения воспаление, инфекцию или злокачественную опухоль, ассоциированные с гипоталамусом, гипофизом, щитовидной железой, поджелудочной железа или надпочечниками, эндокринное заболевание, такое как заболевание поджелудочное железы, диабет, такой как диабет I типа, заболевание щитовидной железы, болезнь Грейвса, тиреоидит, спонтанный аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, (идиопатическую) микседему, патологию яичников, обусловленная аутоиммунной реакцией, аутоиммунное бесплодие, обусловленное антителами против спермы, аутоиммунный простатит и аутоиммунный полигранулярный синдром 1 типа.

Определенные варианты осуществления относятся к уменьшению воспалительных ответов и состояний, ассоциированных с жировыми тканями, активными участниками в регуляции физиологических и патологических процессов, включая иммунное воспаление, а также воспалительные состояния, ассоциированные с липодистрофиями, ламинопатиями, болезнью Кавасаки, ювенильным идиопатическим артритом, болезнями лизосомного накопления и мукополисахаридозами.

Макрофаги представляют собой компоненты жировой ткани и активно участвуют в ее видах активности. Кроме того, взаимное влияние лимфоцитов и адипоцитов может приводить к иммунной регуляции. Жировая ткань продуцирует и выделяет ряд провоспалительных и противовоспалительных факторов, включая адипокины, лептин, адипонектин, резистин и висфатин, а также цитокины и хемокины, такие как TNF-альфа, IL-6, моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 и другие. Провоспалительные молекулы, продуцируемые жировой тканью, задействованы в качестве активных участников в развитии резистентности к инсулину и возникновении повышенного риска сердечно-сосудистого заболевания, ассоциированного с ожирением. В противоположность этому сниженные уровни лептина могут провоцировать повышенную восприимчивость к инфекции, обусловленной сниженными T-клеточными ответами у истощенных индивидуумов. Измененные уровни адипокина наблюдали при различных воспалительных состояниях (см., например, Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol., 115:911-19, 2005, и Berg et al., CirCulation ResearCh, 96:939, 2005).

Полипептиды HRS также можно применять для лечения или ведения воспаления, ассоциированного с гиперчувствительностью. Примеры таких состояний включают гиперчувствительность I типа, гиперчувствительность II типа, гиперчувствительность III типа, гиперчувствительность IV типа, гиперчувствительность немедленного типа, опосредованную антителом гиперчувствительность, опосредованную иммунными комплексами гиперчувствительность, опосредованную T-лимфоцитами гиперчувствительность и гиперчувствительность замедленного типа.

Полипептиды HRS также можно применять для лечения или ведения аутовоспалительных состояний. Примеры аутовоспалительных состояний включают семейную средиземноморскую лихорадку, периодический синдром, ассоциированный с рецептором TNF (TRAPS), гипер-IgD синдром (HIDS), связанные с геном CIASI заболевания, такие как синдром Макла-Уэльса, семейный холодовой аутовоспалительный синдром и мультисистемное воспалительное заболевание неонатального возраста, PAPA-синдром (гнойный стерильный артрит, гангренозная приодермия, акне) и синдром Блау.

Полипептиды HRS можно применять для лечения или ведения воспаления, ассоциированного с рядом злокачественных опухолей. Примеры таких злокачественных опухолей включают без ограничения рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак легких, рак яичника, рак яичка, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак печени, рак почки, злокачественную опухоль головного мозга, меланому, немеланомный рак кожи, злокачественную опухоль кости, лимфому, лейкоз, рак щитовидной железы, рак эндометрия, множественную миелому, острый миелолейкоз, нейробластому, глиобластому и неходжкинскую лимфому.

Как указано выше, в определенных вариантах осуществления можно применять полипептиды HRS для модулирования системного воспаления, такого как для уменьшения или ведения системного воспаления. В определенных вариантах осуществления системное воспаление может быть ассоциировано с синдромом системного воспалительного ответа (SIRS), воспалительным состоянием всего организма с рядом возможных причин. SIRS можно характеризовать или определять общепринятыми способами диагностики. В качестве одного из неограничивающих примеров SIRS можно идентифицировать по наличию двух или более из следующих показателей: (i) температура тела, которая составляет менее 36°C или более 38°C, (ii) частота сердечных сокращений, которая составляет более 90 ударов в минуту, (iii) тахипноэ (учащенное дыхание) с более чем 20 вдохов в минуту или парциальным давлением диоксида углерода в артериальной крови менее чем 4,3 кПа (32 мм рт. ст.), и (iv) общее количество лейкоцитов менее 4000 клеток/мм³ (4×10⁹ клеток/л) или более чем 12000 клеток/мм³ (12×10⁹ клеток/л), или наличие более 10% незрелых нейтрофилов (палочкоядерные нейтрофилы).

SIRS в широком смысле классифицируют как инфекционный или неинфекционный. В более обобщенном смысле инфекционный SIRS ассоциирован с сепсисом, воспалительным состоянием всего организма в сочетании с известной или предполагаемой инфекцией, которая включает бактериемию, вирусемию, паразитемию и синдром токсического шока. Сепсис может быть ассоциирован с широким спектром возбудителей инфекций, включая без ограничения, бактерии, такие как StreptoCoCCus agalaCtiae, EsCheriChia Coli, Haemophilus influenzae, Listeria monoCytogenes, коагулазонегативный стафилококк, StaphyloCoCCus aureus, виды Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, виды EnterobaCter, S. agalaCtiae, виды Serratia, виды ACinetobaCter, StreptoCoCCus pneumoniae, виды Salmonella и Neisseria meningitidis; вирусы, такие как вирус краснухи, цитомегаловирус, вирус простого герпеса и вирус ветрянки; паразитов, таких как при инфекции малярией (например, Plasmodium falCiparum), трипанозомоз и филяриоз, и грибы, такие как виды Candida, виды Aspergillus, виды Histoplasma, CryptoCoCCus neoformans, CoCCidioides immitis, BlastomyCes dermatitidis и PneumoCystis Carinii. В определенных случаях, когда инфекции легких (например, пневмония), мочевого пузыря и почек (например, инфекции мочевыводящих путей), кожи (например, панникулит), брюшной полости (например, аппендицит) и других отделов (например, менингит) могут распространяться и приводить к сепсису, можно использовать полипептиды HRS для модуляции воспаления, ассоциированного с любым этих возбудителей инфекции, независимо от того присутствует или отсутствует сепсис.

Неинфекционный SIRS может быть ассоциирован с травмой, ожогами, панкреатитом, ишемией, кровотечением, послеоперационными осложнениями, недостаточностью надпочечников, эмболией легких, аневризмом аорты, тампонадой сердца, анафилаксией и передозировкой лекарственными средствами наряду с другими. SIRS часто осложнен недостаточностью одного или более органов или системы органов, включая наряду с другими такие, как описывают в настоящем описании. Конкретные примеры включают острое повреждение легких, острое повреждение почки, шок и синдром полиорганной недостаточности. Как правило, SIRS лечат, сфокусировавшись на первичной проблеме (например, соответствующим восполнением жидкости при гиповолемии, IVF/NPO для панкреатита, эпинефрин/стероиды/бенадрил для анафилаксии). В определенных случаях продемонстрировано, что селен, глутамин и эйкозапентаеновая кислота являются эффективными для улучшения симптомов SIRS, а также полезными могут являться антиоксиданты, такие как витамин E. Таким образом, полипептиды HRS можно использовать для лечения или ведения SIRS и осложнений SIRS отдельно или в комбинации с другими видами терапии.

Системное воспаление также может быть ассоциировано с "цитокиновым штормом", опасной иммунной реакцией, обусловленной положительной обратной связью цитокинов и иммунных клеток, приводящей к очень сильно повышенным уровням различных цитокинов. В определенных случаях цитокиновый шторм (гиперцитокинемия) включает системное высвобождение многих известных воспалительных медиаторов, таких как цитокины, свободные радикалы кислорода и факторы свертывания). Также сюда входят повышенные уровни провоспалительных цитокинов, таких как TNF-альфа, IL-1 и IL-6, и противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10 и антагонист рецептора IL-1. Цитокиновые штормы могут возникать при ряде инфекционных и неинфекционных заболеваний, включая реакция "трансплантат против хозяина" (GVHD), острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), сепсис, птичий грипп, натуральную оспу и SIRS. Цитокиновый шторм также может быть индуцирован определенными лекарственными препаратами. Лечение включает OX40 IG, которые уменьшает T-клеточные ответы, ингибиторы ACE, блокаторы рецептора ангиотензина II, кортикостероиды, гемфиброзил, ловушки свободных радикалов и блокаторы TNF-α. Таким образом, полипептиды HRS можно применять для лечения или ведения цитокинового шторма отдельно или в комбинации с другими видами терапии.

В определенных вариантах осуществления можно применять полипептиды HRS для уменьшения любого одного или более из гранулематозного воспаления, фибринозного воспаления, гнойного воспаления, серозного воспаления или язвенного воспаления. Гранулематозное воспаление характеризуется образованием гранулем, как правило, в результате реакции на возбудителей инфекции, таких как туберкулез, лепра и сифилис. Фибринозное воспаление возникает в результате значительного увеличения проницаемости сосудов, которое позволяет фибрину проходить через кровеносные сосуды. Если присутствует соответствующий прокоагуляционный стимул, такой как злокачественная клетка, то скапливается фибринозный экссудат. Этот процесс главным образом наблюдают в серозных полостях, где может происходить преобразование фибринозного экссудата в рубец между серозными оболочками, ограничивая их функцию. Гнойное воспаление возникает в результате образования большого количества гноя, который состоит из нейтрофилов, погибших клеток и жидкости. Инфекция гнойными бактериями, такими как стафилококки, является характерным признаком такого типа воспаления. Большие локализованные накопления гноя, ограниченные окружающими тканями, называются абсцессами. Серозное воспаление характеризуется обильным экссудатом невязкой серозной жидкости, главным образом продуцируемой мезотелиальными клетками серозных оболочек, а также она может образовываться из плазмы крови. Примеры такого типа воспаления включают волдыри на коже. Язвенное воспаление, которое, как правило, возникает около эпителия, приводит к некротической потери ткани на поверхности, таким образом, открывая нижние слои ткани. Последующая экскавация эпителия известна как язва.

Полипептиды HRS также можно применять для лечения телесных повреждений или ран. Например, истирания, гематомы, порезы, колотые раны, разрывы, раны в результате удара, сотрясения, контузии, термические ожоги, отморожение, химические ожоги, солнечные ожоги, гангрена, некроз, обезвоживания, лучевые ожоги, радиоактивные ожоги, ингаляция дыма, разорванные мышцы, растянутые мышцы, разорванные сухожилия, растянутые сухожилия, растянутые связки, разорванные связки, перерастяжение, разорванный хрящ, переломы костей, защемление нервов, язвы и огнестрельные или другие травмирующие раны.

Полипептиды HRS также можно применять для лечения или ведения идиопатического воспаления или воспаления неизвестной этиологии. Также раскрыты способы комбинированного лечения, в которых один или более полипептидов AARS вводят или используют в комбинации с одним или более других видов терапии для любых воспалительных заболеваний или состояний, описываемых в настоящем описании, включая такие виды терапии, которые являются общепринято доступными и известными в данной области. Примеры способов комбинированного лечения включают использованием стандартных противовоспалительных средств, таких как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), иммуноселективные противовоспалительные производные (ImSAID) и стероиды (например, кортикостероиды), противоинфекционные средства, такие как антибиотики и противовирусные средства, антиоксиданты, цитокины, химиотерапевтические средства и другие виды терапии против злокачественных опухолей, и виды иммуносупрессивной терапии.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение в основном относится к способам и композициям для облегчения экстракорпорального удаления эндогенных антител с использованием полипептидов HRS, связанных с биосовместимой твердой подложкой.

Специфическое удаление циркулирующих антител посредством экстракорпоральной иммуноадсорбции с применением иммобилизованного антигена было описано различными исследователями. См. в основном Köhler et al., (2011) J. Clin. Apher., (6):347-55; Müller et al., (2012) Dermatology, 224(3):224-7; Koziolek et al., (2012) J. Neuroinflammation, 9(1):80; Bontadi et al., (2012) J. Clin. Apher., doi: 10,1002/jCa.21229; Westermann et al., (2012) J. Dermatol., 39(2):168-71. Кроме того такой подход успешно ввели в коммерческое обращение в виде жизнеспособной системы для специфического удаления циркулирующих антител, как видно на примере иммуноадсорбционных колонок, продаваемыми под товарными марками Prosorba®, Immunosorba®, поставляемыми Fresenius, St. Wendel, Germany, и Selesorb®, поставляемой Kaneka, Wiesbaden, Germany.

При экстракорпоральной иммуноадсорбции циркулирующие антитела экстракорпорально удаляют с использованием иммуноадсорбционной колонки, специфической для эндогенного антитела. Кровь у пациента получают непрерывно или с перерывами, разделяют на ее клеточные компоненты и плазму, и пропускают плазму через иммуноадсорбционное вещество для удаления антитела. Затем обработанную плазму и клеточные компоненты крови вливают повторно пациенту раздельно или одновременно. В некоторых вариантах осуществления экстракорпоральную иммуноадсорбцию по настоящему изобретению можно проводить непосредственно перед введением полипептида HRS.

Таким образом, определенные варианты осуществления относятся к способам экстракорпоральной иммуноадсорбции антител против гистидил-тРНК-синтетазы из внеклеточной жидкости организма, включающим этапы: (a) предоставления внеклеточной жидкости организма, которую получают у индивидуума, (b) приведения внеклеточной жидкости организма в контакт с биосовместимой твердой подложкой, содержащей по меньшей мере один связанный с ней полипептид HRS, таким образом захватывающей антитела к HRS, и (C) повторное вливание внеклеточной жидкости организма из этапа (b) индивидууму.

Также предусмотрены иммуноадсорбционные композиции для применения для удаления антител к HRS из жидкости организма индивидуума, содержащие биосовместимую твердую подложку, содержащую по меньшей мере один связанный с ней полипептид HRS.

Как правило, в любых из этих иммуноадсорбционных способов и композиций получают жидкости организма, обрабатывают и повторно вливают в стерильных условиях способами и с использованием систем, которые хорошо известны специалисту в данной области. Например, кровь отбирают иглой, которую вводят, например, в периферическую вену, и которая соединена посредством подходящей трубки с контейнером, содержащим биосовместимую твердую подложку, и повторно вливают пациенту через входную трубку, соединенную с иглой, введенной в другую вену. В ситуациях, когда у индивидуума отбирают большие объемы, кровь можно отбирать, например, из подключичной вены.

Кровь или плазму приводят в контакт с биосовместимой твердой подложкой в условиях, которые способствуют связыванию антител и полипептидов HRS, связанных с подложкой. Подходящие колонки и перфузионные системы для экстракорпоральной иммуноадсорбции являются коммерчески доступными, например, от Fresenius, St. Wendel, Germany. Как правило, используют температуры контактирования в диапазоне от 35°C приблизительно до 40°C. Время контактирования, как правило, находится в диапазоне приблизительно от 1 приблизительно до 6 часов. Затем несвязавшуюся часть крови или плазмы собирают для повторного введения пациенту, или ее можно повторно вводить непосредственно в непрерывном режиме. Для мониторинга эффективности способа можно наблюдать за титром антител к Jo-1 индивидуума посредством иммунологического анализа до и /или после проведения способа.

Необязательно можно добавлять антикоагулянтное вещество, такое как цитрат натрия, гепарин или декстран, в кровь, когда ее отбирают из организма, для предотвращения коагуляции крови. Декстран снижает вязкость крови и в комбинации с добавлением физиологического раствора обеспечивает увеличенное расстояние между клетками крови и тромбоцитами крови. Такие антикоагулянты можно добавлять в количествах достаточных для отсутствия коагуляции крови. Перед повторным введением обработанной крови индивидууму можно снижать антикоагуляционное действие, например, гепарина, добавлением подходящего количества гепариназы, протамина и/или витамина K и т.д.

Для снижения риска эмболии можно предпринимать превентивные меры для предотвращения поступления частиц адсорбционной среды пациенту после повторного вливания. Таким образом, устройство улавливания частиц, как правило, применяют после контейнера с адсорбционной средой для удаления каких-либо остаточных частиц из оставшейся жидкости организма перед тем, как ее вводят пациенту. Устройство для улавливания частиц может представлять собой фильтр или сито с размером отверстий, который обеспечивает удержание любого содержащего частицы вещества адсорбционной среды, при этом позволяет неадсорбированным веществам жидкости организма проходить. Экстракорпоральную перфузию крови можно проводить непрерывно или, альтернативно, у пациента можно отбирать определенные объемы крови, обрабатывать, как описано выше, и обработанную плазму и клеточные компоненты крови повторно вводить пациента после того, как завершают обработку.

Широкий спектр веществ является подходящим в качестве биосовместимых твердых подложек для применения в любых таких иммуноадсорбционных способах и композициях, и предпочтительно матрица подложки является механически прочной, достаточно гидрофильной, чтобы предотвращать неспецифическое связывание белков, стабильной и совместимой с кровью и другими водными растворами. Подходящие биологически совместимые вещества матрицы включают, например, синтетические и природные полимеры, полисахариды, полиамиды, стеклянные гранулы, диоксид кремния в виде частиц, пористое стекло, диоксид кремния, смолы, синтетические матрицы, включая производные акриламида, производные метиакриламида или производные полистирола и т.д. в различных формах, включая гранулы, волокнистую форму, пластины или полые волокна.

Иллюстративные полимеры включают природные и синтетические полисахариды и другие полимеры на основе углеводов, включая агар, альгинат, каррагенан, гуаровую камедь, гуммиарабик, камедь гхатти, трагакантовую камедь, камедь карайи, камедь плодов рожкового дерева, ксантановую камедь, агарозы, целлюлозы, пектины, муцины, декстраны, крахмалы, гепарины, хитозаны, гидроксикрахмалы, гидроксипропилкрахмалы, карбоксиметилкрахмалы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Синтетические органические полимеры и мономеры, образующие полимеры, включая акриловые полимеры, полиамиды, полиимиды, сложные полиэфиры, простые полиэфиры, виниловые полимерные соединения, полиалкены и их замещенные производные, а также сополимеры, содержащие более одной такой полимерной функциональной группы, и их замещенные производные и их смеси.

В любых таких экстракорпоральных способах и композициях полипептиды HRS, как правило, являются ковалентно связанными с биосовместимой твердой подложкой, и стандартные способы связывания белков, таких как полипептиды HRS, хорошо известны специалистам в данной области (см. например, Affinity Chromatography, PrinCiples and Methods (PharmaCla-LKB), Dean P.G. et al., eds., 1985, Affinity Chromatography: A praCtiCal approaCh, IRL Press, Oxford, и SCouten W.H., 1981, Affinity Chromatography, Wiley IntersClenCe, New York), "Immobilized Affinity Ligand TeChniques" Hermanson et al., ACademiC Press, InC., San Diego, 1992). Биосовместимую твердую подложку можно подвергать дериватизации (активации) с образованием реакционноспособного вещества, которое может взаимодействовать с одной или более функциональных химических групп в полипептиде HRS, таким образом, образуя химическую ковалентную связь для связывания полипептида HRS с биосовместимой твердой подложкой. Таким образом, вещества, содержащие гидроксильную, амино, амидную, карбоксильную или тиольную группы можно активировать или подвергать дериватизации с использованием различных активирующих химических веществ, например, химических веществ, таких как бромистый циан, дивинилсульфон, эпихлоргидрин, бисэпоксираны, дибромпропанол, глутаровый диальдегид, карбодиимиды, ангидриды, гидразины, периодаты, бензохиноны, триазины, тозилаты, трезилаты и/или ионы диазония, и т.д.

Конкретные иллюстративные активированные биосовместимые твердые подложки для применения в любых из этих способов и композиций включает, например, CNBr-сефарозу, целлюлозы, такие как CNBr-активированная сефароза 4B (Amersham) или эпоксиактивированную агарозу (Sigma). Можно применять биосовместимые спейсеры (такие как, например, NHS-активированная сефароза 4 Fast Flow) или без них (такие как, например, CNBr-активированная сефароза 4B), и они являются коммерчески доступными, и способы связывания таких веществ с полипептидами HRS хорошо известны в данной области, и их можно оптимизировать общепринятым экспериментированием на основании рекомендаций производителя.

Подходящие полипептиды HRS для применения в любых из этих экстракорпоральных способах и композициях включают любые из полипептидов HRS, перечисленные в или получаемые из таблиц 1-9, или любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, распознаваемый антителом к Jo-1. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS выбран из полноразмерной HRS, HRS(1-506), HRS(2-506) и HRS(1-60).

Получаемые из гистидил-тРНК-синтетазы полипептиды

Варианты осуществления настоящего изобретения в основном относятся к использованию получаемых из гистидил-тРНК-синтетазы полипептидов (полипептидов HRS), например, в качестве противовоспалительных средств, блокирующих антитело и/или иммунорегуляторных средств или замещающих белков. Гистидил-тРНК-синтетазы принадлежат к семейству тРНК-синтетаз II класса, которые содержат три мотива с высококонсервативными последовательностями. тРНК-синтетазы I и II класса широко известны как ответственные за специфическое прикрепление аминокислоты к ее родственной тРНК в 2-стадийной реакции: аминокислота (AA) сначала активируется АТФ с образованием AA-АМФ, а затем переносится на акцепторный конец тРНК. Цитозольные полноразмерные гистидил-тРНК-синтетазы, как правил, существуют в виде цитозольного гомодимера или митохондриальной формы альтернативного сплайсинга.

В последнее время было установлено, что некоторые биологические фрагменты или изоформы альтернативного сплайсинга гистидил-тРНК-синтетаз эукариотов (физиокрины или полипептиды HRS), или в некоторых контекстах интактная синтетаза, модулируют определенные пути передачи сигнала в клетки или обладают противовоспалительными свойствами. Такие виды активности, которые отличаются от классической роли тРНК-синтетаз в синтезе белка, совместно обозначают в настоящем описании как "неканонические виды активности". Такие физиокрины могут образовываться естественным путем альтернативным сплайсингом или протеолизом, и могут действовать клеточно-автономным образом (например, в клетке-хозяине) или неклеточно-автономным образом (например, вне клетки-хозяина) для регуляции различных механизмов гомеостаза. Например, как предоставлено в настоящем изобретении, полипептиды HRS, такие как N-концевой фрагмент гистидил-тРНК-синтетазы (например, HRS(1-48), HRS(1-60)), в числе прочего способны вызывать противовоспалительный сигнал, блокируя миграцию воспалительных клеток в участки активного воспаления in vivo. Кроме того, определенные мутации или делеции (например, HRS(1-506)) относительно последовательности полноразмерного полипептида HRS обладают повышенной активностью и/или улучшенными фармакологическими свойствами, стабильностью и/или гомогенностью по сравнению с гистидил-тРНК-синтетазой дикого типа. Последовательности определенных иллюстративных полипептидов HRS приведены в таблице D1.

Таблица D1
Иллюстративные полипептиды HRS Название Тип/Вид/
Остатки Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: N-концевые физиокрины Полноразмерные цитозольные дикого типа Белок/
Человек/ MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 1 полноразмерные митохондриальные дикого типа Белок/
Человек/ MPLLGLLPRRAWASLLSQLLRPPCASCTGAVRCQSQVAEAVLTSQLKAHQEKPNFIIKTPKGTRDLSPQHMVVREKILDLVISCFKRHGAKGMDTPAFELKETLTEKYGEDSGLMYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKVKKMKRYHVGKVWRRESPTIVQGRYREFCQCDFDIAGQFDPMIPDAECLKIMCEILSGLQLGDFLIKVNDRRIVDGMFAVCGVPESKFRAICSSIDKLDKMAWKDVRHEMVVKKGLAPEVADRIGDYVQCHGGVSLVEQMFQDPRLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIADKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPTQAGEEPLNVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGHKVPCVGLSIGVERIFYIVEQRMKTKGEKVRTTETQVFVATPQKNFLQERLKLIAELWDSGIKAEMLYKNNPKLLTQLHYCESTGIPLVVIIGEQELKEGVIKIRSVASREEVAIKRENFVAEIQKRLSES 39 HisRS1^N1 Белок/
Человек/
1-141 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAM 2

HisRS1^N2 Белок/
Человек/
1-408 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTE 3 HisRS1^N3 Белок/
Человек/
1-113 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKL 4 HisRS1^N4
(резокин; SV9;
HRS(1-60)) Белок/
Человек/
1-60 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPK 5 HisRS1^N5 Белок/
Человек/
1243+
27aa MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVGYPWWNSCSRILNYPKTSRPWRAWET 6

С-концевые физиокрины Название Тип/Вид/Остатки Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: HisRS1^C1 Белок/
Человек/
405-509 RTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 7 HisRS1^C2 Белок/
Человек/
1-60 + 175-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 8 HisRS1^C3 Белок/
Человек/
1-60 + 211-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 9

HisRS1^C4 Белок/
Человек/
1-100 + 211-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 10 HisRS1^C5 Белок/
Человек/
1-174+
211-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 11 HisRS1^C6 Белок/
Человек/
1-60+
101-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 12

HisRS1^C7 Белок/
Человек/
1-100+
175-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 13 HisRS1^C8 Белок/
Человек/
1-60+
399-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 14 HisRS1^C9 Белок/
Человек/
1-100+
399-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 15 HisRS1^C10 Белок/
Человек/
369-509 MFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 16 Внутренние физиокрины Название Тип/Вид/
Остатки Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: HisRS1^I1 Белок/
Человек/
191-333 CLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTG 17

Были секвенированы различные природные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) гистидил-тРНК-синтетазы и природные варианты гена человека, и в данной области известно, что они являются по меньшей мере частично функционально взаимозаменяемыми. Некоторые такие варианты гистидил-тРНК-синтетаз (т.е. характерные SNP гистидил-тРНК-синтетазы) представлены в таблице D2.

Таблица D2
SNP гистидил-тРНК-синтетазы человека Номер доступа банка генов Замена нуклеотида Номер доступа банка генов Замена нуклеотида rs193103291 A/G rs186312047 A/G rs192923161 C/T rs186176857 C/T rs192784934 A/G rs186043734 C/G rs192164884 A/G rs185867584 C/T rs192090865 A/C rs185828130 A/G rs192015101 A/T rs185537686 A/G rs191999492 A/G rs185440931 C/T rs191852363 C/T rs185100584 A/C rs191532032 A/T rs185077558 C/T rs191391414 C/T rs184748736 C/G rs191385862 A/G rs184591417 C/T rs191205977 A/G rs184400035 C/G rs191104160 A/G rs184098206 C/T rs190989313 C/G rs183982931 C/T rs190818970 A/T rs183942045 A/G rs190476138 C/T rs183854085 A/G rs190289555 C/T rs183430882 G/T rs190065567 A/G rs183419967 A/C rs189624055 C/T rs183366286 A/G rs189563577 G/T rs183084050 C/T rs189404434 A/G rs182948878 C/T rs189268935 A/G rs182813126 A/G rs189103453 A/T rs182498374 A/G

rs188839103 A/G rs182161259 A/T rs188766717 A/G rs182119902 C/T rs188705391 A/G rs182106891 C/T rs188490030 A/G rs181930530 A/G rs188345926 C/T rs181819577 A/G rs188174426 A/G rs181706697 C/T rs187897435 C/T rs181400061 G/T rs187880261 A/G rs181240610 G/T rs187729939 G/T rs181150977 A/C rs187617985 A/T rs180848617 A/G rs187344319 C/T rs180765564 A/G rs187136933 C/T rs151330569 C/G rs186823043 C/G rs151258227 C/T rs186764765 C/T rs151174822 C/T rs186663247 A/G rs150874684 C/T rs186526524 A/G rs150589670 A/G rs150274370 C/T rs145059663 C/T rs150090766 A/G rs144588417 C/T rs149977222 A/G rs144457474 A/G rs149821411 C/T rs144322728 C/T rs149542384 A/G rs143897456 -/C rs149336018 C/G rs143569397 G/T rs149283940 C/T rs143476664 C/T rs149259830 C/T rs143473232 C/G rs149241235 C/T rs143436373 G/T rs149018062 C/T rs143166254 A/G rs148935291 C/T rs143011702 C/G rs148921342 -/A rs142994969 A/G rs148614030 C/T rs142880704 A/G rs148584540 C/T rs142630342 A/G rs148532075 A/C rs142522782 -/AAAC rs148516171 C/T rs142443502 C/T rs148394305 -/AA rs142305093 C/T rs148267541 C/T rs142289599 A/G

rs148213958 C/T rs142088963 A/C rs147637634 A/G rs141765732 A/C rs147372931 A/C/G rs141386881 A/T rs147350096 A/C rs141291994 A/G rs147288996 C/T rs141285041 C/T rs147194882 G/T rs141220649 C/T rs147185134 C/T rs141147961 -/C rs147172925 A/G rs141123446 -/A rs147011612 C/T rs140516034 A/G rs147001782 A/G rs140169815 C/T rs146922029 C/T rs140005970 G/T rs146835587 A/G rs139699964 C/T rs146820726 C/T rs139555499 A/G rs146801682 C/T rs139447495 C/T rs146571500 G/T rs139364834 -/A rs146560255 C/T rs139362540 A/G rs146205151 -/A rs139300653 -/A rs146159952 A/G rs139251223 A/G rs145532449 C/G rs139145072 A/G rs145446993 A/G rs138612783 A/G rs145112012 G/T rs138582560 A/G rs138414368 A/G rs111863295 C/T rs138377835 A/G rs111519226 C/G rs138300828 C/T rs111314092 C/T rs138067637 C/T rs80074170 A/T rs138035024 A/G rs79408883 A/C rs137973748 C/G rs78741041 G/T rs137917558 A/G rs78677246 A/T rs117912126 A/T rs78299006 A/G rs117579809 G/T rs78085183 A/T rs116730458 C/T rs77844754 C/T rs116411189 A/C rs77585983 A/T rs116339664 C/T rs77576083 A/G rs116203404 A/T rs77154058 G/T

rs115091892 G/T rs76999025 A/G rs114970855 A/G rs76496151 C/T rs114176478 A/G rs76471225 G/T rs113992989 C/T rs76085408 G/T rs113720830 C/T rs75409415 A/G rs113713558 A/C rs75397255 C/G rs113627177 G/T rs74336073 A/G rs113489608 A/C rs73791750 C/T rs113408729 G/T rs73791749 A/T rs113255561 A/G rs73791748 C/T rs113249111 C/T rs73791747 A/T rs113209109 A/G rs73273304 C/T rs113066628 G/T rs73271596 C/T rs112967222 C/T rs73271594 C/T rs112957918 A/T rs73271591 A/G rs112859141 A/G rs73271586 A/T rs112769834 C/G rs73271585 A/G rs112769758 A/C rs73271584 A/G rs112701444 A/C rs73271581 C/T rs112585944 A/G rs73271578 A/T rs112439761 A/G rs72800925 G/T rs112427345 A/C rs72800924 C/T rs112265354 C/T rs72800922 A/T rs112113896 C/G rs72432753 -/A rs112033118 C/T rs72427948 -/A rs112029988 A/G rs72388191 -/A rs72317985 -/A rs6873628 C/T rs71583608 G/T rs5871749 -/C rs67251579 -/A rs4334930 A/T rs67180750 -/A rs3887397 A/G rs63429961 A/T rs3776130 A/C rs61093427 C/T rs3776129 C/T rs61059042 -/A rs3776128 A/G rs60936249 -/AA rs3177856 A/C

rs60916571 -/A rs2563307 A/G rs59925457 C/T rs2563306 A/G rs59702263 -/A rs2563305 C/T rs58302597 C/T rs2563304 A/G rs57408905 A/T rs2530242 C/G rs35790592 A/C rs2530241 A/G rs35609344 -/A rs2530240 A/G rs35559471 -/A rs2530239 A/G rs35217222 -/C rs2530235 A/C rs34903998 -/A rs2230361 C/T rs34790864 C/G rs2073512 C/T rs34732372 C/T rs1131046 C/T rs34291233 -/C rs1131045 C/G rs34246519 -/T rs1131044 C/T rs34176495 -/C rs1131043 C/G rs13359823 A/G rs1131042 A/C rs13180544 A/C rs1131041 C/G rs12653992 A/C rs1131040 A/G rs12652092 A/G rs1131039 C/T rs11954514 A/C rs1131038 A/G rs11745372 C/T rs1131037 A/G rs11548125 A/G rs1131036 A/G rs11548124 C/G rs1131035 C/T rs11344157 -/C rs1131034 A/G rs11336085 -/A rs1131033 A/G rs11318345 -/A rs1131032 A/G rs11309606 -/A rs1089305 A/G rs10713463 -/A rs1089304 A/C rs7706544 C/T rs1065342 A/C rs7701545 A/T rs1050252 C/T rs6880190 C/T rs1050251 A/T rs1050250 A/G rs145769024 -/AAACAAAACAAAACA (SEQ ID NO: 154) rs1050249 C/T rs10534452 -/AAAAC

rs1050248 A/C/T rs10534451 -/AAACAAAACA
(SEQ ID NO: 155) rs1050247 C/T rs59554063 -/CAAAACAAAA
(SEQ ID NO: 156) rs1050246 C/G rs58606188 -/CAAAACAAAACAAAA (SEQ ID NO: 157) rs1050245 C/T rs71835204 (LARGEDELETION)/- rs1050222 C/T rs71766955 (LARGEDELETION)/- rs813897 A/G rs144998196 -/AAACAAAACA
(SEQ ID NO: 158) rs812381 C/G rs68038188 -/ACAAAACAAA
(SEQ ID NO: 159) rs811382 C/T rs71980275 -/AAAAC rs801189 C/T rs71848069 -/AAAC rs801188 A/C rs60987104 -/AAAC rs801187 A/T rs801185 C/T rs801186 A/G rs702396 C/G

Дополнительно существуют гомологи и ортологи гена человека в других видах, как перечислено в таблице D3, и, таким образом, общепринято можно выбирать природную аминокислоту или вариант нуклеотида, содержащиеся в SNP или другой природный гомолог вместо любых последовательностей полипептида HRS человека, перечисленных в таблицах D1, D4-D6 или D8.

Таблица D3
Гомологи гистидил-тРНК-синтетазы человека Тип/Вид/Остатки Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: Mus musCulus MADRAALEELVRLQGAHVRGLKEQKASAEQIEEEVTKLLKLKAQLGQDEGKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGNFLVKVNDRRILDGMFAVCGVPDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQAVEGLGDLKLLFEYLILFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQMPTQAGEEPLGVGSIAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEAS EEKVRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYWEEAGIPLVAIIGEQELRDGVIKLRSVASREEVDVRREDLVEEIRRRTNQPLSTC 18 Canis lupus familiaris MAERAALEELVRLQGERVRGLKQQKASAEQIEEEVAKLLKLKAQLGPDEGKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIISCFKRHGAEVIDTPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQFDPMIPDAECLEIMCEILR SLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVPDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADHIGDYVQQHGGISLVEQLLQDPELSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIADKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPVQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEATEEKVRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWNAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVASREEVDVPREDLVEEIKRRTSQPFCIC 19

Bos taurus MADRAALEDLVRVQGERVRGLKQQKASAEQIEEEVAKLLKLKAQLGPDEGKPKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIISCFKRHGAEVIDTPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQFDPMLPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVPDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIADKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQPPARAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKVRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLISELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEETGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVASREEVDVR REDLVEEIKR RTSQPLCIC 20 Rattus norvegiCus MADRAALEELVRLQGAHVRGLKEQKASAEQIEEEVTKLLKLKAQLGHDEGKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGNFQVKVNDRRILDGMFAVCGVPDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQAVEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQMPTQAGEEPLGVGSIAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQKLEASEEKVRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLISELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGI PLVAIIGEQE LKDGVIKLRSVTSREEVDVR REDLVEEIRR RTSQPLSM 21 Gallus gallus MADEAAVRQQAEVVRRLKQDKAEPDEIAKEVAKLLEMKAHLGGDEGKHKFVLKTPKGTRDYGPKQMAIRERVFSAIIACFKRHGAEVIDTPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKITNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQFDPMIPDAECLKIVQEILSDLQLGDFLIKVNDRRILDGMFAVCGVPDSKFRTICSSVDKLDKMPWEEVRNEMVGEKGLSPEAADRIGEYVQLHGGMDLIEQLLQDPKLSQNKLVKEGLGDMKLLFEYLTLFGITGKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQQNDHGEESVSVGSVAGGGRYDGLVGMFDPKGR KVPCVGISIGIERIFSILEQRVEASEEKIR TTETQVLVASAQKKLLEERLKLISELWDAGIKAEVLYKKNPKLLNQLQYCEDTGIPLVAIVGEQELKDGVVKLRVVATGEEVNIRRESLVEEIRRRTNQL 22

Danio rerio MAALGLVSMRLCAGLMGRRSAVRLHSLRVCSGMTISQIDEEVARLLQLKAQLGGDEGKHVFVLKTAKGTRDYNPKQMAIREKVFNIIINCFKRHGAETIDSPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKITNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQYDAMIPDAECLKLVYEILSELDLGDFRIKVNDRRILDGMFAICGVPDEKFRTICSTVDKLDKLAWEEVKKEMVNEKGLSEEVADRIRDYVSMQGGKDLAERLLQDPKLSQSKQACAGITDMKLLFSYLELFQITDKVVFDLSLARGLDYYTGVIYEAILTQANPAPASTPAEQNGAEDAGVSVGSVAGGGRYDGLVGMFDPKAGKCPVWGSALALRGSSPSWSRRQSCLQRRCAPLKLKCLWLQHRRTF 23

Таким образом, в любых из способов, диагностических композиций, терапевтических композиций и наборов по изобретению термины "полипептид HRS", "белок HRS" или "белковый фрагмент HRS" включает все природные и синтетические формы гистидил-тРНК-синтетазы, которые содержат по меньшей мере один эпитоп, который в значительной степени дает перекрестную реакцию с аутоантителом или аутореактивной T-клеткой при заболевании, ассоциированном с аутоантителами к гистидил-тРНК-синтетазе, или обладают неканонической активностью. Такие полипептиды HRS включают полноразмерный белок человека, а также пептиды HRS, получаемые из полноразмерного белка, приведенного в таблице D1, а также природные и другие варианты, например, как описано или как можно получать из таблиц D2-D9. В некоторых вариантах осуществления термин полипептид HRS относится к полипептидной последовательности, получаемой из гистидил-тРНК-синтетаза человека (SEQ ID NO: 1 в таблице D1), длиной приблизительно от 50 приблизительно до 250 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS значительно не конкурирует за связывание ассоциированного с заболеванием аутоантитела с гистидил-тРНК-синтетазой дикого типа в конкурентном C ELISA до концентрации приблизительно от 1 до 5×10^-7M или выше. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает меньшей аффинностью к ассоциированному с заболеванием аутоантителу чем гистидил-тРНК-синтетаза дикого типа (SEQ ID NO: 1), как измеряют в конкурентном ELISA. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает кажущейся аффинностью к ассоциированному с заболеванием аутоантителу, которая является по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 20 раз меньше, или по меньшей мере приблизительно в 50 раз меньше, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньше чем аффинность ассоциированного с заболеванием аутоантитела к гистидил-тРНК-синтетазе человека дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Модифицированные полипептиды HRS и варианты полипептидов HRS

Таким образом, все такие гомологи, ортологи и природные или синтетические изоформы гистидил-тРНК-синтетазы (например, любой из белков или их соответствующих нуклеиновых кислот, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них) входят в любой из способов наборов и композиций по изобретению. В некоторых аспектах такие полипептиды HRS сохраняют по меньшей мере один эпитоп, который дает специфическую перекрестную реакцию с аутоантителом или аутореактивной T-клеткой от индивидуума с заболеванием, ассоциированными с аутоантителами к гистидил-тРНК-синтетазе, и/или обладают неканонической активностью. Полипептиды HRS могут находиться в своей нативной форме, например, в виде различных вариантов, как они встречаются в природе у различных видов, которые можно рассматривать как функционально эквивалентные варианты гистидил-тРНК синтетазы человека, или они могут представлять собой их функционально эквивалентные природные производные, которые могут различаться по аминокислотной последовательности, например, в результате усечения (например, с N- или C-конца или обоих) или делеций других аминокислот, добавок, вставок, замен или посттрансляционных модификаций. Природные химические производные, включая посттрансляционные модификации и продукты разрушения любого полипептида HRS также конкретно включены в любые из способов и композиций по изобретению, включая, например, пироглутамильные, изоаспартильные, портеолитические, фосфорилированные, гликозилированные, окисленные, изомеризованные и дезаминированные варианты полипептида HRS. Полипептиды HRS также могут состоять из природных аминокислот и/или неприродных аминокислот, как описано в настоящем описании.

В дополнение к пептидам, состоящим только из природных аминокислот, также предоставлены пептидомиметики или аналоги пептидов. Аналоги пептидов широко используют в фармацевтической промышленности в качестве непептидых лекарственных средств со свойствами аналогичными свойствам матричного пептида. Такие типы непептидного соединения называются "миметикими пептидов" или "пептидомиметикими" (Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd Ed., Harwood ACademiC Publishers (1996); JoaChim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); FauChere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS, p. 392 (1985), и Evans et al., J. Med. Chem., 30:229 (1987)). Пептидомиметик представляет собой молекулу, которая имитирует биологическую активность пептида, но не является больше пептидной по своей природе. Соединения пептидомиметиков известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 6245886. В определенных вариантах осуществления полипептиды HRS могут частично или полностью состоять из D-аминокислот, например, для повышения устойчивости к деградации белка in vivo (см., например, Wade et al., PNAS USA, 87:4761-4765, 1990; Hayry et al., FASEB Journal., 9:1336-44, 1995; Van Regenmortel and Muller, Curr. Opin. BioteChol., 9:377-82, 1998; Navab et al., CirCulation., 105:290-292, 2002; Tugyi et al., PNAS USA, 102:412-418, 2005, и заявку США № 2004/00086988; Taylor et al., BioChemistry, 49:3261-72, 2010 для retro-inverso-D-пептидов и Dedkova et al., BioChemistry, 45:15541-51, 2006 для модифицированных бактериальных рибосом, которые способны продуцировать рекомбинантные белки с встроенными D-аминокислотами).

В данной области известно как синтетически модифицировать последовательности белков или пептидов, при этом сохраняя их пригодную активность, и это можно получать способами, которые являются стандартными в данной области и широко описаны в литературе, например, случайный или сайт-специфический мутагенез, расщепление и лигирование нуклеиновых кислот, или путем химического синтеза или модификации аминокислот или полипептидных цепей. Аналогично, специалистам в данной области известно, как решать и/или уменьшать риск иммуногенности, если он возникает при использовании полипептида HRS или его варианта, например, с использованием автоматической программы распознавания для идентификации потенциальных T-клеточных эпитопов и подходов направленной эволюции для идентификации менее иммуногенных форм.

Как указано выше, варианты осуществления настоящего изобретения включают все гомологи, ортологи и природные изоформы гистидил-тРНК-синтетазы (например, любого из белков, перечисленных или получаемых из таблиц D1-D9, или их соответствующих нуклеиновых кислот), и "варианты" таких эталонных полипептидов HRS. Перечисление "вариант" полипептида относится к полипептидам, которые отличаются от эталонного полипептида HRS в результате добавления, делеции и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, и которые, как правило, сохраняют (например, имитируют) или модулируют (например, антагонизируют) один или более видов неканонической активности эталонного полипептида HRS. Варианты также включают полипептиды, которые модифицировали добавлением, делецией и/или заменой по меньшей мере одного аминокислотного остатка, чтобы они обладали улучшенной стабильностью или другими фармацевтическими свойствами.

В определенных вариантах осуществления вариант полипептида отличается от эталонного полипептида одной или более замен, которые могут являться консервативными или неконсервативными, как описано в настоящем описании и известно в данной области. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида содержит консервативные замены и в этом отношении в данной области хорошо понятно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены на другие с в значительной степени аналогичными свойствами без изменения природы активности полипептида.

Конкретные примеры вариантов полипептида HRS, пригодных в любых из способов и композиций по изобретению, включают полноразмерные полипептиды HRS или их усеченные формы или варианты сплайсинга (например, любого из белков, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них), которые i) сохраняют детектируемую неканоническую активность и/или сохраняют по меньшей мере один эпитоп, который дает специфическую перекрестную реакцию с аутоантителом или аутореактивной T-клеткой от индивидуума с заболеванием, ассоциированным с аутоантителам к гистидил-тРНК-синтетазе, и ii) содержат одну или более дополнительных вставок, замен, делеций и/или усечений аминокислот. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или более идентичностью или сходством последовательности с соответствующей последовательностью эталонного полипептида HRS, как описано в настоящем описании, (например, SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 или любым из белков, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них), и по существу сохраняет неканоническую активность такого эталонного полипептида. Также включены последовательности, отличающиеся от эталонных последовательностей HRS вставкой, делецией или заменой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или более аминокислот, но которые сохраняют свойства эталонного полипептида HRS. В определенных вариантах осуществления добавления или делеции аминокислот происходят на C-конце и/или N-конце эталонного полипептида HRS. В определенных вариантах осуществления добавления аминокислот включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более остатков дикого типа (например, из соответствующего полноразмерного полипептида HRS), которые являются ближайшими к C-концу и/или N-концу эталонного полипептида HRS.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды HRS содержит полипептидный фрагмент полноразмерной гистидил-тРНК-синтетазы приблизительно от 50 до 250 аминокислот, который содержит, состоит или по существу состоит из аминокислот последовательности полипептида HRS, указанной в одной или более из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182, или любого из белков, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит, состоит или по существу состоит из остатков 1-141, 1-408, 1-113 или 1-60 SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах полипептид HRS представляет собой вариант сплайсинга, который содержит, состоит или по существу состоит из остатков 1-60+175-509, 1-60+211-509 или 1-60+101-509 SEQ ID NO: 1. В конкретных аспектах полипептид HRS содержит, состоит или по существу состоит из остатков 1-48 или 1-506 SEQ ID NO: 1.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS по изобретению содержит минимальный активный фрагмент полноразмерного полипептида HRS, способный модулировать противовоспалительную активность in vivo, или обладающий видами активности, блокирующей антитело или аутореактивную T-клетку. В некоторых аспектах такой минимальный активный фрагмент содержит или по существу состоит из домена WHEP, (например, приблизительно аминокислот 1-43 SEQ ID NO: 1). В некоторых аспектах минимальный активный фрагмент содержит или по существу состоит из домена аминоацилирования, (например, приблизительно аминокислоты 54-398 SEQ ID NO: 1). В некоторых аспектах минимальный активный фрагмент содержит или по существу состоит из антикодон-связывающего домена (например, приблизительно аминокислоты 406-501 SEQ ID NO: 1). Другие иллюстративные активные фрагменты продемонстрированы в таблице D4 ниже.

Таблица D4
Иллюстративные фрагменты полипептида HRS Название Диапазон аминокислотных остатков SEQ ID NO: 1 Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: HRS(1-500) Белок/Человек/
1-500 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKR 160 HRS(1-501) Белок/Человек/
1-501 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRR 161

HRS(1-502) Белок/Человек/
1-502 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRT 162 HRS(1-503) Белок/Человек/
1-503 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTG 163 HRS(1-504) Белок/Человек/
1-504 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQ 164

HRS(1-505) Белок/Человек/
1-505 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQP 165 HisRS1^N8
HRS(1-506) Белок/Человек/
1-506 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 70 HRS(2-506) Белок/Человек/
2-506 AERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 166

HRS(1-507) Белок/Человек/
1-507 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLC 167 HRS(1-508) Белок/Человек/
1-508 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCI 168 HRS(1-509) Белок/Человек/
1-509 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC 169 HisRS1^N6
HRS(1-48) Белок/Человек/
1-48 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPD 71

В определенных вариантах осуществления такие минимальные активные фрагменты могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или все 29 аминокислот гибкого линкера, соединяющего наименьший домен с гетерологичным белком или вариантом сплайсинга.

Без желания быть связанными какой-либо теорией, уникальная ориентация или конформация домена WHEP в определенных полипептидах HRS может способствовать усилению неканонических и/или блокирующих антитело видов активности, наблюдаемых в таких белках.

Перечисления "идентичность последовательности" или, например, содержащие "последовательность на 50% идентичная", как используют в настоящем описании, относятся к степени, с которой последовательности являются идентичными на основании нуклеотид-к-нуклеотиду или на основании аминокислота-к-аминокислоте на протяжении окна сравнения. Таким образом, "процент идентичности последовательности" можно рассчитывать, сравнивая две оптимально выровненные последовательности на протяжении окна сравнения, определяя число положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, A, T, C, G, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) встречаются в обеих последовательностях с получением числа совпадающих положений, делением числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (например, размера окна) и умножением результат на 100 с получением процента идентичности последовательности.

Термины, используемые для описания сходства последовательности двух или более полипептидов, включают "эталонную последовательность", "окно сравнения", "идентичность последовательности", "процент идентичности последовательности" и "существенную идентичность". Длина "эталонной последовательности" составляет по меньшей мере 12, но чаще от 15 до 18 и, как правило, по меньшей мере 25 мономерных единицы, включая нуклеотиды и аминокислотные остатки. Вследствие того, что каждый их двух полипептидов может содержать (1) последовательность (например, только участок полной полипептидной последовательности), которая является одинаковой для двух полипептидов, и (2) последовательность, которая различается у двух полипептидов, сравнение последовательностей двух (или более) полипептидов, как правило, проводят путем сравнения последовательностей двух полипептидов на протяжении "окна сравнения" для идентификации и сравнения локальных участков сходства последовательностей. "Окно сравнения" относится к смысловому сегменту по меньшей мере 6 смежных положений, как правило, приблизительно от 50 приблизительно до 100, более предпочтительно приблизительно от 100 приблизительно до 150, в которых последовательность сравнивают с эталонной последовательностью, содержащей такое же число смежных положений после оптимального выравнивания последовательностей. Окно сравнения может включать добавления или делеции (например, пропуски), составляющие приблизительно 20% или менее, по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения можно проводить посредством реализации алгоритмов с использованием компьютера (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ WisConsin GenetiCs Release 7.0, GenetiCs Computer Group, 575 SCienCe Drive Madison, WI, USA) или путем проверки и оптимального выравнивания (например, получаемого при максимальном проценте гомологии на всем протяжении окна сравнения), получаемого любым из различных выбранных способов. Также следует отметить семейство программ BLAST, такие как, например, описываемые AltsChul et al., 1997, NuCl. ACids Res., 25:3389. Подробное описание анализа последовательностей можно найти в Unit 19.3 of Ausubel et al., "Current ProtoCols in MoleCular Biology", John Wiley & Sons InC, 1994-1998, Chapter 15.

Вычисления сходства последовательностей или идентичности последовательностей между последовательностями (термины используют взаимозаменяемо в настоящем описании) можно проводить так, как указано ниже. Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты последовательности можно выравнивать для оптимального сравнения (например, можно вводить пропуски в одну или обе из первой и второй последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания и для выравнивания можно не учитывать негомологичные последовательности). В определенных вариантах осуществления длина эталонной последовательности, выравниваемой с целью сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, 60% и даже более предпочтительно по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято аналогичным аминокислотным остатком или нуклеотидом, как соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в этом положении.

Процентная идентичность двух последовательностей представляет собой функцию от числа идентичных положений общих для последовательностей, с учетом числа пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей.

Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности двух последовательностей можно проводить с использованием математического алгоритма. В некоторых вариантах осуществления процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Нидлмана и Вунша (1970, J. Mol. Biol., 48: 444-453), который был введен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG, с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы PAM250, и вес пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес продления 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В еще одном другом предпочтительном варианте осуществления процентную идентичность двух нуклеотидных последовательностей определяют с использованием программы GAP в пакете программного обеспечения GCG с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и вес пропуска 40, 50, 60, 70 или 80 и вес продления 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Другой иллюстративный набор параметров включает оценочную матрицу Blossum 62 со штрафом за пропуск 12, штрафом за продление пропуска 4 и штрафом за сдвиг рамки считывания 5. Процентную идентичность двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей также можно определять с использованием алгоритма E. Meyers and W. Miller (1989, Cabios, 4:11-17), который был введен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы цены остатков PAM120, штрафа за длину пропуска 12 и штрафа за пропуск 4.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков, описываемые в настоящем описании, можно использовать в качестве "искомых последовательностей" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такие виды поиска можно проводить с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) согласно AltsChul, et al. (1990, J. Mol. Biol, 215:403-10). Поиски нуклеотидов в BLAST можно проводить с использованием программы NBLAST (очки=100, длина слова=12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты по изобретению. Поиски белка в BLAST можно проводить с использованием программы XBLAST (очки=50, длина слова=3) для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка по изобретению. Для получения выравнивания с пропусками для сравнения можно использовать программу Gapped BLAST, как описано у AltsChul et al. (NuCleiC ACids Res., 25:3389-3402, 1997). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по-умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

В определенных вариантах осуществления варианты полипептидов отличаются от соответствующих эталонных последовательностей HRS по меньшей мере на 1%, но менее чем на 20%, 15%, 10% или 5% остатков. Если для такого сравнения требуется выравнивание, последовательности необходимо выравнивать для максимального сходства. "Образующие петлю" последовательности в результате делеций или вставок или несоответствий рассматривают как различие. Различия соответственно представляют собой различия или замены заменимого остатка или консервативную замену. В определенных вариантах осуществления молекулярная масса варианта полипептида HRS отличается от молекулярной массы эталонного полипептида HRS приблизительно на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% или более.

Также включены биологически активные "фрагменты" эталонных полипептидов HRS, например, биологически активные фрагменты белковых фрагментов HRS. Характерные биологически активные фрагменты, как правило, участвуют во взаимодействии, например, внутримолекулярном или межмолекулярном взаимодействии. Межмолекулярное взаимодействие может представлять собой взаимодействие специфического связывания или ферментативное взаимодействие. Межмолекулярное взаимодействие может происходить между полипептидом HRS и клеточным партером по связыванию, таким как клеточный рецептор или другая молекула-хозяин, которая участвует в неканонической активности полипептида HRS.

Биологически активный фрагмент эталонного полипептида HRS может представлять собой полипептидный фрагмент, который состоит из, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 38, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 380, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508 или более смежных или несмежных аминокислот, включая все целые числа (например, 101, 102, 103) и диапазоны (например, 50-100, 50-150, 50-200) между ними, аминокислотных последовательностей, указанных в любом из эталонных полипептидов HRS, описываемых в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления биологически активный фрагмент содержит связанные с неканонической активностью последовательность, домен или мотив. В определенных вариантах осуществления C-концевая или N-концевая область любого эталонного полипептида HRS может являться усеченной приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более аминокислот или приблизительно на 10-50, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500 или более аминокислот, включая все целые числа и диапазоны между ними (например, 101, 102, 103, 104, 105) при условии, что усеченный полипептид HRS сохраняет неканоническую активность эталонного полипептида. Определенные иллюстративные усеченные полипептиды HRS представлены в таблице D5 ниже.

Таблица D5
Иллюстративные усеченные полипептиды HRS C-концевые усечения Диапазон HRS Последовательность SEQ ID NO: 1-80 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 74 1-79 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDV 75 1-78 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFD 76 1-77 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVF 77 1-76 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKV 78 1-75 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREK 79 1-74 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVRE 80 1-73 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVR 81 1-72 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAV 82 1-71 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMA 83 1-70 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQM 84 1-69 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQ 85 1-68 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPR 86

1-67 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSP 87 1-66 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYS 88 1-65 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDY 89 1-64 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRD 90 1-63 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTR 91 1-62 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGT 92 1-61 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKG 93 1-60 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPK 94 1-59 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTP 95 1-58 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKT 96 1-57 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLK 97 1-56 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVL 98 1-55 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFV 99 1-54 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKF 100 1-53 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQK 101 1-52 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQ 102 1-51 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESK 103 1-50 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDES 104 1-49 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDE 105 1-48 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPD 106 1-47 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGP 107 1-46 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLG 108 1-45 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQL 109 1-44 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQ 110 1-43 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK
LKA 111 1-42 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK
LK 112 1-41 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK
L 113 1-40 MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK 114

N-концевые усечения 2-80 AERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 115 3-80 ERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 116 4-80 RAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 117 5-80 AALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 118 6-80 ALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 119 7-80 LEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 120 8-80 EELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 121 9-80 ELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 122 10-80 LVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 123 11-80 VKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 124 12-80 KLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 125 13-80 LQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 126 14-80 QGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 127 15-80 GERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 128 16-80 RVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 129 17-80 VRGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 130 18-80 RGLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 131 19-80 GLKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 132 20-80 LKQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 133 21-80 KQQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 134

22-80 QQKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 135 23-80 QKASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 136 24-80 KASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 137 25-80 ASAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 138 26-80 SAELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 139 27-80 AELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 140 28-80 ELIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 141 29-80 LIEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 142 30-80 IEEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 143 31-80 EEEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 144 32-80 EEVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 145 33-80 EVAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 146 34-80 VAKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 147 35-80 AKLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 148 36-80 KLLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 149 37-80 LLK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 150 38-80 LK LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 151 39-80 K LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 152 40-80 LKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVI 153

Как правило, биологически активный фрагмент обладает не менее приблизительно 1%, 10%, 25% или 50% активностью биологически активного (например, неканонической активностью) эталонного полипептида HRS, из которого его получают. Иллюстративные способы измерения таких видов неканонической активности описаны в примерах.

В некоторых вариантах осуществления белки, варианты HRS и их биологически активные фрагменты связываются с одним или более клеточных партнеров по связыванию с аффинностью по меньшей мере приблизительно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 100 или 150 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания белкового фрагмента HRS к выбранному клеточному партнеру по связыванию, в частности партнеру по связыванию, который участвует в неканонической активности, может являться больше, чем аффинность соответствующего полноразмерного полипептида HRS или конкретного варианта альтернативного сплайсинга полипептида HRS по меньшей мере приблизительно в 1,5x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 200x, 300x, 400x, 500x, 600x, 700x, 800x, 900x, 1000x или более (включая все целые числа между ними).

Как указано выше, полипептид HRS можно изменять различными способами, включая замены аминокислот, делеции, усечения и вставки. Способы таких манипуляций, как правило, известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности эталонного полипептида HRS можно получать посредством мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменений нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области. См., например, Kunkel (1985, PNAS USA, 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol., 154: 367-382), патент США № 4873192, Watson J.D. et al., ("MoleCular Biology of the Gene", Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) и цитируемые в них ссылки. Руководство касательно соответсвующих замен аминокислот, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес белка, можно найти в модели Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein SequenCe and StruCture (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

Биологически активные усеченные пептиды HRS и/или варианты полипептидов HRS могут содержать консервативные аминокислотные замены в различных положениях на всем протяженности последовательности по сравнению с эталонным аминокислотным остатком HRS, и такие дополнительные замены могут дополнительно повышать активность или стабильность полипептидов HRS с измененным содержанием цистеина. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток, содержащий аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, содержащих аналогичную боковую цепи, определены в данной области, которые можно, в основном, разделить на подклассы следующим образом:

Кислые: остаток имеет отрицательный заряд вследствие потери иона H при физиологическом pH, и остаток притягивается водным раствором, таким образом, чтобы занять положения на поверхности в конформации пептида, в которой он содержится, когда пептид находится в водной среде при физиологическом pH. Аминокислоты, содержащие кислую боковую цепь, включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту.

Основные: Остаток имеет положительный заряд вследствие ассоциации с ионом H при физиологическом pH или в пределах одной или двух единиц физиологического pH (например, гистидин), и остаток притягивается водным раствором, таким образом, чтобы занять положения на поверхности в конформации пептида, в которой он содержится, когда находится в водной среде при физиологическом pH. Аминокислоты, содержащие основную боковую цепь, включают аргинин, лизин и гистидин.

Заряженные: Остатки являются заряженными при физиологическом pH и, таким образом, содержат аминокислоты, содержащие кислые или основные боковые цепи (например, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аргинин, лизин и гистидин).

Гидрофобные: Остатки являются незаряженными при физиологическом pH, и остаток отталкивается водным раствором, таким образом, чтобы занять внутренние положения в конформации пептида, в которой он содержится, когда пептид находится в водной среде. Аминокислоты, содержащие гидрофобную боковую цепь, включают тирозин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин и триптофан.

Нейтральные/полярные: Остатки являются незаряженными при физиологическом pH, но остаток не достаточно отталкивается водными растворами, таким образом, чтобы занимать внутренние положения в конформации пептида, в которой он содержится, когда пептид находится в водной среде. Аминокислоты, содержащие нейтральную/полярную боковую цепь, включают аспарагин, глутамин, цистеин, гистидин, серин и треонин.

Это описание также характеризует определенные аминокислоты как "малые", т.к. их боковые цепи не являются достаточно большими, даже если отсутствуют полярные группы для придания гидрофобности. За исключением пролина "малые" аминокислоты представляют собой аминокислоты с четырьмя атомами углерода или менее, когда по меньшей мере одна полярная группа находится на боковой цепи, и три атома углерода или менее на ней не находятся. Аминокислоты, содержащие малую боковую цепь, включают глицин, серин, аланин и треонин. Кодируемая геном вторичная аминокислота пролин представляет собой особый случай вследствие ее известных эффектов на вторичную структуру пептидных цепей. Структура пролина отличается от всех других природных аминокислот тем, что его боковая цепь связана с азотом α-аминогруппы, а также α-углеродом. В данной области известно несколько матриц сходства аминокислот (см. например, матрицу PAM120 и матрицу PAM250, как описано, например, Dayhoff et al., 1978, A model of evolutionary Change in proteins). Однако матрицы для определения отношений расстояний, описанные M.O. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequenCe and struCture, Vol. 5, pp. 345-358, National BiomediCal ResearCh Foundation, Washington DC; and by Gonnet et al., (SCienCe, 256: 14430-1445, 1992), включают пролин в ту же группу, что и глицин, серин, аланин и треонин. Таким образом, для целей настоящего изобретения пролин классифицируют как "малую" аминокислоту.

Степень притяжения или отталкивания, необходимая для классификации как полярные или неполярные, является условной, и, таким образом, аминокислоты, конкретно предусматриваемые изобретением, классифицировали как полярные или неполярные. Большую часть аминокислот, конкретно не названных, можно классифицировать на основе их известного поведения.

Аминокислотные остатки можно дополнительно разделить на подклассы как циклические или нециклические и ароматические или неароматические, очевидные классификации на основе групп-заместителей боковых цепей остатков, и как маленькие или большие. Остаток считают маленьким, если он содержит всего четыре атома углерода или менее, включая карбоксильный углерод, при условии, что присутствует дополнительный полярный заместитель, три или менее, если не присутствует. Маленькие остатки, как правило, всегда являются неароматическими. В зависимости от их структурных свойств аминокислотные остатки можно разделить на два или более классов. Для природных аминокислот белка разделение на подклассы в соответствии с этой схемой представлено в таблице A.

Таблица A
Разделение на подклассы аминокислот Подклассы Аминокислоты Кислые Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота Основные Нециклические: аргинин, лизин; циклические: гистидин Заряженные Аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аргинин, лизин, гистидин Малые глицин, серин, аланин, треонин, пролин Полярные/нейтральные аспарагин, гистидин, глутамин, цистеин, серин, треонин Полярные/большие аспарагин, глутамин Гидрофобные тирозин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан Ароматические Триптофан, тирозин, фенилаланин Остатки, которые влияют на ориентацию цепи Глицин и пролин

Консервативные аминокислотные замены также включают распределение по группам на основании боковых цепей. Например, группа аминокислот, содержащих алифатические боковые цепи, представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, содержащих алифатические гидроксильные боковые цепи, представляет собой серин и треонин; группа аминокислот, содержащих боковые цепи, содержащие амид, представляет собой аспарагин и глутамин; группа аминокислот, содержащих ароматические боковые цепи, представляет собой фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, содержащих основные боковые цепи, представляет собой лизин, аргинин и гистидин, и группа аминокислот, содержащих боковые цепи, содержащие серу, представляет собой цистеин и метионин. Например, целесообразно ожидать, что замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутаминат, треонин на серин или аналогичная замена аминокислот на структурно сходную аминокислоту не оказывает большого влияния на свойства получаемого варианта полипептида. Приводит замена аминокислот к функционально усеченному полипептиду HRS и/или варианту полипептида HRS, можно легко определять анализом его неканонической активности, как описано в настоящем описании. Консервативные замены представлены в таблице B под заголовком иллюстративные замены. Замены аминокислот, входящие в объем изобретения, в основном проводят посредством выбора замен, которые значительно не различаются по своему влиянию на сохранение (a) структуры пептидного остова в области замены, (b) заряда или гидрофобности молекулы в участке-мишени, (C) объема боковой цепи, или (d) биологической функции. После введения замен варианты подвергают скринингу на биологическую активность.

Таблица B
Иллюстративные замены аминокислот Исходный остаток Иллюстративные замены Предпочтительные замены Ala Val, Leu, Ile Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln, His, Lys, Arg Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala, Leu, Val Ser, Ala Gln Asn, His, Lys, Asn Glu Asp, Lys Asp Gly Pro Pro His Asn, Gln, Lys, Arg Arg Ile Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleu Leu Leu Norleu, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, Gln, Asn Arg Met Leu, Ile, Phe Leu Phe Leu, Val, Ile, Ala Leu Pro Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Ser Trp Tyr Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu Leu

Альтернативно, аналогичные аминокислоты для проведения консервативных замен можно разделить на три категории на основании идентичности боковых цепей. Первая группа включает глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аргинин, лизин, гистидин, которые все содержат заряженные боковые цепи; вторая группа включает глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, глутамин, аспарагин, и третья группа включает лейцин, изолейцин, валин, аланин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, как описано у Zubay G., BioChemistry, third edition, Wm.C. Brown Publishers (1993).

Была определена ЯМР-структура домена WHEP HRS человека (см. Nameki et al., ACCession 1X59_A). Кроме того, также были определены кристаллические структуры полноразмерной HRS человека и мутант HRS (HRSΔCD) с делецией внутреннего каталитического домена (см. Xu et al., StruCture, 20:1470-7, 2012 и заявку США № 61/674639). В сочетании с первичной аминокислотной последовательностью HRS эти подробные описания физических свойств белка обеспечивают точное понимание роли, которую играют конкретные аминокислоты в белке. Таким образом, специалисты в данной области могут использовать эту информацию для идентификации структурно консервативных доменов, связанных областей, вторичных структур, таких как альфа-спирали, поверхностных или подвергаемых действию растворителя аминокислот, неэкспонируемых или внутренних областей, каталитических участков и взаимодействующих с лигандом поверхностей наряду с другими структурными признаками. Такие специалисты могут затем использовать эту и другую информацию для простого конструирования вариантов HRS, которые сохраняют или улучшают представляющую интерес неканоническую активность, например, путем сохранения или изменения характеристик аминокислотных остатков в них самих или смежных с ними и других структурных признаков, таким образом, как посредством сохранения или изменения полярности, индекса гидрофобности, заряда, размера и/или положения (например, внутри, снаружи) выбранной боковой цепи(ей) аминокислот относительно остатков дикого типа (см., например, Zaiwara et al., Mol BioteChnol., 51:67-102, 2012; Perona and Hadd, BioChemistry, 51:8705-29, 2012; Morin et al., Trends BioteChol., 29:159-66, 2011; Collins et al., Annu. Rev. Biophys., 40:81-98, 2011 и заявку США № 61/674639).

Таким образом, теоретически рассчитанный заменимый аминокислотный остаток в усеченном полипептиде HRS и/или варианте полипептида HRS, как правило, заменяют на другой аминокислотный остаток из того же самого семейства боковых цепей. Альтернативно, мутации можно вводить случайным образом по всей или на участке последовательности, кодирующей HRS, таким образом, как путем насыщающего мутагенеза, и получаемые мутанты можно подвергать скринингу на активность родительского полипептида для идентификации мутантов, которые сохраняют такую активность. После мутагенеза кодирующих последовательностей кодируемый пептид можно рекомбинантно экспрессировать и можно определять активность пептида. "Заменимый" аминокислотный остаток представляет собой остаток, который можно изменять в эталонной последовательности варианта осуществления полипептида, не нарушая или по существу не изменяя один или более видов его неканонической активности. Соответственно изменение по существу не нарушает один из видов такой активности, например, активность составляет по меньшей мере 20%, 40%, 60%, 70% или 80% 100%, 500%, 1000% или более от активности эталонной последовательности HRS. "Незаменимый" аминокислотный остаток представляет собой остаток, изменение которого в эталонной последовательности полипептида HRS приводит к нарушению активности родительской молекулы, таким образом, что присутствует менее 20% эталонной активности. Например, такие незаменимые аминокислотные остатки включают остатки, которые сохраняются в полипептидах HRS у различных видов, включая такие последовательности, которые сохраняются в активном участке(ах) связывания или мотиве(ах) полипептидов HRS у различных видов.

Анализы для определения противовоспалительной активности, включая общепринятые измерения высвобождения цитокинов из клетки in vitro, и исследования на животных хорошо известны в данной области (см., например, Wittmann et al., J. Vis. Exp., (65):e4203. doi: 10,3791/4203, 2012; Feldman et al., Mol. Cell, 47:585-95, 2012; ClutterbuCk et al., J. ProteomiCs, 74:704-15, 2011, Giddings and Maitra, J. Biomol. SCreen., 15:1204-10, 2010; Wijnhoven et al., GlyCoConj J., 25:177-85, 2008 и Frow et al., Med. Res. Rev., 24:276-98, 2004), и их можно легко использовать для составления профиля и оптимизации противовоспалительной активности. По меньшей мере одна иллюстративна экспериментальная система in vivo описана в прилагаемых примерах.

Определенные полипептиды HRS могут содержать одну или более замен цистеина, где один или более природных (не являющихся цистеином) остатков заменяют цистеином, например, для изменения стабильности или характеристик pK, облегчения присоединения по тиольной группе молекул PEG и т.д. В некоторых вариантах осуществления замены цистеином проводят вблизи N-конца и/или C-конца полипептида HRS (например, SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182) или другой поверхности, предоставляющей участки полипептида HRS. Конкретные варианты осуществления включают такие, где один или более остатков в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислотах относительно N-конца и/или C-конца любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 заменяют остатком цистеина. В некоторых вариантах осуществления остатки цистеина можно добавлять к полипептиду HRS путем получения N- или C-концевых слитых белков. Длина таких слитый белков может быть любой, но, как правило, составляет приблизительно 1-5 или приблизительно 5-10, приблизительно от 10 до 20 или приблизительно от 20 до 30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления слияние с C-концом является предпочтительным.

Конкретные иллюстративные варианты осуществления таких модифицированных цистеином белков приведены в таблице D6 на основании полипептида HRS HRS(1-60). Такой подход можно непосредственно применять к полипептидам HRS из таблицы D5 и другим полипептидам HRS, описываемым в настоящем описании.

Таблица D6 Название Последовательности белка SEQ ID NO: HRS(1-60)-M1MC- MCAERAALEE LVKLQGERVR GLKQQKASAE LIEEEVAKLL KLKAQLGPDE SKQKFVLKTP K 170

HRS(1-60)-A26C- MAERAALEEL VKLQGERVRG LKQQKCSAEL IEEEVAKLLK LKAQLGPDES KQKFVLKTPK 171 HRS(1-60)-C61 MAERAALEEL VKLQGERVRG LKQQKASAEL IEEEVAKLLK LKAQLGPDES KQKFVLKTPK C 172 Последовательности ДНК HRS(1-60)-M1MC- ATGTGTGCAGAAAGAGCCGCCCTGGAAGAGTTAGTTAAGTTGCAAGGTGAACGTGTCCGTGGTCTGAAGCAGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCTGATCGAAGAAGAGGTGGCCAAACTGCTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCCGAAA 173 HRS(1-60)-A26C- ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGGTCTGAAGCAGCAGAAGTGCAGCGCGGAGCTGATCGAAGAAGAGGTGGCCAAACTGCTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCCGAAA 174 HRS(1-60)-C61 ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGGTCTGAAGCAGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCTGATCGAAGAAGAGGTGGCCAAACTGCTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCCGAAATGC 175

В некоторых вариантах осуществления вставки или замены остатка(ов) цистеина в полипептиде HRS можно комбинировать с удалением других присутствующих на поверхности остатков цистеина. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид HRS может содержать одну или более замен и/или делеций в Cys83, Cys174, Cys191, Cys196, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455, Cys507 и/или Cys509 (как определено SEQ ID NO: 1), например, для удаления природных остатков цистеина.

Конкретные варианты осуществления включают любую из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 или их варианты, содержащую мутацию или делецию любых одного или более из Cys83, Cys174, Cys191, Cys196, Cys224, Cys235, Cys379, Cys455 или делецию Cys507 и Cys509, например, путем делеции C-концевых 3 аминокислот (Δ507-509). Иллюстративные мутации в этих положениях включают, например, мутацию цистеина на серин, аланин, лейцин, валин или глицин. В определенных вариантах осуществления аминокислотные остатки для конкретных замен цистеина можно выбирать из природных замен, которые встречаются в ортологах HRS у других видов и организмов. Иллюстративные замены такого типа представлены в таблице D7.

В некоторых вариантах осуществления природные остатки цистеина, выбираемые для мутагенеза, идентифицируют или выбирают в зависимости от их нахождения на поверхности. Таким образом, в некоторых аспектах остатки цистеина, выбираемые для замены, выбраны из Cys224, Cys235, Cys507 и Cys509. В некоторых вариантах осуществления последние три (C-концевые) остатка SEQ ID NO: 1 удаляют, таким образом, чтобы удалять остатки от 507 до 509. В некоторых вариантах осуществления цистеины выбирают для мутации или делеции, таким образом, чтобы удалять внутримолекулярную пару цистеинов, например, Cys174 и Cys191.

Конкретные дополнительные примеры желаемых мутаций/замен цистеина (указаны жирным шрифтом с подчеркиванием) для уменьшения предоставленных на поверхности остатков цистеина включают такие, которые перечислены ниже в таблице D8.

Таблица D8
Полипептиды HRS с заменами для удаления предоставленных на поверхности цистеинов Название Последовательности белка SEQ ID NO: HRS(1-506) C174A MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQADFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 176 HRS(1-506) C174V MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQVDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 177

HRS(1-506) C191A MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAEALKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 178 HRS(1-506) C191S MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAESLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 179 HRS(1-506) C191V MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAEVLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 180

HRS(1-506) C224S MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAISGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 181 HRS(1-506) C235S MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTISSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPL 182

Название Последовательности ДНК SEQ ID NO: HRS(1-506) C174A ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGGCTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 183

HRS(1-506) C174V ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGGTTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 184

HRS(1-506) C191A ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGGCTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 185

HRS(1-506) C191S ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGAGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 186

HRS(1-506) C191V ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGGTTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 187

HRS(1-506) C224S ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTCCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 188

HRS(1-506) C235S ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTCCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTA 189

В некоторых вариантах осуществления такие мутанты с заменой цистеина модифицируют для конструирования, вставки или иным образом введения нового предоставленного на поверхности остатка цистеина в определенном положении, предоставленном на поверхности, где вводимый остаток по существу не влияет на неканоническую активность полипептида HRS. Конкретные примеры включают, например, вставку (или повторную вставку обратно) дополнительных остатков цистеина на N- или C-конце любого из описанных выше полипептидов HRS с низким содержанием цистеина. В некоторых вариантах осуществления вставка таких N- или C-концевых предоставленных на поверхности цистеинов включает повторную вставку последней 1, последних 2 или последних 3 природных C-концевых аминокислот полноразмерного HRS человека для варианта полипептида HRS с низким содержанием цистеина, например, повторную вставку всей или участка последовательности CIC (Cys Ile Cys). Иллюстративные мутанты с низким содержанием цистеина содержат, например, любую комбинацию мутаций (или делеции) в остатках Cys174, Cys191, Cys224 и Cys235 и/или делецию или замену Cys507 и Cys509 (согласно нумерации полноразмерной HRS человека (SEQ ID NO: 1) в любом из полипептидов HRS SEQ ID NO: 1-106, 131-133, 137-143, 178, 180, 182, 184 или 186-195 или любом из любых полипептидов HRS, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них.

В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривают модификации в любом положении аминокислот в полипептиде HRS путем замены неприродной аминокислоты, необязательно содержащей функциональную группу. Неприродные аминокислоты можно вставлять или заменять, например, в одном или более остатков в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислотах относительно N-конца и/или C-конца любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 (или любого из полипептидов HRS, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них), на N-конце и/или C-конце любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 (или любого из полипептидов HRS, перечисленных в таблицах D1-D9 или получаемых из них), или аминокислотном остатке на поверхности доступной для растворителя, как описано в настоящем описании.

В конкретных вариантах осуществления неприродные аминокислоты включают без ограничения любую аминокислоту, модифицированную аминокислоту или аналог аминокислоты, отличный от селеноцистеина и следующих двадцати, генетически кодируемых альфа-аминокислот: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин. Общая структура альфа-аминокислоты проиллюстрирована следующей ниже формулой:

Неприродная аминокислота, как правило, представляет собой любую структуру, содержащую указанную выше формулу, где группа R представляет собой любой заместитель, отличный от заместителя, используемого в двадцати природных аминокислотах. Касательно структур двадцати природных аминокислот см., например, учебники по биохимии, такие как BioChemistry by L. Stryer, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York. Следует отметить, что неприродные аминокислоты, описываемые в настоящем описании, могут представлять собой природные соединения, отличные от указанных выше двадцати альфа-аминокислот. Поскольку неприродные аминокислоты, описываемые в настоящем описании, как правило, отличаются от природных аминокислот только по боковой цепи, неприродные аминокислоты образуют амидные связи с другими аминокислотами, например, природными или неприродными, аналогичным способом, которым они образуются в природных белках. Тем не менее неприродные аминокислоты содержат группы боковых цепей, которые отличают их от природных аминокислот. Например, R в указанной выше формуле необязательно содержит алкил-, арил-, арилгалогенид, винилгалогенид, алкилгалогенид, ацетил, кетон, азиридин, нитрил, нитро, галогенид, ацил-, кето-, азидо-, гидроксил-, гидразин, циано-, гало-, гидразид, алкенил, алкинил, простой эфир, простой тиоэфир, эпоксид, сульфон, бороновую кислоту, сложный боронатный эфир, боран, фенилбороновую кислоту, тиол, селено-, сульфонил-, борат, боронат, фосфо, фосфоно, фосфин, гетероцикл, пиридил, нафтил, бензофенон, кольцо с ограниченной конформационной свободой, такое как циклооктин, сложный тиоэфир, енон, имин, альдегид, сложный эфир, тиокислоту, гидроксиламин, амино, карбоновую кислоту, альфа-кето-карбоновую кислоту, альфа- или бета- ненасыщенные кислоты и амиды, глиоксиламид или органосилановую группу или т.п., или любое их сочетание.

Конкретные примеры неприродных аминокислот включают, но не ограничиваются ими, пара-ацетил-L-фенилаланин, O-метил-L-тирозин, L-3-(2-нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, O-4-аллил-L-тирозин, 4-пропил-L-тирозин, три-O-ацетил-GlCNACβ-серин, β-O-GlCNAC-L-серин, три-O-ацетил-GalNAC-α-треонин, α-GalNAC-L-треонин, L-допу, фторированный фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, пара-азидо-L-фенилаланин, пара-ацил-L-фенилаланин, пара-бензоил-L-фенилаланин, L-фосфосерин, фосфосерин, фосфотирозин, пара-йодфенилаланин, пара-бромфенилаланин, пара-амино-L-фенилаланин, изопропил-L-фенилаланин, такие как перечисленные ниже или где-либо еще в настоящем описании, и т.п.

Таким образом, можно выбирать неприродную аминокислоту, содержащую функциональную группу, которая образует ковалентную связь с любой предпочтительной функциональной группой гетерологичной молекулы, например, молекулы PEG. После выбора неприродные аминокислоты можно приобретать у поставщиков или химически синтезировать. В молекулу-мишень можно вводить любое число неприродных аминокислот, оно может изменяться в зависимости от числа желаемых водорастворимых полимеров, например, молекул PEG, которые следует присоединять. Молекулы можно присоединять ко всем или только к некоторым неприродным аминокислотам. Кроме того, одни и те же или различные неприродные аминокислоты можно вводить в полипептид HRS в зависимости от желаемого результата. В определенных вариантах осуществления приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более неприродных аминокислот вводят в полипептид HRS, любая одна или все из которых могут быть конъюгированы с гетерологичной молекулой, содержащей желаемую функциональную группу.

В определенных вариантах настоящего изобретения также предусматривают использование модифицированных полипептидов HRS, содержащих модификации, которые улучшали желаемые характеристики полипептида HRS, как описано в настоящем описании. Модификации полипептидов HRS по изобретению включают химические и/или ферментативные дериватизации в одной или более составных аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации остова и модификации N- и C-конца, включая ацетилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и присоединение слитых белков, углевода или липидных группы, кофакторов, замену D-аминокислот и т.п. Иллюстративные модификации также включают пегэлирование полипептида HRS (см., например, Veronese and Harris, AdvanCed Drug Delivery Reviews, 54: 453-456, 2002 и Pasut et al., Expert Opinion. Ther. Patents, 14(6) 859-894 2004, включенные в настоящее описание посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления такие пегилированные полипептиды HRS содержат мутация для добавления или удаления эндогенного цистеина, для обеспечения избирательного связывания через экзогенный или эндогенный цистеин или другой остаток.

PEG представляет собой хорошо известный полимер, обладающий свойствами растворимости в воде и во многих других органических растворителях, отсутствия токсичности и отсутствия иммуногенности. Он также является прозрачным, бесцветным, не имеет запаха и химически стабильным. По этим и другим причинам PEG был выбран в качестве предпочтительного полимера для присоединения, но его применяли только в целях иллюстрации, а не ограничения. Аналогичные продукты можно получать с использованием других водорастворимых полимеров, включая без ограничения, поливиниловый спирт, другие поли(алкиленоксиды), такие как поли(пропиленгликоль) и т.п., поли(оксиэтилированные полиолы), такие как поли(оксиэтилированный глицерин) и т.п., карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, этилен/малеиновый ангидрид и полиаминокислоты. Специалист в данной области способен выбирать желаемый полимер на основании желаемой дозы, времени циркуляции, устойчивости к протеолизу и других рассматриваемых факторов.

В частности, широкий спектр производных PEG является доступным и пригодным для использования для получения PEG-конъюгатов. Например, реагенты PEG от NOF Corp.'s, продаваемые под торговой маркой серии SUNBRIGHT®, предоставляют многие производные PEG, включая метоксиполиэтиленгликоли и активированные производные PEG, такие как метокси-PEG-амины, малеинимиды, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида и карбоновой кислоты для связывания различными способами с N-концевой, C-концевой или любой внутренней аминокислотой полипептида AARS. Усовершенствованную технологию пегилирования от Nektar TherapeutiCs' также предлагает различные технологии связывания PEG для потенциального улучшения безопасности и эффективности терапевтических средств на основе полипептида HRS.

Патенты, опубликованные патентные заявки и родственные публикации также позволяют специалистам в данной области рассматривать настоящее описание с учетом значительных возможных технологий присоединения PEG и производный PEG. См., например, патенты США № 6436386, 5932462, 5900461, 5824784 и 4904584, содержание которых полностью включено посредством ссылки, в которых описаны такие технологии и производные, и способы их получения.

В определенных аспектах можно использовать способ хемоселектвиного легирования для модификации полипептидов HRS по изобретению, таким образом, как путем присоединения полимеров сайт-специфическим и контролируемым образом. Такой способ, как правило, основан на введении хемоселективных якорных фрагментов в остов белка химическим или рекомбинантным образом и последующей модификации полимером, несущим комплементарный линкер. В результате можно контролировать процесс сборки и ковалентную структуру получаемого конъюгата белок-полимер, обеспечивая рациональную оптимизацию свойств лекарственного средства, таких как эффективность и фармакокинетические свойства (см., например, KoChendoerfer, Current Opinion in ChemiCal Biology, 9:555-560, 2005).

Другие варианты осуществления также относятся к слитым белкам полипептида HRS с другими белками, и эти слитые белки могут модулировать биологическую активность, секрецию, антигенность, направленное воздействие, биологические время жизни, способность проникать через клеточные мембраны или гематоэнцефалический барьер или фармакокинетические свойства полипептида HRS. Примеры слитых белков, которые улучшают фармакокинетические свойства ("модификаторы PK"), включают без ограничения слитые формы с альбумином человека (Osborn et al., Eur. J. PharmaCol., 456(1-3):149-158, (2002)), доменами FC антитела, последовательностями поли-Glu или поли-Asp и трансферрином. Кроме того, слияние с конформационно измененными полипептидными последовательностями, состоящими из аминокислот Pro, Ala и Ser ("PASylation") или гидроксиэтилкрахмала (поставляемого под торговой маркой HESYLATION®), представляет собой простой способ повышения гидродинамического объема полипептида HRS. Такое дополнительное удлинение вносит объемную случайную структуру, которая значительно увеличивает размер, получаемого слитого белка. Таким способом, как правило, замедляют на несколько порядков величины быстрый клиренс более маленьких полипептидов HRS посредством почечной фильтрации. Кроме того, также было показано, что использование слитых белков с IgG обеспечивает проницаемость некоторых слитых белков через гематоэнцефалический барьер (Fu et al., (2010) Brain Res., 1352:208-13).

Примеры слитых белков, которые модулируют антигенность или иммуномодуляторные свойства полипептида HRS включают слитые формы с лигандами связывания T-клеток, включая, например, белки MHC I и II класса, b-2 микроглобулин, участки LFA-3, участки FC-области тяжелой цепи и конъюгаты и их производные. Примеры таких слитых белков описаны, например, в EP 1964854, патентах США №5468481, 5130297, 5635363, 6451314 и US 2009/0280135.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления полипептид HRS может содержать синтетические или природные сигнальные последовательности секреции, получаемые из других хорошо охарактеризованных секретируемых белков. В некоторых вариантах осуществления такие белки могут подвергаться процессингу путем протеолитического расщепления с образованием полипептида HRS in situ. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS может содержать гетерологичные участки протеолитического расщепления для обеспечения экспрессии in situ и продукции полипептида HRS при внутриклеточном или внеклеточном расположении. Другие слитые белки также могут включать, например, слитые формы полипептида HRS с убиквитином для обеспечения новой N-концевой аминокислоты, или в них используют сигнал секреции для опосредования секреции на высоком уровне полипептида HRS во внеклеточную среду, или N- или C-концевые эпитопные метки для улучшения очистки или детекции.

В определенных аспектах использование неприродных аминокислот может применять для модификации (например, повышения) выбранной неканонической активности полипептида HRS или для изменения времени полужизни белка in vivo или in vitro. Неприродные аминокислоты также можно использовать для облегчения (селективных) химических модификаций (например, пегилирования) белка HRS, как описано где-либо еще в настоящем описании. Например, определенные неприродные аминокислоты обеспечивает селективное присоединение полимеров, таких как PEG, к данному белку и, таким образом, улучшают его фармакокинетические свойства.

Описание конкретных примеров аналогов и миметиков аминокислот можно найти, например, в Roberts and VellaCCio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meinhofer, Vol. 5, p. 341, ACademiC Press, InC., New York, N.Y. (1983), полный том которого включен в настоящее описание посредством ссылки. Другие примеры включают пералкилированные аминокислоты, в частности перметилированные аминокислоты. См., например, Combinatorial Chemistry, Eds. Wilson and Czarnik, Ch. 11, p. 235, John Wiley & Sons InC., New York, N.Y. (1997), книга полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Еще одни другие примеры включают аминокислоты, в которых амидную часть (и, таким образом, амидный остов получаемого пептида) заменяли, например, сахарным кольцом, стероидом, бензодиазепином или углеродным циклом. См., например, Burger's MediCinal Chemistry and Drug DisCovery, Ed. Manfred E. Wolff, Ch. 15, pp. 619-620, John Wiley & Sons InC., New York, N.Y. (1995), книга полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Способы синтеза пептидов, полипептидов, пептидомиметиков и белков хорошо известны в данной области (см., например, патент США № 5420109, M. Bodanzsky, PrinCiples of Peptide Synthesis (1st ed. & 2d rev. ed.), Springer-Verlag, New York, N.Y. (1984 & 1993), см. Chapter 7, Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (2d ed.), PierCe ChemiCal Co., RoCkford, Ill. (1984), каждый их которых включен в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом, полипептиды HRS по настоящему изобретению могут состоять из природных и неприродных аминокислот, а также аналогов и миметиков аминокислот.

В определенных вариантах осуществления модифицированные полипептиды HRS или варианты полипептидов HRS, описываемые в настоящем описании, например, полипептиды HRS со сниженным содержанием цистеина, обладают измененными (например, улучшенными, повышенными, сниженными, ослабленными) биохимическими, физическими и/или фармакокинетическими свойствами относительно немодифицированных полипептидов HRS или не являющихся вариантами полипептидов HRS (например, полноразмерной HRS человека дикого типа (SEQ ID NO: 1), соответствующего фрагмент или последовательности HRS с остатками цистеина дикого типа) в идентичных или иным образом сравнимых условиях. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS, обладающий измененными биохимическими, физическими и/или фармакокинетическими свойствами, содержит мутацию (например, делецию, замену) любых одного или более из Cys174, Cys191, Cys224, Cys235, Cys455, Cys507 и Cys509, как описано в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS содержит мутацию Cys507 и Cys509, например, делецию остатков 507-509 (Δ507-509). Некоторые модифицированные полипептиды HRS или варианты полипептидов HRS содержат остатки 1-506 или 2-506 SEQ ID NO: 1 (или их вариант), но не содержат остатки 507-509 SEQ ID NO: 1 (также обозначаемые как HRS(1-506), HRS(2-506)) и необязательно обладают улучшенными биохимическими, физическими и/или фармакокинетическими свойствами относительно полноразмерной HRS человека (SEQ ID NO: 1).

Примеры биохимических, физических и фармакокинетических свойств включают без ограничения абсолютную биологическую активность (например, неканоническую активность), стабильность (например, время полужизни, кинетические параметры или термостабильность, функциональную стабильность, подверженность окислению), прозрачность (например, мутность, опалесценцию) в растворе, образование агрегатов в растворе, гомогенность или монодисперсность в растворе (например, измененное отношение мономерных/димерных или мономерных/олигомерных форм, измененные уровни образования межцепочечных дисульфидных связей), иммуногенность, перекрестную реактивность, неспецифическое связывание, улучшенную экспрессию в бактериях, таких как E. Coli, (например, сниженное загрязнение эндотоксином, улучшенную гомогенность, улучшенную однородность заряда), улучшенный выход растворимого белка, сниженное связывание с эндотоксином, степень деградации в растворе, биодоступность (часть лекарственного средства, которая всасывается), распределение в ткани, объем распределения (кажущийся объем, в котором лекарственное средство мгновенно распределяется после того, как его инъецировали внутривенно, и оно уравновесилось между плазмой и окружающими тканями), концентрацию (начальную или равновесную концентрацию лекарственного средства в плазме), константу скорости элиминации (скорость, с которой лекарственные средства удаляются из организма), скорость элиминации (скорость инфузии, необходимой для уравновешивания элиминации), площадь под кривой (AUC, интеграл по кривой концентрация-время после однократной дозы или в равновесном состоянии), клиренс (объем плазмы, очищенной от лекарственного средства в единицу времени), C_max (пик концентрации лекарственного средства в плазме после перорального введения), t_max (время достижения C_max), C_min (наиболее низкую концентрацию, которую достигает лекарственное средство перед введением следующей дозы) и флуктуацию (пик флуктуации в интервале одного дозирования в равновесном состоянии).

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает фармакокинетическим профилем AUC в плазме или сыворотке по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз больше или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% больше чем соответствующий немодифицированный или не являющийся вариантом полипептид HRS после введения млекопитающему.

В некоторых аспектах такие улучшенные свойства получают без существенного изменения вторичной структуры и/или снижения неканонической биологической активности варианта или модифицированного полипептида HRS. Фактически, некоторые варианты или модифицированные полипептиды HRS обладают повышенной неканонической биологической активностью. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает повышенной (например, абсолютной) биологической активностью относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептидом HRS в сравнимых условиях. Иллюстративные виды активности включают любой из видов неканонической активности, описываемой в настоящем описании, такие как виды противовоспалительной активности и способность связываться с антителами к Jo-1 или другими клеточными связывающими средствами. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз большей или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% большей биологической активностью по сравнению с немодифицированным или не являющимся вариантом полипептидом HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает сниженной IC₅₀ (т.е. более высокой аффинностью связывания) по отношению к связыванию с антителом к Jo-1 по сравнению с полноразмерным немодифицированным белком (SEQ ID NO: 1) в анализе ELISA. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает IC₅₀ в конкурентном ELISA с Jo-1, которая является по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже, чем у немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает IC₅₀ в конкурентном ELISA с Jo-1, которая составляет менее приблизительно 0,2 нМ, менее приблизительно 0,18 нМ, менее приблизительно 0,16 нМ или менее или равна приблизительно 0,15 нМ.

В определенных вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает повышенной "стабильностью" (например, как измеряют по времени полужизни, скорости деградации белка), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз больше или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, или 500% выше чем у немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. В конкретных вариантах осуществления временя полужизни модифицированного полипептида HRS или варианта полипептида HRS при данном наборе условий (например, температуре, pH) составляет по меньшей мере приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа, приблизительно 84 часов, приблизительно 96 часов, приблизительно 120 часов, приблизительно 144 часа, приблизительно 168 часов, приблизительно 192 часа, приблизительно 216 часов или более, приблизительно 240 часов или более или любое промежуточное время полужизни или диапазон между ними.

В некоторых вариантах осуществления "стабильность" полипептида HRS включает его "функциональную стабильность" или скорость, с которой снижается по меньшей мере один вид биологической активности при данном наборе условий в течение определенного периода времени. Иллюстративные виды биологической активности включают любые один или более видов неканонической активности, описываемой в настоящем описании, и сохранение по меньшей мере одного эпитопа, который дает специфическую перекрестную реакцию с аутоантителом или аутореактивной T-клеткой при заболевании ассоцированным с аутоантителами к HRS человека. В некоторых вариантах осуществления биологическая активность модифицированного или являющийся вариантом полипептида HRS уменьшается со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чему немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях.

В определенных вариантах осуществления "стабильность" полипептида HRS включает его "кинетическую стабильность" или "термостабильность", включая его скорость развертывания при данном наборе условий в течение определенного периода времени. Белок, который является кинетически стабильным, развертывается медленнее, чем кинетически нестабильный белок. В кинетически стабильных белках для развертывания необходим большой барьер свободной энергии, и факторы, влияющие на стабильность, представляют собой относительную свободную энергию свернутого (G_f) и переходного состояния (G_ts) для первого коммитированного этапа пути развертывания. Белок может необратимо денатурировать, когда развернутый белок быстро претерпевает определенное необратимое изменение, такое как агрегация или протеолитическая деградация. В конкретных вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS развертывается со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% больше чем температура плавления немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C выше чем у немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. Температуру плавления можно измерять, например, дифференциальной сканирующей флуорометрией (DSF).

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает улучшенной или повышенной гомогенностью или монодисперсностью (например, отношением мономеров/олигомеров, отношением димеров/олигомеров, отношением мономеров/димеров, отношением димеров/мономеров, отношением образования межцепочечных дисульфидных связей в восстановительных условиях, распределением кажущихся молекулярных масс, включая пониженные пики высокомолекулярных или низкомолекулярных соединений, детектируемые в анализе SDS-PAGE или ВЭЖХ) в растворе относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления гомогенность или монодисперсия модифицированного полипептида HRS или варианта полипептида HRS увеличивается по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. В конкретных вариантах осуществления полипептид HRS, содержащий делецию (Δ507-509) или замену C-концевых остатков цистеина Cys507 и Cys509, обладает повышенной гомогенностью (например, отношением мономеров/олигомеров) в растворе относительно соответствующего полипептида HRS, содержащего один или более из Cys507/Cys509 (например, SEQ ID NO: 1). Без желания быть связанными какой-либо теорией, полноразмерная HRS человека олигомеризуется с участием C-концевых остатков цистеина Cys507/Cys509, и замена или делеция одного или обоих таких остатков цистеина может повышать гомогенность полипептида HRS в растворе (например, физиологическом буфере, фармацевтической/терапевтической композиции, биологической жидкости, такой как кровь или плазма). В конкретных вариантах осуществления вариант полипептида HRS представляет собой HRS(1-506) (SEQ ID NO: 70) или HRS(2-506). Повышенная гомогенность мономеров в растворе также может приводить, например, к сниженной биологической активности, стабильности и других свойств, описываемых в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладают пониженной мутностью (например, степенью образования частиц или волокон) в растворе относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления мутность модифицированного полипептида HRS или варианта полипептида HRS повышается приблизительно или по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз ниже или приблизительно или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. Мутность можно измерять, например, по оптической плотности при A340.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS обладает уменьшенной опалесценцией в растворе относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления опалесценция модифицированного полипептида HRS или варианта полипептида HRS снижается по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. Опалесценцию можно измерять, например, по оптической плотности при A580.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS характеризуется пониженным образованием агрегатов (например, высокомолекулярных агрегатов, низкомолекулярных агрегатов) в растворе относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления образование агрегатов модифицированного полипептида HRS или варианта полипептида HRS снижается приблизительно или по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, или 200 раз или приблизительно или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. Агрегацию можно измерять, например, эксклюзионной ВЭЖХ или анализом SDS-PAGE. Также можно проводить мониторинг за более высокими уровнями агрегации посредством измерений мутности, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS характеризуется улучшенным выходом продукта в E. Coli относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления выход продукта улучшается по меньшей мере приблизительно в 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS, получаемого в идентичных или иным образом сравнимых условиях.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS характеризуется повышенной чистотой и/или сниженным содержанием эндотоксина после экспрессии и очистки из E. Coli относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления уровень эндотоксина является сниженным по меньшей мере приблизительно в 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS, получаемого в идентичных или иным образом сравнимых условиях.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид HRS или вариант полипептида HRS характеризуется пониженной фрагментацией в растворе относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS. В некоторых вариантах осуществления степень фрагментации модифицированного полипептида HRS или варианта полипептида HRS является сниженной по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно немодифицированного или не являющегося вариантом полипептида HRS в идентичных или иным образом сравнимых условиях. Фрагментацию можно измерять, например, анализом SDS-PAGE и эксклюзионной ВЭЖХ.

Иллюстративные условия для измерения любых биохимических, физических и/или фармакокинетических свойств, описываемых в настоящем описании, включают "физиологические условия", такие как диапазон температур ~20-40°C, атмосферное давление ~1 и pH ~6-8. Общие примеры условий включают без ограничения условия in vivo после введения млекопитающему, условия in vitro или раствора в биологической жидкости (например, крови, сыворотки, тканевой культуры) и условия in vitro или раствора в физиологическом буфере или фармацевтической/терапевтической композиции. Иллюстративные фармацевтические/терапевтические композиции описаны где-либо еще в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления условия включают температуру приблизительно -80, -60, -40, -20, -10, -5, -4, -3, -20, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100°C, включая все целые числа и диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления условия включают pH приблизительно 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или 8,0, включая все целые числа и диапазоны между ними.

Фармакокинетические, биохимические и/или физические свойства, описываемые в настоящем описании, можно измерять при любом данном условии или измененных условиях (например, при повышенной температуре) приблизительно в течение 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, или 24 часов, или приблизительно 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 суток или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 недель, или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или т.п. В некоторых вариантах осуществления фармакокинетические, биохимические и/или физические свойства измеряют после замораживания-оттаивания композиции по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз.

Полинуклеотиды HRS

Определенные варианты осуществления относятся к полинуклеотидам, которые кодируют полипептид HRS, включая их усечения и/или варианты, а также к композициям, содержащим такие полинуклеотиды. Наряду с другими применениями эти варианты осуществления можно использовать для рекомбинантной продукции желаемого полипептида HRS или его варианта или для экспрессии полипептида HRS в выбранной клетке или у индивидуума. Характерные природные нуклеотидные последовательности, кодирующие нативные полипептиды HRS, включают например, номера доступа GeneBank. AK000498.1 и U18937.1.

Как используют в настоящем описании, термины "ДНК" и "полинуклеотид", и "нуклеиновая кислота" относятся к молекуле ДНК, которую выделили из общей геномной ДНК конкретного вида. Таким образом, сегмент ДНК, кодирующий полипептид, относится к сегменту ДНК, который содержит одну или более кодирующих последовательностей, является при этом по существу выделенным или очищенным от общей геномной ДНК вида, из которого получают сегмент ДНК. В термины "сегмент ДНК" и "полинуклеотид" включены сегменты ДНК и меньшие фрагменты таких сегментов, а также рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фагмиды, фаги, вирусы и т.п.

Как будет понятно специалистам в данной области, полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут включать геномные последовательности, внегеномные последовательности и кодируемые плазмидой последовательности и меньшие генетически сконструированные сегменты, которые экспрессируются, или которые можно адаптировать к экспрессии, белки, полипептиды, пептиды и т.п. Такие сегменты можно выделять из природных источников, или они могут быть модифицированы синтетически человеком.

Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой ДНК (геномную, кДНК или синтетическую ДНК) или молекулы РНК. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, содержаться в полинуклеотиде по настоящему изобретению, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связанным с другими молекулами и/или веществами подложки.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую полипептид HRS или его участок) или могут содержать вариант или биологически функциональный эквивалент такой последовательности. Варианты полинуклеотида могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, как в дальнейшем описано ниже, предпочтительно такие, что модулирующая воспалительный ответ активность кодируемого полипептида по существу не уменьшается относительно немодифицированного полипептида. Эффект на модулирующую воспалительный ответ активность кодируемого полипептида можно, как правило, оценивать так, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, содержащим смежные фрагменты различной длины, последовательности идентичной или комплементарной полипептиду HRS, где выделенные полинуклеотиды кодируют усеченный полипептид HRS, как описано в настоящем описании.

Специалистам в данной области следует принимать во внимание, что вследствие вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид HRS, как описано в настоящем описании. Некоторые из этих полинуклеотидов могут обладать минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее в настоящем изобретение конкретно предусмотрены полинуклеотиды, которые отличаются вследствие различий использования кодона, например, полинуклеотиды, которые оптимизируют для селекции кодона человека, дрожжей или бактерий.

Таким образом, многие полинуклеотиды могут кодировать полипептиды HRS по изобретению. Кроме того, полинуклеотидную последовательность можно подвергать манипуляции по различным причинам. Примеры включают, но не ограничиваются ими, введение предпочтительных кодонов для усиления экспрессии полинуклеотида у различных организмов (см. в основном Nakamura et al., NuC. ACid. Res., 28 (1):292, 2000). Кроме того, можно вводит молчащие мутаций с целью введения или удаления участков рестрикции, снижения плотности мотивов динуклеотида CpG (см. например, Kameda et al., BioChem. Biophys. Res. Commun., 349(4):1269-1277, 2006) или уменьшения способности одноцепочечных последовательностей образовывать структуры стебель-петля: (см., например, Zuker M., NuCl. ACid Res., 31(13):3406-3415, 2003). Кроме того, экспрессию у млекопитающих можно дополнительно оптимизировать путем введения консенсусной последовательности Козака [например, (a/g)CC(a/g)CCATGg; SEQ ID NO: 130] в начале кодона. Консенсусные последовательности Козака, пригодные для этой цели, известны в данной области (Mantyh et al., PNAS, 92:2662-2666, 1995; Mantyh et al., Prot. Exp. & Purif., 6, 124, 1995). Иллюстративные кодон-оптимизированные полинуклеотидные последовательности приведены в таблице D9 ниже.

Таблица D9
Кодон-оптимизированные последовательности ДНК Название Диапазон аминокислотного остатка SEQ ID NO: 1 Последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: Дикий тип (полноразмер-ная HisRS) 1-509 atggCagagCgtgCggCgCtggaggagCtggtgaaaCttCagggagagCgCgtgCgaggCCtCaagCagCagaaggCCagCgCCgagCtgatCgaggaggaggtggCgaaaCtCCtgaaaCtgaaggCaCagCtgggtCCtgatgaaagCaaaCagaaatttgtgCtCaaaaCCCCCaagggCaCaagagaCtatagtCCCCggCagatggCagttCgCgagaaggtgtttgaCgtaatCatCCgttgCttCaagCgCCaCggtgCagaagtCattgataCaCCtgtatttgaaCtaaaggaaaCaCtgatgggaaagtatggggaagaCtCCaagCttatCtatgaCCtgaaggaCCagggCggggagCtCCtgtCCCttCgCtatgaCCtCaCtgttCCttttgCtCggtatttggCaatgaataaaCtgaCCaaCattaaaCgCtaCCaCatagCaaaggtatatCggCgggataaCCCagCCatgaCCCgtggCCgataCCgggaattCtaCCagtgtgattttgaCattgCtgggaaCtttgatCCCatgatCCCtgatgCagagtgCCtgaagatCatgtgCgagatCCtgagttCaCttCagataggCgaCttCCtggtCaaggtaaaCgatCgaCgCattCtagatgggatgtttgCtatCtgtggtgtttCtgaCagCaagttCCgtaCCatCtgCtCCtCagtagaCaagCtggaCaaggtgtCCtgggaagaggtgaagaatgagatggtgggagagaagggCCttgCaCCtgaggtggCtgaCCgCattggggaCtatgtCCagCaaCatggtggggtatCCCtggtggaaCagCtgCtCCaggatCCtaaaCtatCCCaaaaCaagCaggCCttggagggCCtgggagaCCtgaagttgCtCtttgagtaCCtgaCCCtatttggCattgatgaCaaaatCtCCtttgaCCtgagCCttgCtCgagggCtggattaCtaCaCtggggtgatCtatgaggCagtgCtgCtaCagaCCCCagCCCaggCaggggaagagCCCCtgggtgtgggCagtgtggCtgCtggaggaCgCtatgatgggCtagtgggCatgttCgaCCCCaaagggCgCaaggtgCCatgtgtggggCtCagCattggggtggagCggattttCtCCatCgtggaaCagagaCtagaggCtttggaggagaagataCggaCCaCggagaCaCaggtgCttgtggCatCtgCaCagaagaagCtgCtagaggaaagaCtaaagCttgtCtCagaaCtgtgggatgCtgggatCaaggCtgagCtgCtgtaCaagaagaaCCCaaagCtaCtgaaCCagttaCagtaCtgtgaggaggCaggCatCCCaCtggtggCtatCatCggCgagCaggaaCtCaaggatggggtCatCaagCtCCgttCagtgaCgagCagggaagaggtggatgtCCgaagagaagaCCttgtggaggaaatCaaaaggagaaCaggCCagCCCCtCtgCatCtgC 24

HisRS1^N1 1-141 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACCCGTGACTATTCTCCTCGTCAAATGGCCGTCCGTGAAAAAGTGTTCGACGTGATCATTCGCTGCTTTAAACGCCATGGTGCCGAAGTGATTGATACCCCGGTGTTTGAGCTGAAAGAGACACTGATGGGCAAATATGGTGAGGACAGCAAACTGATTTATGACCTGAAAGATCAGGGTGGTGAACTGCTGAGTCTGCGCTATGATCTGACAGTTCCGTTTGCCCGTTATCTGGCAATG 25 HisRS1^N2 1-408 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACCCGTGACTATTCTCCTCGTCAAATGGCCGTCCGTGAAAAAGTGTTCGACGTGATCATTCGCTGCTTTAAACGCCATGGTGCCGAAGTGATTGATACCCCGGTGTTTGAGCTGAAAGAGACACTGATGGGCAAATATGGTGAGGACAGCAAACTGATTTATGACCTGAAAGATCAGGGTGGTGAACTGCTGAGTCTGCGCTATGATCTGACAGTTCCGTTTGCCCGTTATCTGGCAATGAATAAACTGACCAACATTAAACGCTATCACATTGCTAAAGTCTATCGCCGTGACAATCCTGCTATGACCCGTGGTCGTTATCGTGAGTTCTATCAGTGTGACTTCGATATTGCCGGCAACTTTGATCCGATGATCCCGGATGCTGAATGCCTGAAAATCATGTGTGAGATCCTGAGCAGTCTGCAGATTGGCGATTTCCTGGTGAAAGTCAACGATCGCCGTATTCTGGATGGCATGTTCGCCATCTGTGGTGTTAGCGACTCCAAATTCCGTACCATCTGTAGTAGTGTGGACAAACTGGATAAAGTGAGCTGGGAGGAGGTGAAAAACGAAATGGTGGGCGAGAAAGGTCTGGCTCCTGAAGTGGCTGACCGTATTGGTGATTATGTCCAGCAGCACGGTGGAGTATCACTGGTTGAGCAACTGCTGCAAGACCCTAAACTGAGTCAGAATAAACAGGCCCTGGAGGGACTGGGAGATCTGAAACTGCTGTTCGAGTATCTGACCCTGTTCGGTATCGATGACAAAATCTCCTTTGACCTGTCACTGGCTCGTGGACTGGACTATTATACCGGCGTGATCTATGAAGCTGTACTGCTGCAAACTCCAGCACAAGCAGGTGAAGAGCCTCTGGGTGTGGGTAGTGTAGCCGCTGGGGGACGTTATGATGGACTGGTGGGGATGTTCGACCCTAAAGGCCGTAAAGTTCCGTGTGTGGGTCTGAGTATCGGTGTTGAGCGTATCTTTTCCATCGTCGAGCAACGTCTGGAAGCACTGGAGGAAAAAATCCGTACGACCGAA 26 HisRS1^N3 1-113 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACCCGTGACTATTCTCCTCGTCAAATGGCCGTCCGTGAAAAAGTGTTCGACGTGATCATTCGCTGCTTTAAACGCCATGGTGCCGAAGTGATTGATACCCCGGTGTTTGAGCTGAAAGAGACACTGATGGGCAAATATGGTGAGGACAGCAAACTG 27

HisRS1^N4 HRS(1-60) ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAG 28 HisRS1^N8 HRS(1-506) atggCagagCgtgCggCgCtggaggagCtggtgaaaCttCagggagagCgCgtgCgaggCCtCaagCagCagaaggCCagCgCCgagCtgatCgaggaggaggtggCgaaaCtCCtgaaaCtgaaggCaCagCtgggtCCtgatgaaagCaaaCagaaatttgtgCtCaaaaCCCCCaagggCaCaagagaCtatagtCCCCggCagatggCagttCgCgagaaggtgtttgaCgtaatCatCCgttgCttCaagCgCCaCggtgCagaagtCattgataCaCCtgtatttgaaCtaaaggaaaCaCtgatgggaaagtatggggaagaCtCCaagCttatCtatgaCCtgaaggaCCagggCggggagCtCCtgtCCCttCgCtatgaCCtCaCtgttCCttttgCtCggtatttggCaatgaataaaCtgaCCaaCattaaaCgCtaCCaCatagCaaaggtatatCggCgggataaCCCagCCatgaCCCgtggCCgataCCgggaattCtaCCagtgtgattttgaCattgCtgggaaCtttgatCCCatgatCCCtgatgCagagtgCCtgaagatCatgtgCgagatCCtgagttCaCttCagataggCgaCttCCtggtCaaggtaaaCgatCgaCgCattCtagatgggatgtttgCtatCtgtggtgtttCtgaCagCaagttCCgtaCCatCtgCtCCtCagtagaCaagCtggaCaaggtgtCCtgggaagaggtgaagaatgagatggtgggagagaagggCCttgCaCCtgaggtggCtgaCCgCattggggaCtatgtCCagCaaCatggtggggtatCCCtggtggaaCagCtgCtCCaggatCCtaaaCtatCCCaaaaCaagCaggCCttggagggCCtgggagaCCtgaagttgCtCtttgagtaCCtgaCCCtatttggCattgatgaCaaaatCtCCtttgaCCtgagCCttgCtCgagggCtggattaCtaCaCtggggtgatCtatgaggCagtgCtgCtaCagaCCCCagCCCaggCaggggaagagCCCCtgggtgtgggCagtgtggCtgCtggaggaCgCtatgatgggCtagtgggCatgttCgaCCCCaaagggCgCaaggtgCCatgtgtggggCtCagCattggggtggagCggattttCtCCatCgtggaaCagagaCtagaggCtttggaggagaagataCggaCCaCggagaCaCaggtgCttgtggCatCtgCaCagaagaagCtgCtagaggaaagaCtaaagCttgtCtCagaaCtgtgggatgCtgggatCaaggCtgagCtgCtgtaCaagaagaaCCCaaagCtaCtgaaCCagttaCagtaCtgtgaggaggCaggCatCCCaCtggtggCtatCatCggCgagCaggaaCtCaaggatggggtCatCaagCtCCgttCagtgaCgagCagggaagaggtggatgtCCgaagagaagaCCttgtggaggaaatCaaaaggagaaCaggCCagCCCCtC 72 HisRS1^N6 HRS(1-48) ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGAT 73

HisRS1^I1 191-333 TGCCTGAAAATCATGTGTGAGATCCTGAGTAGTCTGCAAATTGGCGACTTTCTGGTCAAAGTGAACGATCGCCGTATTCTGGATGGCATGTTCGCCATCTGTGGTGTTAGCGACTCCAAATTCCGTACAATCTGTAGCAGCGTGGACAAACTGGATAAAGTGTCCTGGGAAGAGGTGAAAAACGAAATGGTGGGTGAAAAAGGTCTGGCTCCGGAGGTTGCTGACCGTATCGGTGATTATGTTCAGCAGCACGGCGGTGTTAGTCTGGTTGAACAACTGCTGCAAGACCCGAAACTGTCTCAGAACAAACAGGCCCTGGAAGGACTGGGAGATCTGAAACTGCTGTTCGAGTATCTGACGCTGTTCGGCATTGATGACAAAATTTCTTTCGACCTGTCACTGGCACGTGGACTGGACTATTATACCGGT 29 HisRS1^C1 405-509 CGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 30 HisRS1^N5 1-243+27aa ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACCCGTGACTATTCTCCTCGTCAAATGGCCGTCCGTGAAAAAGTGTTCGACGTGATCATTCGCTGCTTTAAACGCCATGGTGCCGAAGTGATTGATACCCCGGTGTTTGAGCTGAAAGAGACACTGATGGGCAAATATGGTGAGGACAGCAAACTGATCTATGACCTGAAAGACCAAGGCGGTGAACTGCTGTCCCTGCGTTATGATCTGACTGTGCCGTTTGCCCGTTATCTGGCCATGAATAAACTGACGAACATTAAACGCTATCACATTGCCAAAGTGTATCGCCGTGACAATCCTGCTATGACTCGTGGACGTTATCGTGAATTCTATCAGTGTGACTTCGATATTGCCGGCAACTTCGACCCTATGATTCCGGATGCTGAATGCCTGAAAATCATGTGTGAGATCCTGAGCAGCCTGCAAATTGGTGACTTCCTGGTGAAAGTGAATGACCGTCGTATCCTGGATGGCATGTTTGCCATTTGTGGTGTGAGCGATTCCAAATTCCGTACCATCTGTAGTAGTGTGGACAAACTGGATAAAGTGGGCTATCCGTGGTGGAACTCTTGTAGCCGTATTCTGAACTATCCTAAAACCAGCCGCCCGTGGCGTGCTTGGGAAACT 31

HisRS1^C2 1-60+175-509 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGACTTCGATATTGCCGGGAATTTTGACCCTATGATCCCTGATGCCGAATGTCTGAAAATCATGTGTGAGATCCTGAGCAGTCTGCAGATTGGTGACTTCCTGGTGAAAGTGAACGATCGCCGTATTCTGGATGGAATGTTTGCCATTTGTGGCGTGTCTGACAGCAAATTTCGTACGATCTGTAGCAGCGTGGATAAACTGGATAAAGTGAGCTGGGAGGAGGTGAAAAATGAGATGGTGGGCGAAAAAGGTCTGGCACCTGAAGTGGCTGACCGTATCGGTGATTATGTTCAGCAACATGGCGGTGTTTCTCTGGTCGAACAGCTGCTGCAAGACCCAAAACTGAGCCAGAACAAACAGGCACTGGAAGGACTGGGTGATCTGAAACTGCTGTTTGAGTATCTGACGCTGTTTGGCATCGATGACAAAATCTCGTTTGACCTGAGCCTGGCACGTGGTCTGGATTATTATACCGGCGTGATCTATGAAGCCGTCCTGCTGCAAACTCCAGCACAAGCAGGTGAAGAACCTCTGGGTGTTGGTAGTGTAGCGGCAGGCGGACGTTATGATGGACTGGTGGGGATGTTTGATCCGAAAGGCCGTAAAGTTCCGTGTGTCGGTCTGAGTATCGGGGTTGAGCGTATCTTTAGCATTGTGGAGCAACGTCTGGAAGCTCTGGAGGAAAAAATCCGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 32

HisRS1^C3 1-60+211-509 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGTGAATGATCGCCGTATCCTGGATGGCATGTTTGCCATTTGTGGTGTGAGCGACTCGAAATTCCGTACGATTTGCTCTAGCGTCGATAAACTGGACAAAGTGTCCTGGGAAGAGGTGAAAAACGAGATGGTGGGTGAGAAAGGTCTGGCTCCTGAAGTTGCCGACCGTATTGGTGATTATGTTCAGCAGCATGGCGGTGTTTCACTGGTTGAACAACTGCTGCAAGACCCGAAACTGTCTCAGAATAAACAGGCGCTGGAAGGACTGGGAGATCTGAAACTGCTGTTTGAGTATCTGACCCTGTTCGGCATTGATGACAAAATCAGCTTCGACCTGAGCCTGGCACGTGGTCTGGATTATTATACCGGCGTGATCTATGAAGCCGTTCTGCTGCAGACACCAGCACAAGCAGGCGAAGAACCTCTGGGTGTTGGTTCTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGACTGGTAGGCATGTTCGATCCGAAAGGCCGTAAAGTTCCGTGTGTGGGACTGAGTATCGGTGTTGAGCGTATCTTTAGCATCGTGGAACAACGTCTGGAAGCGCTGGAGGAGAAAATTCGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 33

HisRS1^C4 1-100+211-509 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACTCGTGATTATAGCCCTCGCCAGATGGCTGTCCGTGAAAAAGTGTTCGATGTGATCATTCGCTGCTTCAAACGTCATGGTGCCGAAGTCATTGATACCCCGGTGTTCGAGCTGAAAGTGAACGATCGCCGTATTCTGGATGGCATGTTCGCCATTTGTGGTGTTAGCGATAGCAAATTCCGTACAATCTGCTCTAGCGTGGACAAACTGGACAAAGTGAGCTGGGAAGAGGTGAAAAACGAGATGGTGGGTGAGAAAGGCCTGGCTCCTGAAGTTGCCGACCGTATCGGAGATTATGTTCAGCAGCATGGCGGAGTTTCACTGGTTGAACAACTGCTGCAAGACCCGAAACTGTCTCAGAACAAACAGGCACTGGAAGGTCTGGGAGATCTGAAACTGCTGTTCGAGTATCTGACGCTGTTCGGTATTGACGACAAAATTTCCTTCGACCTGTCGCTGGCACGTGGTCTGGATTATTATACAGGCGTGATCTATGAGGCTGTACTGCTGCAGACACCAGCACAAGCAGGTGAAGAGCCTCTGGGTGTTGGTTCAGTTGCTGCCGGTGGACGTTATGACGGACTGGTAGGGATGTTTGACCCAAAAGGCCGTAAAGTCCCGTGTGTAGGACTGTCTATTGGCGTTGAGCGTATCTTTAGCATCGTGGAGCAACGTCTGGAAGCTCTGGAGGAGAAAATCCGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 34

HisRS1^C5 1-174+211-509 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACTCGTGATTATAGCCCTCGCCAGATGGCTGTCCGTGAAAAAGTGTTCGATGTGATCATTCGCTGCTTCAAACGTCATGGTGCCGAAGTCATTGATACCCCGGTGTTCGAGCTGAAAGAAACCCTGATGGGCAAATATGGGGAAGATTCCAAACTGATCTATGACCTGAAAGACCAGGGAGGTGAACTGCTGTCTCTGCGCTATGACCTGACTGTTCCTTTTGCTCGCTATCTGGCCATGAATAAACTGACCAACATCAAACGCTATCATATCGCCAAAGTGTATCGCCGTGACAATCCAGCAATGACCCGTGGTCGTTATCGTGAATTTTATCAGTGTGTGAACGATCGCCGTATTCTGGACGGCATGTTCGCCATTTGTGGTGTGTCTGACTCCAAATTTCGTACGATCTGCTCAAGCGTGGACAAACTGGACAAAGTGAGCTGGGAAGAGGTGAAAAACGAGATGGTGGGTGAGAAAGGCCTGGCTCCTGAAGTTGCCGACCGTATCGGAGATTATGTTCAGCAGCATGGCGGAGTTTCACTGGTTGAACAACTGCTGCAAGACCCGAAACTGTCACAGAACAAACAGGCACTGGAAGGTCTGGGGGATCTGAAACTGCTGTTCGAGTATCTGACGCTGTTCGGTATTGACGACAAAATCAGCTTCGATCTGAGCCTGGCACGTGGTCTGGACTATTATACCGGCGTGATTTATGAAGCCGTTCTGCTGCAGACTCCAGCACAAGCAGGTGAAGAGCCTCTGGGTGTTGGAAGTGTGGCAGCCGGTGGCCGTTATGATGGTCTGGTTGGCATGTTTGACCCGAAAGGCCGTAAAGTCCCGTGTGTAGGACTGTCTATCGGCGTGGAGCGTATTTTTAGCATCGTGGAACAACGCCTGGAAGCTCTGGAAGAGAAAATCCGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 35

HisRS1^C6 1-60+101-509 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGAAACCCTGATGGGCAAATATGGCGAAGATTCCAAACTGATCTATGACCTGAAAGACCAAGGCGGTGAACTGCTGTCCCTGCGTTATGACCTGACTGTTCCGTTTGCTCGTTATCTGGCCATGAATAAACTGACCAACATTAAACGCTATCACATTGCCAAAGTGTATCGCCGTGACAATCCTGCTATGACTCGTGGACGTTATCGTGAATTCTATCAGTGTGACTTCGATATTGCCGGCAACTTCGACCCTATGATTCCGGATGCTGAATGCCTGAAAATCATGTGTGAGATCCTGAGCAGCCTGCAAATTGGTGACTTCCTGGTGAAAGTGAATGACCGTCGTATCCTGGATGGCATGTTCGCCATTTGTGGTGTTAGCGATTCCAAATTCCGTACCATCTGTAGTAGTGTGGACAAACTGGATAAAGTGAGCTGGGAAGAGGTGAAAAACGAAATGGTGGGCGAAAAAGGTCTGGCACCTGAGGTTGCTGATCGTATCGGTGACTATGTCCAGCAGCATGGAGGTGTTTCACTGGTTGAGCAACTGCTGCAAGATCCGAAACTGTCTCAGAACAAACAGGCCCTGGAAGGACTGGGTGATCTGAAACTGCTGTTCGAGTATCTGACGCTGTTCGGTATTGATGACAAAATCTCGTTCGACCTGTCTCTGGCTCGTGGACTGGATTATTATACGGGCGTAATCTATGAAGCTGTCCTGCTGCAGACACCAGCACAAGCAGGTGAAGAGCCTCTGGGTGTTGGAAGTGTTGCTGCCGGTGGTCGCTATGACGGACTGGTTGGCATGTTCGATCCGAAAGGCCGTAAAGTTCCGTGTGTAGGACTGAGCATTGGCGTTGAGCGTATCTTTTCCATCGTTGAGCAACGTCTGGAAGCACTGGAAGAGAAAATCCGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 36

HisRS1^C7 1-100+175-509 ATGGCAGAACGTGCCGCCCTGGAAGAGCTGGTAAAACTGCAAGGCGAGCGTGTTCGTGGTCTGAAACAGCAGAAAGCAAGCGCTGAACTGATCGAAGAAGAAGTGGCGAAACTGCTGAAACTGAAAGCACAGCTGGGTCCTGATGAATCAAAACAAAAATTCGTCCTGAAAACTCCGAAAGGAACTCGTGATTATAGCCCTCGCCAGATGGCTGTCCGTGAAAAAGTGTTCGATGTGATCATTCGCTGCTTCAAACGTCATGGTGCCGAAGTCATTGATACCCCGGTGTTCGAGCTGAAAGATTTCGATATTGCCGGCAACTTTGATCCGATGATTCCGGATGCTGAGTGTCTGAAAATCATGTGTGAGATCCTGAGTAGTCTGCAGATTGGGGATTTCCTGGTGAAAGTGAACGATCGCCGTATTCTGGACGGCATGTTTGCCATTTGTGGCGTTAGCGATAGCAAATTCCGTACGATCTGTAGCAGTGTGGACAAACTGGATAAAGTCTCTTGGGAAGAGGTCAAAAACGAGATGGTTGGTGAGAAAGGCCTGGCTCCTGAAGTGGCTGACCGTATTGGTGATTATGTCCAGCAGCATGGTGGTGTTTCACTGGTTGAACAACTGCTGCAAGACCCGAAACTGTCTCAGAACAAACAGGCACTGGAAGGTCTGGGTGATCTGAAACTGCTGTTCGAGTATCTGACGCTGTTCGGTATTGACGACAAAATTTCCTTCGACCTGTCACTGGCACGTGGTCTGGATTATTATACAGGCGTAATCTATGAGGCTGTACTGCTGCAAACTCCAGCACAAGCAGGTGAAGAACCTCTGGGAGTTGGTAGTGTAGCGGCAGGGGGTCGTTATGATGGGCTGGTCGGGATGTTCGATCCAAAAGGCCGTAAAGTCCCGTGTGTTGGTCTGTCTATTGGCGTTGAGCGTATCTTCTCCATCGTGGAGCAACGTCTGGAAGCTCTGGAAGAAAAAATCCGTACCACCGAAACCCAAGTTCTGGTTGCCTCAGCTCAGAAAAAACTGCTGGAAGAACGCCTGAAACTGGTTAGCGAACTGTGGGATGCTGGCATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAGGAAGCGGGTATTCCTCTGGTGGCCATTATCGGAGAACAGGAACTGAAAGACGGCGTTATTAAACTGCGTAGCGTGACCTCTCGTGAAGAAGTTGACGTTCGCCGTGAAGATCTGGTCGAGGAAATCAAACGTCGTACCGGTCAACCTCTGTGTATTTGC 37 HisRS1^C10 369-509 ATGTTCGACCCAAAAGGCCGTAAAGTTCCGTGTGTAGGGCTGTCTATCGGTGTTGAGCGTATCTTCTCCATCGTTGAGCAGCGTCTGGAAGCACTGGAGGAAAAAATCCGTACGACCGAGACTCAAGTCCTGGTTGCTAGTGCCCAGAAAAAACTGCTGGAAGAGCGCCTGAAACTGGTTAGTGAGCTGTGGGATGCCGGTATTAAAGCCGAACTGCTGTATAAAAAAAACCCGAAACTGCTGAATCAGCTGCAGTATTGTGAAGAAGCGGGCATTCCGCTGGTAGCGATTATCGGGGAACAAGAACTGAAAGATGGCGTGATCAAACTGCGTAGCGTTACAAGCCGTGAGGAAGTGGACGTCCGCCGTGAGGATCTGGTTGAAGAGATTAAACGCCGTACAGGTCAGCCTCTGTGTATTTGC 38

В полинуклеотиде по настоящему изобретению могут, но не обязательно, содержаться дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связанным с другими молекулами и/или веществами подложки. Таким образом, полинуклеотиды по настоящему изобретению независимо от длины самой кодирующей последовательности можно комбинировать и функционально связывать с другими последовательностями ДНК или РНК, такими как контролирующие экспрессию последовательности, включая, например, промоторы, сигналы полиаденилирования. Кроме того, полинуклеотиды могут дополнительно содержат участки распознавания рестрикционных ферментов, участки множественного клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., таким образом, что общая их длина может значительно варьировать.

Таким образом, предусматривают, что можно использовать фрагмент полинуклеотида практически любой длины, где общая длина предпочтительно ограничена простотой получения и использования в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК. Включены полинуклеотиды, длина которых составляет приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 270, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 или более (включая все целые числа между ними) оснований, включая любой участок или фрагмент (например, больше приблизительно 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов в длину) эталонного полинуклеотида HRS (например, число оснований X-Y, в которых X составляет приблизительно 1-3000 или более, и Y составляет приблизительно 10-3000 или более) или его комплемента.

Варианты осуществления настоящего изобретения также включают "варианты" эталонных полинуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид HRS. "Варианты" полинуклеотида могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным полинуклеотидом. Как правило, варианты эталонной полинуклеотидной последовательности полипептида HRS могут обладать по меньшей мере приблизительно 30%, 40% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, как правило, по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, желательно приблизительно от 90% до 95% или более и более предпочтительно приблизительно 98% или более идентичностью последовательности по отношению к конкретной нуклеотидной последовательности (такой, как, например, SEQ ID NO: 24-38, 40, 42, 72-73, 173-175 или 183-189), как определяют посредством программ для выравнивания последовательностей, описываемых где-либо в настоящем описании, с использованием параметров по-умолчанию. В определенных вариантах осуществления варианты могут отличаться от эталонной последовательности приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (включая все целые числа между ними) или более оснований. В определенных вариантах осуществления, таких как те, где вариант полинуклеотида кодирует полипептид HRS, обладающий неканонической активностью, желаемая активность кодируемого полипептида HRS по существу не уменьшается относительно немодифицированного полипептида. Влияние на активность кодируемого полипептида, как правило, можно оценивать, как описано в настоящем описании, включая, например, способы, описываемые в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления варианты могут изменять состояние агрегации полипептидов HRS, например, обеспечивая полипептиды HRS, которые существуют в других вариантах осуществления преимущественно в виде мономера, димера или мультимера.

Определенные варианты осуществления включают полинуклеотиды, которые гибридизуются с эталонной полинуклеотидной последовательностью HRS (такие как, например, любая из SEQ ID NO: 24-38, 40, 42, 72-73, 173-175 или 183-189) или с ее комплементами в условиях с жесткостью, описанными ниже. Как используют в настоящем описании, термин "гибридизуется в условиях с низкой жесткостью, средней жесткостью, высокой жесткостью или с очень высокой жесткостью" описывает условия для гибридизации и промывания. Руководство для проведения реакций гибридизации можно найти у Ausubel et al., (1998, выше), SeCtions 6.3.1-6.3.6. В указанной ссылке описаны водные и неводные способы, и любые из них можно использовать.

Ссылка в настоящем описании на условия с низкой жесткостью включает и охватывает по меньшей мере приблизительно от 1% об./об. по меньшей мере приблизительно до 15% об./об. формамида и по меньшей мере приблизительно от 1 M по меньшей мере приблизительно до 2 M соли для гибридизация при 42°C и по меньшей мере приблизительно от 1 M по меньшей мере приблизительно до 2 M соли для промывания при 42°C. Условия с низкой жесткостью также могут включать 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS для гибридизации при 65°C , и (i) 2×SSC, 0,1% SDS или (ii) 0,5% BSA, 1 мМ EDTA, 40 мМ NaHPO₄ (pH 7,2), 5% SDS для промывания при комнатной температуре. Один из вариантов осуществления условий с низкой жесткостью включает гибридизацию в 6×хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) приблизительно при 45°C с последующими двумя промываниями в 0,2×SSC, 0,1% SDS по меньшей мере при 50°C (температуру промываний можно повышать до 55°C для условий с низкой жесткостью).

Условия со средней жесткостью включают и охватывают по меньшей мере приблизительно от 16% об./об. по меньшей мере приблизительно до 30% об./об. формамида и по меньшей мере приблизительно от 0,5 M по меньшей мере приблизительно до 0,9 M соли для гибридизации при 42°C и по меньшей мере приблизительно от 0,1 M по меньшей мере приблизительно до 0,2 M соли для промывания при 55°C. Условия со средней жесткостью также могут включать 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 1 мМ EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS для гибридизации при 65°C и (i) 0,2×SSC, 0,1% SDS или (ii) 0,5% BSA, 1 мМ EDTA, 40 мМ NaHPO₄ (pH 7,2), 5% SDS для промывания при 60-65°C. Один из вариантов осуществления условий со средней жесткостью включает гибридизацию в 6×SSC приблизительно при 45°C с последующим одним или более промываний в 0,2×SSC, 0,1% SDS при 60°C. Условия с высокой жесткостью включают и охватывают по меньшей мере приблизительно от 31% об./об. по меньшей мере приблизительно до 50% об./об. формамида и приблизительно от 0,01 M приблизительно до 0,15 M соли для гибридизации при 42°C и приблизительно от 0,01 M приблизительно до 0,02 M соли для промывания при 55°C.

Условия с высокой жесткостью также могут включать 1% BSA, 1 мМ EDTA, 0,5 M NaHPO₄ (pH 7,2), 7% SDS для гибридизации при 65°C и (i) 0,2×SSC, 0,1% SDS или (ii) 0,5% BSA, 1 мМ EDTA, 40 мМ NaHPO₄ (pH 7,2), 1% SDS для промывания при температуре более 65°C. Один из вариантов осуществления условий с высокой жесткостью включает гибридизацию в 6×SSC приблизительно при 45°C с последующим одним или более промываний в 0,2×SSC, 0,1% SDS при 65°C. Один из вариантов осуществления условия с очень высокой жесткостью включает гибридизацию в 0,5 M фосфате натрия, 7% SDS при 65°C с последующим один или более промываний в 0,2×SSC, 1% SDS при 65°C.

Другие условия жесткости хорошо известны в данной области, и специалисту в данной области понятно, что для оптимизации специфичности гибридизации можно регулировать различные факторы. Оптимизация жесткости конечных промываний может служить для обеспечения высокой степени гибридизации. Подробные примеры, см. Ausubel et al., выше на страницах 2.10.1-2.10.16 и Sambrook et al. (1989, выше) в разделах 1.101-1.104. Несмотря на то, что промывания в жестких условиях, как правило, проводят при температурах приблизительно от 42°C до 68°C, специалисту в данной области понятно, что другие температуры могут являться подходящими для жестких условий. Максимальную скорость гибридизации, как правило, наблюдают приблизительно при 20°C-25°C ниже T_m для образования гибрида ДНК-ДНК. В данной области хорошо известно, что T_m представляет собой температуру плавления или температуру, при которой две комплементарные полинуклеотидные последовательности диссоциируют. Способы оценки T_m хорошо известны в данной области (см. Ausubel et al., выше на странице 2.10.8).

Как правило, T_m идеально совпадающего дуплекса ДНК можно теоретически рассчитывать в виде приблизительной величины по формуле: T_m=81,5+16,6(log₁₀ M)+0,41(%G+C)-0,63 (% формамида)-(600/длина), где: M представляет собой концентрацию Na⁺, предпочтительно в диапазоне от 0,01 моль до 0,4 моль, %G+C представляет собой сумму оснований гуанозина и цитозина в виде процента от общего числа оснований, в диапазоне от 30% до 75% G+C, % формамида представляет собой процентную концентрацию формамид по объему, длина представляет собой число пар оснований в дуплексе ДНК. T_m дуплекса ДНК снижается приблизительно на 1°C с каждым увеличением на 1% числа случайно совпадающих пар оснований. Промывание, как правило, проводят при T_m-15°C для условий с высокой жесткостью или T_m-30°C для условий с умеренной жесткостью.

В одном из примеров способа гибридизации мембрану (например, нитроцеллюлозную мембрану или нейлоновую мембрану), содержащую иммобилизованную ДНК, гибридизуют в течение ночи при 42°C в гибридизационном буфере (50% деионизированный формамид, 5×SSC, 5×раствор Денхардта (0,1% фиколл, 0,1% поливинилпирролидон и 0,1% бычий сывороточный альбумин), 0,1% SDS и 200 мг/мл денатурированная ДНК из спермы лосося), содержащем меченый зонд. Затем мембрану подвергают двум последовательным промываниям в условиях со средней жесткостью (например, 0,2×SSC, 0,1% SDS в течение 15 минут при 45°C с последующим 0,2×SSC, 0,1% SDS в течение 15 минут при 50°C) с последующими двумя последовательными промываниями в условиях с высокой жесткостью (например, 0,2×SSC, 0,1% SDS в течение 12 минут при 55°C с последующим 0,2×SSC и 0,1% растворе SDS в течение 12 мин при 65-68°C.

Получение полипептидов HRS

Полипептид HRS можно получать любым подходящим способом, известным специалистам в данной области, например, с использованием стандартного твердофазного пептидного синтеза (Merrifield, J. Am. Chem. SoC., 85:2149-2154 (1963)) или рекомбинантной технологии с использованием генетически модифицированного хозяина. Синтез белка можно проводить ручными способами или автоматически. Автоматический синтез можно проводить, например, с использованием синтезатора пептидов Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Альтернативно, различные фрагменты можно химически синтезировать раздельно и комбинировать химическими способами с получением желаемой молекулы.

Полипептиды HRS также можно получать экспрессией последовательности ДНК, кодирующей рассматриваемый полипептид HRS в подходящей клетке-хозяине хорошо известными способами. Полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид HRS, можно получать синтетически общепринятыми стандартными способами, например, фосфорамидитным способом, описанным BeauCage et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1869, или способом, описанным Matthes et al., (1984) EMBO Journal, 3:801-805. В соответствии с фосфорамидитным способом олигонуклеотиды синтезируют, например, на автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, спаривают и лигируют с образованием синтетической конструкции ДНК. Альтернативно конструкцию ДНК можно конструировать стандартными рекомбинантными молекулярно-биологическими способами, включая опосредованное рестрикционными ферментами клонирование и амплификацию гена на основе ПЦР.

Полинуклеотидные последовательности также могут являться смешанными геномными, кДНК и синтетического происхождения. Например, геномную последовательность или последовательность кДНК, кодирующую лидирующий пептид, можно присоединять к геномной последовательности или последовательности кДНК, кодирующей полипептид HRS, после чего последовательность ДНК можно модифицировать на участке посредством вставки синтетических олигонуклеотидов, кодирующих желаемую аминокислотную последовательность, или ПЦР с использованием подходящих олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления можно вводить сигнальную последовательность перед кодирующей последовательностью. Такая последовательность кодирует сигнальный пептид, N-концевой к кодирующей последовательности, которая взаимодействует с клеткой-хозяином, чтобы направлять полипептид к клеточной поверхности или секретировать полипептид в среду. Как правило, сигнальный пептид отщепляется клеткой-хозяином до того, как белок выходит из клетки. Сигнальные пептиды можно найти в различных белках у прокариот и эукариот.

Известны различные экспрессирующих векторов/системы хозяев, и их можно использовать для содержания и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Они включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, экспрессирующими векторами на основе плазмидой или космидной ДНК, дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессирующими векторами, системы на основе клетки насекомого, инфицированные экспрессирующими векторами на основе вируса (например, бакуловируса), системы на основе растительной клетки, трансформированные экспрессирующими векторами на основе вируса (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмидами Ti или pBR322), или системы на основе животной клетки, включая системы на основе клетки млекопитающего и более конкретно клетки человека, трансформированные вирусными, плазмидными, эписомальными или интегрирующими экспрессирующими векторами.

Такие экспрессирующие векторы могут содержать контролирующие экспрессию последовательности, включая, например, энхансеры, промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые области - которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции трансляции. Длина и специфичность таких элементов может изменяться. В зависимости от используемой векторной системы и хозяина можно использовать любое число подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальные системы можно использовать индуцибельные промоторы, такие как гибридный laCZ-промотор фагмиды PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) или плазмиды PSPORT1 (GibCo BRL, Gaithersburg, Md.) и т.п. В системах на основе клетки млекопитающего, как правило, предпочтительными являются промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Если необходимо получать линии клеток, которые содержат множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущественно можно использовать векторы на основе SV40 или EBV с соответствующим селектируемым маркером.

В определенных вариантах осуществления можно применять экспрессирующие системы на основе E. Coli (см., например, StruCtural GenomiCs Consortium et al., Nature Methods., 5:135-146, 2008). Такие и родственные варианты осуществления могут частично или полностью основываться на лигазно-независимом клонировании (LIC) для продукции подходящего экспрессирующего вектора. В конкретных вариантах осуществления экспрессию белка можно контролировать РНК-полимеразой T7 (например, серией векторов pET). В таких и связанных вариантах осуществления можно экспрессирующий штамм-хозяин BL21(DE3), лизоген λDE3 BL21, который поддерживает T7-опосредованную экспрессию и не содержит протеазы lon и ompT для улучшенной стабильности белка-мишени. Также включены экспрессирующие штаммы-хозяева, несущие плазмиды, кодирующие тРНК, редко используемые в E. Coli, такие как штаммы ROSETTA™ (DE3) и Rosetta 2 (DE3). В некоторых вариантах осуществления можно использовать другие штаммы E. Coli, включая другие штаммы E. Coli K-12, такие как W3110 (F^- lambda^- IN(rrnD-rrnE)1 rph-1), которые могут приводить к сниженным уровням посттрансляционных модификаций во время ферментации. Лизис клеток и обработку образца также можно улучшать с использованием реагентов, продаваемых под товарными марками нуклеаза BENZONASE® и реагент для экстракции белка BUGBUSTER®. Для культуры клеток самоиндуцирующаяся среда может улучшать эффективность многих экспрессирующих систем, включая высокопроизводительные экспрессирующие системы. Среды такого типа (например, самоиндуцирующаяся система OVERNIGHT EXPRESS™) постепенно вызывает экспрессию белка посредством метаболического сдвига без добавления искусственных индуцирующих средств, таких как IPTG.

В конкретных вариантах осуществления применяют гексагистидиновые метки или другие метки аффинности или очистки с последующей очисткой аффинной хроматографией на иммобилизованных ионах металла (IMAC) или родственными способами. Однако в определенных аспектах белки со степенью чистоты для клинического применения можно выделять из телец включения E. Coli без аффинных меток или без их использования (см., например, Shimp et al., Protein Expr Purif., 50:58-67, 2006). В качестве дополнительного примера в определенных вариантах осуществления можно применять индуцируемые холодовым шоком продуцирующие системы с высоким выходом продукта E. Coli, т.к. сверхэкспрессия белков в EsCheriChia Coli при низкой температуре улучшает их растворимость и стабильность (см., например, Qing et al., Nature BioteChnology., 22:877-882, 2004).

Также включены системы бактериальной ферментации с высокой плотностью. Например, культивирование клеток Ralstonia eutropha при высокой плотности обеспечивает продукцию белка при плотности клеток более 150 г/л и экспрессию рекомбинантных белков при титрах, превышающих 10 г/л. В дрожжах SaCCharomyCes Cerevisiae можно использовать ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как альфа-фактор, алкогольоксидаза и PGH. Для обзора см. Ausubel et al. (выше) и Grant et al., Methods Enzymol., 153:516-544 (1987). Также включены экспрессирующие системы PiChia pandoris (см., например, Li et al., Nature BioteChnology., 24, 210-215, 2006, и Hamilton et al., SCienCe, 301:1244, 2003). Определенные варианты осуществления включают дрожжевые системы, которые конструируют для избирательного гликозилирования белков, включая наряду с другими дрожжи, которые имеют гуманизированные пути N-гликозилирования (см., например, Hamilton et al., SCienCe, 313:1441-1443, 2006, Wildt et al., Nature Reviews MiCrobiol., 3:119-28, 2005 и Gerngross et al., Nature-BioteChnology, 22:1409-1414, 2004, патенты США № 7629163, 7326681 и 7029872). Только в качестве примера рекомбинантные дрожжевые культуры можно выращивать наряду с другими в колбах Фернбаха или в 15 л, 50 л, 100 л и 200 л ферментерах.

В случае, когда используют растительные экспрессирующие векторы, экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может регулироваться любым из ряда промоторов. Например, можно использовать вирусные промоторы, такие как промоторы 35S и 19S CaMV, отдельно или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из TMV (Takamatsu, EMBO J., 6:307-311 (1987)). Альтернативно, можно использовать растительные промоторы, такие как малая субъединица RUBISCO или промоторы теплового шока (Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., SCienCe, 224:838-843 (1984) и Winter et al., Results Probl. Cell Differ., 17:85-105 (1991)). Эти конструкции можно вводить в растительные клетки непосредственной трансформацией ДНК или опосредованной патогеном трансфекцией. Такие способы описаны в ряде общедоступных обзоров (см., например, Hobbs in MCGraw Hill, Yearbook of SCienCe and TeChnology, pp. 191-196 (1992)).

Для экспрессии представляющего интерес полипептида также можно использовать системы на основе клеток насекомых. Например, в одной из таких систем используют вирус ядерного полиэдроза (ACNPV) Autographa CaliforniCa в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в клетках TriChoplusia. Последовательности, кодирующие полипептид можно клонировать в неосновную область вируса, такую как ген полиэдрина, и помещать под контроль промотора полиэдрина. Успешное встраивание кодирующей полипептид последовательности приводит к инактивации гена полиэдрина и продукции рекомбинантного вируса, не содержащего белок оболочки. Затем можно использовать рекомбинантные вирусы для инфекции, например, клеток S. frugiperda или клеток TriChoplusia, в которых можно экспрессировать представляющий интерес полипептид (Engelhard et al., ProC. Natl. ACad. SCi. USA, 91:3224-3227 (1994)). Также включены экспрессирующие системы на основе бакуловируса, в том числе такие, в которых используют клетки SF9, SF21 и T. ni (см., например, Murphy and Piwnica-Worms, Curr ProtoC Protein SCi., Chapter 5:Unit 5.4, 2001). Системы на основе клеток насекомых могут обеспечивать посттрансляционные модификации, которые являются аналогичными системам на основе клеток млекопитающих.

В клетках-хозяевах млекопитающих ряд экспрессирующих систем является хорошо известным в данной области и коммерчески доступным. Иллюстративные векторные системы млекопитающих включают, например, pCEP4, pREP4 и pREP7 от Invitrogen, систему PerC6 от CruCell и системы на основе лентивирусов, такие как pLP1 от Invitrogen и другие. Например, в случаях, когда аденовирус используют в качестве экспрессирующего вектора, последовательности, кодирующие представляющий интерес полипептид, можно лигировать в комплекс транскрипция/трансляция аденовируса, состоящий из позднего промотора и состоящих из тройной лидерной последовательности. Встраивание в неосновную область E1 или E3 вирусного генома можно использовать для получения жизнеспособного вируса, который способен экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (Logan & Shenk, ProC. Natl. ACad. SCi. USA, 81:3655-3659, 1984). Кроме того, для увеличения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV).

Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают линию клеток почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); эмбриональных клеток почки человека (клетки 293 или 293 субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клетки почка обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TR1 (Mather et al., Annals N.Y. ACad. SCi., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линию клеток гепатомы человека (Hep G2). Другие пригодные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (CHO), включая DHFR-клетки CHO (Urlaub et al., PNAS USA, 77:4216 (1980)), и линии клеток миеломы, такие как NSO и Sp2/0. Для обзора определенных линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продукции антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in MoleCular Biology, Vol. 248 (B.K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268. Определенные предпочтительные на основе клеток млекопитающих включают экспрессирующие системы на основе клеток CHO и HEK293. В экспрессирующих системах на основе клеток млекопитающих наряду с другими известными в данной области можно использовать прикрепленные линии клеток, например, в T-колбах, роллерных флаконах, или клеточные фабрики, или суспензионные культуры, например, в 1 л и 5 л вращающихся колбах, 5 л, 14 л, 40 л, 100 л и 200 л биореакторах с механическим перемешиванием или 20/50 л и 100/200 л биореакторах WAVE.

Также включены способы бесклеточной экспрессии белка. В таких и родственных вариантах осуществления, как правило, используют очищенную РНК-полимеразу, рибозимы, тРНК и рибонуклеотиды. Такие реагенты можно получать, например, экстракцией из клеток или из экспрессирующей системы на основе клеток.

Кроме того, можно выбирать штамм клеток-хозяев на основании их способности модулировать экспрессию встраиваемых последовательностей или процессировать экспрессируемой белок желаемым образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются ими, посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизация и ацилирование, или встраивание неприродных аминокислот (см. в основном патенты США № US 7939496, US 7816320, US 7947473, US 7883866, US 7838265, US 7829310, US 7820766, US 7820766, US77737226, US 7736872, US 7638299, US 7632924 и US 7230068). Для облегчения правильного встраивания, свертывания и/или функционирования также можно использовать посттрансляционный процессинг, который расщепляет "препро" форму белка. Для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка можно выбирать различные клетки-хозяева, такие как дрожжи, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 и W138, в дополнение к бактериальным клеткам, которые обладают или даже не обладают специальным клеточным аппаратом и характерными механизмами для таких видов посттрансляционной активности.

Полипептиды HRS, продуцируемые рекомбинантными клетками, можно очищать и характеризовать различными способами, известными в данной области. Иллюстративные системы для проведения очистки белка и анализа чистоты белка включают жидкостную экспресс-хроматографию белков (FPLC) (например, системы AKTA и Bio-Rad FPLC), жидкостную хроматографию высокого давления (ВЭЖХ) (например, ВЭЖХ BeCkman and Waters). Иллюстративные химические анализы для очистки включают ионообменную хроматографию (например, Q, S), эксклюзионную хроматографию, солевые градиенты, аффинную очистку (например, Ni, Co, FLAG, мальтозу, глутатион, белок A/G), гель-фильтрацию, обращенно-фазную ионообменную хроматографию CeramiC HYPERD® и колонки с гидрофобным взаимодействием (HIC) наряду с другими известными в данной области. Несколько иллюстративных способов также описаны в разделе примеры.

Рекомбинантные векторы и полинуклеотиды

Другой вариант осуществления изобретения относится к рекомбинантным полинуклеотидам, рекомбинантным векторам и рекомбинантным вирусным векторам, содержащим полинуклеотид, последовательность которого содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует любой из полипептидов HRS, описываемых в настоящем описании.

Также включены составы, содержащие модифицированные и усиленные мРНК, кодирующие полипептиды HRS, которые способны снижать естественную иммунную активность популяции клеток, в которые их вводят, таким образом, повышая эффективность продукции белка в такой популяции клеток. Такие модифицированные мРНК включают, например, структуру 5'Cap1 и хвост полиА длиной приблизительно 160 нуклеотидов, и которые необязательно формулируют в липидном составе, таком как липосома, липоплекс или липидная наночастица, как описано например, в публикации заявки США № 2012/0251618 и международных заявках № PCT/US2011/046861 и PCT/US2011/054636, содержание которых полностью включено посредством ссылки.

Выбор рекомбинантных векторов, подходящих для экспрессии полипептидов HRS по изобретению, способы встраивания последовательностей нуклеиновой кислоты в вектор для экспрессии полипептидов HRS и способы доставки рекомбинантного вектора в представляющие интерес клетки известны специалистам в данной области. См., например, TusChl T., (2002), Nat. BioteChnol., 20: 446-448; Brummelkamp T.R. et al., (2002), SCienCe, 296: 550-553; Miyagishi M. et al., (2002) Nat. BioteChnol., 20: 497-500; Paddison P.J. et al., (2002), Genes Dev., 16: 948-958; Lee N.S. et al., (2002) Nat. BioteChnol., 20: 500-505; Paul C.P. et al., (2002) Nat. BioteChnol., 20: 505-508, Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004) и Fjord-Larsen et al., (2005) Exp. Neurol., 195:49-60, полные описания которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Характерные коммерчески доступные рекомбинантные экспрессирующие векторы включают, например, pREP4, pCEP4, pREP7 и pCDNA3.1, и pCDNA™5/FRT от Invitrogen и векторы pBK-CMV и pExChange-6 Core от Stratagene. Характерные коммерчески доступные вирусные экспрессирующие векторы включают, но не ограничиваются ими, системы на основе аденовирусов, такие как система Per.C6, доступная от CruCell, InC., системы на основе лентивирусов, такие как pLP1 от Invitrogen и ретровирусные векторы, такие как ретровирусные векторы pFB-ERV и pCFB-EGSH от Stratagene (US).

Как правило, можно использовать любой рекомбинантный или вирусный вектор, способный принимать кодирующие последовательности для полипептидов HRS, чтобы их экспрессировать, например, векторы, получаемые из аденовируса (AV), аденоассоциированного вируса (AAV), ретровирусов (например, лентивирусов (LV), рабдовирусов, вируса лейкоза мыши), вируса герпеса, вируса папилломы (патенты США № 6399383 и 7205126) и т.п. Тропизм вирусных векторов также можно модифицировать посредством псевдотипирования векторов с использованием белков оболочки или других поверхностных антигенов от других вирусов. Например, вектор AAV по изобретению можно псевдотипировать белками поверхности из вируса везикулярного стоматита (VSV), бешенства, Эбола, Мокола и т.п. Также можно использовать неинфекционные псевдовирусы, например, вируса папилломы, для эффективной доставки генов в слизистые оболочки (патент США № 7205126, Peng et al., Gene Ther., 2010 Jul 29 epub).

В некоторых аспектах в настоящем изобретении можно использовать вирусные векторы, получаемые из AV и AAV. Векторы AAV, подходящие для экспрессии полипептидов HRS по изобретению, способы конструирования рекомбинантного вектора AAV и способы доставки векторов в клетки-мишени описаны у Samulski R. et al., (1987), J. Virol., 61:3096-3101; Fisher K.J. et al., (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski R. et al., (1989), J. Virol., 63:3822-3826, патенте США № 5252479, патенте США № 5139941, международной патентной заявке № WO 94/13788 и международной патентной заявке № WO 93/24641, полные описания которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Как правило, рекомбинантные векторы и рекомбинантные вирусные векторы включают контролирующие экспрессию последовательности, которые направляют экспрессию полинуклеотида по изобретению в различных системах как in vitro, так и in vivo. Например, один набор регуляторных элементов направляет экспрессию в определенных клетках млекопитающих или тканях, а другой набор регуляторных элементов направляет экспрессию в бактериальные клетки, и еще одни третий набор регуляторных элементов направляет экспрессию в системах на основе бакуловируса. Некоторые векторы представляют собой гибридные векторы, содержащие регуляторные элементы, необходимые для экспрессии более чем в одной системе. Векторы, содержащие такие различные регуляторные системы, являются коммерчески доступными, и специалист в данной области способен легко клонировать полинуклеотиды по изобретению в такие векторы.

В некоторых случаях, полинуклеотиды или векторы содержат промоторы для экспрессии полипептидов HRS в широком спектре клеток. В других случаях векторы содержат промоторы, которые являются тканеспецифическими. Например, промоторы направляют экспрессию только в иммунных клетках, мышечных клетках. В некоторых аспектах вектор по изобретению содержит полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого кодирует полипептид HRS любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182.

Рекомбинантные полинуклеотиды и векторы можно вводить непосредственно пациенту или в сочетании с подходящим реагентом для доставки, включая липофильные реагент Minis Transit LT1, липофектин, липофектамин, целфектин, поликатионы (например, полилизин) или липосомы. Выбор рекомбинантных вирусных векторов, пригодных для использования в изобретении, способы встраивания последовательностей нуклеиновой кислоты для экспрессии полипептидов HRS в вектор и способы доставки вирусного вектора в представляющие интерес клетки известны специалистам в данной области. См., например, Dornburg R., (1995) Gene Therap., 2:301-310; Eglitis M.A., (1988) BioteChniques, 6:608-614; Miller A.D., (1990) Hum. Gene. Therap., 1:5-14 и Anderson W.F., (1998) Nature, 392:25-30, полные описания которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Клетки-хозяева

Некоторые варианты осуществления включают клетку-хозяина, трансформированную вектором или полинуклеотидом, описываемыми в настоящем описании. В некоторых аспектах описываемые в настоящем описании полипептиды HRS экспрессируют с использованием клетки-хозяина для получения или производства полипептида HRS. Такие клетки-хозяева включают бактерии, клетки насекомых, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих.

В некоторых аспектах клетки-хозяева можно использовать для экспрессии и доставки полипептида HRS посредством клеточной терапии. Таким образом, определенные аспекты включают клеточную терапию для лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения, предусматривающую введение клетки-хозяина, экспрессирующей или способной экспрессировать полипептид HRS по изобретению. В некоторых аспектах заболевание или нарушение выбрано из воспалительных миопатий, включая, например, наряду с другими описываемыми в настоящем описании полимиозит, дерматомиозит, перекрестный синдром полимиозит-склеродермия, интерстициальную легочную болезнь, гиперчувствительный пневмонит, склеродермию, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, синдром Черджа-Строса, гранулематоз Вегенера, синдром Гудпасчера, астму, мышечные дистрофии, кахексию и рабдомиолиз.

Клеточная терапия включает введение клеток, которые выбрали, подвергли манипуляции и фармакологически обработали или изменили (например, генетически модифицировали) вне организма (Bordignon C. et al., Cell Therapy: AChievements and PerspeCtives (1999), HaematologiCa, 84, pp. 1110-1149). Такие клетки-хозяева включают, например, первичные клетки, включая мышечные клетки, PBMC, макрофаги и стволовые клетки, которые генетически модифицировали для экспрессии полипептида HRS по изобретению. Целью клеточной терапии является замена, восстановление или усиление биологической функции поврежденных тканей или органов (Bordignon C. et al., (1999), HaematologiCa, 84, pp. 1110-1149).

В некоторых аспектах таких способов клетка-хозяин секретирует полипептид HRS и, таким образом, обеспечивает пополняемый источник полипептида HRS в ткани или органе, в который клетка-хозяин имплантирована.

Другие терапевтические средства

В некоторых вариантах осуществления в композициях и способах, описываемых в настоящем описании, можно применять антитела, фрагменты антител или не являющиеся полипептидом HRS связывающие белки для блокирования активности аутоантител к гистидил-тРНК-синтетазе. В некоторых аспектах антитело или связывающие белок направлен на антигенсвязывающий домен аутоантитела, т.е. антитела представляют собой антиидиотипические антитела, таким образом, избирательно блокируя активность аутоантитело. Таким образом, такие связывающие средства можно использовать для диагностики, лечения или профилактики заболеваний, нарушений или других состояний, опосредованных аутоантителами к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированных с аутоиммунным заболеванием.

Термин "антитело" означает иммуноглобулин природный или синтетически получаемый частично или полностью. Термин также включает любой полипептид или белок, содержащий связывающий домен, который представляет собой антигенсвязывающий домен или является гомологичным ему. Также настоящим термином предусмотрены CDR-привитые антитела, включая биспецифические антитела и гуманизированные антитела, в которых одну или более CDR получают из антител, получаемых из B-клеток, идентифицированных, клонированных или отобранных любым из способов, описываемых или заявляемых в настоящем описании.

"Нативные антитела IgG" и "нативные иммуноглобулины IgG", как правило, представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. В некоторых случаях каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, при этом в различных изотипах иммуноглобулина число дисульфидных связей в тяжелых цепях изменяется. Каждые тяжелые и легкие цепи также содержат регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен ("V_H") с последующими несколькими константными доменами ("C_H"). Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен на одном конце ("V_L") и константный домен ("C_L") на своем другом конце, константный домен легкой цепи является выровненным с первым константным домен тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи является выровненным с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют область контакта между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

Термин "вариабельный домен" относится к доменам белка, последовательность которых значительно различается среди представителей семейства (т.е. среди различных изоформ или в различных видах). В отношении антитела, термин "вариабельный домен" относится к вариабельным доменам антител, которые используется в связывании и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность не является равномерно распределенной на всем протяжении вариабельных доменов антитела. Она сосредоточена в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями, как в вариабельных доменах легких цепей, так и вариабельных доменах тяжелых цепей. Наиболее высококонсервативные участки вариабельных доменов называются "каркасной областью" или "FR". Каждый из вариабельные домены немодифицированных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR (FR1, FR2, FR3 и FR4, соответственно), преимущественно принимающими конфигурацию β-листа, соединенными тремя гипервариабельными областями, где каждая формирует петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть структуры β-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости FR и с гипервариабельными областями из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего участка антител (см. Kabat et al., SequenCes of Proteins of ImmunologiCal Interest, 5th Ed. PubliC Health ServiCe, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647 669). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

Термин "гипервариабельная область" при использовании в настоящем описании относится к аминокислотным остаткам антитела, которые являются ответственными за связывания антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из трех "определяющих комплементарность областей" или "CDR", некоторые непосредственно связываются комплементарным образом с антигеном и известны как CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно.

В вариабельном домене легкой цепи CDR соответствуют приблизительно остаткам 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) и 89-97 (CDRL3), и в вариабельном домене тяжелой цепи CDR соответствуют приблизительно остаткам 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDRH3); Kabat et al., SequenCes of Proteins of ImmunologiCal Interest, 5th Ed. PubliC Health ServiCe, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или таким остаткам из "гипервариабельной петли" (т.е. остаткам 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

Как используют в настоящем описании, "вариабельная каркасная область" или "VFR" относится к каркасным остаткам, которые образуют участок антигенсвязывающего "кармана" и/или бороздку, которая может контактировать с антигеном. В некоторых вариантах осуществления каркасные остатки образуют петлю, которая является частью антигенсвязывающего "кармана" или бороздки. Аминокислотные остатки в петле могут контактировать с антигеном или могу не контактировать с ним. В одном из вариантов осуществления аминокислоты петли VFR определяют исследованием трехмерной структуры антитела, тяжелой цепи антитела или легкой цепи антитела. Трехмерную структуру можно анализировать в отношении положений аминокислот, доступных для растворителя, таких как положения, которые с большей вероятностью образуют петлю и/или обеспечивают контактирование антигена в вариабельном домене антитела. Некоторые положения аминокислот, доступные для растворителя могут допускать разнообразие аминокислотной последовательности, а другие (например, структурные положения) могут быть менее разнообразными. Трехмерную структуру вариабельного домена антитела можно получать из кристаллической структуры или моделирования белка. В некоторых вариантах осуществления VFR содержит, состоит по существу или состоит из положений аминокислот, соответствующих положениям аминокислот от 71 до 78 вариабельного домена тяжелой цепи, где положения определяют согласно Kabat et al., 1991. В некоторых вариантах осуществления VFR образует участок каркасной области 3, расположенный между CDRH2 и CDRH3. Предпочтительно, VFR образует петлю, которая хорошо располагается, чтобы образовывать контакт с антигеном-мишенью или образовывать участок антиген антигенсвязывающего "кармана".

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелой цепи иммуноглобулины можно разделить на различные классы. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи (FC), которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов. "Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) из любых видов позвоночных можно разделить на один из двух четко отличающихся типов, называемых каппа или ("κ") и лямбда или ("λ"), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

Термины "антигенсвязывающий участок антитела", "антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающий домен", "фрагмент антитела" или "функциональный фрагмент антитела" используют взаимозаменяемо в настоящем изобретении для обозначения одного или более фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (см., например, Holliger et al., Nature BioteCh., 23 (9): 1126-1129 (2005)). Неограничивающие примеры фрагментов антител, входящие в термин "антигенсвязывающий участок" антитела, но не ограниченные им, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H антитела с одним плечом, (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature, 341:544-546), который состоит из домена V_H, и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируется отдельными генами, их можно соединять рекомбинантными способами посредством синтетического линкера, который обеспечивает возможность их получения в виде единой цепи белка, в которой области V_L и V_H спариваются с образованием моновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Fv (sCFv), см. например, Bird et al., (1988) SCienCe, 242:423-426 и Huston et al., (1988) PNAS USA, 85:5879-5883, и Osbourn et al., (1998) Nat. BioteChnol., 16:778). Также подразумевают, что такие одноцепочечные антитела входят в термин "антигенсвязывающий участок" антитела. Любые последовательности V_H и V_L конкретного sCFv можно связывать с кДНК или геномными последовательностями константной области иммуноглобулина человека для получения экспрессирующих векторов, кодирующих полные молекулы IgG или другие его изотипы. V_H и V_L также можно использовать для получения Fab, Fv или других фрагментов иммуноглобулинов с использование белковой химии или технологии рекомбинантных ДНК. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела.

Молекулы "F(ab')₂" и "Fab'" можно получать обработкой иммуноглобулина (моноклонального антитела) протеазой, такой как пепсин и папаин, и вводить фрагмент антитела, получаемый расщеплением иммуноглобулина вблизи дисульфидных связей, существующих между шарнирными областями в каждой из двух H-цепей. Например, папаин расщепляет IgG выше дисульфидных связей, существующих между шарнирными областями каждой из двух H-цепей, с образованием двух гомологичных фрагментов антител, в которых L-цепь, состоящая из V_L (вариабельной области L-цепи) и C_L (константной области L-цепи), и фрагмент H-цепи, состоящий из V_H (вариабельной области H-цепи), и C_Hγ1 (области γ1 в константной области H-цепи) соединены в своих C-концевых областях дисульфидной связью. Каждый из этих двух гомологичных фрагментов антител называется Fab'. Пепсин расщепляет IgG ниже дисульфидных связей, существующих между шарнирными областями в каждой из двух H-цепей, с образованием фрагмента антитела незначительно больше, чем фрагмент, в котором два указанных выше Fab' соединены в шарнирной области. Такой фрагмент антитела называется F(ab')₂.

Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (C_H1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличается от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена C_H1 тяжелой цепи, содержащим один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем описании представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток цистеина(ов) константных доменов несет три тиольные группы. Фрагменты F(ab')₂ антител исходно получали в виде пар фрагментов Fab', которые содержали цистеины шарнирной области между собой. Также известны другие виды химического связывания фрагментов антител.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Такая область состоит из димера одной тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной нековалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют с определенным антигенсвязывающим участком на поверхности димера V_H-V_L. В совокупности шесть гипервариабельных областей обеспечивают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три гипервариабельные области, специфичные к антигену) обладает способностью распознавать и связываться с антигеном, но с меньшей аффинностью, чем полный участок связывания.

"Одноцепочечные Fv" или фрагменты антител "sFv" содержат домены V_H и V_L антитела, где эти домены содержатся в одной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который обеспечивает возможность sFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора молекул sFv, см., например, PluCkthun in The PharmaCology of MonoClonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Как используют в настоящем описании, "природные" или "встречающиеся в природе" антитела или вариабельные домены антител относятся к антителам или вариабельным доменам антител, содержащим последовательность антитела или вариабельного домена антитела, определяемую из несинтетического источника, например, из зародышевой последовательности, или дифференцируемую антиген-специфической B-клеткой, получаемой ex vivo, или ее соответствующей линией гибридомных клеток, или из сыворотки животного. Такие антитела могут включать антитела, образуемые при любом типе иммунного ответа, индуцируемого природным путем или иным образом. Природные антитела включают аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, которые состоят или кодируют такие антитела, например, как определено в базе данных Kabat.

Антитела можно получать любым из ряда способов, известных специалистам в данной области. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Моноклональные антитела, специфические к представляющему интерес полипептиду, можно получать, например, способом Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976 и его улучшенными версиями. Также включены способы, в которых для экспрессии антител человека используют трансгенных животных, таких как мыши. См., например, Neuberger et al., Nature BioteChnology, 14:826, 1996; Lonberg et al., Handbook of Experimental PharmaCology 113:49-101, 1994 и Lonberg et al., Internal Review of Immunology, 13:65-93, 1995. Конкретные примеры включают платформу VELOCIMMUNE® от REGERNEREX® (см., например, патент США № 6596541). Антитела также можно получать или идентифицировать с использованием библиотек фагового дисплея или дрожжевого дисплея (см., например, патент США № 7244592; Chao et al., Nature ProtoCols, 1:755-768, 2006). Неограничивающие примеры доступных библиотек включают клонированные или синтетические библиотеки, такие как комбинаторная библиотека антител человека (HuCAL), в которой спектр структурного разнообразия антител человека представлен генами семи вариабельных областей тяжелой цепи и семи вариабельных областей легкой цепи. Сочетания этих генов обуславливает 49 каркасов в основной библиотеке. Накладыванием высоко вариабельных генетических кассет (CDR=определяющие комплементарность области) на эти каркасы, можно получать большое разнообразие антител человека. Также включены библиотеки для человека, конструируемые с использованием фрагментов получаемых от являющихся человеком доноров, кодирующих вариабельную область легкой цепи, CDR-3 тяжелой цепи, синтетическую ДНК, кодирующую разнообразие CDR-1 тяжелой цепи, и синтетическую ДНК, кодирующую разнообразие CDR-2 тяжелой цепи. Другие библиотеки, пригодные для использования, будут понятны специалистам в данной области.

По другому аспекту настоящее изобретение дополнительно относится к альтернативным вариантам антитела или другим связывающим средствам, таким как растворимые рецепторы, аднектины, пептиды, миметики пептидов, аптамеры и т.д., которые обладают специфичностью связывания в отношении аутоантитела к гистидил-тРНК-синтетазе, и композициям и способам их применения. Связывающие средства можно использовать в любом из терапевтических способов и композиций, описываемых в настоящем описании. Биологические связывающие средства, такие как аднектины, растворимые рецепторы, авимеры и тринектины, являются особенно пригодными.

В определенных вариантах осуществления такие связывающие средства являются эффективными для блокирования аутоантител к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированных с аутоиммунным заболеванием. Таким образом, такие связывающие средства можно использовать для диагностики, лечения или профилактики заболеваний, нарушений или других состояний, опосредованных аутоантителами к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированными с аутоиммунным заболеванием, таким образом, как путем полного или частичного антагонизма или агонизма их активности.

Как указано выше, "пептиды" включают в качестве связывающих средств. Термин пептид, как правило, относится к полимеру из аминокислотных остатков и к его вариантам и синтетическим аналогам. В определенных вариантах осуществления термин "пептид" относится к относительно коротким полипептидам, включая пептиды, которые состоят приблизительно из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот, включая все целые числа и диапазоны между ними (например, 5-10, 8-12, 10-15), и взаимодействует с одним или более аутоантителами к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированными с аутоиммунным заболевание. Пептиды могут состоять из природных аминокислот и/или неприродных аминокислот, как описано в настоящем описании.

В дополнение к пептидам, состоящим только из природных аминокислот, также предоставлены пептидомиметики или аналоги пептидов. Аналоги пептидов широко используются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средства со свойствами, аналогичными свойствами эталонного пептида. Такие типы непептидного соединения называются "миметиками пептидов" или "пептидомиметиками" (Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd Ed., Harwood ACademiC Publishers (1996); JoaChim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); FauChere J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS, p. 392 (1985) и Evans et al., J. Med. Chem., 30:229 (1987)). Пептидомиметик представляет собой молекулу, которая имитирует биологическую активность пептида, но не является больше пептидной по химической природе. Соединения пептидомиметиков известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 6245886.

Настоящее изобретение также относится к пептоидам. Пептоидные производные пептидов представляют собой другую форму модифицированных пептидов, которые сохраняют структурные факторы важные для биологической активности, но не содержат пептидных связей, таким образом, обеспечивая устойчивость к протеолизу (Simon et al., PNAS USA, 89:9367-9371, 1992). Пептоиды представляют собой олигомеры N-замещенных глицинов. Был описан ряд N-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты. Пептидомиметики по настоящему изобретению включают соединения, в которых по меньшей мере одну аминокислоту, несколько аминокислот или все аминокислотные остатки заменяют соответствующими N-замещенными глицинами. Пептоидные библиотеки описаны, например, в патенте США № 5811387.

В качестве связывающих средств также включают аптамеры (см., например, Ellington et al., Nature, 346, 818-22, 1990 и Tuerk et al., SCienCe, 249, 505-10, 1990). Примеры аптамеров включают аптамеры нуклеиновых кислот (например, ДНК-аптамеры, РНК-аптамеры) и пептидные аптамеры. Аптамеры нуклеиновых кислот относятся в основном к видам нуклеиновых кислот, которые были сконструированы посредством повторяющихся циклов селекции in vitro или эквивалентным способом, таким как SELEX (систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении) для связывания с различными молекулярными мишенями, такими как низкомолекулярные соединения, белки, нуклеиновые кислоты и даже клетки, ткани и организмы. См., например, патенты США № 6376190 и 6387620. Таким образом, включены аптамеры нуклеиновых кислот, которые связываются с полипептидами AARS, описываемыми в настоящем описании, и/или их клеточными партнерами по связыванию.

Пептидные аптамеры, как правило, содержит вариабельную пептидную петлю, присоединенную с обоих концов к белковому каркасу, двойное структурное ограничение, которое, как правило, повышает аффинность связывания пептидного аптамера до уровней, сравнимых с уровнями антитела (например, в наномолярном диапазоне). В определенных вариантах осуществления длина вариабельной петли может составлять приблизительно 10-20 аминокислот (включая все целые числа между ними), и каркас может содержать любой белок, который обладает хорошими свойствами растворимости и укладки. В определенных иллюстративных вариантах осуществления в качестве белка каркаса можно использовать бактериальный белок тиоредоксин-A, где вариабельную петлю встраивают в участки сниженной активности (петля -Cys-Gly-Pro-Cys- в белке дикого типа), где два цистеина боковых цепей способны образовывать дисульфидный мостик. Способы идентификации пептидных аптамеров описаны, например, в заявке США № 2003/0108532. Таким образом, включены пептидные аптамеры, которые связываются с полипептидами AARS, описываемыми в настоящем описании, и/или их клеточными партнерами по связыванию. Выбор пептидных аптамеров можно проводить с использованием различных систем, известных в данной области, включая дрожжевую двухгибридную систему.

Также включены ADNECTIN™, AVIMER™, анафоны и антикалины, которые специфически связываются с белковым фрагментом AARS по изобретению. ADNECTIN™ относятся к классу направленных биологических препаратов, получаемых из фибронектина человека, распространенного внеклеточного белка, которые в природе связывается с другими белками. См., например, заявки США № 2007/0082365, 2008/0139791 и 2008/0220049. ADNECTIN™, как правило, состоит из природного остова фибронектина, а также многих направленных доменов конкретного участка фибронектина человека. Направленные домены можно конструировать, чтобы обеспечивать специфическое распознавание ADNECTIN™ аутоантител к гистидил-тРНК-синтетазе, ассоциированных с аутоиммунным заболеванием.

AVIMER™ относятся к мультимерным связывающим белкам или пептидам, сконструированным с использованием перестановки экзонов и фагового дисплея in vitro. Многие связывающие домены соединяют, что приводит к большей аффинности и специфичности по сравнению с иммуноглобулиновыми доменами с одним эпитопом. См., например, Silverman et al., Nature BioteChnology, 23:1556-1561, 2005, патент США № 7166697 и заявки США № 2004/0175756, 2005/0048512, 2005/0053973, 2005/0089932 и 2005/0221384.

Также включены сконструированные белки с анкириновыми повторами (дарпины), которые включают класс не являющихся иммуноглобулином белков, которые могут обеспечивать преимущество по сравнению с антителами с точки зрения связывания мишени при исследовании лекарственных средств и разработке лекарственных средств. В числе прочих применений дарпины идеально подходят для визуализации или доставки in vivo токсинов или других терапевтических нагрузок вследствие их благоприятных молекулярных свойств, включая небольшой размер и высокую стабильность. Низкозатратное получение в бактериях и быстрое производство многих специфичных к мишени дарпинов делает подход на основе дарпинов пригодным для исследования лекарственных средств. Кроме того, дарпины можно легко получать в форматах со множественной специфичностью, что дает возможность направлять эффекторный дарпин на конкретный орган или направлять на многие рецепторы с помощью одной молекулы, состоящей из нескольких дарпинов. См., например, Stumpp et al., Curr Opin Drug DisCov Devel., 10:153-159, 2007, заявку США № 2009/0082274 и PCT/EP2001/10454.

Определенные варианты осуществления включают "монотела", в которых, как правило, используют 10-й домен фибронектина III типа фибронектина человека (FNfn10) в качестве каркаса для предоставления многих петель поверхности для связывания мишени. FNfn10 представляет собой небольшой (94 остатка) белок со структурой β-сэндвич, аналогичной укладке иммуноглобулина. Оно является высокостабильным без дисульфидных связей или ионов металлов, и его можно экспрессировать в бактериях на высоком уровне в правильно свернутой форме. Каркас FNfn10 является совместимым практически с любыми технологиями на основе дисплея. См., например, Batori et al., Protein Eng., 15:1015-20, 2002 и WojCik et al., Nat. StruCt. Mol. Biol., 2010 и патент США № 6673901.

Антикалины относятся к классу миметиков антител, которые, как правило, синтезируют из липокалинов человека, семейства связывающих белков с гипервариабельной областью петли, поддерживаемой структурно жестким каркасом. См., например, заявка США № 2006/0058510. Размер антикалинов, как правило, составляет приблизительно 20 кДа. Антикалины характеризуются бочковидной структурой, образуемой восемью антипараллельными β-цепями (стабильный β-бочковидный каркас), которые попарно соединены четырьмя пептидными петлями, и присоединенной α-спиралью. В определенных аспектах в гипервариабельной области(ях) петли проводят конформационные изменения для получения специфического связывания. См., например, Skerra, FEBS J., 275:2677-83, 2008, включенную в настоящее описание посредством ссылки.

Терапевтические композиции, фармацевтические составы, введение и наборы

Варианты осуществления настоящего изобретения включают терапевтические или фармацевтические композиции для лечения воспалительного заболевания(ий), мышечных дистрофий, рабдомиолиза, кахексии и других заболеваний, описываемых в настоящем описании, содержащим по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS обладает одним или более видов неканонической активности.

Также включены терапевтические или фармацевтические композиции для лечения аутоиммунного заболевания(ий), содержащие по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS обладает одним или более видов неканонической активности.

Некоторые варианты осуществления относятся к терапевтическим или фармацевтическим композициям для лечения аутоиммунных заболеваний, воспалительного заболевания(ий), мышечных дистрофий, рабдомиолиза, кахексии и других заболеваний, описываемых в настоящем описании, содержащим по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп, который дает специфическую перекрестную реакцию с аутоантителом или аутореактивной T-клеткой при заболевании, ассоциированным с аутоантителами к гистидил-тРНК-синтетазе, и/или обладает одним или более видов неканонической активности. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп Th гистидил-тРНК-синтетазы.

Некоторые варианты осуществления включают терапевтические или фармацевтические композиции для лечения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания(ий), мышечных дистрофий, рабдомиолиза, кахексии и других заболеваний, описываемых в настоящем описании, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид HRS млекопитающих, где полипептид HRS содержит по меньшей мере один эпитоп гистидил-тРНК-синтетазы и/или обладает одним или более видов неканонической активности, и где нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями для обеспечения экспрессии HRS в клетке.

Определенные варианты осуществления включают терапевтические или фармацевтические композиции для лечения заболеваний, ассоциированных с аутоантителами, специфическими для гистидил-тРНК-синтетазы, содержащих рекомбинантную клетку-хозяина, где клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один гетерологичный полипептид HRS, который содержит по меньшей мере один эпитоп гистидил-тРНК-синтетазы, и где нуклеиновая кислота является функционально связанной с контролирующими экспрессию последовательностями для обеспечения экспрессии HRS в клетке. Также включены терапевтические или фармацевтические композиции для лечения заболеваний, ассоциированных с недостаточностью гистидил-тРНК-синтетазы, содержащие по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS способен заменять по меньшей мере один вид канонической или неканоническая функции гистидил-тРНК-синтетазы.

Некоторые варианты осуществления включают терапевтические или фармацевтические композиции для лечения заболеваний, ассоциированных с аутоантителом, специфическим к гистидил-тРНК-синтетазе, содержащие по меньшей мере один полипептид HRS, где полипептид HRS значительно не конкурирует за связывание аутоантитела, ассоциированного с заболеванием, с гистидил-тРНК-синтетазой в конкурентном ELISA до концентрации приблизительно 1×10^-7M.

Некоторые варианты осуществления включают терапевтические или фармацевтические композиции, которые повышают, оптимизируют или увеличивают стабильность, гомогенность, монодисперсность или активность полипептидов HRS.

Также изобретение относится к пригодным с медицинской точки зрения терапевтическим или фармацевтическим композициям, содержащим полипептид по меньшей мере приблизительно 400 аминокислот полипептида HRS, где полипептид является:

a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистым;

b) менее чем приблизительно на 5% агрегированным; и

C) по существу не содержит эндотоксинов.

В другом варианте осуществления пригодные с медицинской точки зрения терапевтические или фармацевтические композиции содержат полипептид HRS приблизительно от 40 и 80 аминокислот, где полипептид является:

a) по меньшей мере приблизительно на 95% чистым;

b) менее чем приблизительно на 5% агрегированным; и

C) по существу не содержит эндотоксинов.

Также предусмотрены новые медицинские применения полипептидов HRS для получения лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания.

В любых из этих терапевтических композиций и применений композиции можно формулировать в фармацевтически приемлемых, физиологически приемлемых и/или растворах с фармацевтической степенью чистоты для введения в клетку, индивидууму или животному отдельно или в комбинации с один или более другим видом терапии. Также следует понимать, что при желании композиции по изобретению также можно вводить в комбинации с другими средствами, такими как, например, другие белки или полипептиды, или фармацевтически активные средства. В этом контексте "вводимый в комбинации" включает (1) часть той же самой готовой лекарственной формы и (2) введение раздельно, но в качестве части той же самой программы терапевтического лечения или схемы лечения, как правило, но не обязательно, на те же самые сутки.

В некоторых вариантах осуществления композиции содержат смесь из 2 или более полипептидов HRS. В некоторых аспектах композиции могут содержать приблизительно от 2 приблизительно до 50 или приблизительно от 2 приблизительно до 25, или приблизительно от 2 приблизительно до 15 или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более полипептидов HRS, описываемых в настоящем описании.

Терапевтические или фармацевтические композиции, содержащие терапевтическую дозу полипептида HRS, содержат любой один или более гомологов, ортологов, вариантов, фрагментов, модифицированных полипептидов и/или природных изоформ гистидил-тРНК-синтетазы, описываемых в настоящем описании (например, любую из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 или любой из полипептидов HRS или нуклеиновых кислот, перечисленных в таблицах D1-D9 и получаемых из них).

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS значительно не конкурирует за связывание аутоантитела, ассоциированного с заболеванием, с гистидил-тРНК-синтетазой дикого типа в конкурентном ELISA до концентрации приблизительно 1×10^-7M. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает меньшей аффинностью к аутоантителу, ассоциированному с заболеванием, чем к гистидил-тРНК-синтетазе дикого типа (SEQ ID NO: 1), как измеряют в конкурентом ELISA. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает кажущейся аффинностью к аутоантителу, ассоциированному с заболеванием, которая является по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 20 раз меньше, или по меньшей мере приблизительно в 50 раз меньше, или по меньшей мере приблизительно в раз 100 меньше аффинности аутоантитела, ассоциированного с заболеванием, к гистидил-тРНК-синтетазе дикого типа человека (SEQ ID NO: 1).

Для фармацевтического получения композиции полипептида HRS, как правило, по существу не содержат эндотоксинов. Эндотоксины представляют собой токсины, ассоциированные с определенными бактериями, как правило, грамотрицательными бактериями, хотя эндотоксины можно найти в грамположительных бактериях, таких как Listeria monoCytogenes. Наиболее распространенные эндотоксины представляют собой липополисахариды (LPS) или липоолигосахариды (LOS), встречающиеся на наружной мембране различных грамотрицательных бактерий, и которые представляют собой основной патогенный признак способности этих бактерий вызывать заболевание. Небольшие количества эндотоксина могут вызывать у людей лихорадку, понижение артериального давления и активацию воспаления и коагуляции наряду с другими неблагоприятными физиологическими эффектами.

Эндотоксины можно детектировать общепринятыми способами, известными в данной области. Например, анализ с использованием лизата амебоцитов мечехвоста лизат, в котором используют кровь мечехвоста, является очень чувствительным анализом детекции наличия эндотоксина. В этом тесте очень низкие уровни LPS могут вызывать детектируемую конъюгацию лизата мечехвоста вследствие мощного каскада ферментативных реакций, происходящих при такой реакции. Эндотоксины также можно количественно оценивать твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA).

Для того чтобы эндотоксины по существу не содержались, уровни эндотоксинов могут составлять приблизительно или менее приблизительно 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,08, 0,09, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ЕЭ/мг белка. Как правило, 1 нг липополисахарида (LPS) соответствует приблизительно 1-10 ЕЭ.

В определенных вариантах осуществления содержание эндотоксинов в композиции составляет приблизительно или менее приблизительно 10 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 9 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 8 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 7 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 6 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 5 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 4 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 3 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 2 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 1 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 1 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мг полипептида HRS, приблизительно или менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мг полипептида HRS или приблизительно или менее приблизительно 0,01 ЕЭ/мг полипептида HRS. В определенных вариантах осуществления как указано выше, композиция является чистой от эндотоксинов по меньшей мере приблизительно на 95%, 96%, 97% или 98%, по меньшей мере приблизительно на 99% чистой от эндотоксинов, по меньшей мере приблизительно на 99,5% чистой от эндотоксинов или по меньшей мере приблизительно на 99,99% чистой от эндотоксинов в пересчете на мас./мас. белка.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит один или более средств для буферирования pH, т.е. буферы. Иллюстративные буферы включают гистидин (например, L-гистидин, D-гистидин), цитратные буферы (например, цитрат натрия, лимонную кислоту их смеси) и фосфатные буферы (например, фосфат натрия, фосфатно-солевой буфер (PBS)).

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 30 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 25 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 20 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 15 мМ, или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 10 мМ или приблизительно от 0,3 мМ приблизительно до 5 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 1 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 30 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 25 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 20 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 15 мМ, или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 10 мМ или приблизительно от 1 мМ приблизительно до 5 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 2 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 30 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 25 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 20 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 15 мМ, или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 10 мМ или приблизительно от 2 мМ приблизительно до 5 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 5 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 30 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 25 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 20 мМ, или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 15 мМ или приблизительно от 5 мМ приблизительно до 10 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 10 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 30 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 25 мМ, или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 20 мМ или приблизительно от 10 мМ приблизительно до 15 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 15 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 30 мМ или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 25 мМ, или приблизительно от 15 мМ приблизительно до 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 20 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 35 мМ, или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 30 мМ или приблизительно от 20 мМ приблизительно до 25 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 25 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 40 мМ, или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 35 мМ или приблизительно от 25 мМ приблизительно до 30 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 30 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 45 мМ, или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 40 мМ или приблизительно от 30 мМ приблизительно до 35 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 35 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 50 мМ, или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 45 мМ или приблизительно от 35 мМ приблизительно до 40 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 40 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 55 мМ, или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 50 мМ или приблизительно от 40 мМ приблизительно до 45 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 45 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 60 мМ, или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 55 мМ или приблизительно от 45 мМ приблизительно до 50 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 50 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 65 мМ, или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 60 мМ или приблизительно от 50 мМ приблизительно до 55 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 55 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 65 мМ или приблизительно от 55 мМ приблизительно до 60 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 60 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 75 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 70 мМ, или приблизительно от 60 мМ приблизительно до 65 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 65 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 65 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 65 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 65 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 65 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 65 мМ приблизительно до 75 мМ или приблизительно от 65 мМ приблизительно до 70 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 70 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 70 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 70 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 70 мМ приблизительно до 85 мМ, или приблизительно от 70 мМ приблизительно до 80 мМ, или приблизительно от 70 мМ приблизительно до 75 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 75 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 75 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 75 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 75 мМ приблизительно до 85 мМ или приблизительно от 75 мМ приблизительно до 80 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 80 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 80 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 80 мМ приблизительно до 90 мМ, или приблизительно от 80 мМ приблизительно до 85 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 85 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 85 мМ приблизительно до 95 мМ, или приблизительно от 85 мМ приблизительно до 90 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно от 90 мМ приблизительно до 100 мМ, или приблизительно от 90 мМ приблизительно до 95 мМ или приблизительно от 95 мМ приблизительно до 100 мМ.

В некоторых вариантах осуществления буфер содержится в концентрации в диапазоне приблизительно 40-60, 41-60, 42-60, 43-60, 44-60, 45-60, 46-60, 47-60, 48-60, 49-60, 50-60, 51-60, 52-60, 53-60, 54-60, 55-60, 56-60, 57-60, 58-60, 59-60 мМ или приблизительно 40-59, 41-59, 42-59, 43-59, 44-59, 45-59, 46-59, 47-59, 48-59, 49-59, 50-59, 51-59, 52-59, 53-59, 54-59, 55-59, 56-59, 57-59, 58-59 мМ, или приблизительно 40-58, 41-58, 42-58, 43-58, 44-58, 45-58, 46-58, 47-58, 48-58, 49-58, 50-58, 51-58, 52-58, 53-58, 54-58, 55-58, 56-58, 57-58 мМ, или приблизительно 40-57, 41-57, 42-57, 43-57, 44-57, 45-57, 46-57, 47-57, 48-57, 49-57, 50-57, 51-57, 52-57, 53-57, 54-57, 55-57, 56-57 мМ, или приблизительно 40-56, 41-56, 42-56, 43-56, 44-56, 45-56, 46-56, 47-56, 48-56, 49-56, 50-56, 51-56, 52-56, 53-56, 54-56, 55-56 мМ, или приблизительно 40-55, 41-55, 42-55, 43-55, 44-55, 45-55, 46-55, 47-55, 48-55, 49-55, 50-55, 51-55, 52-55, 53-55, 54-55 мМ, или приблизительно 40-54, 41-54, 42-54, 43-54, 44-54, 45-54, 46-54, 47-54, 48-54, 49-54, 50-54, 51-54, 52-54, 53-54 мМ, или приблизительно 40-53, 41-53, 42-53, 43-53, 44-53, 45-53, 46-53, 47-53, 48-53, 49-53, 50-53, 51-53, 52-53 мМ, или приблизительно 40-52, 41-52, 42-52, 43-52, 44-52, 45-52, 46-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 51-52 мМ, или приблизительно 40-51, 41-51, 42-51, 43-51, 44-51, 45-51, 46-51, 47-51, 48-51, 49-51, 50-51 мМ, или приблизительно 40-50, 41-50, 42-50, 43-50, 44-50, 45-50, 46-50, 47-50, 48-50, 49-50 мМ, или приблизительно 40-49, 41-49, 42-49, 43-49, 44-49, 45-49, 46-49, 47-49, 48-49 мМ, или приблизительно 40-48, 41-48, 42-48, 43-48, 44-48, 45-48, 46-48, 47-48 мМ, или приблизительно 40-47, 41-47, 42-47, 43-47, 44-47, 45-47, 46-47 мМ, или приблизительно 40-46, 41-46, 42-46, 43-46, 44-46, 45-46 мМ, или приблизительно 40-45, 41-45, 42-45, 43-45, 44-45 мМ, или приблизительно 40-44, 41-44, 42-44, 43-44 мМ, или приблизительно 40-43, 41-43, 42-43 мМ, или приблизительно 40-42, 41-42 мМ или приблизительно 40-42 мМ.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит буфер в концентрации приблизительно 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 мМ, включая все диапазоны между ними.

В некоторых вариантах осуществления наличие буфера изменяет (например, улучшает, повышает, снижает, ослабляет) одно или более биохимических, физических и/или фармакокинетических свойств полипептида HRS относительно композиции без буфера или с другим буфером.

Например, в определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии буфера обладает повышенной биологической активностью относительно соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. Иллюстративные виды активности включают любой из видов неканонической активности, описываемых в настоящем описании, такие как виды противовоспалительной активности и другие виды биологической активности, включая связывание с антителом (например, связывание с антителом к Jo-1). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в буфере обладает по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз большей или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% большей биологической активностью по сравнению с соответствующим полипептидом HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В конкретных аспектах буфер представляет собой гистидиновый буфер.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии буфера обладает повышенной "стабильностью" (например, как измеряют по времени полужизни), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз большей или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% большей, чем у соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В конкретных аспектах буфер представляет собой гистидиновый буфер.

В некоторых вариантах осуществления "стабильность" полипептида HRS включает его "функциональную стабильность" или скорость, при которой по меньшей мере один вид биологической активности полипептида HRS понижается при данном наборе условий в течение определенного периода времени. Иллюстративные виды биологической активности включают любой один или более видов канонической или неканонической активности, описываемой в настоящем описании, включая, например, сохранение по меньшей мере одного эпитопа, который дает специфическую перекрестную реакцию с антителом к Jo-1. В некоторых вариантах осуществления биологическая активность полипептида HRS в присутствии буфера снижается со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В конкретных аспектах буфер представляет собой гистидиновый буфер.

В определенных вариантах осуществления "стабильность" полипептида HRS включает его "кинетическую стабильность" или "термостабильность", включая скорость развертывания, агрегации или осаждения при данном наборе условий в течение определенного периода времени. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии буфер развертывается, агрегирует или преципитирует со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии буфер развертывается, агрегирует или преципитирует со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии буфера имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% больше чем температура плавления соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии буфера имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C выше чем у соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В конкретных аспектах буфер представляет собой гистидиновый буфер.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает улучшенной или повышенной гомогенностью или монодисперсностью (например, отношением мономеров/олигомеров, отношением димеров/олигомеров, отношением мономеров/димеров, отношением димеров/мономеров, отношением образования межцепочечных дисульфидных связей в восстановительных условиях, распределением кажущихся молекулярных масс, включая пониженные пики высокомолекулярных и/или низкомолекулярных соединений, как детектируют анализом SDS-PAGE или ВЭЖХ) в присутствии буфера относительно соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В некоторых вариантах осуществления гомогенность или монодисперсность полипептида HRS в буфере повышается по меньшей мере приблизительно по меньшей мере в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно соответствующего полипептида HRS в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В конкретных аспектах буфер представляет собой гистидиновый буфер при pH в диапазоне приблизительно от pH 7,0 приблизительно до pH 7,5, или цитратный буфер при pH в диапазоне приблизительно от pH 7,5 приблизительно до pH 6,5.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS в присутствии гистидинового или цитратного буфера характеризуется пониженным пиком(ами) высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, которое составляет менее приблизительно 2% от основного пика после 2 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах HRS композиция характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 1% от основного пика после 2 суток хранения при 37°C.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS в присутствии гистидинового или цитратного буфера характеризуется пониженным пиком(ами) низкомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS в присутствии гистидинового или цитратного буфера имеет пониженную мутность (A340), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в иным образом идентичной или сравнимой композиции без буфера или с другим буфером. В некоторых аспектах композиция HRS содержит гистидиновый буфер приблизительно pH от 7,0 до 7,5 и имеет мутность (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 2 суток хранения при 37°C. В конкретных аспектах композиция HRS имеет мутность (A340), которая составляет менее приблизительно 0,05 после 2 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS содержит цитратный буфер приблизительно pH от 7,0 до 7,5 и имеет мутность (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 2 суток хранения при 37°C. В конкретных аспектах композиция HRS имеет мутность (A340), которая составляет менее приблизительно 0,05 после 2 суток хранения при 37°C.

В определенных вариантах осуществления pH композиции (например, в присутствии буферного средства или буфера) составляет приблизительно 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления pH композиции находится в диапазоне приблизительно 6,0-6,1, 6,0-6,2, 6,0-6,3, 6,0-6,4, 6,0-6,5, 6,0-6,6, 6,0-6,7, 6,0-6,8, 6,0-6,9, 6,0-7,0, 6,0-7,1, 6,0-7,2, 6,0-7,3, 6,0-7,4, 6,0-7,5, 6,0-7,6, 6,0-7,7, 6,0-7,8, 6,0-7,9, 6,0-8,0 или приблизительно 6,5-6,6, 6,5-6,7, 6,5-6,8, 6,5-6,9, 6,5-7,0, 6,5-7,1, 6,5-7,2, 6,5-7,3, 6,5-7,4, 6,5-7,5, 6,5-7,6, 6,5-7,7, 6,5-7,8, 6,5-7,9, 6,5-8,0, или приблизительно 7,0-7,1, 7,0-7,2, 7,0-7,3, 7,0-7,4, 7,0-7,5, 7,0-7,6, 7,0-7,7, 7,0-7,8, 7,0-7,9, 7,0-8,0, или приблизительно 7,2-7,3, 7,2-7,4, 7,2-7,5, 7,2-7,6, 7,2-7,7, 7,2-7,8, 7,2-7,9, 7,2-8,0, или приблизительно 7,4-7,5, 7,4-7,6, 7,4-7,7, 7,4-7,8, 7,4-7,9, 7,4-8,0, или приблизительно 7,5-7,6, 7,5-7,7, 7,5-7,8, 7,5-7,9, 7,5-8,0 или приблизительно 7,6-7,7, 7,6-7,8, 7,6-7,9 или 7,6-8,0.

В некоторых вариантах осуществления pH композиции или буфера изменяет (например, улучшает, повышает, снижает, ослабляет) одно или более биохимических, физических и/или фармакокинетических свойств полипептида HRS относительно композиции с pH вне указанных выше диапазонов. В конкретных вариантах осуществления буфер является гистидиновым, и pH композиции находится в диапазоне приблизительно 7,0-7,5. В других вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер, и pH композиции находится в диапазоне приблизительно 6,5-7,5. В других вариантах осуществления буфер представляет собой натрий фосфатный буфер, и pH композиции находится в диапазоне приблизительно 7,0-7,5.

Например, в определенных вариантах осуществления полипептид HRS в композиции, содержащей (a) гистидиновый буфер и pH приблизительно 7,0-7,5, (b) цитратный буфер и pH приблизительно 6,5-7,5, или (C) фосфатный буфер и pH приблизительно 7,0-7,5, обладает повышенной биологической активностью относительно сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов. Иллюстративные виды активности включают любой из видов неканонической активности, описываемых в настоящем описании, такие как виды противовоспалительной активности и другие виды биологической активности, включая связывание с антителом (например, связывание с антителами к Jo-1). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз большей или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% большей биологической активностью по сравнению с соответствующим полипептидом HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в композиции, содержащей (a) гистидиновый буфер и pH приблизительно 7,0-7,5, (b) цитратный буфер и pH приблизительно 6,5-7,5 или (C) фосфатный буфер и pH приблизительно 7,0-7,5, обладает повышенной "стабильностью" (например, как измеряют по времени полужизни), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз большей или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% большей чем у соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В некоторых вариантах осуществления "стабильность" полипептида HRS включает его "функциональную стабильность" или скорость, с которой по меньшей мере один вид биологической активности полипептида HRS снижается при данном наборе условий в течение определенного периода времени. Иллюстративные виды биологической активности включают любой один или более видов канонической или неканонической активности, описываемых в настоящем описании, включая, например, сохранение по меньшей мере одного эпитопа, который дает специфическую перекрестную реакцию с антителом к Jo-1. В некоторых вариантах осуществления биологическая активность полипептида HRS снижается со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В определенных вариантах осуществления "стабильность" полипептида HRS включает его "кинетическую стабильность" или "термостабильность", включая скорость его развертывания при данном наборе условий в течение определенного периода времени. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS развертывается со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% больше чем температура плавления соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C выше чем у соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS обладает улучшенной или повышенной гомогенностью или монодисперсностью (например, отношением мономеров/олигомеров, отношением димеров/олигомеров, отношением мономеров/димеров, отношением димеров/мономеров, отношением образования межцепочечных дисульфидных связей в восстановительных условиях, распределением кажущихся молекулярных масс, например, пониженными пиками высокомолекулярных или низкомолекулярных соединений, детектируемых анализом SDS-PAGE или ВЭЖХ) относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов. В некоторых вариантах осуществления гомогенность или монодисперсность полипептида HRS повышается по меньшей мере приблизительно по меньшей мере в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS с pH в указанных выше диапазонах (a), (b) или (C) характеризуется пониженным пиком(ами) высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS с pH в указанных выше диапазонах (a), (b), или (C) характеризуется пониженным пиком(ами) низкомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, которые является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS с pH в указанных выше диапазонах (a), (b), или (C) характеризуется сниженной мутностью (A340), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток относительно соответствующего полипептида HRS в сравнимой композиции с pH вне указанных выше в (a), (b) или (C) диапазонов.

В некоторых вариантах осуществления композиция имеет определенную ионную силу, например, определенную концентрацию хлорида натрия (NaCl) или другой соли. Например, композиция может содержать приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 или 400 мМ NaCl или другой соли, включая все целые числа и диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит приблизительно 50-300, 100-300, 150-300, 200-300, 250-300, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 50-200, 100-200, 150-200, 50-150, 100-150 или 50-100 мМ NaCl или другой соли. В определенных вариантах осуществления композиция содержит высокую концентрацию солей, например, приблизительно или ≥ приблизительно 140 мМ NaCl приблизительно или ≥ приблизительно 280 мМ NaCl.

В некоторых вариантах осуществления содержание NaCl в любой одной или более из таких концентраций или диапазонов изменяет (например, улучшает, повышает, снижает, ослабляет) одно или более биохимических, физических и/или фармакокинетических свойств полипептида HRS относительно композиции без NaCl или относительно композиции с концентрацией NaCl, которая находится вне указанных выше количеств или диапазонов. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии определенной концентрации NaCl развертывается, агрегирует или преципитирует со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без определенной концентрации NaCl.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии NaCl развертывается, агрегирует или преципитирует со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без NaCl или с концентрацией NaCl, которая находится вне указанных выше количеств или диапазонов.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии определенной концентрации NaCl имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% больше чем температура плавления соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без определенной концентрации NaCl. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии определенной концентрации NaCl имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C выше чем у соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без определенной концентрации NaCl или с концентрацией NaCl, которая находится вне указанных выше количеств или диапазонов. В определенных вариантах осуществления композиция также содержит буфер, как описано выше. В конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер. В других вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS имеет концентрацию NaCl в диапазоне приблизительно от 140 мМ приблизительно до 240 мМ и характеризуется пониженным пиком(ами) высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без NaCl. В некоторых аспектах композиция HRS содержит приблизительно от 140 мМ приблизительно до 280 мМ NaCl, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, которое составляет менее приблизительно 2% от основного пика после 2 суток хранения при 37°C. В конкретных аспектах композиция HRS характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 1% от основного пика после 2 суток хранения при 37°C.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS имеет концентрацию NaCl в диапазоне приблизительно от 140 мМ приблизительно до 240 мМ и характеризуется пониженным пиком(ами) низкомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без NaCl или с концентрацией NaCl, которая находится вне диапазона приблизительно от 140 мМ приблизительно до 240 мМ.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS имеет концентрацию NaCl в диапазоне приблизительно от 140 мМ приблизительно до 240 мМ и характеризуется пониженной мутностью (A340), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без NaCl или с концентрацией NaCl, которая находится вне диапазона приблизительно от 140 мМ приблизительно до 240 мМ. В некоторых аспектах композиция HRS содержит приблизительно от 140 мМ приблизительно до 280 мМ NaCl, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 2 суток хранения при 37°C. В конкретных аспектах композиция HRS имеет мутность (A340), которая составляет менее приблизительно 0,05 после 2 суток хранения при 37°C.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Иллюстративные эксципиенты включают без ограничения сахарозу, маннит, трегалозу, сорбит, аргинин, глицин и глицерин. В определенных вариантах осуществления эксципиент содержится приблизительно при 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10% (масс./об.), включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления эксципиент содержится в диапазоне приблизительно 0,1-5,0, 0,1-4,5, 0,1-4,0. 0,1-3,5, 0,1-3,0, 0,1-2,5, 0,1-2,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-0,5% (масс./об.) или в диапазоне приблизительно 0,2-5,0, 0,2-4,5, 0,2-4,0, 0,2-3,5, 0,2-3,0, 0,2-2,5, 0,2-2,0, 0,2-1,5, 0,2-1,0, 0,2-0,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 0,5-5,0, 0,5-4,5, 0,5-4,0, 0,5-3,5, 0,5-3,0, 0,5-2,5, 0,5-2,0, 0,5-1,5, 0,5-1,0% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 1,0-5,0, 1,0-4,5, 1,0-4,0, 1,0-3,5, 1,0-3,0, 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 1,5-5,0, 1,5-4,5, 1,5-4,0, 1,5-3,5, 1,5-3,0, 1,5-2,5, 1,5-2,0% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 2,0-5,0, 2,0-4,5, 2,0-4,0. 2,0-3,5, 2,0-3,0, 2,0-2,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 2,5-5,0, 2,5-4,5, 2,5-4,0, 2,5-3,5, 2,5-3,0% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 3,0-5,0, 3,0-4,5, 3,0-4,0, 3,0-3,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 3,5-5,0, 3,5-4,5, 3,5-4,0% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 4,0-5,0, 4,0-4,5 или 4,5-5,0% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления эксципиент содержится в концентрации приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 или 400 мМ, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления эксципиент содержится в диапазоне концентраций приблизительно 50-400, 100-400, 150-400, 200-400, 250-400, 300-400, 350-400, 50-350, 100-350, 150-350, 200-350, 250-350, 300-350, 50-300, 100-300, 150-300, 200-300, 250-300, 50-250, 100-250, 150-250, 200-250, 50-200, 100-200, 150-200, 50-150, 100-150 или 50-100 мМ.

В некоторых вариантах осуществления наличие одного или более эксципиентов изменяет (например, улучшает, повышает, снижает, ослабляет) одно или более биохимических, физических и/или фармакокинетических свойств полипептида HRS относительно композиции без эксципиента(ов) или относительно композиции с концентрацией эксципиента(ов), которая находится вне указанных выше количеств или диапазонов. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии эксципиента(ов) развертывается со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без эксципиента(ов). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии эксципиента(ов) имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% больше чем температура плавления соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без эксципиента(ов). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии эксципиента(ов) имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C выше чем у соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без эксципиента(ов). В определенных вариантах осуществления композиция также содержит буфер, как описано выше, и необязательно имеет определенную концентрацию NaCl, как описано выше. В конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер. В других вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер.

В определенных вариантах осуществления композиция содержит один или более поверхностно-активных веществ. Иллюстративные поверхностно-активные вещества включают без ограничения полисорбаты и полоксамеры. Полисорбаты представляют собой маслянистые жидкости, получаемые из пегилированного сорбитана (производного сорбита), который подвергают этерификации жирной кислотой. Некоторые полисорбаты представляют являются доступными под товарными наименованиями Alkest™, CanarCel™ и Tween™. Иллюстративные полисорбаты включают полисорбат 20 (полиоксиэтилен (20) монолаурат сорбитана), полисорбат 40 (полиоксиэтилен (20) монопальмитат сорбитана), полисорбат 60 (полиоксиэтилен (20) моностеарат сорбитана) и полисорбат 80 (полиоксиэтилен (20) моноолеат сорбитана). Полоксамеры представляют собой неионные триблок-сополимеры, которые содержит центральную гидрофобную цепь полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)), фланкированную двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)). Некоторые полоксамеры являются доступными под товарными наименованиями SynperoniCs™, PluroniCs™ и Kolliphor™. В определенных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество содержится приблизительно при 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0% (масс./об.), включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество содержится в диапазоне приблизительно 0,01-3,0, 0,01-2,5, 0,01-2,0, 0,01-1,5, 0,01-1,0, 0,01-1,5, 0,01-1,0, 0,01-0,5, 0,01-0,1% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 0,05-3,0, 0,05-2,5, 0,05-2,0, 0,05-1,5, 0,05-1,0, 0,05-1,5, 0,05-1,0, 0,05-0,5, 0,05-0,1% (масс./об.) или в диапазоне приблизительно 0,1-3,0, 0,1-2,5, 0,1-2,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-0,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 0,5-3,0, 0,5-2,5, 0,5-2,0, 0,5-1,5, 0,5-1,0, 0,5-1,5, 0,5-1,0% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 1,0-3,0, 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 1,5-3,0, 1,5-2,5, 1,5-2,0% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 2,0-3,0, 2,0-2,5% (масс./об.), или в диапазоне приблизительно 2,5-3,0% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 (PS20). В определенных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер плюроник F68.

В некоторых вариантах осуществления наличие одного или более поверхностно-активных веществ изменяет (например, улучшает, повышает, снижает, ослабляет) один или более биохимических, физических и/или фармакокинетических свойств полипептида HRS относительно композиции без поверхностно-активного вещества(в) или относительно композиции с концентрацией поверхностно-активного вещества(в), которая находится вне указанных выше количеств или диапазонов. В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) развертывается, агрегирует или преципитирует со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в).

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) развертывается, агрегирует или преципитирует со скоростью, которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 раз меньше или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% меньше чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в).

В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% больше чем температура плавления соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в). В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) имеет температуру плавления (T_m), которая является по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50°C выше чем у соответствующего полипептида HRS в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в). В определенных вариантах осуществления композиция также содержит буфер, как описано выше, и необязательно имеет определенную концентрацию NaCl, как описано выше, и необязательно содержит один или более эксципиентов, как описано выше. В конкретных вариантах осуществления буфер представляет собой гистидиновый буфер. В других вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) характеризуется пониженным пиком(ами) высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в).

В некоторых аспектах композиция HRS содержит PS20, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и приблизительно 140 мМ NaCl и характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 1% от основного пика в анализе SE-ВЭЖХ после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 0,5% от основного пика после 7 суток хранения при 37°C.

В некоторых аспектах композиция HRS содержит PS80, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и приблизительно 140 мМ NaCl и характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 2% от основного пика в анализе SE-ВЭЖХ после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 0,5% от основного пика после 7 суток хранения при 37°C.

В некоторых аспектах композиция HRS содержит плюроник F68, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и приблизительно 140 мМ NaCl и характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 1% от основного пика в анализе SE-ВЭЖХ после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных, которое составляет менее приблизительно 0,5% от основного пика после 7 суток хранения при 37°C.

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) характеризуется пониженным пиком(ами) низкомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, который является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в).

В определенных вариантах осуществления композиция полипептида HRS в присутствии поверхностно-активного вещества(в) характеризуется пониженной мутностью (A340), которая является по меньшей мере приблизительно в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз ниже или по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% или 500% ниже чем у соответствующего полипептида HRS при инкубации приблизительно при 5°C или приблизительно при комнатной температуре (например, ~20-25°C), или приблизительно при 37°C в течение приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 часов, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 3 суток, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 7 суток в ином образом идентичной или сравнимой композиции без поверхностно-активного вещества(в).

В некоторых аспектах композиция HRS содержит PS20, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и приблизительно 140 мМ NaCl и характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,2 после 7 суток хранения при 37°C.

В некоторых аспектах композиция HRS содержит PS80, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и приблизительно 140 мМ NaCl и характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,2 после 7 суток хранения при 37°C.

В некоторых аспектах композиция HRS содержит плюроник F68, гистидиновый буфер с pH приблизительно 7,0-7,5 и приблизительно 140 мМ NaCl и характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах композиция HRS характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,2 после 7 суток хранения при 37°C.

В определенных вариантах осуществления композиция содержит один или более антиоксидантных соединений. Иллюстративные антиоксиданты включают без ограничения цистеин, метионин, N-ацетилцистеин (NAC) и глутатион, токоферолы, каротины, восстановленный кофермент Q и аскорбиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления антиоксидантное соединение содержится в концентрации приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10 мМ, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления антиоксидантное соединение содержится в диапазоне концентраций приблизительно 0,1-5,0, 0,1-4,5, 0,1-4,0, 0,1-3,5, 0,1-3,0, 0,1-2,5, 0,1-2,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-0,5 мМ или в диапазоне концентраций приблизительно 0,2-5,0, 0,2-4,5, 0,2-4,0, 0,2-3,5, 0,2-3,0, 0,2-2,5, 0,2-2,0, 0,2-1,5, 0,2-1,0, 0,2-0,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 0,5-5,0, 0,5-4,5, 0,5-4,0, 0,5-3,5, 0,5-3,0, 0,5-2,5, 0,5-2,0, 0,5-1,5, 0,5-1,0 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 1,0-5,0, 1,0-4,5, 1,0-4,0, 1,0-3,5, 1,0-3,0, 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 1,5-5,0, 1,5-4,5, 1,5-4,0, 1,5-3,5, 1,5-3,0, 1,5-2,5, 1,5-2,0 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 2,0-5,0, 2,0-4,5, 2,0-4,0, 2,0-3,5, 2,0-3,0, 2,0-2,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 2,5-5,0, 2,5-4,5, 2,5-4,0, 2,5-3,5, 2,5-3,0 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 3,0-5,0, 3,0-4,5, 3,0-4,0, 3,0-3,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 3,5-5,0, 3,5-4,5, 3,5-4,0 мМ или в диапазоне концентраций приблизительно 4,0-5,0, 4,0-4,5 или 4,5-5,0 мМ.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит хелатирующее средство. Иллюстративные хелатирующие средства включают без ограничения этилендиаминтетраацетат (EDTA), этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), 1,2-бис(o-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (BAPTA) и 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновую кислоту (DMPS). В определенных вариантах осуществления хелатирующее средство содержится в концентрации приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0 мМ, включая все диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления хелатирующее средство содержится в диапазоне концентраций приблизительно 0,1-5,0, 0,1-4,5, 0,1-4,0, 0,1-3,5, 0,1-3,0, 0,1-2,5, 0,1-2,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-0,5 мМ или в диапазоне концентраций приблизительно 0,2-5,0, 0,2-4,5, 0,2-4,0, 0,2-3,5, 0,2-3,0, 0,2-2,5, 0,2-2,0, 0,2-1,5, 0,2-1,0, 0,2-0,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 0,5-5,0, 0,5-4,5, 0,5-4,0, 0,5-3,5, 0,5-3,0, 0,5-2,5, 0,5-2,0, 0,5-1,5, 0,5-1,0 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 1,0-5,0, 1,0-4,5, 1,0-4,0, 1,0-3,5, 1,0-3,0, 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 1,5-5,0, 1,5-4,5, 1,5-4,0, 1,5-3,5, 1,5-3,0, 1,5-2,5, 1,5-2,0 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 2,0-5,0, 2,0-4,5, 2,0-4,0, 2,0-3,5, 2,0-3,0, 2,0-2,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 2,5-5,0, 2,5-4,5, 2,5-4,0, 2,5-3,5, 2,5-3,0 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 3,0-5,0, 3,0-4,5, 3,0-4,0, 3,0-3,5 мМ, или в диапазоне концентраций приблизительно 3,5-5,0, 3,5-4,5, 3,5-4,0 мМ или в диапазоне концентраций приблизительно 4,0-5,0, 4,0-4,5 или 4,5-5,0 мМ.

В некоторых вариантах осуществления композиция и/или полипептид(ы) HRS, содержащиеся в ней, характеризуются одним или более абсолютных физических свойств, таких как степень агрегации высокомолекулярных соединений (или образование агрегатов), внешний вид или прозрачность (например, мутность, опалесценция), степень гомогенности или монодисперсности, растворимость, чистота белка, температура плавления, концентрация белка и/или степень фрагментации белка.

В определенных аспектах композиция характеризуется содержанием агрегатов приблизительно или менее приблизительно 10% относительно общего количества содержащегося белка или в некоторых вариантах осуществления композиция характеризуется содержанием агрегатов приблизительно или менее приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, или 5%, или в некоторых аспектах композиция характеризуется содержанием агрегатов приблизительно или менее приблизительно 4%, 3% или 2%, или в конкретных аспектах композиция характеризуется содержанием агрегатов приблизительно или менее приблизительно 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1%. В некоторых вариантах осуществления содержанием агрегатов представляет собой содержание высокомолекулярных агрегатов. Содержание высокомолекулярных агрегатов можно определять различными аналитическими способами, включая, например, эксклюзионную хроматографию (SE-ВЭЖХ), динамическое светорассеяние, анализ SDS-PAGE и аналитическое ультрацентрифугирование.

В некоторых аспектах по внешнему виду композиция является прозрачной, и не наблюдают существенного образования частиц или волокон. Прозрачность композиции можно характеризовать, например, мутностью, опалесценцией или тем и другим. Мутность можно измерять по оптической плотности при A340 и опалесценцию можно измерять по оптической плотности при A580. В некоторых вариантах осуществления мутность композиции, как измеряют по оптической плотности при A340, составляет приблизительно или менее приблизительно 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,09, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006, 0,005, 0,004, 0,003, 0,002 или 0,001. В определенных вариантах осуществления опалесценция композиции, как измеряют по оптической плотности при A580, составляет приблизительно или менее приблизительно 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,09, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006, 0,005, 0,004, 0,003, 0,002 или 0,001.

В некоторых аспектах композиция содержит один или более полипептидов HRS, которые являются по существу гомогенными или монодисперсными, что означает, что композиции полипептида HRS существуют по существу (например, по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) в одной форме кажущейся молекулярной массы при оценке, например, эксклюзионной хроматографией, динамическим светорассеянием, SDS-PAGE или аналитическим ультрацентрифугированием. В некоторых аспектах полипептид HRS существует по существу в виде мономера. В определенных аспектах полипептид HRS существует по существу в виде димера. В некоторых аспектах такие композиции могут содержать DTT или другие подходящие восстановители для уменьшения образования дисульфидных связей.

В определенных вариантах осуществления полипептиды HRS обладает растворимостью, которая является желаемой для конкретного способа введения, такого как внутривенное введение, подкожное введение и т.д. Примеры желаемых растворимостей включают приблизительно или по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 мг/мл или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 мг/мл, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 мг/мл, или приблизительно или по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 мг/мл.

В некоторых аспектах композиция имеет чистоту в пересчете на белок (например, полипептид HRS относительно других клеточных белков) приблизительно или по меньшей мере приблизительно 90% или в некоторых аспектах имеет чистоту в пересчете на белок приблизительно или по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97% или 98%, или в некоторых аспектах имеет чистоту в пересчете на белок приблизительно или по меньшей мере приблизительно 99% или 99,5%. Чистоту можно определять любым общепринятым аналитическим способом, как известно в данной области.

В некоторых аспектах полипептид HRS в данной композиции имеет определенную термостабильность, как характеризуют, например, температурой плавления (T_m). В некоторых аспектах T_m полипептида HRS в композиции составляет приблизительно или по меньшей мере приблизительно 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70°C. В определенных аспектах полипептид HRS в композиции имеет T_m, которая находится в диапазонах приблизительно 45-70, 46-70, 47-70, 48-70, 49-70, 50-70, 51-70, 52-70, 53-70, 54-70, 55-70, 56-70, 57-70, 58-70, 59-70, 60-70, 61-70, 62-70, 63-70, 64-70, 65-70, 66-70, 67-70, 68-70 или 69-70°C или в диапазонах приблизительно 45-69, 46-69, 47-69, 48-69, 49-69, 50-69, 51-69, 52-69, 53-69, 54-69, 55-69, 56-69, 57-69, 58-69, 59-69, 60-69, 61-69, 62-69, 63-69, 64-69, 65-69, 66-69, 67-69, 68-69°C, или диапазонах приблизительно 45-68, 46-68, 47-68, 48-68, 49-68, 50-68, 51-68, 52-68, 53-68, 54-68, 55-68, 56-68, 57-68, 58-68, 59-68, 60-68, 61-68, 62-68, 63-68, 64-68, 65-68, 66-68, 67-68°C, или диапазонах приблизительно 45-67, 46-67, 47-67, 48-67, 49-67, 50-67, 51-67, 52-67, 53-67, 54-67, 55-67, 56-67, 57-67, 58-67, 59-67, 60-67, 61-67, 62-67, 63-67, 64-67, 65-67, 66-67°C, или в диапазонах приблизительно 45-66, 46-66, 47-66, 48-66, 49-66, 50-66, 51-66, 52-66, 53-66, 54-66, 55-66, 56-66, 57-66, 58-66, 59-66, 60-66, 61-66, 62-66, 63-66, 64-66, 65-66°C, или диапазонах приблизительно 45-65, 46-65, 47-65, 48-65, 49-65, 50-65, 51-65, 52-65, 53-65, 54-65, 55-65, 56-65, 57-65, 58-65, 59-65, 60-65, 61-65, 62-65, 63-65, 64-65°C, или в диапазонах приблизительно 45-64, 46-64, 47-64, 48-64, 49-64, 50-64, 51-64, 52-64, 53-64, 54-64, 55-64, 56-64, 57-64, 58-64, 59-64, 60-64, 61-64, 62-64, 63-64°C, или в диапазонах приблизительно 45-63, 46-63, 47-63, 48-63, 49-63, 50-63, 51-63, 52-63, 53-63, 54-63, 55-63, 56-63, 57-63, 58-63, 59-63, 60-63, 61-63, 62-63°C, или в диапазонах приблизительно 45-62, 46-62, 47-62, 48-62, 49-62, 50-62, 51-62, 52-62, 53-62, 54-62, 55-62, 56-62, 57-62, 58-62, 59-62, 60-62, 61-62°C, или в диапазонах приблизительно 45-61, 46-61, 47-61, 48-61, 49-61, 50-61, 51-61, 52-61, 53-61, 54-61, 55-61, 56-61, 57-61, 58-61, 59-61, 60-61°C, или в диапазонах приблизительно 45-60, 46-60, 47-60, 48-60, 49-60, 50-60, 51-60, 52-60, 53-60, 54-60, 55-60, 56-60, 57-60, 58-60, 59-60°C, или в диапазонах приблизительно 45-59, 46-59, 47-59, 48-59, 49-59, 50-59, 51-59, 52-59, 53-59, 54-59, 55-59, 56-59, 57-59, 58-59°C, или в диапазонах приблизительно 45-58, 46-58, 47-58, 48-58, 49-58, 50-58, 51-58, 52-58, 53-58, 54-58, 55-58, 56-58, 57-58°C, или в диапазонах приблизительно 45-57, 46-57, 47-57, 48-57, 49-57, 50-57, 51-57, 52-57, 53-57, 54-57, 55-57, 56-57°C, или в диапазонах приблизительно 45-56, 46-56, 47-56, 48-56, 49-56, 50-56, 51-56, 52-56, 53-56, 54-56, 55-56°C, или в диапазонах приблизительно 45-55, 46-55, 47-55, 48-55, 49-55, 50-55, 51-55, 52-55, 53-55, 54-55°C, или в диапазонах приблизительно 45-54, 46-54, 47-54, 48-54, 49-54, 50-54, 51-54, 52-54, 53-54°C, или в диапазонах приблизительно 45-53, 46-53, 47-53, 48-53, 49-53, 50-53, 51-53, 52-53°C, или в диапазонах приблизительно 45-52, 46-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52, 51-52°C, или в диапазонах приблизительно 45-51, 46-51, 47-51, 48-51, 49-51, 50-51°C, или в диапазонах приблизительно 45-50, 46-50, 47-50, 48-50, 49-50°C, или в диапазонах приблизительно 45-49, 46-49, 47-49, 48-49°C, или в диапазонах приблизительно 45-48, 46-48, 47-48, 45-47, 46-47 или 45-46°C. Температуру плавления можно опредилить различными аналитическими способами, включая, например, дифференциальную сканирующую флуорометрию (DSF).

В некоторых аспектах полипептид HRS содержится в композиции при определенной концентрации белка. Например, в определенных композициях концентрация полипептида(ов) HRS составляет приблизительно или по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг/мл. Некоторые композиции имеют концентрацию полипептида(ов) HRS, которая находится в диапазоне приблизительно 5-100, 10-100, 15-100, 20-100, 25-100, 30-100, 35-100, 40-100, 45-100, 50-100, 55-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100 мг/мл, или приблизительно 5-90, 10-90, 15-90, 20-90, 25-90, 30-90, 35-90, 40-90, 45-90, 50-90, 55-90, 60-90, 70-90, 80-90 мг/мл, или приблизительно 5-80, 10-80, 15-80, 20-80, 25-80, 30-80, 35-80, 40-80, 45-80, 50-80, 55-80, 60-80, 70-80 мг/мл, или приблизительно 5-70, 10-70, 15-70, 20-70, 25-70, 30-70, 35-70, 40-70, 45-70, 50-70, 55-70, 60-70 мг/мл, или приблизительно 5-60, 10-60, 15-60, 20-60, 25-60, 30-60, 35-60, 40-60, 45-60, 50-60, 55-60 мг/мл, или приблизительно 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 45-50 мг/мл, или приблизительно 5-45, 10-45, 15-45, 20-45, 25-45, 30-45, 35-45, 40-45 мг/мл, или приблизительно 5-40, 10-40, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40 мг/мл, или приблизительно 5-35, 10-35, 15-35, 20-35, 25-35, 30-35 мг/мл, или приблизительно 5-30, 10-30, 15-30, 20-30, 25-30 мг/мл, или приблизительно 5-25, 10-25, 15-25, 20-25, 5-20, 10-20, 15-20, 5-15, 10-15 или 5-10 мг/мл белка.

В определенных аспектах композиция характеризуется степенью фрагментации белка менее приблизительно 10% относительно общего количества содержащегося белка, или в некоторых вариантах осуществления композиция характеризуется степенью фрагментации белка менее приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, или 5%, или в некоторых аспектах композиция характеризуется степенью фрагментации белка менее приблизительно 4%, 3%, или 2%, или в конкретных аспектах композиция характеризуется степенью фрагментации белка менее приблизительно 1%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1%. Фрагментацию белка можно измерять различными аналитическими способами, включая, например, эксклюзионную хроматографию, анализ SDS-PAGE и аналитическое ультрацентрифугирование.

В конкретных вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит по меньшей мере один по существу чистый полипептид HRS необязательно в концентрации по меньшей мере приблизительно 10-50 мг/мл, приблизительно 40-50 мМ гистидина (например, L-гистидина), приблизительно 140-240 мМ NaCl, приблизительно 1-2% трегалозы, приблизительно 0,20-0,05% полисорбата 20 (PS20), имеет pH приблизительно 7,0-7,5 и по существу не содержит эндотоксинов. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 1% от основного пика в анализе SE-ВЭЖХ после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 0,5% от основного пика в анализе SE-ВЭЖХ после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,2 после 7 суток хранения при 37°C.

В других вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере один по существу чистый полипептид HRS необязательно в концентрации по меньшей мере приблизительно 10-50 мг/мл, приблизительно 40-50 мМ гистидина (например, L-гистидина), приблизительно 140-240 мМ NaCl, приблизительно 1-2% сахарозы, приблизительно 0,01-0,05% полисорбата 20 (PS20), имеет pH приблизительно 7,3 и по существу не содержит эндотоксинов. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений, которое составляет менее приблизительно 1% от основного пика в анализе SE-ВЭЖХ после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется пиковым содержанием высокомолекулярных соединений в анализе SE-ВЭЖХ, которое составляет менее приблизительно 0,5% от основного пика после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,5 после 7 суток хранения при 37°C. В некоторых аспектах терапевтическая композиция характеризуется мутностью (A340), которая составляет менее приблизительно 0,2 после 7 суток хранения при 37°C.

В определенных вариантах осуществления полипептид HRS содержит, состоит или состоит по существу из любой из SEQ ID NO: 1-23, 39, 41, 43, 70-71, 74-153, 160-172 или 176-182 или полипептида HRS, перечисленного в любой из таблиц 1-9 или получаемого из них, включая его варианты. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS представляет собой HRS(1-506) или HRS(2-506), или его вариант, T_m которого в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 58, 59, 60 или 61°C.

Биохимические, физические и/или фармакокинетические свойства композиций полипептида HRS, описываемых в настоящем описании, можно охарактеризовать в любом определенном наборе условий, таких как температура, pH или другое условие, и необязательно в любой данный момент времени или в течение определенного периода времени. Например, в определенных вариантах осуществления такие свойства охарактеризованы при температуре приблизительно -80, -60, -40, -20, -10, -5, -4, -3, -20, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100°C, включая все целые числа и диапазоны между ними. В некоторых вариантах осуществления такие свойства охарактеризованы приблизительно при комнатной температуре (например, 20-25°C). Такие свойства также можно характеризовать в течение определенного периода времени, например, в течение периода приблизительно 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часа или в течение периода приблизительно 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 суток, или в течение периода приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 недели, или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 месяцев или т.д. В некоторых вариантах осуществления такие свойства характеризуют после замораживания-оттаивания композиции по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз.

Фармацевтические композиции могут содержать фармацевтически приемлемые соли полипептида HRS. Для обзора подходящих солей, см. Handbook of PharmaCeutiCal Salts: Properties, SeleCtion, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002). Подходящие основные соли получают из оснований, которые образуют нетоксичные соли. Характерные примеры включают соли алюминия, аргинина, бензатина, кальция, холина, диэтиламина, диоламина, глицина, лизина, магния, меглумина, оламина, калия, натрия, трометамина и цинка. Также можно получать полусоли кислот и оснований, например, гемисульфатные и гемикальциевые соли. Композиции для использования в изобретении, подходящие для парентерального введения, могут содержать стерильные водные растворы и/или суспензии фармацевтически активных ингредиентов предпочтительно получаемых, как изотонические с кровью реципиента, как правило, с использованием хлорида натрия, глицерина, глюкозы, маннита, сорбита и т.п. Органические кислоты, подходящие для получения фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот, включают в качестве примера и без ограничения, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, пропионовую кислоту, гексановую кислоту, циклопентанпропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, пировиноградную кислоту, молочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, яблочную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, пальмитиновую кислоту, бензойную кислоту, 3-(4-гидроксибензоил)бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, алкилсульфоновые кислоты (например, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, 1,2-этандисульфоновую кислоту, 2-гидроксиэтансульфоновую кислота и т.д.), арилсульфоновые кислоты (например, бензолсульфоновую кислоту, 4-хлорбензолсульфоновуую кислоту, 2-нафталинсульфоновую кислоту, 4-толуолсульфоновую кислоту, камфарсульфоновую кислоту и т.д.), 4-метилбицикло(2.2.2)-окт-2-ен-1-карбоновую кислоту, глюкогептоновую кислоту, 3-фенилпропионовую кислоту, триметилуксусную кислоту, третичную бутилуксусную кислоту, лаурилсерную кислоту, глюконовую кислоту, глутаминовую кислоту, гидроксинафтойную кислоту, салициловую кислоту, стеариновую кислоту, муконовую кислоту и т.п.

В конкретных вариантах осуществления носитель может содержать воду. В некоторых вариантах осуществления носитель может представлять собой водный раствор физиологического раствора, например, воду, содержащую физиологические концентрации натрия, калия, кальция, магния и хлорида при физиологическом pH. В некоторых вариантах осуществления носитель может представлять собой воду, и состав может дополнительно содержать NaCl. В некоторых вариантах осуществления состав может быть изотоническим. В некоторых вариантах осуществления состав может быть гипотоническим. В других вариантах осуществления состав может являться гипертоническим. В некоторых вариантах осуществления состав может являться изоосмотическим. В некоторых вариантах осуществления состав по существу не содержит полимеры (например, гельобразующие полимеры, увеличивающие вязкость полимеров средства и т.д.). В некоторых вариантах осуществления состав по существу не содержит увеличивающие вязкость средства (например, карбоксиметилцеллюлозу, полианионные полимеры и т.д.). В некоторых вариантах осуществления состав по существу не содержит гельобразующих полимеров. В некоторых вариантах осуществления вязкость состава является приблизительно такой же как вязкость физиологического раствора, содержащего аналогичную концентрацию полипептида HRS (или его фармацевтически приемлемой соли).

В фармацевтических композициях по изобретению состав фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителя хорошо известен специалистам в данной области, также как разработка подходящего дозирования и схем лечения для использования конкретных композиций, описываемых в настоящем описании в различных схемах лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и состав.

В определенных применениях фармацевтические композиции, описываемые в настоящем описании, можно доставлять посредством перорального введения индивидууму. В связи с этим такие композиции можно формулировать в инертном разбавителе или с усваиваемым пищевым носителем, или их можно заключать в желатиновую капсулу с жесткой или мягкой оболочкой, или их можно прессовать в таблетки, или их можно непосредственно вводить с пищевыми продуктами рациона.

Фармацевтические композиции, подходящие для доставки полипептидов HRS и способы их получения будут легко понятны специалистам в данной области. Такие композиции и способы их получения можно найти, например, в Remington's PharmaCeutiCal SCienCes, 19th Edition (MaCk Publishing Company, 1995).

Введение терапевтической дозы полипептида HRS можно проводить любым подходящим способом, известным в медицинской области, включая например, пероральное, ректальное, интраназальное, парентеральное введение, включая интравитреальное, субконъюктивальное, субтеноновое, ретробульбарное, супрахориоидальное внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутриуретральное, интрастернальное, внутричерепное, внутримышечное, интрасиновиальное, внутриглазное, местное и подкожное. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольные (включая микроигольные) инъекторы, безигольные инъекторы и инфузионные способы.

Парентеральные составы, как правило, представляют собой водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы и буферные средства (предпочтительно pH от 3 до 9), но для некоторых применений их можно более подходящим образом формулировать в виде стерильного неводного раствора или в виде сухой формы для использования в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная, по существу апирогенная или апирогенная вода. Получение парентеральных составов в стерильных условиях, например, посредством лиофилизации, можно легко проводить стандартными фармацевтическими способами, хорошо известными специалистам в данной области.

Составы для парентерального введения можно формулировать так, чтобы они являлись с немедленным и/или длительным высвобождением. Композиции с длительным высвобождением включают отсроченное, модифицированное, импульсное, контролируемое, направленное и программируемое высвобождение. Таким образом, полипептид HRS можно формулировать в виде суспензии или в виде полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в качестве имплантируемого депо, обеспечивающего длительное высвобождение полипептидов HRS. Примеры таких составов включают без ограничения покрытые лекарственным средством стенты и полутвердые вещества и суспензии, содержащие нагруженные лекарственным средством многослойные везикулы на основе поли(DL-молочно-ко-гликолевой) кислоты (PGLA), поли(DL-лактид-ко-гликолида) (PLG) или поли(лактида) (PLA) или микрочастицы, гидрогели (Hoffman A.S.: Ann. N.Y. ACad. SCi., 944: 62-73 (2001)), системы наночастицы на основе полиаминокислот, такие как ситема Medusa, разработанная Flamel TeChnologies InC., системы на основе неводного геля, такие как Atrigel, разработанный Atrix, InC., и SABER (на основе сахарозы-ацетата-изобутирата с продленным высвобождением), разработанная DureCt Corporation, и системы на основе липидов, такие как DepoFoam, разработанная SkyePharma.

Как указано выше, можно получать растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей в воде подходящим образом, смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза, полисорбат (например, полисорбат 20, полисорбат 80) или плюроник F68. Также можно получать дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсий для немедленного применения (патент США № 5466468, конкретно полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки). Во всех случаях форма должна являться стерильной и должна быть жидкой в такой степени, чтобы существовала возможность простого введения через шприц. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения, и ее следует предохранять от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может включать растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Подходящее жидкое состояние можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и т.п. Во многих случаях предпочтительно включать средства придания изотоничности, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъецируемых композиций можно получать с использованием в композициях средств, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор необходимо подходящим образом буферизовать при необходимости и жидкий разбавитель сначала делают изотоническим достаточным количеством физиологического раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы являются особенно подходящими для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В связи с этим стерильные водные среды, которые можно применять станут известны специалистам в данной области в свете настоящего описания. Например, одну дозу можно растворять в 1 мл изотонического раствора NaCl и добавлять к 1000 мл жидкости для подкожного введения или инъецировать в предлагаемый участок инфузии (см., например, Remington's PharmaCeutiCal SCienCes, 15th Edition, pp. 1035-1038 и 1570-1580). В зависимости от состояния индивидуума, подлежащего лечению, неизбежно возникают некоторые изменения дозы. Лицо, ответственное за введение в любом случае определит подходящую дозу для отдельного индивидуума. Кроме того, препараты для введения человеку должны отвечать стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности, и чистоты в соответствии с требованиями Отдела биологических стандартов FDA.

Стерильные инъецируемые растворы можно получать введением активных соединений в необходимом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают введением различных стерильных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную диспергирующую среду и необходимые другие ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов предпочтительные способы получения представляют собой способы вакуумной сушки и лиофилизации, которыми получают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из их предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

Композиции, описываемые в настоящем описании, можно формулировать в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот (образованные со свободными аминогруппами белка) и которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образуемые со свободными карбоксильными группами, также можно получать из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После получения растворы вводят путем, совместимым с дозируемым составом, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы с легкостью вводят в различных лекарственных формах, таких как инъецируемые растворы, капсулы для высвобождения лекарственного средства и т.п.

Как используют в настоящем описании, "носитель" включает любой и все растворители, диспергирующие среды, носители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства, эксципиенты, модификаторы ионной силы, поверхностно-активные вещества, буферы, несущие растворы, суспензии, коллоидные вещества и т.п. Использование таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением тех случаев, когда любая общепринятая среда или средство является несовместимым с активным ингредиентом, предусмотрено его использование в терапевтических композициях. Также в композиции можно вводить дополнительные активные ингредиенты.

Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным структурам и композициям, которые не вызывают аллергической или аналогичной неблагоприятной реакции при введении человеку. Получение водной композиции, которая содержит белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области. Как правило, такие композиции получают в виде инъецируемых составов, в виде жидких растворов или суспензий, также можно получать твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также может являться эмульгированным.

Способы получения хорошо известны в данной области и описаны, например, в Remington: The SCienCe and PraCtiCe of PharmaCy, MaCk Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995). Композиции и средства, предоставленные в настоящем описании, можно вводить способами по настоящему изобретению в любых терапевтически эффективных режимах дозирования. Величина дозы и частота введения выбраны для создания эффективного уровня средства, не вызывая неблагоприятные эффекты. Эффективное количество соединения по настоящему изобретению зависит от пути введения, типа теплокровного животного, подлежащего лечению, и физических характеристик конкретного рассматриваемого теплокровного животного. Эти факторы и их взаимосвязь для определения такого количества хорошо известны квалифицированным практикам в медицинской области. Такое количество и способ введения можно оптимизировать для получения оптимальной эффективности, но оно зависит от таких факторов как масса, рацион, сопутствующее лечение и другие факторы, которые понятны специалистам в медицинской области.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции можно доставлять посредством интраназальных спреев, ингаляции и/или других носителей для доставки аэрозолей. Способы доставки композиций генов, полинуклеотидов и пептидов непосредственно в легкие посредством назальных аэрозольных спреев были описаны например, в патенте США № 5756353 и патенте США № 5804212 (каждый конкретно полностью включен в настоящее описание посредством ссылки). Аналогично, в фармацевтической области также хорошо известна доставка лекарственных средств с использованием микрочастиц смолы для интраназального введения (Takenaga et al., 1998) и соединений лизофосфатидилглицерина (патент США № 5725871, конкретно полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки). Аналогично, в патенте США № 5780045 (конкретно полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки) описана трансмукозальная доставка лекарственного средства в форме матрицы на подложке на основе политетрафторэтилена.

В определенных вариантах осуществления доставку можно проводить с использованием липосом, нанокапсул, микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и т.п., для введения композиций по настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции по настоящему изобретению можно формулировать для доставки в таком виде, как инкапсулированные в липидной частице, липосоме, везикуле, наносфере, наночастице или т.п. Состав и использование таких систем доставки можно проводить известными и общепринятыми способами.

В определенных вариантах осуществления средства, предоставленные в настоящем описании, можно присоединять к фармацевтически приемлемому твердому субстрату, включая биосовместимые и биоразлагаемые субстраты, такие как полимеры и матрицы. Примеры таких твердых субстратов включают без ограничения сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамината, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как поли(молочной-ко-гликолевой кислоты) (PLGA) и LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту, коллаген, металл, гидроксиапатит, биостекло, оксид алюминия, биотермические вещества и очищенные белки.

В одном конкретном варианте осуществления твердый субстрат содержит биоразлагаемый полимер, такой как твердое вещество под товарным наименованием Atrigel® (QLT, InC., VanCouver, B.C.). Система доставки лекарственных средств Atrigel® состоит из биоразлагаемых полимеров, растворимых в биосовместимых носителях. Фармацевтические средства можно перемешивать в этой жидкой системе доставки во время получения, или в зависимости от продукта врач может добавлять их позже в момент использования. В случае, когда жидкий продукт инъецируют в подкожное пространство через иглу небольшого диаметра или помещают в доступные участки ткани через канюлю, вода в тканевых жидкостях вызывает преципитацию полимера и фиксацию лекарственного средства в твердом имплантате. Затем лекарственное средство, инкапсулированное в имплантате, высвобождается контролируемым образом по мере того, как полимерная матрица биоразлагается со временем.

В конкретных вариантах осуществления количество вводимой композиции HRS или средства, как правило, находится в диапазоне дозы приблизительно от 0,1 приблизительно до 100 мг/кг/сутки и, как правило, приблизительно от 0,1 до 10 мг/кг при пероральном или внутривенном введении. В конкретных вариантах осуществления доза составляет 1 мг/кг или 5,0 мг/кг. Для людей применяемое суточное дозирование может находиться в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/кг до 0,5 мг/кг, приблизительно от 1 мг/кг до 5 мг/кг, приблизительно от 5 мг/кг до 10 мг/кг, приблизительно от 10 мг/кг до 20 мг/кг, приблизительно от 20 мг/кг до 30 мг/кг, приблизительно от 30 мг/кг до 50 мг/кг и приблизительно от 50 мг/кг до 100 мг/кг/24 часа.

В определенных вариантах осуществления композицию или средство вводят в однократной дозе от 0,1 до 10 мг/кг или от 0,5 до 15 мг/кг. В других вариантах осуществления композицию или средство вводят в дозе от 0,1 до 1 мг/кг/сутки, от 0,5 до 2 мг/кг/сутки или от 5 до 20 мг/кг/сутки, или приблизительно от 20 до 80 мг/кг/сутки или приблизительно от 80 до 150 мг/кг/сутки.

В различных вариантах осуществления доза составляет приблизительно 50-2500 мг в сутки, 100-2500 мг/сутки, 300-1800 мг/сутки или 500-1800 мг/сутки. В одном из вариантов осуществления доза составляет приблизительно от 100 до 600 мг/сутки. В другом варианте осуществления доза составляет приблизительно от 300 и 1200 мг/сутки. В конкретных вариантах осуществления композицию или средство вводят в дозе 100 мг/сутки, 240 мг/сутки, 300 мг/сутки, 600 мг/сутки, 1000 мг/сутки, 1200 мг/сутки или 1800 мг/сутки в одной или более дозах в сутки (например, когда комбинированными дозами достигают желаемого суточного дозирования). В родственных вариантах осуществления доза составляет 200 мг два раза в день, 300 мг два раза в день, 400 мг два раза в день, 500 мг два раза в день, 600 мг два раза в день или 700 мг два раза в день, 800 мг два раза в день, 900 мг два раза в день или 1000 мг два раза в день. В различных вариантах осуществления композицию или средство вводят в однократной дозе или повторных дозах. Начальная доза и последующие дозы могут являться аналогичными или различными.

В некоторых вариантах осуществления вводимая суммарная доза может составлять приблизительно 0,001 мг, приблизительно 0,005 мг, приблизительно 0,01 мг, приблизительно 0,05 мг, приблизительно 0,1 мг, 0,5 мг, приблизительно 1 мг, приблизительно 2 мг, приблизительно 3 мг, приблизительно 4 мг, приблизительно 5 мг, приблизительно 6 мг, приблизительно 7 мг, приблизительно 8 мг, приблизительно 9 мг, приблизительно 10 мг, приблизительно 20 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 40 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 60 мг, приблизительно 70 мг, приблизительно 80 мг, приблизительно 90 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 500 мг, 1000 мг, приблизительно 2000 мг, приблизительно 3000 мг, приблизительно 4000 мг, приблизительно 5000 мг, приблизительно 6000 мг, приблизительно 7000 мг, приблизительно 8000 мг, приблизительно 9000 мг, приблизительно 10000 мг/интервал дозирования (например, каждые 24 часа). В некоторых вариантах осуществления интервал дозирования может составлять один раз в сутки, один раз в двое суток, один раз в трое суток, один раз в четверо суток, один раз в пять суток, один раз в неделю, или один раз в две недели. Для повторных введений каждые несколько суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не наступает желаемое подавление симптомов заболевания. За эффективностью такой и других видов терапии (например, видов терапии ex vivo) можно легко проводить мониторинг общепринятыми способами и анализами и на основании критериев, известных врачу или другим специалистам в данной области.

Кроме того, следует понимать, что для средств доставки и композиций с длительным высвобождением суммарная доза HRS, содержащаяся в такой системе доставки, соответственно в значительной степени зависит от профиля высвобождения системы с длительным высвобождением. Таким образом, композиция с длительным высвобождением или устройство, которое предназначено для доставки полипептида HRS в течение периода 5 суток, как правило, содержит по меньшей мере приблизительно от 5 до 10 раз большую суточную дозу полипептида HRS; композиция с длительным высвобождением или устройство, которое предназначено доставлять пептид HRS в течение периода 365 суток, как правило, содержит по меньшей мере приблизительно от 400 до 800 раз большую суточную дозу полипептида HRS (в зависимости от стабильности и биодоступности полипептида HRS при введении с использованием систем с длительным высвобождением).

В определенных вариантах осуществления композицию или средство вводят внутривенно, например, посредством инфузии в течение периода времени приблизительно, например, от 10 минут до 90 минут. В других родственных вариантах осуществления композицию или средство вводят посредством непрерывной инфузии, например, в дозе приблизительно от 0,1 приблизительно до 10 мг/кг/час в течение определенного периода времени. При этом период времени можно изменять, в определенных вариантах осуществления период времени может составлять приблизительно от 10 минут приблизительно до 24 часов или приблизительно от 10 минут приблизительно до трех суток.

В конкретных вариантах осуществления эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для получения общей концентрации композиции или средства в плазме крови индивидуума с C_max приблизительно от 0,1 мкг/мл и приблизительно до 20 мкг/мл или приблизительно от 0,3 мкг/мл и приблизительно до 20 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления пероральная доза представляет собой количество, достаточное для получения концентрации (C_max) в плазме крови приблизительно от 0,1 мкг/мл приблизительно до 5 мкг/мл или приблизительно от 0,3 мкг/мл приблизительно до 3 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления внутривенная доза представляет собой количество, достаточное для получения концентрации (C_max) в плазме крови приблизительно от 1 мкг/мл приблизительно до 10 мкг/мл или приблизительно от 2 мкг/мл и приблизительно до 6 мкг/мл. В родственном варианте осуществления общая концентрация средства в плазме крови индивидуума имеет среднюю остаточную концентрацию менее приблизительно 20 мкг/мл и/или концентрацию в равновесном состоянии менее приблизительно 20 мкг/мл. В дополнительном варианте осуществления общая концентрация средства в плазме крови индивидуума имеет среднюю остаточную концентрацию менее приблизительно 10 мкг/мл и/или концентрацию в равновесном состоянии менее приблизительно 10 мкг/мл.

В еще одном варианте осуществления общая концентрация средства в плазме крови индивидуума имеет среднюю остаточную концентрацию приблизительно от 1 нг/мл и приблизительно до 10 мкг/мл и/или концентрацию в равновесном состоянии приблизительно от 1 нг/мл и приблизительно до 10 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления общая концентрация средства в плазме крови индивидуума имеет среднюю остаточную концентрацию приблизительно от 0,3 мкг/мл и приблизительно до 3 мкг/мл и/или концентрацию в равновесном состоянии приблизительно от 0,3 мкг/мл и приблизительно до 3 мкг/мл.

В конкретных вариантах осуществления композицию или средство вводят в количестве, достаточном для получения в плазме крови млекопитающих концентрации, имеющей среднюю остаточную концентрацию приблизительно от 1 нг/мл и приблизительно до 10 мкг/мл и/или концентрацию в равновесном состоянии приблизительно от 1 нг/мл и приблизительно до 10 мкг/мл. В родственных вариантах осуществления общая концентрация средства в плазме крови млекопитающего имеет среднюю остаточную концентрацию приблизительно от 0,3 мкг/мл и приблизительно до 3 мкг/мл и/или концентрацию в равновесном состоянии приблизительно от 0,3 мкг/мл и приблизительно до 3 мкг/мл.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество композиции или средства или концентрацию композиции или средства в плазме крови получают или поддерживают, например, в течение по меньшей мере 15 минут, по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 45 минут, по меньшей мере 60 минут, по меньшей мере 90 минут, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 3 часов, по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере одной недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере одного года, по меньшей мере 2 лет или более 2 лет.

В определенных вариантах осуществления количество вводимого полипептида, как правило, находится в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 15 мг/кг или приблизительно от 15 мг/кг приблизительно до 50 мг/кг массы тела пациента. В зависимости от типа и тяжести заболевания приблизительно от 0,1 мкг/кг приблизительно до 0,1 мг/кг, приблизительно до 50 мг/кг массы тела (например, приблизительно 0,1-15 мг/кг/доза) полипептида может представлять собой начальную кандидатную дозу для введения пациенту, например, посредством одного или более отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Например, режим дозирования может включать введение начальной ударной дозы приблизительно 4 мг/кг с последующей еженедельной поддерживающей дозой приблизительно 2 мг/кг полипептида или приблизительно половины ударной дозы. Однако пригодными могут являться другие режимы дозирования. Иллюстративное суточное дозирование может находиться в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/кг приблизительно до 20 мг/кг, до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. При повторных введениях в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение сохраняют до тех пор, пока не наступает желаемое подавление симптомов заболевания. В конкретных вариантах осуществления эффективная доза достигает уровней в плазме крови или средней остаточной концентрации композиции или средства, описываемого в настоящем описании. Их можно легко определять общепринятыми способами.

В конкретных вариантах осуществления эффективная доза достигает уровней в плазме или средней остаточной концентрации композиции или средства, описываемого в настоящем описании. Их можно легко определять общепринятыми способами.

В некоторых вариантах осуществления в композицию также могут вводить один или более адъювантов, например, при применении терапевтических иммунологических композиций в качестве вакцин. Адъюванты представляют собой вещества, которые неспецифически повышают или усиливают иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные CTL и хелперными T-клетками (T_H) к антигену, и, таким образом, их рассматривают как пригодные для терапевтических композиций по настоящему изобретению. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются ими, 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, флагеллин или лиганды TLR5, получаемые из флагелина, лиганд FLT3, GM-C SF, IC30, IC31, имиквимод (ALDARA), ImuFaCt IMP321, интерферон-альфа или интерферон-бета, или их пегилированные производные, IS PatCh, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, Juvlmmune, LipoVaC, MALP2, MF59, монофосфорил липид A, монтанид IMS 1312, монтанид ISA 206, монтанид ISA 50V, монтанид ISA-51, эмульсии "вода-в-масле" и "масло-в-воде", OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, векторную систему PepTel®, микрочастицы PLG, резиквимод, SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, ловушка VEGF, R848, бета-глюкан, Pam3Cys, стимулон Aquila's QS21, который выделяют из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитаторы бактериальной клеточной стенки, и другие патентованные адъюванты, такие как Ribi's Detox, Quil или Superfos. Адъюванты, такие как Фрейнда или GM-CSF являются предпочтительными. Некоторые специфические для дендритных клеток иммунологические адъюванты (например, MF59) и их получение были ранее описаны (Dupuis M. et al., 1998, Allison, 1998). Также можно использовать цитокины. Некоторые цитокины непосредственно связаны с влиянием на миграцию дендритных клеток в лимфоидные ткани (например, TNF-α), ускоряя созревание дендритных клеток в эффективные антигенпрезентирующие клетки для T-лимфоцитов (например, GM-CSF, IL-1 и IL-4) (патент США № 5849589, конкретно полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-альфа, IFN-бета) (GabriloviCh et al., 1996).

Также было описано, что иммуностимулирующие олигонуклеотиды CpG усиливают эффекты адъювантов в условиях вакцины. Без связи с теорией олигонуклеотиды CpG действуют путем активации врожденной (неприобретенной) иммунной системы через Toll-подобные рецепторы (TLR), в основном TLR9. Индуцируемая CpG активация TLR9 усиливает антигенспецифические гуморальные и клеточные ответы к широкому спектру антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины на основе дендритных клеток, вакцины на основе аутологичных клеток и полисахаридные конъюгаты в профилактических и терапевтических вакцинах. Более того она усиливает созревание дендритных клеток и дифференцировку, приводя к повышенной активации клеток T_H1 и значительной генерации цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) даже в отсутствие хелперных T-клетка CD4. Иммунный ответ с участием T_H1, индуцируемый стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии адъювантов вакцины, таких как алюминий или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют иммунному ответу с участием T_H2. Олигонуклеотиды CpG обладают даже большей адъювантной активностью, когда их формулируют или совместно вводят с другими адъювантами или в составах, таких как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или аналогичные составы, которые являются особенно необходимыми для индукции сильного ответа в случае, когда антиген является относительно слабым. Они также усиливают иммунный ответ и позволяют снижать дозу антигена приблизительно на два порядка величины при сравнимых ответах антитела на полнодозовую вакцину с CpG в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug DisCovery, 5, JUNE 2006, 471-484). В патенте США № 6406705 B1 описано комбинированное применение олигонуклеотидов CpG, не являющихся нуклеиновой кислотой адъювантов и антигена для индукции антигенспецифического иммунного ответа. Коммерчески доступный антагонист TLR9 CpG представляет собой dSLIM (иммуномодулятор с двойной структурой стебель-петля) от Mologen (Berlin, Germany), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Также можно использовать другие связывающиеся с TLR молекулы, такие как РНК- связывающий TLR 7, TLR 8 и/или TLR 9.

Другие примеры пригодных адъювантов включают, но не ограничиваются ими, химически модифицированные CpG (например, CpR, Idera), поли(I:C), такие как AmpliGen, не-CpG бактериальную ДНК или РНК, а также иммуноактивные низкомолекулярные соединения и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафиниб, XL-999, CP-547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, антитело против CTLA4 и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или в качестве адъюванта. Специалист в данной области может легко определять количества и концентрации адъювантов и добавок, пригодных в контексте настоящего изобретения, без излишнего экспериментирования.

Способы комбинированного лечения

Настоящее изобретение также относится к способам комбинированного лечения, включающим введение пациенту терапевтической дозы полипептида HRS или блокирующего антитела реагента в комбинации со вторым активным средством или устройством, или способом лечения аутоиммунных заболеваний, воспалительного заболевания(ий), мышечных дистрофий, рабдомиолиза, кахексии и других заболеваний, описываемых в настоящем описании. В этом контексте "вводимый в комбинации" означает: (1) часть одно и той же единичной лекарственной формы; (2) введение раздельно, но в виде части одной и той же программы терапевтического лечения или схемы лечения, как правило, но не обязательно, на те же сутки.

В некоторых аспектах таких способов комбинированного лечения второе активное средство выбрано из одного или более из антигистаминных средств, одного или более противовоспалительных средств, одного или более антинеопластических средств, одного или более иммуносупрессирующих средств, одного или более противовирусных средств, одного или более средств, которые ингибируют B-клетки, блокируют дифференцировка B-клеток или активацию B-клеток памяти, или одно или более антиоксидантных средств. Фармакологические или терапевтические средства, которые могут находить применение в комбинации с полипептидами HRS по изобретению, включают без ограничения средства, описанные в патенте США № 4474451, 4-6 колонках и в патенте США № 4327725, 7-8 колонках.

Примеры антигистаминных средств включают, но не ограничиваются ими, лорадатин, гидроксизин, дифенгидрамин, хлорфенирамин, бромфенирамин, ципрогептадин, терфенадин, клемастин, трипролидин, паракарбиноксамин, дифенилпиралин, фениндамин, азатадин, трипеленнамин, дексхлорфенирамин, дексбромфенирамин, метдилазин и тримпазин доксиламин, фенирамин, пириламин, хлорциклизин, тонзиламин и их производные.

Примеры антинеопластических средств включают, но не ограничиваются ими, антибиотики и аналоги (например, аклациномицины, актиномицин f₁, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карубицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, меногарил, митомицины, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, пирарубицин, пликамицин, порфиромицин, пуромицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, зиностатин, зорубицин), антиметаболиты (например, аналоги фолиевой кислоты (например, деноптерин, эдатрексат, метотрексат, пиритрексим, птероптерин, Tomudex®, триметрексат), аналоги пуринов (например, кладрибин, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин), аналоги пиримидинов (например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, доксифлуридин, эмитефур, эноцитабин, флоксуридин, фторурацил, гемцитабин, тагафур).

Примеры противовоспалительных средств включают, но не ограничиваются ими, стероидные противовоспалительные средства и нестероидные противовоспалительные средства. Иллюстративные стероидные противовоспалительные средства включают ацетоксипрегненолон, алклометазон, алгестон, амцинонид, беклометазон, бетаметазон, будезонид, хлорпреднизон, клобетазол, клобетазон, клокортолон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакорт, дезонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флунизолид, флуоцинолона ацетонид, флуцинонид, флуокортин бутил, флуороктолон, фторметолон, флуперолона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, флурандренолид, флутиказона пропионат, формокортал, галцинонид, галобетазола пропионат, галометзон, галопредона ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, лотепреднола этабонат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпреднизолон, мометазона фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, 25-диэтиламиноацетат преднизолона, преднизолона фосфат натрия, преднизон, предниваль, преднилиден, римексолон, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолона ацетонид, триамцинолона бенетонид и триамцинолон гексацетонид.

Иллюстративные нестероидные противовоспалительные средства включают производные аминоарилкарбоновой кислоты (например, энфенамовую кислоту, этофенамат, флуфенамовую кислоту, изониксин, меклофенамовую кислоту, мефенамовую кислоту, нифлумовую кислоту, талнифлумат, терофенамат, толфенамовую кислоту), производные арилуксусной кислоты (например, ацеклофенак, ацеметацин, алкофенак, амфенак, амтолметин гуацил, бромфенак, буфексамак, цинметацин, клопирак, диклофенак натрия, этодолак, фелбинак, фенклозовую кислоту, фентиазак, глукаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиазиновую кислоту, мофезолак, оксаметацин, пиразолак, проглуметацин, сулиндак, тиарамид, толметин, тропезин, зомепирак), производные арилмасляной кислоты (например, бумадизон, бутибуфен, фенбуфен, ксенбуцин), арилкарбоновые кислоты (например, клиданак, кеторолак, тиноридин), производные арилпропионовой кислоты (например, алминопрофен, беноксапрофен, бермопрофен, буклоксовую кислоту, карпрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флурбипрофен, ибупрофен, ибупроксам, индопрофен, кетопрофен, локсопрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопролен, пипрофен, пранопрофен, протизиновую кислоту, супрофен, тиапрофеновую кислоту, ксимопрофен, залтопрофен), пиразолы (например, дифенамизол, эпиризол), пиразолоны (например, апазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропифеназон, рамифеназон, суксибузон, тиазолинобутазон), производные салициловой кислоты (например, ацетаминосалол, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, ацетилсалицилат кальция, дифлунизал, этерсалат, фендозал, гентизиновую кислоту, гликольсалицилат, имидазол салицилат, ацетилсалицилат лизина, месаламин, морфолин салицилат, 1-нафтилсалицилат, олсалазин, парсалмид, фенилацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламид-o-уксусную кислоту, салицилсерную кислоту, салсалат, сульфасалазин), тиазинкарбоксамиды (например, ампироксикам, дроксикам, изоксикам, лорноксикам, пироксикам, теноксикам), ε-ацетамидокапроновую кислоту, сек-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляную кислоту, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфазон, фепрадинол, гваязулен, набуметон, нимесулид, оксацепрол, паранилин, перизоксаль, прогуазон, супероксиддисмутазу, тенидап и зилеутон.

Примеры иммуносупрессирующих средств включают без ограничения 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. патент США № 4665077), азатиоприн, циклофосфамид, бромокриптин, даназол, дапсон, глутаральдегид (который маскирует антигены MHC, как описано в патенте США № 4120649), антиидиотипические антитела для антигенов MHC и фрагментов MHC, циклоспорин A, стероиды, такие как глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон, цитокин или антагонисты рецепторов цитокинов, включая антитела против интерферона-γ, интерферона-β или интерферона-α, антитела против фактора некроза опухоли-α, антитела против фактора некроза опухоли-43, антитела к интерлейкину 2 и антитела к рецептору IL-2, антитела к LFA-1, включая антитела к CD11a и антитела к CD18, антитела к L3T4, гетерологичный антилимфоцитарный глобулин, антитела к пан-T, предпочтительно антитела к CD3 или антитела к CD4/CD4a, растворимый пептид, содержащий LFA-3 связывающий домен (WO 90/08187, опубликованный 26 июля 1990 года), стрептокиназу, TGF-β, стрептодорназу, РНК или ДНК от хозяина, FK506, RS-61443, дезоксиспергуалин, рапамицин, T-клеточный рецептор (Cohen et al., патент США № 5114721), фрагменты T-клеточного рецептора (Offner et al., SCienCe, 251:430-432 (1991), WO 90/11294, Ianeway, Nature, 341:482 (1989) и WO 91/01133), и антитела к T-клеточному рецептору (EP 340109), такие как T10139, антитела к CD19, как описано у Hekman et al., CanCer Immunol. Immunother., 32:364-372 (1991) и Vlasveld et al., CanCer Immunol. Immunother., 40:37-47 (1995), антитело B4 у Kiesel et al., Leukemia ResearCh II, 12:1119 (1987), антитела к CD22, включая эпратузумаб, антитела к BLyS (CD257), включая белимумаб (беналиста), антитела к CD20, включая окрелизумаб, ритуксимаб и офатумумаб. "Ритуксимаб" или "RITUXAN®" относится к генетически сконструированному химерному моноклональному антителу мыши/человека, направленному против антигена CD20 и обозначаемому "C2B8" в патенте США № 5736137. Антитело представляет собой иммуноглобулин IgG₁-каппа, содержащий последовательности вариабельной области легких и тяжелых цепей мыши и последовательности константной области человека. Ритуксимаб обладает аффинностью связывания к антигену CD20 приблизительно 8,0 нМ.

Примеры противовирусных средств включают интерферон гамма, зидовудин, амантадина гидрохлорид, рибавирин, ацикловир, валацикловир, дидезоксицитидин, фосфонмуравьиную кислоту, ганцикловир и их производные.

Примеры средств, которые ингибируют B-клетки, блокируют дифференцировку B-клеток или активацию B-клеток памяти, включают антитела к CD19, антитела к CD22, включая эпратузумаб, антитела к BLyS (CD257), включая белимумаб (беналиста), антитела к CD20, включая окрелизумаб, ритуксимаб, офатумумаб и "ритуксимаб" или "RITUXAN®".

Примеры антиоксидантных средств включают аскорбат, альфа-токоферол, маннит, восстановленный глутатион, различные каротиноиды, цистеин, мочевую кислоту, таурин, тирозин, супероксиддисмутазу, лютени, зеаксантин, криптоксантин, астаксантин, ликопин, N-ацетилцистеин, карнозин, гамма-глутамилцистеин, кверцитин, лактоферрин, дигидролипоевую кислоту, цитрат, экстракт гинкго билоба, катехины чая, экстракт черники, витамины E или сложные эфиры витамина E, ретинилальмитат и его производные. Другие терапевтические средства включают скваламин, ингибиторы карбоангидразы, агонисты альфа-2-адренергических рецепторов, противопаразитарные средства, противогрибковые средства и их производные.

Предпочтительно полипептид HRS можно вводить при фиксированном суточном дозировании, а другие активные средства принимать по мере необходимости. Когда полипептид HRS вводят в качестве вспомогательной терапии со вторым активным средством, предпочтительное суточное дозирование составляет приблизительно от 0,1 мг/кг/24 часа приблизительно до 55 мг/кг/24 часа, более предпочтительно приблизительно от 2 мг/кг/24 часа приблизительно до 20 мг/кг /24 часа.

Точная доза каждого вводимого компонента, как правило, различается в зависимости от конкретных компонентов, предписанных индивидууму, подлежащему лечению, тяжести заболевания, например, тяжести воспалительной реакции, от способа введения и от решения лечащего врача. Таким образом, вследствие вариабельности между пациентами, указанные выше приведенные дозы носят рекомендательный характер, и врач может регулировать дозы соединений для обеспечения такого лечения, которое врач считает подходящим.

Наборы

Варианты осуществления настоящего изобретения в других аспектах относятся к наборам, содержащим один или более контейнеров, наполненных одним или более из выделенных полипептидов HRS, полинуклеотидов, антител и связывающих белков по изобретению, как описано в настоящем описании. Наборы могут содержать напечатанные инструкции, как использовать такие композиции (например, для модуляции клеточной сигнализации, воспалительных состояний, для диагностики и т.д.).

Наборы в настоящем описании также могут содержать одно или более дополнительных терапевтических средств или других компонентов, подходящих или желательных для показания, подлежащего лечению, или для желательного диагностического применения. При желании дополнительное терапевтическое средство может содержаться во втором контейнере. Примеры дополнительных терапевтических средств включают, но не ограничиваются ими, антинеопластические средства, противовоспалительные средства, антибактериальные средства, противовирусные средства, ангиогенные средства и т.д.

Наборы в настоящем описании также могут содержать один или более шприцов или других компонентов, необходимых или желательных для облегчения предполагаемого способа доставки (например, стенты, имплантируемые депо и т.д.).

В другом аспекте изобретения наборы содержат: a) контейнер, содержащий компонент полипептида HRS, и b) инструкции по использованию. Инструкции могут включать этапы, как применять полипептиды HRS, как хранить полипептиды HRS, и что ожидать от использования полипептидов HRS.

В другом аспекте изобретения наборы содержит: a) контейнер, содержащий рекомбинантный вектор или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую компонент полипептида HRS, и b) инструкции по использованию. Инструкции могут включать этапы, как применять векторы или полинуклеотиды, как хранить векторы или полинуклеотиды, или как трансфицировать клетки векторами или полинуклеотидами.

В другом аспекте изобретение относится к наборам для лечения заболевания или нарушения, содержащим: a) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую компонент полипептида HRS в фармацевтически приемлемом составе, и b) инструкции и/или листок-вкладыш.

Диагностика

Полипептиды HRS и соответствующие полинуклеотиды (HRS полинуклеотиды) можно использовать в диагностических анализах и диагностических композициях. Наряду с другими включены биохимические, гистологические способы и композиции и способы и композиции на основе и клеток.

Эти и родственные варианты осуществления включают детекцию последовательности(ей) полинуклеотида HRS или соответствующей последовательности(ей) полипептида HRS или их участков, или антител к ним. Например, определенные аспекты включают детекцию последовательности(ей) полинуклеотида HRS или соответствующей последовательности(ей) полипептида или их участков одного или более недавно идентифицированных вариантов сплайсинга HRS и/или одной или более точек сплайсинга таких вариантов сплайсинга. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид или соответствующая полипептиду последовательность(и) по меньшей мере одной точки сплайсинга является уникальной для такого конкретного варианта сплайсинга HRS. В некоторых вариантах осуществления такие варианты сплайсинга HRS могут указывать на предрасположенность к заболеванию, включая например, аутоиммунные заболевания, воспалительное заболевание(я), мышечные дистрофии, рабдомиолиз, кахексию и другие заболевания, описываемые в настоящем описании.

Также включена непосредственная детекция белковых фрагментов HRS, включая варианты сплайсинга, протеолитические фрагменты и другие. В определенных вариантах осуществления наличие или уровни одного или более недавно идентифицированных белковых фрагментов HRS ассоциированы или коррелируют с одним или более клеточных типов или клеточных состояний, включая например, специфические аутоантитела. Таким образом, наличие или уровни полипептида или полинуклеотида HRS можно использовать для проведения различий между различными клеточными типами или различными клеточными состояниями. Наличие или уровни белковых фрагментов HRS или их родственных полинуклеотидов можно детектировать способами диагностики на основе полинуклеотида и/или полипептида, как описано в настоящем описании и известно в данной области.

В определенных аспектах можно применять белковые фрагменты HRS или полинуклеотиды HRS в качестве части комплексного способа диагностики, как правило, для оценки, будет ли реагировать благоприятно индивидуум или популяция индивидуумов на конкретное медицинское лечение. Например, терапевтическое средство на основе данного полипептида HRS (например, белкового фрагмента, антитела, связывающего средства) можно идентифицировать как подходящее индивидууму или определенным популяциям индивидуумов на основании того, содержится ли у индивидуума(ов) один или более выбранных биомаркеров или антител для данного заболевания или состояния. Примеры биомаркеров включают маркеры сыворотки/ткани, предшествующие антитела к гистидил-тРНК-синтетазе, а также маркеры, которые можно идентифицировать способами медицинской визуализации. В определенных вариантах осуществления природный белок HRS или его фрагмент (или его соответствующий полинуклеотид) может сам являться биомаркером сыворотки и/или ткани, который можно использовать для измерения уровней антител к полипептиду HRS или уровней свободного полипептида HRS у конкретного индивидуума или в конкретной популяции индивидуумов. В определенных аспектах идентификация полипептида HRS или эталонной полинуклеотидной последовательности может включать характеристику дифференциальной экспрессии этой последовательности у выбранного индивидуума, в выбранной ткани или иным образом, как описано в настоящем описании и известно в данной области.

Некоторые из способов, предоставленные в настоящем описании, основаны на дифференциальной экспрессии полипептида HRS или полинуклеотида для характеристики условия или состояния клетки, ткани или индивидуума и для проведения различий от другой клетки, ткани или индивидуума. Неограничивающие примеры включают способы детекции наличия или уровней полипептида или полинуклеотида HRS в биологическом образце для проведения различий между клетками или тканями различных видов, клетками различных тканей или органов, состояний клеточного развития, таких как неонатальное и взрослое состояние, состояния клеточной дифференцировки, состояний, таких как здоровое, состояние болезни и состояние лечения, внутриклеточных и внеклеточных фракций, в дополнение к первичным культурам клеток и другим культурам клеток, таким как иммортализованные культуры клеток.

Дифференциальная экспрессия включает статистически значимое отличие одного или более уровней экспрессии генов эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида HRS по сравнению с уровнями экспрессии аналогичных последовательностей в соответствующем контроле. Статистически значимое отличие может относиться к повышению или снижению уровней экспрессии, как измеряют по уровням РНК, уровням белка, функции белка или любого другого релевантного измерения экспрессии гена, такого как измерения, описываемые в настоящем описании. Также включено сравнение полинуклеотида или полипептида HRS по изобретению и полноразмерной или цитозольной или митохондриальной последовательности HRS дикого типа, как правило, такого же или соответствующего типа. Дифференциальную экспрессию можно детектировать различными способами, известными в данной области и описываемыми в настоящем описании, включая способы на основе полинуклеотидов и полипептидов, такие как ПЦР в реальном времени, вычитающая гибридизация, полинуклеотидные и полипептидные чипы и другие.

Результат, как правило, обозначают как статистически значимый, если он с низкой вероятностью является случайным. Уровень значимости критерия или результата общепринято относится к анализу частоты принятия статистической гипотезы. В простых случаях статистическую значимость можно определять как вероятность принятия решения отклонения нулевой гипотезы, когда нулевая гипотеза фактически является истинной (решение, известное как ошибка I рода, или "ложноположительное определение"). Такое решение, как правило, принимают с использованием p-значения: если p-значение является меньше уровня значимости, то нулевую гипотезу отвергают. Чем меньше p-значение, тем более достоверный результат. Для определения статистической значимости также можно использовать коэффициенты Байеса (см., например, Goodman S., Ann. Intern. Med., 130:1005-13, 1999).

В более сложных, но с практической точки зрения важных случаях уровень значимости критерия или результата может отражать анализ, в котором вероятность принятия решения отклонения нулевой гипотезы, когда нулевая гипотеза фактически является истиной, является не более чем установленное значение вероятности. Такой тип анализа обеспечивает возможность таких применений, в которых вероятность принятия решения отклонения может быть намного меньше уровня значимости для некоторых наборов допущений, входящих в нулевую гипотезу.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления статистически значимая дифференциальная экспрессия может включать ситуации, где уровень экспрессии данной последовательности HRS обеспечивает по меньшей мере приблизительно 1,2X, 1,3X, 1,4X, 1,5X, 1,6X, 1,7X, 1,8X, 1,9X. 2,0X., 2,2X, 2,4X, 2,6X, 2,8X, 3,0X, 4,0X, 5,0X, 6,0X, 7,0X, 8,0X, 9,0X, 10,0X, 15,0X, 20,0X, 50,0X, 100,0X или большее отличие экспрессии (например, дифференциальная экспрессия, которая может представлять собой более высокую или низкую экспрессию) в исследуемом биологическом образце по сравнению с соответствующим контролем, включая все целые числа и десятичные дроби между ними (например, 1,24X, 1,25X, 2,1X, 2,5X, 60,0X, 75,0X и т.д.). В определенных вариантах осуществления статистически значимая дифференциальная экспрессия может включать ситуации, где уровень экспрессии данной последовательности HRS обеспечивает по меньшей мере приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 процентов (%) или большее отличие экспрессии (например, дифференциальная экспрессия, которая может являться выше или ниже) в исследуемом биологическом образце по сравнению с соответствующим контролем, включая все целые числа и десятичные дроби между ними.

В качестве дополнительного примера дифференциальную экспрессию также можно определять путем проведения Z-тестирования, например, вычислением абсолютного Z-показателя, как описано в настоящем описании и известно в данной области. Z-тестирование, как правило, используют для идентификации значимых отличий между средним значением для образца и средним значением для популяции. Например, по сравнению со стандартной нормальной таблицей (например, контрольная ткань) при доверительном интервале 95% (например, при уровне значимости 5%), Z-показатель с абсолютным значением более 1,96 указывает на неслучайность. Для доверительного интервала 99%, если абсолютный Z составляет более 2,58, это означает, что p<0,01, и отличие является еще более достоверным, таким образом, нулевую гипотезу можно отклонять с большим доверием. В этих и родственных вариантах осуществления абсолютный Z-показатель 1,96, 2, 2,58, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более, включая все десятичные дроби между ними (например, 10,1, 10,6, 11,2 и т.д.), может обеспечивать высокое значение статистической значимости. В определенных вариантах осуществления абсолютный Z-показатель более 6 может обеспечивать очень высокую статистическую значимость.

По существу аналогичный, как правило, относится к отсутствию по существу значимого отличия уровней экспрессии между биологическим образцом и эталонным контролем. Примеры по существу аналогичных уровней экспрессии могут включать ситуации, где уровень экспрессии данного SSCIGS обеспечивает менее приблизительно 0,05X, 0,1X, 0,2X, 0,3X, 0,4X, 0,5X, 0,6X, 0,7X, 0,8X, 0,9X. 1,0X., 1,1X, 1,2X, 1,3X или 1,4X отличие экспрессии (например, дифференциальная экспрессия, которая может представлять собой более высокую или низкую экспрессию) в исследуемом биологическом образце по сравнению с эталонным образцом, включая все десятичные дроби между ними (например, 0,15X, 0,25X, 0,35X и т.д.). В определенных вариантах осуществления дифференциальная экспрессия может включать ситуации, где уровень экспрессии данной последовательности HRS обеспечивает менее приблизительно 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 процентов (%) отличие экспрессии (например, дифференциальная экспрессия, которая может являться выше или ниже) в исследуемом биологическом образце по сравнению с эталонным образцом, включая все десятичные дроби между ними.

В определенных вариантах осуществления, таких как, когда используют микропанель Affymetrix для измерения уровней экспрессии эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида HRS, дифференциальную экспрессию также можно определять с использованием среднего значения экспрессии, суммированной с использованием программного обеспечения Affymetrix MiCroarray Suite 5 (Affymetrix, Santa Clara, CA), или другого аналогичного программного обеспечения, как правило, с нормированным среднем значении экспрессии, равным 1000.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают способы детекции наличия или уровней эталонной последовательности полинуклеотида или полипептида HRS для характеристики или диагностики состояния или клетки, ткани, органа или индивидуума, у которого такое состояние можно охарактеризовать как здоровое, состояние болезни, состояние риска развития болезни, или состояние лечения. Для таких диагностических целей термин "диагностика" или "диагностируемый" включает идентификацию наличия или природы патологического состояния, характеризующегося риском развития такого состояния, и/или измерение изменения (или отсутствия изменения) патологического состояния в ответ на терапию. Способы диагностики могут различаться по чувствительности и специфичности. В определенных вариантах осуществления "чувствительность" диагностического анализа относится к проценту пораженных клеток, тканей или индивидуумов, которые имеют положительный ответ в анализе (процент "истинно положительных"). Пораженные клетки, ткани или индивидуумов, не детектируемых в анализе, как правило, обозначают как "ложноотрицательные". Клетки, ткани или индивидуумы, которые не являются пораженными и которые имеют отрицательный ответ в анализе, можно называть "истинно отрицательными". В определенных вариантах осуществления "специфичность" диагностического анализа можно определять как один (1) минус частота встречаемости ложноположительных, где частоту встречаемости "ложноположительных" определяют как отношение таких образцов или индивидуумов, не страдающих заболеванием и которые имеют положительный ответ в анализе. Несмотря на то, что конкретный способ диагностики может не предоставлять окончательный диагноз состояния, достаточно, если способ обеспечивает положительную индикацию, которая облегчает диагностирование.

В определенных случаях наличие или риск развития патологического состояния можно диагностировать посредством сравнения наличия или уровней одной или более эталонных последовательностей выбранного полинуклеотида или полипептида HRS или их участков, или антител к ним, которые коррелируют с состоянием в зависимости от повышенных или пониженных уровней по сравнению с подходящим контролем. "Подходящий контроль" или "соответствующий контроль" включает значение, уровень, признак, характеристику или свойство, определяемое в клетке или другом биологическом образце ткани или организма, например, в контрольной или нормальной клетке, ткани или организме, проявляющем, например, нормальные признаки, такие как отсутствие состояния. В определенных вариантах осуществления "подходящий контроль" или "соответствующий контроль" представляет собой предопределенную величину, уровень, признак, характеристику или свойство. Другие подходящие контроли будут понятны специалистам в данной области. Примеры заболеваний и состояний, например, заболеваний, ассоциированных с аутоантителами, специфическими к гистидил-тРНК-синтетазе, описаны где-либо еще в настоящем описании.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают способы детекции на основе полинуклеотида или нуклеиновой кислоты HRS, которые обеспечивают определенные преимущества благодаря чувствительности детекции. Таким образом, определенные варианты осуществления относятся к использованию или детекции полинуклеотидов HRS в качестве части способа диагностики или диагностического анализа. Наличие и/или уровни полинуклеотидов HRS можно измерять любым известным в данной области способом, включая наряду с другими анализы гибридизации, такие как "нозерн"-блот, количественная или качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР), количественная или качественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-ПЦР), микропанель, дот-блоты или слот-блоты или гибридизация in situ, такая как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Некоторые из этих способов более подробно описаны ниже.

Полинуклеотиды HRS, такие как ДНК и РНК, также можно собирать и/или получать из крови, биологических жидкостей, тканей, органов, линий клеток или других соответствующих образцом с применением известных в данной области способов, таких как способы, описанные в Kingston. (2002 Current ProtoCols in MoleCular Biology, Greene Publ. AssoC. InC. & John Wiley & Sons, InC., NY, NY (см., например, как описано Nelson et al. ProC. Natl. ACad. SCi. USA, 99:11890-11895, 2002) и где-либо еще. Кроме того, ряд коммерчески доступных наборов для конструирования РНК являются пригодными для получения РНК, которую можно использовать в настоящем изобретении. РНК можно конструировать из органов/тканей/клеток, получаемых у нормальных здоровых индивидуумов, однако настоящее изобретение также предусматривает конструкцию РНК от страдающих болезнью индивидуумов. Определенные варианты осуществления предусматривают использование любого типа органа от любого типа индивидуума или животного. Для тестируемых образцов РНК можно получать у индивидуума (например, любого животного, включая млекопитающих) с видимым заболеванием или без него и из образцов ткани, биологических жидкостей (например, цельной крови) или т.д.

В определенных вариантах осуществления амплификация или конструкция последовательностей кДНК может являться пригодной для увеличения возможностей детекции. В настоящем описание, а также в данной области техники, предоставлен необходимый уровень подробного описания для выполнения таких задач. В одном иллюстративном варианте осуществления цельную кровь используют в качестве источника РНК и, таким образом, необязательно используют стабилизирующие РНК реагенты, такие как пробирки PAX, как описано, например, у ThaCh et al., J. Immunol. Methods, DeC 283(1-2):269-279, 2003 и Chai et al., J. Clin. Lab. Anal, 19(5):182-188, 2005 (обе включенные посредством ссылки). Библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) можно получать с применением известных в данной области способов, таких как способы, описанные у Ausubel et al. (2001, Current ProtoCols in MoleCular Biology, Greene Publ. AssoC. InC. & John Wiley & Sons, InC., NY, NY); Sambrook et al. (1989, MoleCular Cloning, SeCond Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY), Maniatis et al. (1982 MoleCular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY) и где-либо еще. Кроме того, ряд коммерчески доступных наборов для конструирования библиотек кДНК является пригодным для получения библиотек кДНК по настоящему изобретению. Библиотеки можно конструировать из органов/тканей/клеток, получаемых у нормальных, здоровых индивидуумов.

В определенных вариантах осуществления можно применять способы гибридизации для детекции последовательностей полинуклеотида HRS. Способы проведения анализов гибридизации полинуклеотидов хорошо установлены в данной области. Способы и условия анализа гибридизации изменяются в зависимости от применения и выбраны в соответствии с общими известными способами связывания, включая способы, указанные в: Maniatis et al., MoleCular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to MoleCular Cloning TeChniques (ACademiC Press, InC., San Diego, Calif., 1987), Young and Davis, PNAS, 80:1194 (1983). Способы и устройства для проведения воспроизводимых и контролируемых реакций гибридизации были описаны в патентах США № 5871928, 5874219, 6045996 и 6386749, 6391623, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.

В определенных вариантах осуществления можно применять способы амплификации нуклеиновых кислот для детекции последовательностей полинуклеотида HRS. Термин "амплификация" или "амплификация нуклеиновых кислот" относится к получению множественных копий нуклеиновой кислоты-мишени, которая содержит по меньшей мере участок, предполагаемой конкретной последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Множественные копии могут быть обозначены как ампликоны или продукты амплификации. В определенных вариантах осуществления амплифицируемая мишень содержит не полную последовательность гена-мишени (интроны и экзоны) или экспрессированную последовательность гена-мишени (сплайсированный транскрипт экзонов и фланкирующих нетранслируемых последовательностей). Например, конкретные ампликоны можно получать амплификацией участка полинуклеотида-мишени с использованием праймеров для амплификации, которые гибридизуются с и инициируют полимеризацию от внутренних положений полинуклеотида-мишени. Предпочтительно амплифицированный участок содержит детектируемую последовательность-мишень, которую можно детектировать любым из ряда хорошо известных способов.

"Селективная амплификация" или "специфическая амплификация", как используют в настоящем описании, относится к амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, где детектируемая амплификация последовательности-мишени является по существу ограниченной амплификацией последовательности-мишени, в которую вносит вклад представляющий интерес образец нуклеиновой кислоты, который тестировали, и не вносит вклад последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, получаемая из какого-либо другого источника образца, например, загрязнения, содержащегося в реагентах, используемых во время реакций амплификации, или в окружающей среде, в которой проводят реакции амплификации.

Термин "условия амплификации" относится к условиям, обеспечивающим возможность амплификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Условия амплификации в некоторых вариантах осуществления могут являться менее жесткими по сравнению с "жесткими условиями гибридизации", как описано в настоящем описании. Олигонуклеотиды, используемые в реакциях амплификации по настоящему изобретению, гибридизуются со своими предполагаемыми мишенями в условиях амплификации, но могут гибридизоваться в жестких условиях гибридизации или могут не гибридизоваться. С другой стороны зонды для детекции по настоящему изобретению, как правило, гибридизуются в жестких условиях гибридизации. Специалист в данной области может легко определять приемлемые условия для проведения амплификаций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в зависимости от конкретного применяемого способа амплификации.

Во многих хорошо известных способах амплификации нуклеиновой кислоты необходимо термоциклирование для чередования циклов денатурации двухцепочечных нуклеиновых кислот и гибридизации праймеров, однако другие хорошо известные способы амплификации нуклеиновой кислоты являются изотермическими. В полимеразной цепной реакции (патенты США № 4683195, 4683202, 4800159, 4965188), общепринято обозначаемой как ПЦР, используют много циклов денатурации, отжига пар праймеров на противоположных цепях и удлинение праймера с экспоненциальным увеличением числа копий последовательности-мишени. В варианте, называемом RT-ПЦР, используют обратную транскриптазу (RT) для получения комплементарной ДНК (кДНК) из мРНК, а затем кДНК амплифицируют посредством ПЦР для получения множественных копий ДНК.

Как указано выше, термин "ПЦР" относится к множественным циклам амплификации, в которых избирательно амплифицируют вид-мишень нуклеиновой кислоты. Включены количественная ПЦР (qПЦР), ПЦР в реальном времени), также в данной области описаны ПЦР с обратной транскрипцией (RT-ПЦР) и количественная ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-ПЦР). Термин "pПЦР" относится к количественной полимеразной цепной реакции, и термин "qRT-ПЦР" относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. qПЦР и qRT-ПЦР можно использовать для амплификации и одномоментного количественного определения молекулы-мишени кДНК. Она обеспечивает детекцию и количественное определение конкретной последовательности в совокупности кДНК, такой как выбранный ген или транскрипт AARS.

Термин "ПЦР в реальном времени" может предполагать использование ДНК-связывающего красителя для связывания со всеми двухцепочечными (дц) ДНК в ПЦР, что вызывает флуоресценцию красителя. Увеличение продукта ДНК во время ПЦР, таким образом, приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, и ее измеряют в каждом цикле, таким образом, обеспечивая количественную оценку концентраций ДНК. Однако красители для дцДНК, такие как SYBR Green, связываются со всеми продуктами дцДНК ПЦР. Флуоресценцию детектируют и измеряют в термоциклере для ПЦР в реальном времени и используют ее геометрическое увеличение, соответствующее экспоненциальному увеличению продукта, для определения порогового цикла ("Ct") в каждой реакции.

Термин "значение Ct" относится к значению порогового цикла, который представляет собой цикл, при котором амплификация ПЦР превосходит пороговый уровень. Если в образце содержится более высокое количество мРНК конкретного гена, она перейдет порог раньше, чем ген, экспрессируемый на более низком уровне, т.к. содержится больше начальной РНК для амплификации. Таким образом, низкое значение Ct свидетельствует о высокой экспрессию гена в образце, и высокое значение Ct является показателем низкой экспрессии гена.

В определенных вариантах осуществления можно применять лигазную цепную реакцию (Weiss, SCienCe, 254: 1292, 1991), общепринято обозначаемую как LCR, в которой используют два набора комплементарных олигонуклеотидов ДНК, которые гибридизуются с соседними областями нуклеиновой кислоты-мишени. Олигонуклеотиды ДНК ковалентно связываются ДНК-лигазой в повторных циклах термической денатурации, гибридизации и лигирования с получением детектируемого двухцепочечного лигированного олигонуклеотидного продукта.

Другой способ представляет собой амплификацию с замещением цепей (Walker et al., 1992, PNAS USA, 89:392-396, патенты США № 5270184 и 5455166), общепринято обозначаемую как SDA, в которой используют циклы отжига последовательностей пар праймеров с противоположными цепями последовательности-мишени, удлинение праймера в присутствии dNTPαS с получением дуплекса гемитиофосфатированного продукта удлинения праймера, опосредованного эндонуклеазой одноцепочечного разрыва с образованием гемимодифицированного участка распознавания рестрикционной эндонуклеазы, и опосредованного полимеразой удлинения праймера с 3'-конца одноцепочечного разрыва с перемещением существующей цепи и получением цепи для следующего цикла отжига праймера, одноцепочечного разрыва и перемещения цепи, приводящего к геометрической амплификации продукта. В термофильной SDA (tSDA) используют термофильные эндонуклеазы и полимеразы при высоких температурах по существу аналогичным способом (европейский патент № 0684315).

Другие способы амплификации включают, например: амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (патент США № 5130238), общепринято, обозначаемой как NASBA, амплификацию, в которой используют РНК-репликазу для амплификации самой молекулы зонда (Lizardi et al., 1988, BioTeChnol., 6:1197-1202), общепринято обозначаемую как Qβ-репликаза, способ амплификации на основе транскрипции (Kwoh D. et al., 1989, ProC. Natl. ACad. SCi. USA, 86:1173-1177), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli J. et al., 1990, ProC. Natl. ACad. SCi. USA. 87:1874-1878) и опосредованную транскрипцией амплификацию (патенты США № 5480784 и 5399491), общепринято обозначаемую как TMA. Для дополнительного описания известных способов амплификации см. Persing David H., 1993, "In Vitro NuCleiC ACid AmplifiCation TeChniques" in DiagnostiC MediCal MiCrobiology: PrinCiples and AppliCations (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (AmeriCan SoCiety for MiCrobiology, Washington, DC).

Иллюстративные системы амплификации на основе транскрипции по настоящему изобретению включают TMA, в которой применяют РНК-полимеразу для получения множественных РНК-транскриптов области-мишени (патенты США № 5480784 и 5399491). В TMA используют "промотор-праймер", который гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью в присутствии обратной транскриптазы и РНК-полимеразы с образованием двухцепочечного промотора, из которого РНК-полимераза продуцирует РНК-транскрипты. Эти транскрипты могут становиться матрицами для дальнейших циклов TMA в присутствии второго праймера, способного гибридизоваться с РНК-транскриптами. В отличие от ПЦР LCR или другие способы, в которых необходима тепловая денатурация, TMA представляет собой изотермический способ, в котором используют активность РНКазы H для расщепления цепи РНК гибрида РНК:ДНК, таким образом, делая цепь ДНК доступной для гибридизации с праймером или промотором-праймером. Как правило, используют активность РНКазы H, ассоциированную с обратной транскриптазой, предоставляемой для амплификации.

В иллюстративном способе TMA один праймер для амплификации представляет собой олигонуклеотид промотор-праймер, который содержит промоторную последовательность, которая становится функциональной, когда является двухцепочечной, расположенной со стороны 5' по отношению к связывающей мишень последовательности, которая может гибридизоваться с участком связывания РНК-мишени в положении 3' по отношению к последовательности, которую необходимо амплифицировать. Промотор-праймер может быть обозначен как "T7-праймер", когда он является специфическим для распознавания РНК-полимеразы T7. В определенных обстоятельствах 3'-конец промотора-праймера или субпопуляции таких промоторов-праймеров можно модифицировать, чтобы блокировать или уменьшать удлинение праймера. Из немодифицированного промотора-праймера обратная транскриптаза создает копию кДНК РНК-мишени, при этом активность РНКазы H расщепляет РНК-мишень. Затем второй праймер для амплификации связывается с кДНК. Этот праймер может быть обозначен как обозначаемый как "не-T7 праймер" для отличия его от "T7-праймера". Из этого второго праймера для амплификации обратная транскриптаза создает другую цепь ДНК, приводящую к образованию двухцепочечной ДНК с функциональным промотором на одном конце. Когда она является двухцепочечной, промоторная последовательность способна связываться с РНК-полимеразой с началом транскрипции последовательности-мишени, с которой гибридизован промотор-праймер. РНК-полимераза использует эту промоторную последовательность для продукции множественных РНК-транскриптов (например, ампликонов), как правило, приблизительно от 100 до 1000 копий. Каждый вновь синтезированный ампликон может отжигаться со вторым праймером для амплификации. Затем обратная транскриптаза может создавать копию ДНК, при этом активность РНКазы H приводит к деградации РНК такого дуплекса РНК:ДНК. Затем промотор-праймер может связываться с вновь синтезированной ДНК, обеспечивая возможность обратной транскриптазе образовывать двухцепочечную ДНК, из которой РНК-полимераза образует множественные ампликоны. Таким образом, можно получать в миллион раз большую изотермическую амплификацию с использованием двух праймеров для амплификации.

В определенных вариантах осуществления можно использовать другие способы для оценки РНК-транскриптов из транскриптов конкретной библиотеки кДНК, включая анализ с использованием микропанелей (Han et al., Nat BioteChnol., 19:631-635, 2001, Bao et al., Anal. Chem., 74:1792-1797, 2002, SChena et al., PNAS USA, 93:10614-19, 1996 и Heller et al., ProC. Natl. ACad. SCi. USA, 94:2150-55, 1997) и SAGE (серийный анализ экспрессии генов). Аналогично MPSS, SAGE является цифровым и с его использованием можно получать большое количество сигнатурных последовательностей. (См. например, VelCulesCu V.E. et al., Trends Genet., 16:423-425., 2000, Tuteja R. and Tuteja N., Bioessays, 2004 Aug; 26(8):916-22), несмотря на то, что порядки величин являются ниже, чем у доступных способов, таких как MPSS.

В определенных вариантах осуществления термин "микропанель" включает "микропанель нуклеиновой кислоты", содержащий совокупность связанных с субстратом нуклеиновых кислот, где гибридизацию с каждой из совокупности связанных нуклеиновых кислот можно отдельно детектировать. Субстрат может являться твердым или пористым, плоским или неплослоким, цельным или дискретным. Микропанели нуклеиновой кислоты включают все устройства так называемые в SChena (ed.), DNA MiCroarrays: A PraCtiCal ApproaCh (PraCtiCal ApproaCh Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1) (suppl.): 1-60 (1999); SChena (ed.), MiCroarray BioChip: Tools and TeChnology, Eaton Publishing Company/BioTeChniques Books Division (2000). Микропанели нуклеиновых кислот могут включать совокупность связанных с субстратом нуклеиновых кислот, где совокупность нуклеиновых кислот располагается на совокупности гранул, а не на цельном плоском субстрате, как описано, например, у Brenner et al., ProC. Natl. ACad. SCi. USA, 97(4): 1665-1670 (2000). Примеры микропанелей нуклеиновой кислоты можно найти в патентах США № 6391623, 6383754, 6383749, 6380377, 6379897, 6376191, 6372431, 6351712, 6344316, 6316193, 6312906, 6309828, 6309824, 6306643, 6300063, 6287850, 6284497, 6284465, 6280954, 6262216, 6251601, 6245518, 6263287, 6251601, 6238866, 6228575, 6214587, 6203989, 6171797, 6103474, 6083726, 6054274, 6040138, 6083726, 6004755, 6001309, 5958342, 5952180, 5936731, 5843655, 5814454, 5837196, 5436327, 5412087 и 5405783, описания которых включены посредством ссылки.

Дополнительные примеры включают панели нуклеиновых кислот, которые являются коммерчески доступными от Affymetrix (Santa Clara, Calif.) под товарным наименованием GENECHIP™. Дополнительные иллюстративные способы получения и использования панелей предоставлены, например, в патентах США № 7028629, 7011949, 7011945, 6936419, 6927032, 6924103, 6921642 и 6818394.

В настоящем изобретении касательно панелей и микропанелей также предусмотрено использование полимеров, прикрепленных к твердым субстратам. Такие применения включают мониторинг экспрессии генов, анализ экспрессии генов, скрининг библиотек, генотипирование и диагностику. Способы мониторинг и анализа экспрессии генов и способы, пригодные для мониторинга и анализа экспрессии генов представлены в патентах США № 5800992, 6013449, 6020135, 6033860, 6040138, 6177248 и 6309822. Генотипирование и применение, таким образом, представлены в патентах США № 10/442021, 10/013598 (заявка США № 2003/0036069) и патентах США № 5925525, 6268141, 5856092, 6267152, 6300063, 6525185, 6632611, 5858659, 6284460, 6361947, 6368799, 6673579 и 6333179. Другие способы амплификации нуклеиновой кислоты, мечения и анализа, которые можно использовать в комбинации со способами, описываемыми в настоящем описании, описаны в патентах США № 5871928, 5902723, 6045996, 5541061 и 6197506.

Как будет понятно специалистам в данной области, в определенных вариантах осуществления можно применять олигонуклеотиды, такие как праймеры или зонды, для амплификации или детекции, как описано в настоящем описании. Олигонуклеотиды определенной последовательности и химической структуры можно получать способами, известными специалистам в данной области, такими как химическим или биохимическим синтезом, и экспрессией in vitro или in vivo из рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, например, бактериальных или вирусных векторов. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид состоит не только из хромосомной ДНК дикого типа или ее продуктов транскрипции in vivo.

Олигонуклеотиды или праймеры можно модифицировать любым путем при условии, что данная модификация является совместимой с желаемой функцией данного олигонуклеотида. Специалист в данной области может легко определять, является ли данная модификация подходящей или желательной для любого данного олигонуклеотида по настоящему изобретению. Соответствующие олигонуклеотиды AARS более подробно описаны где-либо еще в настоящем описании.

Несмотря на то, что структура и последовательность олигонуклеотидов зависит от их функции, как описано в настоящем описании, как правило, учитывают несколько параметров. В числе наиболее релевантных являются: длина, температура плавления (T_m), специфичность, комплементарность с другими олигонуклеотидами в системе, содержание G/C, полипиримидиновые (T, C) или полипуриновые (A, G) участки и 3'-конецая последовательность. Регулирование таких и других параметров является стандартом и хорошо известным аспектом конструирования олигонуклеотидов, и различные компьютерные программы являются легкодоступными для скрининга большого числа потенциальных олигонуклеотидов для оптимальных вариантов.

Таким образом, определенные варианты осуществления относится к способам детекции полинуклеотида-мишени AARS в образце, где полинуклеотид содержит последовательность эталонного полинуклеотида AARS, как описано в настоящем описании, включающим a) гибридизацию образца с зондом, содержащим последовательность, комплементарную полинуклеотиду-мишени в образце, и где зонд специфически гибридизуется с указанным полинуклеотидом-мишенью в условиях, в которых образуется гибридизационный комплекс указанного зонда и указанного полинуклеотида-мишени или их фрагментов, и b) детекцию наличия или отсутствия указанного гибридизационного комплекса и при наличии необязательно его количества. Также включены способы детекции полинуклеотида-мишени HRS в образце, где полинуклеотид содержит последовательность эталонного полинуклеотида HRS, как описано в настоящем описании, включающие a) амплификацию полинуклеотида-мишени или его фрагмента и b) детекцию наличия или отсутствия указанного амплифицированного полинуклеотида-мишени или его фрагмента и необязательно при наличии его количества. Конкретные варианты осуществления относятся к детекции вариантов сплайсинга AARS, такой как детекция уникальной точка сплайсинга варианта сплайсинга гибридизацией, амплификацией или другим способом детекции.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают ряд способов на основе детекции полипептида HRS, включая способы детекции на основе детекции антитела. В эти варианты осуществления входит применение полипептидов HRS для детекции, количественного определения или картирование эпитопов антител к HRS в биологическом образце, таком как сыворотка, цельная кровь или плазма. В определенных вариантах осуществления можно применять стандартные способы и детекторы, такие как вестерн-блоттинг и иммунопреципитация, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), проточная цитометрия и иммунофлуоресцентные анализы (IFA), в которых используют устройство для визуализации.

Такие полипептиды HRS человека обладают неожиданно превосходными характеристиками связывания антитела по сравнению с существующими ранее способами детекции антитела, которые основаны на препаратах гистидил-тРНК-синтетазы, не принадлежащей человеку, или на неочищенных препаратах.

В некоторых вариантах осуществления таких анализов полипептид HRS представляет собой полипептиды HRS, перечисленные в таблицах D1-D9 или получаемые из них. В некоторых вариантах осуществления полипептид HRS содержит метку для облегчения прикрепления к твердой поверхности. В одном из вариантов осуществления метка представляет собой полигистидиновую метку.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептиды HRS можно использовать для составления профиля пациентов для идентификации тяжести заболевания на основе антител к Jo-1. Такие профили обеспечивают отбор пациентов в субпопуляции, которые получать пользу от лечения полипептидом HRS, прогноз наиболее вероятного терапевтического исхода и/или идентификацию полипептида(ов) HRS, наиболее пригодных для использования в качестве терапевтических средств.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу идентификации являющегося человеком индивидуума, подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, включающему a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела к гистидил-тРНК-синтетазе у индивидуума и b) и идентификацию индивидуума, как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума присутствуют детектируемые антитела к гистидил-тРНК-синтетазе или полипептиду HRS.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке составляет более приблизительно 1 микромоль.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке составляет более приблизительно 2 микромоль.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать как подвергающегося риску развития неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение полипептида HRS, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке составляет более приблизительно 4 микромоль.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу выбора полипептида HRS для лечения являющегося человеком индивидуума с аутоиммунным или воспалительным состоянием, включающему a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела к гистидил-тРНК-синтетазе у индивидуума и b) выбора полипептида HRS, который обладает пониженной аффинностью к антителу к гистидил-тРНК-синтетазе по сравнению с гистидил-тРНК-синтетазой дикого типа.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу диагностики прогрессирования заболевания у являющегося человеком индивидуума, включающему a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела к гистидил-тРНК-синтетазе у индивидуума и b) идентификацию индивидуума как подвергающегося риску развития более тяжелого заболевания, если у индивидуума выявляют детектируемые антитела к гистидил-тРНК-синтетазе или полипептиду HRS.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать, как подвергающегося риску развития более тяжелого заболевания, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке составляет более приблизительно 1 микромоль.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать, как подвергающегося риску развития более тяжелого заболевания, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке составляет более приблизительно 2 микромоль.

В некоторых аспектах индивидуума можно идентифицировать, как подвергающегося риску развития более тяжелого заболевания, если у индивидуума концентрация антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке составляет более приблизительно 4 микромоль.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу прогнозирования реакций индивидуума в ответ на введение полипептида HRS, включающему a) определение уровня антитела или эпитопной специфичности антитела к гистидил-тРНК-синтетазе у индивидуума и b) идентификацию того, что введение полипептида является подходящим для индивидуума, если у индивидуума не выявляют детектируемые антитела к гистидил-тРНК-синтетазе или полипептиду HRS.

В некоторых аспектах можно идентифицировать, что введение полипептида HRS является подходящим для индивидуума, если у индивидуума выявляют концентрацию антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке менее приблизительно 1 микромоль.

В некоторых аспектах можно идентифицировать, что введение полипептида HRS является подходящим для индивидуума, если у индивидуума выявляют концентрацию антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке менее приблизительно 0,1 микромоль.

В некоторых аспектах можно идентифицировать, что введение полипептида HRS является подходящим для индивидуума, если у индивидуума выявляют концентрацию антител к гистидил-тРНК-синтетазе в сыворотке более приблизительно 0,01 микромоль.

В определенных вариантах осуществления можно применять "панели", такие как "микропанели". В определенных вариантах осуществления "микропанель" может также обозначать "микропанель пептидов" или "микропанель белков", содержащую связанный с субстратом набор или совокупность полипептидов, где связывание с каждой из совокупности связанных полипептидов можно раздельно детектировать. Альтернативно, микропанель пептидов может содержать совокупность связывающих средств, включая, но, не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, связывающие средства из фагового дисплея, связывающие средства из дрожжевых 2-гибридных систем и аптамеры, с использованием которых можно специфически детектировать связывание полипептидов HRS, описываемых в настоящем описании. Панель может быть основана на детекции аутоантителами этих полипептидов HRS, как описано, например, у Robinson et al., Nature MediCine, 8(3):295-301 (2002). Примеры панелей пептидов можно найти в WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210 и WO 97/42507, и патентах США № 6268210, 5766960 и 5143854, каждые из которых включены посредством ссылки.

В определенных вариантах осуществления можно применять MS или другие способы на основе определения молекулярной массы для диагностической детекции последовательностей полипептида HRS. Масс-спектрометрия (MS), как правило, относится к аналитическому способу определения элементной композиции образца или молекулы. MS также можно использовать для определения химических структур молекул, таких как пептиды и другие химические соединения.

Как правило, MS основана на ионизации химических соединений с образованием заряженных молекул или фрагментов молекул, а затем изменении их отношений масса к заряду. В иллюстративном способе MS: образец наносят на устройство для MS и повергают испарению, компоненты образца ионизируют любым из ряда способов (например, подвергая их воздействию электронной пушки), что приводит к образованию положительно заряженных частиц, затем положительные ионы ускоряют магнитным полем, вычисление проводят на основании отношения массы к заряду (m/z) частиц на основании характеристик перемещения ионов при прохождении через электромагнитные поля и детекции ионов, которые на предыдущем этапе были отсортированы в соответствии с m/z.

В иллюстративных устройствах для MS содержатся три модуля: источник ионов, который преобразует газовую фазу образца молекул в ионы (или в случае ионизации распылением в электрическом поле перемещает ионы, которые существуют в растворе, в газовую фазу), масс-анализатор, который сортирует ионы по их массам посредством приложения электромагнитного поля, и детектор, который измеряет значение количества индикатора и, таким образом, предоставляет данные для вычисления относительных содержаний каждого содержащегося иона.

Способ MS находит качественное и количественное применения, включая идентификацию неизвестных соединений, определение изотопного состава элементов в молекуле и определение структуры соединения путем наблюдения его фрагментации. Другие применения включают определение количества соединения в образце или исследования основных принципов химии ионов газовой фазы (химии ионов и нейтральных частиц в вакууме). Включены газовая хроматография-масс-спектрометрия (GC/MS или GC-MS), жидкостная хроматография масс-спектрометрия (LC/MS или LC-MS) и спектрометрия подвижности ионов/масс-спектрометрия (IMS/MS или IMMS). Таким образом, способы MS можно использовать в соответствии с любым из способов, предоставленных в настоящем описании, для измерения содержания или уровней полипептид AARS по изобретению в биологическом образце и для сравнения этих уровней с контрольным образцом или предопределенного значения.

В определенных вариантах осуществления можно применять сортировку клеток или визуализацию клеток или устройства для визуализации/способы для детекции или количественного определения наличия или уровней полинуклеотидов или полипептидов AARS. Примеры включают проточную цитометрию или FACS, иммунофлуоресцентный анализ (IFA) и способы гибридизации in situ, такие как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

В определенных вариантах осуществления для диагностических целей можно применять общепринятые в биологии способы, программное обеспечение и системы. Продукты компьютерного программного обеспечения по изобретению, как правило, включают машиночитаемый носитель, содержащий выполняемые компьютером инструкции для проведения этапов способа по изобретению. Подходящий машиночитаемый носитель включает гибкий диск, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, жесткий диск, флэш-память, ROM/RAM, магнитные ленты и т.д. Выполняемые компьютером инструкции могут быть написаны на подходящем языке программирования или комбинации нескольких языков. Основные способы вычислительной биологии описаны, например, у Setubal and Meidanis, et al., IntroduCtion to Computational Biology Способы (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Computational Methods in MoleCular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, BioinformatiCs BasiCs: AppliCation in BiologiCal SCienCe and MediCine (CRC Press, London, 2000) и Ouelette and Bzevanis BioinformatiCs: A PraCtiCal Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, InC., 2nd ed., 2001). См. патент США № 6420108.

В определенных вариантах осуществления можно применять различные компьютерные программные продукты и программное обеспечение для различных целей, таких как конструирование зондов, обработка данных, анализ и работы прибора. См., патенты США № 5593839, 5795716, 5733729, 5974164, 6066454, 6090555, 6185561, 6188783, 6223127, 6229911 и 6308170.

Полногеномный анализ образца (WGSA) описан, например, у Kennedy et al., Nat. BioteCh., 21, 1233-1237 (2003), Matsuzaki et al., Gen. Res., 14:414-425, (2004) и Matsuzaki, et al., Nature Methods, 1:109-111 (2004). Алгоритмы для использования с анализами картирования описаны, например, у Liu et al., BioinformatiCs, 19:2397-2403 (2003) и Di et al. BioinformatiCs, 21:1958 (2005). Дополнительные способы, родственные WGSA, и панели, пригодные для WGSA и применения WGSA описаны, например, в патентной заявке США № 60/676058, зарегистрированной 29 апреля 2005 года, 60/616273, зарегистрированной 5 октября 2004 года, 10/912445, 11/044831, 10/442021, 10/650332 и 10/463991. Полногеномные исследования связей с использованием анализов картирования описаны, например, у Hu et al., CanCer Res., 65(7):2542-6 (2005), Mitra et al., CanCer Res., 64(21):8116-25 (2004), ButCher et al., Hum Mol Genet., 14(10):1315-25 (2005) и Klein et al., SCienCe, 308(5720):385-9 (2005).

Кроме того, определенные варианты осуществления могут включать способы предоставления генетической информации в сетях, таких как интернет, как продемонстрировано, например, в заявках США № 10/197621, 10/063559 (публикация заявки США № 2002/0183936), 10/065856, 10/065868, 10/328818, 10/328872, 10/423403 и 60/482389.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение His-направленного резокина (HRS(1-60))

Оптимизация кодона и синтез гена

ДНК, кодирующую резокин (HRS(1-60)), подвергали оптимизации кодона для экспрессии в E. Coli с использованием алгоритма, разработанного DNA2.0 (Menlo Park, CA). Ген синтезировали с C-концевой меткой 6xHis и субклонировали в вектор pJexpress411, где использовали промотор T7 для регуляции транскрипции и использовали устойчивость к канамицину для отбора с использованием антибиотика. Кодон-оптимизированные последовательность ДНК являются такими, как указано ниже:

ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGGTCTGAAGCAGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCTGATCGAAGAAGAGGTGGCCAAACTGCTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCCGAAACACCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO: 40)

Последовательность транслируемого белка является такой, как указано ниже:

MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKHHHHHH (SEQ ID NO: 41)

Экспрессирующий штамм. Компетентные клетки BL21(DE3) (Novagen, каталожный номер 69450) трансформировали кодон-оптимизированной экспрессирующей конструкцией. В кратком изложении плазмиду (1 мл) добавляли к 50 мл компетентных клеток. Реакционную смесь смешивали и инкубировали на льду в течение 30 минут. Реакционную смесь подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 30 секунд с последующим холодовым шоком на льду в течение 2 минут. Затем добавляли среду SOC (500 мл) и инкубировали пробирку при 37°C, 250 об/мин в течение 1 часа. В заключении аликвоту культуры (50 мл) распределяли на чашке с канамицином (Teknova S9641) и инкубировали при 37°C в течение ночи. Отбирали отдельную колонию и использовали для экспрессии в крупных масштабах.

Среда. Среду M9YE получали смешиванием 200 мл стерильной минимальной соли M9 5X (BD248510), 778 мл 30 г/л дрожжевого экстракта в стерильной очищенной воде (BD212750), 20 мл стерилизованной 20% глюкозы (Sigma G7021) и 2 мл стерильного 1,0 M MgSO₄ (Sigma M7506). Раствор для подпитки содержал 5% дрожжевой экстракт, 50% глюкозы, микроэлементы и 2 г/л сульфата магния. Канамицин сульфат (Invitrogen 15160) добавляли до конечной концентрации 100 мг/мл в M9YE и раствор для подпитки.

Периодическая ферментация с подпиткой. Для периодической ферментации с подпиткой использовали 4 л ферментер (Sartorius Biostat B plus) с программным обеспечением MFCS/DA. Перемешивание устанавливали при 1000 об/мин. Значение pH регулировали при 7,0 автоматически добавлением 30% гидроксида аммония (Sigma 221228) и 30% фосфорной кислоты (Sigma P5811). Поступление воздуха обеспечивали при скорости потока 4 л/минуту с воздушного компрессора с диафрагмой без масла (Cole-Parmer). Воздух пропускали через 0,2 мм фильтр Midisart 2000 (Sartorius 17805). Чистый кислород (West Air) поставляли автоматически, контролируя уровень растворенного кислорода при 70%. Температуру контролировали при 30°C с использованием циркуляторного насоса Neslab RTE7 (Thermo SCientifiC). Пенообразование регулировали добавлением противовспенивателя 204 (Sigma A8311). Начальный объем среды M9YE в ферментере составлял 3 л. Ферментер инкубировали со 150 мл посевной культуры, растущей в течение ночи при 30°C и 250 об/мин. Когда уровень глюкозы в сосуде снижался, в сосуд вводили концентрированный раствор для подпитки посредством перистальтического насоса, установленного при 0,9 мл/мин. Когда оптическая плотность клеток при 600 нм достигала приблизительно 30, культуру индуцировали 0,5 мМ IPTG (Fisher SCientifiC BP1755). Культуру растили в течение ночи (приблизительно фазу с подпиткой в течение 18 часов) и собирали центрифугированием при 6000×g в течение 1 часа. Осадок клеток хранили при -20°C до очистки. Экспрессию резокина подтверждали на SDS-PAGE.

Очистка резокина. Замороженную клеточную массу (70 г) ресуспендировали в 280 мл (т.е. 4 мл/г клеточной массы) лизирующего буфера (50 мМ Tris, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 5 мМ β-ME, pH 7,5). К суспензии добавляли не содержащие EDTA таблетки полного ингибитора протеазы (RoChe) в отношении 1 таблетка/50 мл. Суспензию дважды пропускали через микрофлюидизатор (MiCrofluidiCs) при 15000 фунт/дюйм² с охлаждением на льду. Лизат центрифугировали при 15000×g в течение 30 минут при 4°C. Супернатант фильтровали через 0,45+0,22 мкм капсульные фильтры ACropak 400 (Pall).

Осветленный лизат связывался со смолой Ni-NTA (Qiagen), предварительно уравновешенной связывающим буфером Ni-NTA (50 мМ Tris, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, pH 7,5). Колонку промывали 50 объемами колонки связывающего буфера Ni-NTA + 0,1% Triton X-114 с последующим промыванием 20 объемами колонки связывающего буфера Ni-NTA. Связанный белок, резокин, элюировали 4 объемами колонки элюирующего буфера Ni-NTA (50 мМ Tris, 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, pH 7,5).

Элюат Ni-NTA дополнительно очищали на катионообменной колонке. В частности, элюат Ni-NTA разбавляли в 20 раз связывающим буфером SP (10 мМ фосфата Na, pH 7,0) и нагружали в 33 мл колонку HP SP-сефароза, предварительно уравновешенную связывающим буфером SP. Размер колонки составлял диаметр 2,6 см при высоте 6,2 см. Желаемый продукт элюировали из колонки в линейном градиенте 0-0,5 M NaCl в связывающем буфере SP более 10 объемами колонки. Очищенный белок концентрировали до 6 мг/мл, буфер заменяли на PBS (Invitrogen produCt №10010) и фильтровали через 0,22 мкм стерильный фильтр. Выход очищенного белка составлял 150 мг (из 70 г клеточной массы) и уровень эндотоксина в нем составлял <1,7 ЕЭ/мг.

ПРИМЕР 2

Получение His-меченной полноразмерной гистидил-тРНК-синтетазы (HRS)

Оптимизация кодона и синтез генов. Ген полноразмерной HisRS подвергали кодон-оптимизации для экспрессии в E. Coli и субклонировали в вектор pET21a, где для управления транскрипции использовали промотор T7. Кроме того, к C-концу прикрепляли линкер длиной 5-аминокислот и метку 6×His.

Последовательность ДНК является такой, как указано ниже:

ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAaCCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTATGTATTTGCGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA (SEQ ID NO: 42)

Последовательность транслируемого белка является такой, как указано ниже:

MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCICAAALEHHHHHH (SEQ ID NO: 43)

Экспрессионный штамм. Компетентные клетки BL21(DE3) (Novagen, каталожный номер 69450) трансформировали кодон-оптимизированной экспрессирующей конструкцией. В кратком изложении, плазмиду (1 мл) добавляли к 50 мл компетентных клеток. Реакционную смесь смешивали и инкубировали на льду в течение 30 минут. Реакционную смесь подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 30 секунд с последующим холодовым шоком на льду в течение 2 минут. Затем добавляли среду SOC (500 мл) и инкубировали пробирку при 37°C, 250 об/мин. в течение 1 часа. В заключении аликвоту культуры (50 мл) распределяли на чашке с ампициллином (Teknova S9641) и инкубировали при 37°C в течение ночи. Отбирали отдельную колонию и использовали для экспрессии в крупных масштабах.

Среда. Среду M9YE получали смешиванием 200 мл стерильной минимальной соли M9 5X (BD248510), 778 мл 30 г/л дрожжевого экстракта в стерильной очищенной воде (BD212750), 20 мл стерилизованной 20% глюкозы (Sigma G7021) и 2 мл стерильного 1,0 M MgSO₄ (Sigma M7506). Питательный раствор содержит 5% дрожжевого экстракта, 50% глюкозы, микроэлементы и 2 г/л сульфаты магния. Ампициллин добавляли до конечной концентрации 100 мг/мл в M9YE и раствор для подпитки.

Периодическая ферментация с подпиткой. Для периодической ферментации с подпиткой использовали 4 л ферментер (Sartorius Biostat B plus) с программным обеспечением MFCS/DA. Перемешивание устанавливали при 1000 об/мин. Значение pH регулировали при 7,0 автоматически добавлением 30% гидроксида аммония (Sigma 221228) и 30% фосфорной кислоты (Sigma P5811). Поступление воздуха обеспечивали при скорости потока 4 л/минуту с воздушного компрессора с диафрагмой без масла (Cole-Parmer). Воздух пропускали через 0,2 мм фильтр Midisart 2000 (Sartorius 17805). Чистый кислород (West Air) поставляли автоматически, контролируя уровень растворенного кислорода при 70%. Температуру контролировали при 30°C с использованием циркуляторного насоса Neslab RTE7 (Thermo SCientifiC). Пенообразование регулировали добавлением противовспенивателя 204 (Sigma A8311). Начальный объем среды M9YE в ферментере составлял 3 л. Ферментер инкубировали со 150 мл посевной культуры, растущей в течение ночи при 30°C и 250 об/мин. Когда уровень глюкозы в сосуде снижался, в сосуд вводили концентрированный раствор для подпитки посредством перистальтического насоса, установленного при 0,9 мл/мин. Когда оптическая плотность клеток при 600 нм достигала приблизительно 30, культуру индуцировали 0,5 мМ IPTG (Fisher SCientifiC BP1755). Культуру растили в течение ночи (приблизительно фазу с подпиткой в течение 18 часов) и собирали центрифугированием при 6000×g в течение 1 часа. Осадок клеток хранили при -20°C до очистки. Экспрессию резокина подтверждали на SDS-PAGE.

Очистка HisRS. Замороженную клеточную массу (40 г) ресуспендировали в 160 мл (т.е. 4 мл/г клеточной массы) лизирующего буфера (20 мМ Tris, 400 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 14 мМ β-ME, pH 8,0 при 4°C). К суспензии добавляли не содержащие EDTA таблетки полного ингибитора протеазы (RoChe) в отношении 1 таблетка/50 мл. Суспензию дважды пропускали через микрофлюидизатор (MiCrofluidiCs) при 15000 фунт/дюйм² с охлаждением на льду. Лизат центрифугировали при 35000×g в течение 45 минут при 4°C. Супернатант фильтровали через 0,22 мкм капсульные фильтры ACropak 400 (Pall).

Осветленный лизат связывался со смолой Ni-NTA (Qiagen), предварительно уравновешенной связывающим буфером Ni-NTA (20 мМ Tris, 400 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 5 мМ β-ME, pH 8,0 при 4°C). Колонку промывали 500 объемами колонки связывающего буфера Ni-NTA + 0,1% Triton X-114 с последующим промыванием 50 объемами колонки связывающего буфера Ni-NTA. Связанный белок, HisRS, элюировали 5 объемами колонки элюирующего буфера Ni-NTA (20 мМ Tris, 400 мМ NaCl, 500 мМ имидазола, 5 мМ β-ME, pH 8,0 при 4°C).

Элюат Ni-NTA дополнительно очищали на катионообменной колонке. В частности, элюат Ni-NTA подвергали диализу против связывающего буфера Q (20 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT, pH 7,4) и нагружали в 5 мл колонку Q-сефароза, предварительно уравновешенную связывающим буфером Q. Желаемый продукт элюировали из колонки в линейном градиенте 0-1 M NaCl в связывающем буфере Q более 10 объемами колонки. Очищенную HisRS концентрировали и заменяли буфер на PBS (Invitrogen produCt №10010)+1 мМ DTT, и фильтровали через 0,22 мкм стерильный фильтр.

ПРИМЕР 3

Оценка резокина (HRS(1-60)) в качестве противовоспалительного средства

Для оценки потенциального противовоспалительного свойства полипептидов, получаемых из HRS, тестировали N-концевой природный вариант сплайсинга, содержащий аминокислоты 1-60 HRS (резокин) на модели колит, индуцированного TNBS (Epistem, Ltd, UK).

Наиболее распространенные формы воспалительных заболеваний кишечника (IBD), болезнь Крона и язвенный колит представляют собой хронические и прогрессирующие воспалительные нарушения желудочно-кишечного тракта. Болезнь Крона, как правило, поражает подвздошную кишку и толстую кишку, тогда как язвенный колит, как правило, поражает только внутреннюю оболочку толстой кишки и прямой кишки. Симптомы болезни Крона и язвенного колита, как правило, являются сходными с болью в животе и диареей. При умеренно-тяжелом язвенном колите часто наблюдают кровянистый стул. В настоящее время не существует лечения для IBD. Лекарственные средства и биологические препараты широко используются для лечения симптомов, индукции ремиссии и профилактики рецидива. Противовоспалительные лекарственные средства, такие как сульфасалазин, месаламин и кортикостероиды, как правило, представляют собой лекарственные препараты первой линии для лечения IBD для индукции ремиссии, при этом, как правило, используют супрессоры иммунной системы, чтобы способствовать поддержанию ремиссии. Наиболее распространенные модуляторы иммунной системы, используемые для лечения IBD, представляют собой азатиоприн, меркаптопурин и виды биологической терапии, такие как антитела против фактора некроза опухоли (антитела против TNF-α).

Разработка моделей IBD на животных способствует пониманию и исследованию видов терапии для IBD. На моделях колита, индуцированного сульфатом декстрана (DSS) и тринитробензолсульфоновой кислотой, (TNBS) на грызунах было продемонстрировано, что тяжесть потери массы, оценки при гистопатологии и эндоскопии толстой кишки соответствуют степени изменений провоспалительных цитокинов и хемокинов, которые преимущественно способствуют инфильтрации нейтрофилов и матричных металлопротеиназ. Эти модели IBD на грызунах также использовали для обоснования вычислительного подхода для идентификации потенциальных новых видов лекарственной терапии для IBD.

Исследования проводили на самцах мышей BDF-1 с 12 мышами/группе. Все мыши в группах обработки получали 3 мг TNBS в 50% этаноле/физиологическом растворе путем введения в толстую кишку на сутки исследования 0 для индукции колита и добавляли будезонид при 5 мг/кг перорально в качестве положительного контроля.

В этом исследовании резокин вводили ежесуточно посредством в/в инъекции, начиная за 3 часа до обработки TNBS, в концентрации 1 или 5 мг/кг. Данные, представленные на фигуре 1, демонстрируют, что обработка резокином (HRS(1-60)) в любой концентрации приводила к значительному увеличению выживаемости. Таким образом, очевидно, что резокин обладает потенциальными противовоспалительными эффектами, что находится в соответствии с гипотезой, что полипептиды HRS участвуют в локальном контроле воспалительных процессов.

Для прямого сравнения HRS(1-60) непосредственно с HRS (1-506) проводили повторное исследование TNBS в Biomodels (MA, USA на мышах C57BL/6).

План исследования: Контрольная группа без обработки состояла из 5 мышей с интраректальным введением носителя для TNBS (группа 1). TNBS (4 мг/100 мкл 50% этанола) вводили группе 2 (15 мышей/группа) и 10 мышам/группе для групп 3-7 на сутки 0. Группы 2 и 4-7 получали внутривенное введение один раз в сутки носителя, HRS(1-506), 3 и 1 мг/кг, и aTyr1920 5 и 1 мг/кг, соответственно с -1 до 5 суток. Группа 3 получала пероральное введение 2 мг/кг преднизолона один раз в сутки с -1 до 5 суток. Животных ежесуточно взвешивали. Всех животных подвергали видеоэндоскопии на сутки 3 и 5 для оценки степени колита и выявления можно ли наблюдать какие-либо благоприятные эффекты обработки. Всех выживших животных подвергали эвтаназии на сутки 5 для получения тканей толстой кишки для измерений массы и длины и для патологического исследования.

Способы: Эндоскопию проводили в слепом для исследователя режиме с использованием эндоскопа для мелких животных (Karl Storz Endoskope, Germany). Для оценки тяжести колита животных анестезировали изофлураном и подвергали видеоэндоскопии нижнего отдела толстой кишки. Колит оценивали визуально по 5 балльной шкале от 0 для нормальной до 4 для тяжелых язв. В описательных терминах эта шкала определена так, как описано в таблице E1. Каждой мыши присваивали один балл, который соответствовал наиболее тяжелому повреждению, наблюдаемому на всем протяжении длины толстой кишки. На сутки 5 животных подвергали эвтаназии и удаляли у них толстую кишку, ополаскивали, взвешивали и измеряли ее длину.

Таблица E1
Эндоскопическая шкала по оценки колита Балл Описание: 0 Нормальный 1 Утрата васкуляризации 2 Утрата васкуляризации и ломкость 3 Ломкость и язвы 4 Образование язв и кровотечения

Гистологические параметры оценивали путем осмотра толстой кишки, измеряя нижние 5 см у каждого животного, которые иссекали и 2 см срезы с каждого конца фиксировали в 10% формалине, заливали, делали срезы приблизительно 5 микрон и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического анализа. Средний 1 см срез толстой кишки быстро замораживали и хранили при -80°C. Тканевые срезы анализировал профессионально сертифицированный в области ветеринарии патолог, в частности с практикой в области патологии GI в слепом режиме. Каждый срез оценивали в баллах в отношении воспаления, отека и некроза/потери эпителия с использованием 5 бальной шкалы в соответствии с критериями, перечисленными в таблице E2. Баллы для каждых 4 срезов усредняли с получением одного среднего балла для мыши для одного параметра. Также описывали среднюю сумму баллов, которая представляет собой сумму баллов трех параметров.

Таблица E2
Гистологическая шкала колита Воспаление Балл Описание 0 Отсутствует 1 Редкие очаги, минимальный 2 Рассеянные агрегаты или легкое диффузное воспаление 3 Множественные агрегаты или умеренное диффузное воспаление 4 Заметное диффузное воспаление Отек Балл Описание 0 Отсутствует 1 Редкие очаги, минимальный 2 Рассеянные области или легкий диффузный отек 3 Множественные области или умеренный диффузный отек 4 Заметный диффузный отек Некроз/потеря эпителия Балл Описание 0 Отсутствует 1 <25% пораженной слизистой оболочки 2 26-50% пораженной слизистой оболочки 3 51-75% пораженной слизистой оболочки 4 >76% пораженной слизистой оболочки

Результаты: Все животные, которых обрабатывали TNBS, заметно теряли массу тела на сутки 1 и начинали набирать массу снова на сутки 3 или 4. На сутки 3 и 5 обработка 1 и 3 мг/кг HRS(1-506) или 1 и 5 мг/кг HRS(1-60) вызывала от легкого до умеренного снижения балльной оценки колита (таблица E3). Обработка 3 мг/кг HRS(1-506) соответственно вызвала наибольшее снижение балльной оценки колита по сравнению с другими группами обработки на сутки 3 и 5 (таблица E3). Обработка 2 мг/кг преднизолона вызывала легкое снижение балльной оценки колита на сутки 5, но не оказывала действия на сутки 3. Обработка 1 и 3 мг/кг HRS(1-506) или 1 и 5 мг/кг HRS(1-60) приводила к незначительным уменьшениям воспаления, отека, некроза/потери эпителия и суммарной балльной оценки по сравнению с обработкой TNBS+носитель (таблица E3).

Заключение: На модели колита, индуцированного TNBS, на мышах обработка HRS(1-60) при внутривенном введении 1 и 5 мг/кг и HRS(1-506) при 1 и 3 мг/кг приводила к значительным снижениям эндоскопической бальной оценки колита и патологической бальной оценки воспаления, отека, некроза/потери эпителия и суммы баллов. Не наблюдали неблагоприятного действия, характерного для лечения HRS(1-60), HRS(1-506) или преднизолоном. Эти результаты подтверждают проводимые ранее исследования и дополнительно устанавливают противовоспалительную роль полипептидов HRS при воспалительных заболеваниях и нарушениях, таких как IBD.

ПРИМЕР 4

Титрование остатков цистеина активного центра в полноразмерной HARS

Для определения расположения и идентичности предоставляемых на поверхности остатков цистеина в полноразмерной HARS очищенный рекомбинантный белок инкубировали с йодацетамидом в нативном и денатурированном состояниях для алкилирования любых предоставляемых на поверхности остатков цистеина. Затем образцы анализировали ограниченным протеолизом с последующим анализом LC-масс-спектрометрии для определения расположения и идентичности модифицированных остатков цистеина.

Для проведения исследований алкилирования полноразмерную меченую полигистидином HRS (6,65 мг/мл в PBS, 10% глицерина, 2 мМ DTT, pH7,4, (пример 2) сначала полностью восстанавливали посредством инкубации с 10 мМ DTT в течение 45 минут при комнатной температуре. Инкубации с йодацетамидом проводили с концентрацией йодацетамида 30 мМ ("низкая") или 100 мМ ("высокая") в течение 30 минут в темноте и проводили на нативных и денатурированных образцах HARS для подтверждения того, что реакция прошла. Денатурированные HARS получали посредством предварительно инкубации белка с 4M гуанидина в течение 45 минут при 50°C. После инкубации с йодацетамидом образцы подвергали диализу в PBS pH 7,4 при 4°C с использованием мембраны для диализа с порогом молекулярной массы 10 кДа и по меньшей мере с 3 сменами буфера, а затем использовали в масс-спектроскопическом анализе, как описано ниже.

В кратком изложении образцы получали разбавлением белков в 0,1% муравьиной кислоте до конечной концентрации 1 мг/мл и 5 мкг образцов белков инъецировали и анализировали обращенно-фазовой ВЭЖХ с последующим масс-спектрометрическим анализом с использованием масс-спектрометра Agilent TOF. Сначала образцы разделяли на колонке C3 для ВЭЖХ (колонка Agilent ZORBAX 300SB-C3, 5 мкм, 2,1×150 мм) в линейном градиенте (подвижная фаза B 2-60%) в течение 18 минут (подвижная фаза A: 0,1% муравьиная кислота, подвижная фаза B: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Масс-спектрометрический анализ образцов проводили в режиме построения кривой. Получали данные и анализировали посредством MassHunter (Agilent). Измеряемую молекулярную массу рассчитывали посредством MassHunter BioConfirm (Agilent).

Результаты (данные не показаны) демонстрировали, что в нативных состояниях только 3 или 4 остатка цистеина являются легко модифицированными, тогда как по сравнению с тем, когда белок сначала подвергают денатурации для разрушения его нативной конформации, все 10 цистеинов являлись легкодоступные для денатурации.

Для идентификации идентичности модифицированных остатков цистеина образцы перед инкубацией с йодацетамидом и после нее подвергали денатурации в 4M гуанидин HCl при 37°C в течение 30 минут с последующим протеолитическим расщеплением LysC с отношением 10:1 (масс./масс.) при комнатной температуре в течение 20 часов. Продукты расщепления белка анализировали LC/MS/MS с использованием ВЭЖХ Dionex и масс-спектрометра Thermo LTQ XL. Образцы сначала разделяли на колонке C18 ВЭЖХ (Agilent ZORBAX 300SB-C18, 5 мкм, 2,1×150 мм) в линейном градиенте подвижной фазы B (подвижная фаза A: 0,1% муравьиная кислота, подвижная фаза B: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Градиент начинается с 1-3% B в течение 10 минут, а затем до 40% B в течение 76 минут. Разделенные продукты расщепления белка анализировали полной MS в режиме построения графика или полным сканированием MS или анализировали сканированием тандемной MS/MS на трех первых идентифицированных ионах. Получали данные и анализировали XCalibur (Thermo). Секвенирование пептидов было основано на спектрах MS/MS каждого пептида, у которого пики b- и y-ионов совпадают с их теоретическими ионами. Идентификация пептидов и картирование участков модификаций основаны на молекулярной массе, и их подтверждают секвенированием пептидов с использованием спектров MS/MS, и они приведены в таблице E4.

Таблица E4
Результаты картирование пептидов LC-MS после ограниченного расщепления трипсином остаток Cys От-до Последовательность RT (мин) MH+ Cys83 76-85 VFDVIIRCFK (SEQ ID NO: 190) 56,24 1239,68 Cys174Cys191 155-193 VYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLK
(SEQ ID NO: 191) 61,27 4673,14 Cys196 194-210 IMCEILSSLQIGDFLVK (SEQ ID NO: 192) 73,14 1909,01 Cys224 211-230 VNDRRILDGMFAICGVSDSK (SEQ ID NO: 193) 58,53 2196,08 Cys235 231-240 FRTICSSVDK (SEQ ID NO: 194) 22,8 1155,57 Cys235 231-243 FRTICSSVDKLDK (SEQ ID NO: 195) 28,77 1511,79 Cys379 377-403 VPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEK (SEQ ID NO: 196) 81,00 3013,63 Cys445 448-472 LLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELK (SEQ ID NO: 197) 72,46 2784,48 Cys505Cys509 500-509 RRTGQPLCIC (SEQ ID NO: 198) 27,17 1146,57

Результаты выявили (данные не показаны), что Cys235, Cys507 и Cys509 являются легко модифицируемыми обработкой йодацетамидом и, таким образом, с большой вероятностью являются предоставленными на поверхности остатками, которые легко поддаются химической модификации.

ПРИМЕР 5

Получение модифицированных полипептидов HRS с измененным содержанием цистеина

Для определения, можно ли модулировать до альтернативных природных аминокислотных остатков или удалять любой из 10 природных остатков цистеина в полноразмерной HRS, конструировали праймеры для избирательной мутации каждого остатка цистеина. Для проведения этого можно использовать праймеры на основе представленных ниже (см. таблицу E5).

Таблица E5 Мутация Последовательность олигомеров SEQ ID NO: C83 5'-GTTTGACGTAATCATCCGTTGCTTCAAGCGCCACGGTGCAG-3' (Прямой) 199 C83 5'-CTGCACCGTGGCGCTTGAAGCAACGGATGATTACGTCAAAC-3' (Обратный) 200 C174 5'-GCCGATACCGGGAATTCTACCAGTGTGATTTTGACATTGCTGGG-3' (Прямой) 201 C174 5'-CCCAGCAATGTCAAAATCACACTGGTAGAATTCCCGGTATCGGC-3' (Обратный) 202 C191 5'-CCATGATCCCTGATGCAGAGTGCCTGAAGATCATGTGCGAG-3' (Прямой) 203 C191 5'-CTCGCACATGATCTTCAGGCACTCTGCATCAGGGATCATGG-3' (Обратный) 204 C196 5'-GCAGAGTGCCTGAAGATCATGTGCGAGATCCTGAGTTCACTTC-3' (Прямой) 205 C196 5'-GAAGTGAACTCAGGATCTCGCACATGATCT TCAGGCACTCTG C-3' (Обратный) 206 C224 5'-CTAGATGGGATGTTTGCTATCTGTGGTGTTTCTGACAGCAAGTTC-3' (Прямой) 207 C224 5'-GAACTTGCTGTCAGAAACACCACAGATAGCAAACATCCCATCTAG-3' (Обратный) 208 C235 5'-CAGCAAGTTCCGTACCATCTGCTCCTCAGTAGACAAGCTGG-3' (Прямой) 209 C235 5'-CCA GCT TGTCTACTGAGGAGCAGATGGTACGGAACTTGCTG-3' (Обратный) 210 C379 5'-GGGCGCAAGGTGCCATGTGTGGGGCTCAGCATTGGGG-3' (Прямой) 211 C379 5'-CCC CAA TGC TGA GCC CCA CAC ATG GCA CCT TGC GCC C-3' (Обратный) 212 C455 5'-CTGAACCAGTTACAGTACTGTGAGGAGGCAGGCATCCC-3' (Прямой) 213 C455 5'-GGGATGCCTGCCTCCTCACAGTACTGTAACTGG TTCAG-3' (Обратный) 214 C507 5'-GAGAACAGGCCAGCCCCTCTGCATCTGCTAGAACCCAGC-3' (Прямой) 215 C507 5'-GCTGGGTTCTAGCAGATGCAGAGGGGCTGGCCTGTTCTC-3' (Обратный) 216 C509 5'-CCAGCCCCTCTGCATCTGCTAGAACCCAGCTTTCTTG-3' (Прямой) 217 C509 5'-CAAGAAAGCTGGGTTCTAGCAGATGCAGAGGGGCTGG-3' (Обратный) 218 Удаление 3 последних кодонов 5'-GAACAGGCCAGCCCCTCTAGAACCCAGCTTTCTTG 3' (Прямой) 219 Удаление 3 последних кодонов 5'-CAAGAAAGCTGGGTTCTAGAGGGGCTGGCCTGT TC-3' (Обратный) 220

Для подтверждения данных титрования активного центра анализировали кристаллическую структуру полноразмерной HRS с использованием программы Getarea1.1 для оценки относительной локализации 10 остатков цистеина. Результаты (данные не показаны) позволяют предположить, что в дополнение к Cys235, Cys507 и Cys509 цистеины в положениях Cys174, Cys191 и Cys224 SEQ ID NO: 1 являются по меньшей мере частично предоставленными на поверхности, и с большой вероятностью их можно модифицировать стандартными реагентами. Кроме того анализ кристаллической структуры HRS позволяет предположить, что Cys174 и Cys191 способны образовывать внутреннюю дисульфидную связь, тогда как Cys507 и Cys509 способны образовывать межцепочечные дисульфидные связи в димере HRS, потенциально способствуя микрогетерогенности, которую можно благоприятным образом устранять.

Для непосредственной оценки значения двух C-концевых остатков цистеина в обеспечении образования межцепочечных дисульфидных связей сравнивали варианты с His-меткой полноразмерной HRS и варианты HRS с удаленным C-концом (HRS(1-506)) анализом SDSPAGE до восстановления и после него, как описано ниже. Результаты, представленные на фигуре 2, демонстрируют, что полноразмерная HRS представляет собой смесь ~50:50 нековалентно и SS-связанного димера, тогда как в HRS(1-506) значительно снижается содержание SS-связанного димера. Сравнение двух белков конкуретным ELISA, как описано ниже, выявило, что оба белка обладали сравнимыми значениями IC₅₀ в отношении связывания антитело к Jo-1 (данные не показаны). Значительное снижение образования межцепочечных дисульфидных связей, ассоциированных с HRS(1-506), позволяет предположить, что этот вариант является подходящей начальной точкой для разработки улучшенных форм продукта следующего поколения.

Для определения можно ли подвергать мутации любой из оставшихся четырех частично предоставленных на поверхности остатков цистеина в полноразмерной HRS до альтернативных природных аминокислотных остатков, конструировали праймеры для избирательной мутации остатков C174, C191, C224 и C235. Для проведения этого использовали следующие ниже праймеры, как представлено в таблице E6.

Таблица E6 Мутация Последовательность олигонуклеотидов SEQ ID NO: C191A CCCGGATGCCGAGGCTTTGAAAATTATGTG (Прямой) 221 C191A CAC ATA ATT TTC AAA GCC TCG GCA TCC GGG (Обратный) 222 C191S GATCCCGGATGCCGAGAGTTTGAAAATTATGTGTG (Прямой) 223 C191S CAC ACA TAA TTT TCA AAC TCT CGG CAT CCG GGA TC (Обратный) 224 C191V GATCCCGGATGCCGAGGTTTTGAAAATTATGTGTG (Прямой) 225 C191V CAC ACA TAA TTT TCA AAA CCT CGG CAT CCG GGA TC (Обратный) 226 C174A CGCGAATTCTATCAGGCTGATTTTGATATTGCCGG (Прямой) 227 C174A CCG GCA ATA TCA AAA TCA GCC TGA TAG AAT TCG CG (Обратный) 228 C174V CGCGAATTCTATCAGGTTGATTTTGATATTGCCG (Прямой) 229 C174V CGG CAA TAT CAA AAT CAA CCT GAT AGA ATT CGC G (Обратный) 230 C224S GGTATGTTTGCTATTTCCGGTGTTTCTGATTCC (Прямой) 231 C224S GGA ATC AGA AAC ACC GGA AAT AGC AAA CAT ACC (Обратный) 232 C235S CCAAATTCCGTACAATCTCCTCAAGCGTGGACAAATTGG (Прямой) 233 C235S CCA ATT TGT CCA CGC TTG AGG AGA TTG TAC GGA ATT TGG (Обратный) 234 C191A CCCGGATGCCGAGGCTTTGAAAATTATGTG (Прямой) 235 C191A CAC ATA ATT TTC AAA GCC TCG GCA TCC GGG (Обратный) 236

Мутации вводили посредством мутагенеза с использованием набора для сайт-специфического мутагенеза QuikChange Lightning (Agilent, каталожный номер 210518) по инструкциям производителя. После мутагенеза образцы обрабатывали ферментом Dpn I при 37°C и трансформировали в компетентные клетки XL10 gold общепринятыми способами. Множественные колонии выращивали в высокопитательном бульоне в течение ночи при 37°C и очищали получаемые плазмиды с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, каталожный номер 27106). Плазмиды секвенировали для подтверждения идентичности замены аминокислот каждого клона. Характерные клоны трансформировали в компетентные клетки NovaBlue (Novagen, каталожный номер 70181) и выращивали в 250 мл среды M9YE при 37°C в течение ночи. Получение препаратов проводили с использованием набора HiSpeed Plasmid Maxi (Qiagen, каталожный номер 12663) для получения исходного раствора плазмид мутанта для дальнейшего анализа. Концентрацию и чистоту определяли измерением A260, A280 и A230. Очищенные плазмиды хранили при -20°C до трансфекции в E. Coli или клетки млекопитающих согласно стандартным протоколам.

Для оценки влияния мутации каждого остатка характерные клоны трансформировали в E. Coli или клетки млекопитающих, и определяли выходы продукта, содержания эндотоксинов, стабильность и относительную активность в анализе ELISA для определения связывания с антителом к Jo-1, как описано ниже.

Получение белка. Компетентные клетки BL21(DE3) (Novagen, каталожный номер 69450) или клетки W3110 (ATTC) трансформировали кодон-оптимизированными экспрессирующими конструкциями, кодирующими конструкции со сниженным содержанием цистеина, как описано выше. Экспрессирующая система, ферментационные среды, условия ферментации и этапы очистки, используемые для получения рекомбинантного белка, являлись по существу такими же, как те, что описаны в примере 6 выше, после регуляции для получения в промышленном масштабе и количества используемой клеточной массы. В таблице E7 ниже представлены выходы продукта после очистки и уровни эндотоксинов для получаемых белков.

Таблица E7
Выходы продукта после очистки и уровни эндотоксина вариантов со сниженным содержанием цистеина Название Выход (мг/г клеточной массы) Эндотоксин (ЕЭ/мг) Полноразмерная HRS ++ 3,2 HRS(1-506) +++ 0,32 HRS(1-506)C174V ++ 0,71 HRS(1-506)C174A ++ 0,30 HRS(1-506)C191A ++ 0,46 HRS(1-506)C191V +++ 0,33 HRS(1-506)C191S +++ 0,32 HRS(1-506)C224S ++ 0,54 HRS(1-506)C235S +++ 0,60 +++ более чем 7 мг белка/г клеточной массы;
++ более 5 мг/г клеточной массы
+ менее 5 мг/г клеточной массы.

Результаты демонстрируют, что все варианты со сниженным содержанием Cys являлись относительно хорошо экспрессированным и являлись эффективно очищенными с низкими уровнями эндотоксина. В частности варианты со сниженным содержанием цистеина на основе мутации Cys191 и Cys235 проявляли благоприятные уровни экспрессии, хотя для всех клонов, демонстрировали приемлемые уровни экспрессии и низкие уровни эндотоксина. По сравнению с экспрессией полноразмерной HRS для всех белков с модифицированными цистеинами выявляли значительно меньшее содержание эндотоксинов. Кроме того, все мутанты со сниженным содержанием цистеина HRS(1-506), HRS(1-506)C191V, HRS(1-506)C191S и HRS(1-506)C235S обладали улучшенной экспрессией относительно полноразмерной HARS дикого типа.

Для оценки влияния мутаций цистеина на гетерогенность заряда очищенных белков образцы каждого клона анализировали изоэлектрофокусированием. Образцы (10 мкг) нагружали на изоэлектрофокусирующий гель (pH 3-10) с использованием 1,0 мм геля IEF Life TeChnologies Novex pH 3-10 (каталожный номер P/N EC6645BOX), маркера IEF3-10 Novex (каталожный номер P/N 391201), набора буферов IEF Novex pH 3-10 (каталожный номер P/N LC5317) прогоняли с 1X катодным буфером (верхняя камера) и 1X анодным буфером (нижняя камера) при 100В в течение 1 часа, 200В в течение 1 часа и 500В в течение 30 минут. Гели фиксировали 12% TCA с 3,5% сульфосалициловой кислотой в течение 30 минут и окрашивали Expedeon InstantBlue (каталожный номер P/N ISB1L). Данные (результаты не показаны) демонстрируют, что мутация цистеина в положении 174 значительно снижала гетерогенность изоэлектрической точки, что согласуется вероятностью того, что этот остаток цистеина претерпевает образование внутримолекулярной дисульфидной связи с цистеином 191.

Для оценки влияния модификаций цистеина на термостабильность, подверженность агрегации, структуру и активность тРНК-синтетазы получаемых белков, белки оценивали дифференциальной сканирующей флуорометрией, эксклюзионной ВЭЖХ (SE-ВЭЖХ), конкурентным ELISA и титрованием активного центра. Результаты представлены в таблице E8 ниже.

Дифференциальную сканирующую флуорометрию проводили на образцах белка посредством мониторинга флуоресценции в зависимости от интенсивности флуоресценции липофильного красителя во время тепловой денатурации. Исследования проводили на образцах после того, как их разбавляли до 0,5 мг/мл в 100 мкл конечного объема PBS pH 7,0 (150 мМ NaCl, 20 мМ фосфат) и смешивали с раствором красителя с тепловым сдвигом, который получали разбавлением исходного раствора (Applied Biosystems/Life TeChnologies, P/N 4461146) в 20 раз в сверхчистой дистиллированной воде (GibCo, P/N 10977). Пять мкл разбавленного красителя добавляли к 100 мкл образца. Смесь вносили в 384-луночный оптически чистый реакционный планшет (Applied Biosystems/Life TeChnologies P/N 4309849) при 20 мкл в каждую лунку и повторения в 4 лунки на образец. Планшет считывали посредством устройства для ПЦР в реальном времени ViiA 7 (Applied Biosystems/Life TeChnologies, P/N 4453552). Протокол тепловой денатурации начинался со скорости изменения 1,6°C/с до тех пор, пока температура не достигала 25°C, где в этом устройстве удерживали такую температуру в течение 2 минут перед дальнейшим повышением температуры до 99°C при скорости 0,5°C/с, где в этой точке такую температуру удерживали еще в течение 2 минут.

Анализ эксклюзионной ВЭЖХ проводили на образцах очищенного белка с использованием TSKgel Super SW3000, 4,6 мм ID×30 см, размер частиц 4 мкм, колонки 250 Å (Tosoh, 18675) с использованием подвижной фазы 200 мМ фосфата Na, 150 мМ NaCl pH 7,0 при скорости потока 0,3 мл/минуту с системой ВЭЖХ Agilent 1260, оборудованной вакуумным дегазатором, насосом для двухкомпонентных/четырехкомпонентных смесей, термостатированного автоматического дозатора, термостатированного отделения колонки, детектора на диодной матрице (DAD) и хроматографического программного обеспечения Chemstation. Неразбавленные образцы (40 мкг) каждого белка инъецировали после короткого центрифугирования. Для обеспечения точности теста использовали образец для пригодности системы (бычий сывороточный альбумин, BSA, Thermo SCientifiC, P/N: 23209) и внутренний контроль (HRS дикого типа) для прогона перед прогоном образцов.

Конкурентные ELISA проводили в 96-луночных планшетах (Immulon 4HBX), которые покрывали 50 мкл раствором полноразмерной меченной his HARS, доведенным до концентрации 2 мг/мл PBS. Планшеты герметизировали и инкубировали в течение ночи при 4°C. Перед использованием планшеты промывали пять раз PBST, а затем блокировали 100 мкл 1% BSA в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. Пока проводили блокирование планшетов ELISA, конкурирующие молекулы со сниженным содержанием цистеина (в диапазоне концентраций от 1×10^-6M до 1×10^-13M) инкубировали с антителами к α-Jo-1 (GenWay GWB-FB7A3D или Immunovision HJO-0100) при разбавлении 1:10000 в 1% BSA PBS в отдельном планшете для инкубации (96-луночный планшет Costar 3357) в течение одного часа при 4°C. После завершения блокирования планшеты ELISA промывали три раза PBST и добавляли в планшет ELISA 50 мкл раствора, содержащего антитело и конкурирующее соединение, и инкубировали образцы при комнатной температуре в течение 1,5 часов. После первичной инкубации для связывания планшеты промывали пять раз PBST. Затем добавляли 50 мкл детектируемого антитела (антитела козы против F(ab')2 IgG человека: AbD SeroteC HRP 0500-0099) в разбавлении 1:5000 и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После вторичной инкубации для связывания планшеты промывали пять раз PBST и добавляли 50 мкл субстрата TMB (субстрат TMB Thermo SCientifiC PierCe PI-34021). Реакции протекали в течение 8 минут, где в это момент времени добавляли 50 мкл 2M останавливающего раствора серной кислота. Колориметрическое количественное определение проводили с использованием планшетного спектрофотометра SpeCtraMax при 450 нМ.

Для определения числа каталитически активных центров в каждом варианте HARS506 цистеина применяли анализ титрования активного центра (как описано у Fersht et al., (1975) BioChemistry). В кратком изложении, анализы проводили при комнатной температуре с 5 мкМ HARS, 10 мМ MgCl₂, 50 мкМ АТФ, 20 мМ L-гистидина, 2 мкг/мл неорганической пирофосфатазы, 1,65 мкМ [γ-32P]АТФ в стандартном буфере (100 мМ HEPES pH 7,5, 20 мМ KCl). Реакции инициировали ферментом в низкопрофильных планшетах для ПЦР, и моменты времени, в которые гасили в 96-луночных многослойных планшетах для фильтрования PVDF Millipore, содержащих HClO4/взвесь угля (1:4 7% HClO4:10% взвесь угля), составляли 30 секунд, 1 минуту, 2 минуты, 4 минуты, 6 минут и 10 минут. После перемешивания и суспендирования пипетированием и образцы центрифугировали в планшете для сбора иммунологического материала со смесью сцинтиллятора, и регистрировали на планшетном спектрофотометре MiCrobetae.

Таблица E8
Влияние модификации цистеина на термостабильность, агрегацию и активность HARS Название T_m % низкомолекулярных агрегатов % высокомолекулярных агрегатов IC₅₀ анализом ELISA титрование активного центра Полноразмерная HRS 1,2 7,0 0,2 ND HRS(1-506) 49,0 2,0 0,2 0,15 63,3 HRS(1-506)C174V 47,8 7,8 0,4 0,39 55,5 HRS(1-506)C174A 49,2 3,0 0,8 0,19 59,8 HRS(1-506)C191A 44,7 5,1 0,3 0,14 66,2 HRS(1-506)C191V 47,8 1,8 0,2 0,16 60,8 HRS(1-506)C191S 45,8 2,3 0,3 0,16 63,2 HRS(1-506)C224S 48,9 4,9 0,5 0,14 60,5 HRS(1-506)C235S 48,8 3,1 0,42 0,14 64,6

Результаты этих исследований подтверждают, что все мутанты по цистеину являются активными с незначительной потерей активности, стабильности или конформации или без потери, как измеряют титрованием активного центра, связыванием ELISA и определениями T_m для тепловой денатурации. Титрование активного центра активности тРНК-синтетазы выявило, что все мутанты со сниженным содержанием цистеина являются активными и, таким образом, пригодными для использования в любых из композиций, способах и наборах по изобретению. Как правило, для замены Cys191 выявляли общую более низкую термостабильность, тогда как для мутантов Cys174 демонстрировали значительно меньшую гетерогенность, как определяли изоэлектрофокусированием.

ПРИМЕР 6

Получение модифицированных полипептидов HRS с C-концевым усечением (HisRS^N8)

Для удаления трех последних аминокислот и линкера между HisRS дикого типа и меткой His конструировали праймеры для использования с набором для сайт-специфического мутагенеза QuikChange Lightning (Agilent, кат. № 210519). Для проведения этого используют следующие ниже праймеры, как перечислено в таблице E9:

Таблица E9 Мутация Последовательность олигонуклеотидов SEQ ID NO: Удаление CICAAALE прямой 5'-CGCCGCACCGGTCAACCGTTACACCACCACCACCACCACTG-3' 66 Удаление CICAAALE обратный 5'-CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGT AAC GGT TGA CCG GTG CGG CG-3' 67

Делецию вносили по инструкциям производителя для набора для сайт-специфического мутагенеза QuikChange Lightning. После мутагенеза образец обрабатывали ферментом Dpn I при 37°C и трансформировали в компотные клетки XL10 gold общепринятыми способами. Множественные клоны выращивали в бульоне Луриа-Бертани в течение ночи при 37°C и получаемые плазмиды очищали с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, каталожный номер 27106). Плазмиды секвенировали для подтверждения идентичности замены аминокислот каждого клона. Для удаления метки His конструировали праймеры для применения с набором для сайт-специфического мутагенеза QuikChange Lightning (Agilent, кат. № 210519). Для проведения этого использовали следующие ниже праймеры, как представлено в таблице E10:

Таблица E10 Мутация Последовательность олигонуклеотидов SEQ ID NO: Удаление His-метки прямой 5'-CGC CGC ACC GGT CAA CCG TTA TGA GAT CCG GCT GCT AAC-3' 68 Удаление His-метки обратный 5'-GTT AGC AGC CGG ATC TCA TAA CGG TTG ACC GGT GCG GCG-3' 69

Делецию вносили по инструкциям производителя для набора для сайт-специфического мутагенеза QuikChange Lightning, как описано выше.

Получение белка. Компетентные клетки BL21(DE3) (Novagen, каталожный номер 69450) или клетки W3110 (ATTC) трансформировали кодон-оптимизированной экспрессирующей конструкцией, кодирующей HisRS^N8 (HRS(1-506)), как описано в примере 2. Экспрессирующая система, ферментационные среды и условия ферментации, используемые для получения рекомбинантного белка, по существу являлись такими же, как описано в примере 2.

Очистка не содержащей метки HisRS^N8 (HisRS(1-506)). Замороженную клеточную массу (400 г) ресуспендировали в 4 объемах (1600 мл) лизирующего буфера (50 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ L-цистеина, pH7,4). К суспензии добавляли не содержащие EDTA таблетки полного ингибитора протеазы (RoChe, каталожный № 05056489001) в отношении 1 таблетка/50 мл. Суспензию дважды пропускали через микрофлюидизатор (MiCrofluidiCs) при 18000 фунтов/дюйм² с охлаждением льдом. Лизат центрифугировали при 15000×g в течение 45 минут при 4°C. Супернатант фильтровали через 2-3 капсулы ACroPak 1500 (0,8/0,2 мкм, Pall, PN12675).

Осветленный лизат нагружали в 382 мл колонку Q HP (5×19,5 см), предварительно уравновешенную буфером Q A (50 мМ Tris, 50 мМ NaCl, pH 7,4). Продукт элюировали в линейном градиенте 0-30% буфера Q B (50 мМ Tris, 1 M NaCl, pH 7,4) более чем 10 объемами колонки (CV). Собирали фракции при ½ CV/фракция и анализировали SDS-PAGE. Объединение было основано на гель анализе.

3,5 M раствор сульфата аммония добавляли к объединенной указанной выше фракции Q HP до конечной концентрации 1,2 M. Смесь фильтровали через ACroPak 200 (0,2 мкм) и нагружали в 481 мл колонку фенил HP (5×24,5 см), предварительно уравновешенную 20 мМ Tris, 1,2 M сульфата аммония, pH 7,0. Продукт элюировали в линейном градиенте 1,2-0 M сульфата аммония в 20 мМ Tris/pH 7,0 более 10 CV. Объединяли фракции (½ CV/фракция), содержащие продукт, на основании анализа SDS-PAGE.

Указанные выше объединенные фенильные фракции концентрировали до 0,5 л посредством системы TFF, состоящей из держателя кассет PelliCon Mini (Millipore, кат. № XX42PMINI), насоса Masterflex I/P и кассеты 2×0,1 м² (30 кДа M_WCO, Novasep, кат. № PP030M01L). Затем заменяли буфер концентрированного раствора 6 объемами (3 л) буфера CHT A (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,0). Перед проведением следующего этапа ретентат фильтровали через фильтр 0,2 мкм Millex GP-50 (Millipore, партия № SLGP 05010).

Указанный выше раствор нагружали в 380 мл керамическую гидроксиапатитную колонку (CHT) (5×19,4 см), предварительно уравновешенную буфером CHT A. Колонку промывали буфером A, а затем промывали 6% буфером B (500 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,0). Продукт элюировали в линейном градиенте 6-56% буфера B более 10 CV. Объединяли фракции (½ CV/фракция), содержащие продукт, на основании анализа SDS-PAGE.

С использованием аналогичной системы TFF объединенные фракции CHT концентрировали до ~0,2 л, заменяли буфер 6 объемами текущей буферной смеси (20 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,0), и концентрировали до целевой концентрации ~10 мг/мл. Раствор продукта фильтровали через фильтр 0,2 мкм Millex GP-50 (Millipore, партия № SLGP 05010) и хранили при -80°C в морозильнике.

ПРИМЕР 7

Оценка связывания полипептидов HRS с антителами к jo-1 в образцах у являющегося человеком пациента

96-луночные планшеты (Immulon 4HBX) покрывали 50 мл раствора белка, доведенного до концентрации 2 мг/мл PBS. Планшеты герметизировали и инкубировали в течение ночи при 4°C. Перед использованием планшеты промывали пять раз PBST, а затем блокировали 100 мл 1% BSA в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. Пока проводили блокирование планшетов ELISA, конкурирующую молекулу инкубировали с коммерчески доступными антителами к α-Jo-1 (GenWay GWB-FB7A3D, Immunovision HJO-0100 или RDL) при различных разбавлениях в 1% BSA PBS в отдельном планшете для инкубации (96-луночный планшет Costar 3357) в течение одного часа при 4°C. После окончания блокирования планшеты ELISA промывали три раза PBST и 50 мл раствора, содержащего антитело, и добавляли конкурирующее соединение в планшет ELISA и инкубировали образцы при комнатной температуре в течение 1,5 часов. После первичной инкубации для связывания планшеты промывали пять раз PBST. Затем добавляли 50 мл детектирующего антитела (антитело козы против F(ab')2 IgG человека: AbD SeroteC HRP 0500-0099) в 1:5000 разбавлении и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После вторичной инкубации для связывания планшеты промывали пять раз PBST и добавляли 50 мл субстрата TMB (субстрат TMB Thermo SCientifiC PierCe PI-34021). Реакции продолжались в течение 8 минут, в этот момент времени добавляли 50 мл 2M останавливающего раствора серной кислоты. Колориметрическое количественное определение проводили с использованием планшетного спектрофотометра SpeCtraMax при 450 нМ.

Характерные результаты представлены для конкурентного ELISA для HisRS^N8 (HRS1-506) по сравнению с полноразмерной HRS (фигура 5), резокина (HisRS^N4: HRS(1-60)) по сравнению с полноразмерной HRS (фигура 4) и полноразмерной HRS, инкубируемой с сывороткой в диапазоне разбавлений (фигура 3). Данные демонстрируют, что HisRS^N8 и полноразмерная HRS, но не резокин, способны конкурировать за связывание антител к Jo-1 в образцах являющегося человеком пациента с воспалительной миопатией и или интерстициальной легочной болезнью, у которых присутствуют антитела к Jo-1. Таким образом, HisRS^N8 и полноразмерная HRS обеспечивают эффективную стратегию конкуренции и блокирования активности антител к Jo-1 в клинических образцах человека, страдающего заболеванием, ассоциированным с аутоантителами, специфическими к гистидил-тРНК-синтетазе.

Кроме того, данные неожиданно демонстрируют, что Resokine (HisRS^N4) в этих условиях не дает значительной перекрестной реакции с антителами к Jo-1 и существенно не конкурирует пока присутствует в концентрации не более приблизительно 1×10^-7 M, когда полноразмерная гистидил-тРНК-синтетаза является связанной с поверхностью планшета. Таким образом, резокин (HisRS^N4) можно вводить пациентам для опосредования противовоспалительного действия, потенциально не вызывая существенной перекрестной реактивности с циркулирующими антителами к Jo-1.

Для дальнейшего исследования этого наблюдения проводили дополнительные исследования конкуренции с использованием общепринятых ELISA с титрованием (фигура 6). Результаты демонстрируют, что, когда HisRS^N4 или по существу полноразмерная гистидил-тРНК-синтетаза является связанной с поверхностью планшета, кривые связывания антител к Jo-1 являются приблизительно сопоставимыми, что подтверждает, что авидность или другие эффекты значительно могут способствовать кажущимся различиям, наблюдаемым в анализе конкурентного ELISA.

ПРИМЕР 8

Оценка эпитопной специфичности антитела к Jo-1

Для оценки эпитопной специфичности антител к Jo-1 у различных пациентов получали образцы сыворотки от RDL (California) и проводили скрининг посредством подхода элиминирующего ELISA для идентификации относительной специфичности антител образцов.

В кратком изложении, планшеты ELISA составляли с образцами His-меченных белков, приведенных на фигуре 7, как описано ранее, которые экспрессировали и очищали в E. Coli, как описано в примере 2. Образцы сначала инкубировали в планшетах ELISA, содержащих перечисленные выше белки (см. пример 5), а затем переносили супернатанты в новый планшет ELISA, с которым была связана по существу полноразмерная гистидил-тРНК-синтетаза. Сравнивая титры антител до и после деплеции, можно рассчитывать долю связывающихся антител к Jo-1, которые являются специфическими к конструкции каждого белка.

Данные, представленные на фигуре 8, демонстрируют широкий диапазон видов специфичности антитела к области (1-60) домена WHEP, а также к оставшемуся участку белка (dWHEP).

ПРИМЕР 9

Экстракорпоральное удаление антител к Jo-1 полипептидами HRS

Для оценки, могут ли полипептиды HRS являться пригодными для эффективной иммунодеплеции антител к HRS (например, антител к Jo-1) в сыворотке пациента, образцы HRS(1-506) и HRS(1-60) иммобилизовали на твердой подложке, а затем приводили в контакт с сывороткой для определения, способны ли они к иммунодеплеции образцов сыворотки антител к HRS. Титры антител к Jo-1 измеряли до и после нанесения на аффинную колонку для оценки способности каждого из полипептидов HRS удалять антитела к Jo-1.

Иммобилизация полипептидов HRS и деплеция антител к Jo-1. Полноразмерную HARS, HRS(1-506), HRS(1-60) и бычий сывороточный альбумин иммобилизовали на агарозном геле с использованием химии образования поперечных связей N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с рекомендациями производителя (Bio-Rad, аффигель 10, каталожный №153-6046). Для конъюгации использовали отношение 2 мг белка на 1 мл смолы. Антитела человека к Jo-1, получаемые от коммерческого поставщика (RDL, Los Angeles CA), разбавляли до 1:1000, а затем образцы пропускали через колонку, выполненную с каждым из конъюгатов иммобилизованного полипептида HRS и агарозы, получаемых как описано выше. Определяли титры антител к Jo-1 до и после прохождения через аффинную колонку, как описано ниже.

Титрование антитела к Jo-1. 96-луночные планшеты (планшеты Thermo sCientifiC Immulon 4 HBX, каталожный №6484) покрывали HisRS1 в концентрации 2 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°C. На следующие сутки планшеты промывали PBST и блокировали 1% BSA (Invitrogen, каталожный №15260), разбавленном в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали три раза PBST и инкубировали с образцами, содержащими антитела к Jo-1 в течение 1,5 часов при 37°C. Затем планшеты снова промывали три раза PBST и инкубировали со вторичным антителом (антитело козы против IgG человека, AbD SeroteC каталожный №0500-0099) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты снова промывали три раза PBST и инкубировали с субстратом 3,3',5,5'-тетраметилбензидином (TMB) (Thermo sCientifiC, каталожный №34021) в течение 5 минут и добавляли 2M серной кислоты и перемешивали, чтобы остановить реакцию. Затем снимают показания с планшетов при 450 нМ и определяли относительные титры антител.

Результаты (фигура 9) выявляли, что полноразмерная HARS и HRS(1-506) являлись эффективными для иммунодеплеции антитела к Jo-1 из образцов сыворотки человека. Неожиданно HRS(1-506) оказалась способной удалять до 99% детектируемых антител к Jo-1 при одном пропускании через аффинную смолу, тогда как полноразмерная HARS была способна удалять только приблизительно 93% детектируемых антител в тех же условиях. В соответствии с предшествующими исследованиями использованием меньшего фрагмента HARS HRS(1-60) обеспечивало возможность деплеции только приблизительно 20% детектируемых антитела к Jo-1, подтверждая, что этот полипептид HRS может являться пригодным для избирательного удаления конкретных субпопуляций циркулирующих антител к Jo-1.

ПРИМЕР 10

Оценка полипептидов HRS для лечения индуцированного статином миозита и рабдомиолиза

Статины представляют собой ингибиторы HMG ко-A редуктазы, которые ингибируют синтез мевалоната, ограничивающего скорость этапа в синтезе холестерина. Терапия статинами способствует снижению уровней холестерина у пациентов. Однако побочные эффекты и осложнения терапии статинами включает мышечную слабость, миозит и рабдомиолиз. Мышечная миопатия представляет собой осложнение некоторых статинов, представленных на рынке, и у пациентов, как правило, исключают терапию статинами, если у них выявляют любой из этих симптомов. Аналогично многим другим миопатиям, мышечным дистрофиям и воспалительным нарушениям мышц прогрессирование заболевания при индуцируемой статином миопатии, вероятнее всего, возникает в результате первичного химического, генетического или физического повреждения, которое становится в большей степени воспалительным в результате инвазии иммунных клеток в клетки поврежденных мышц.

Таким образом, индуцируемая статином миопатия представляет собой широко применимую модельную систему для исследования индуцируемого лекарственными средствами миозита, которую можно непосредственно применять к другим миопатиям и мышечным дистрофиям, которые все характеризуются общим воспалительным компонентом, который опосредует прогрессирование заболевания, способствуя инвазии иммунных клеток поврежденной мышечной ткани.

Целью этого исследования являлась оценка эффективности HRS(1-506) в отношении устранения эффектов индуцированного статином мышечного миозита, на что указывает измененные уровни, циркулирующих ферментом и изменения экспрессии генов маркеров мышечной функции и воспалительных маркеров в ответ на лечение HRS(1-506).

С этой целью крыс дозировали ежесуточно 1 мг/кг церивастатина, а затем переводили на дозирование церивастатином через сутки (qod). Цель такого режима дозирования заключалась в поддержании длительного состояния болезни у животных, а неполучение такого тяжелого заболевания, которое значительно влияло бы на выживаемость крыс. Затем оценивали эффективность диапазона доз HRS(1-506) у крыс после того как дозирование статином уже инициировало изменяемые изменения циркулирующих маркеров миозита.

Протокол и способы. В этом исследовании самок крыс Sprague-Dawley в возрасте 10 недель обрабатывали 1 мг/кг церивастатина ((Sigma, каталожный номер SML0005) в 0,5% метилцеллюлозе, начиная на сутки 1 посредством перорального принудительного кормления. Через 7 суток ежесуточного введения крыс переводили на схему дозирования через сутки (qod) на сутки 9, 11 и 13. Введение HRS(1-506) и носителя начинали на сутки 6 через внутривенную инъекцию и проводили дозирование крысам ежесуточно до суток 14 (схематично представлено на фигуре 10A). У всех крыс регистрировали показания на сутки 15 через 24 часа после конечного дозирования тестируемого препарата и через 48 часов после последнего введения статина. HRS(1-506) вводили в 3 дозах (0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг) в 20 мМ NaPO₄, 0,15M NaCl, pH 7,0 ежесуточно.

Для решения основной задачи этого исследования проводили следующие ниже измерения и конечные точки исследования: выживаемость крыс, масса, циркулирующие уровни CK в сыворотке на сутки 12 и 15, окрашивание H&E на сутки 15 образцов мышц задней поверхности бедра, ELISA тропонина I, CBC в крови на сутки 15, кПЦР в образцах мышц задней поверхности бедра и уровни эндогенной HARS в сыворотке.

Способы кПЦР. У животных вырезали мышцы задней поверхности бедра мыши и хранили при -80°C до анализа. Ткань предварительно подготавливали по группам из 10 мышцы задней поверхности бедра с использованием набора Qiagen's RNeasy Fibrous Tissue Midi (каталожный №75742). После того, как РНК элюировали из колонки Qiagen, ее обрабатывали на биоанализаторе Agilent 2100 для тестирования целостности РНК и NanoDrop для определения концентрации и чистоты РНК. Затем РНК хранили при -80°C.

Обратную транскрипцию (RT) РНК в кДНК проводили в формате 96-луночного планшета ПЦР в устройстве для ПЦР Eppendorf's MasterCyCler с использованием следующей программы: 37°C в течение 60 минут, 95°C в течение 5 минут. Краевые лунок 96-луночного планшета не использовали и наполняли 50 мкл воды для предотвращения испарения внутренних лунок. Использовали 20 мкл РНК и 30 мкл исходной смеси для обратной транскрипции (Ambion's TaqMan PreAmp Cells to CT Kit, каталожный №4387299) на образец RT. После завершения RT следующий этап заключался в предварительной амплификации представляющих интерес генов в образце кДНК. Праймеры для представляющих интерес генов (праймеры DELTAgene, сконструированные Fluidigm) объединяли до конечной концентрации 200 нМ. С использованием этих праймеров представляющие интерес гены предварительно амплифицировали в каждом образце. Предварительную амплификацию проводили в 10 мкл реакционных смесей (2,5 мкл кДНК, 7,5 мкл готовой смеси Pre-Amp) в 384-луночном формате с использованием устройства для ПЦР Applied Biosystems ViiA7 со следующей программой: 95°C в течение 10 минут, 14 циклов 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 4 минут. После этапа предварительной амплификации добавляли экзонуклеазу (New England BioLabs, каталожный №M0293L) для удаления невстроившихся праймеров из каждого образца. Такую экзонуклеазную реакцию также проводили в устройстве для ПЦР ViiA7 со следующей программой: 37°C в течение 30 минут, 80°C в течение 15 минут. После экзонуклеазы образец RT дополнительно разбавляли 1:5 (7 мкл образца экзонуклеазы + 18 мкл буфера с низким содержанием EDTA).

Чип, используемый для проведения кПЦР на системе Biomark Fluidigm, представлял собой 96.96 DynamiC Array IFC для анализа экспрессии генов. Чип первоначально обрабатывали контроллером IFC HX в соответствии инструкциями производителя перед тем как наносить образец и пробы. Для подготовки проб для нанесения на чип 4,4 мкл исходной смеси для проб (2X реагент для нанесения пробы Fluidigm, каталожный №8500736 и TE с низким содержанием EDTA) получали 3,6 мкл 20 мкМ прямых и обратных праймеров для каждого представляющего интерес гена в 96-луночном планшете. Для подготовки образцов 4,5 мкл исходной смеси для образца (2X TaqMan исходная смесь для анализа экспрессии генов Ambion, 20X связывающийся с ДНК краситель реагент для нанесения образца Fluidigm, каталожный номер 100-0388 и 20X EvaGreen Biotium, каталожный №31000) добавляли к 3 мкл разбавленного предварительно амплифицированного/обработанного экзонуклеазой образца в 96-луночном планшете. После первоначальной обработки чипа на чип наносили 5 мкл образца или пробы, подготовленных выше. Затем чип помещали обратно в контроллер IFC для образцов, чтобы заполнить ими чип. После того как завершали заполнения чипа можно было проводить кПЦР на Biomark с использованием представленной программы для 96.96 DynamiC Array для экспрессии генов с кривой плавления для определения специфичности праймеров. Относительную экспрессию генов определяли способом дельта-дельта Ct.

Количественное определение внеклеточной HARS. ELISA на 96-луночном планшете разрабатывали внутри лаборатории с использованием 2 моноклональных антител мыши к HARS M03 (Sigma № SAB1403905 и Abnova № H00003035-M03) и M01 (Abgent № AT2317a) в формате сэндвича для детекции HARS в сыворотке крыс. Анализы проводили в 96-луночных планшетах Costar (96-луночный планшет Costar №3369) с использованием стандартной кривой с семью точками, которую получали в диапазоне от 75 до 0,1 нг/мл с использованием исходного раствора HRS(1-506), (7,5 мг/мл в 20 мМ NaPO₄, 0,15 M NaCl pH 7,0 с использованием 1x PBST (0,05% Tween-20) в качестве разбавителя). Моноклональное антитело мыши M01 клон 1C8 (Abgent № AT2317a) подвергали биотинилированию внутри лаборатории и использовали в качестве детектируемого антитела и моноклональное антитело мыши M03 (Sigma № SAB1403905, лот №11238, 0,5 мг/мл и Abnova № H00003035-M03, лот №11238, 0,5 мг/мл) использовали в качестве захватывающего антитело. Казеин (Thermo SCientifiC, №37528) использовали в качестве блокирующего средства и 1x PBST (0,05% Tween-20) использовали в качестве промывочного буфера. Связывание антитела количественно определяли с использованием стрептавидин-HRP (Invitrogen, кат. №434323, лот №816755A) с использованием субстрата TMB (Thermo, №34021) и 2M серной кислоты в качестве останавливающего раствора.

Анализы ELISA проводили на планшетах, покрытых в течение ночи от 0,6 до 2 мкг/мл антителами M03 в 1X PBS, которые затем блокировали инкубацией с казеином в течение одного часа и промывали 3x PBST. Затем планшеты инкубировали со стандартами и образцами в течение 1 часа, промывали 3x PBST, а затем инкубировали 500 нг/мл биотинилированным M01, разбавленным в PBST, 1 HRS, промывали 3x PBST, инкубировали с 200 нг/мл стрептавидина-HRP в течение одного часа, промывали 3x PBST, а затем добавляли субстрат TMB в течение 4 минут. Реакции останавливали останавливающим раствором и определяли оптическую плотность при 450 нм.

Результаты количественно определяли на основании стандартной кривой на основании средних необработанных значений оптической плотности без вычитания фона. Для аппроксимации стандартных кривых использовали Prism. Модель: Log(агонист) в сравнении с подбором ответа [логистическая регрессия с 4 параметрами]. Процент сходимости рассчитывали для каждой отдельной точки концентрации (не усредненной):

Другие показания. Крыс ежесуточно взвешивали. Образцы сыворотка получали на сутки 1, 8, 12 (через хвостовую вену) и сутки 15 (при умерщвлении) для использования в анализе циркулирующего фермента (Idexx) и измерений тропонина I скелетной мышцы в сыворотке, измерения проводили с использованием коммерческого набора ELISA. Анализ мочи проводили на сутки 3, 5, 8, 10, 12 и 15 до дозирования на эти сутки. Анализ CBC проводили в крови, выделяемой на сутки 15 до эвтаназии крыс. На сутки 15, крыс подвергали эвтаназии и часть мышцы задней поверхности бедра и легкого (не наполненного) помещали в 10% NBF для заливки в парафин и окрашивания H&E срезов (Premier Laboratory). Другую часть мышцы задней поверхности бедра и легкого помещали при -80°C для использования для экстракции и профилирования РНК. На сутки 15 также выделяли печень, почку и сердце и помещали в цинк-формалин для заливки в парафин (гистология TSRI) для длительного хранения ткани.

Результаты. В этом исследовании наблюдали 100% выживаемость, и все крысы выживали до запланированного забора образцов на сутки 15. Крысы, которым дозировали статин, имели меньшую среднюю массу тела по сравнению с контрольными крысами, которым не дозировали статин. На сутки 15 в группе статин + носитель наблюдали наименьшую среднюю массу крыс из всех групп, тогда как в группе, которой дозировали статин + 3 мг/кг HRS(1-506), наблюдали наибольшую среднюю массу из всех обрабатываемых статином животных (данные не показаны). Анализ CBC демонстрировал общие сходные паттерны изменений в различных группах обработки животных (данные не показаны).

Небольшое увеличение CK в сыворотке наблюдали у крыс, обрабатываемых статином, в сравнении с необрабатываемыми контролями на сутки 12 и 15. На сутки 12 крысы, которым дозировали 1 мг/кг и 3 мг/кг HRS(1-506), имели меньшие ограниченные средние значения CK по сравнению с животными, которых обрабатывали статином + носителем. (Фигура 11) в соответствии с положительным влиянием лечения HRS(1-506) на миозит, индуцируемый статином, также в соответствии с положительным эффектом HRS(1-506) на функцию мышц у животных, обрабатываемых HRS(1-506) (фигура 10B), также снижались уровни тропонина C. Кроме того, эндогенные уровни HRS в сыворотке являлись повышенными у крыс, обрабатываемых статином, по сравнению с крысами, не получавшими статин (фигура 12), что подтверждает, что высвобождение HRS может играть роль эндогенного регулятора воспаления мышц. Окрашивание H&E мышц задней поверхности бедра демонстрировало сниженную мышечную дегенерацию/некроз и баллы воспаления у обрабатываемых статином крыс, которым дозировали 1 мг/кг и 3 мг/кг HRS(1-506) по сравнению с крысами, которым дозировали носитель и 0,3 мг/кг HRS(1-506) (фигура 13).

Для дополнительного исследования основы механизмов действия HRS на миопатию, индуцируемую статином, после завершения исследования анализировали изменения экспрессии генов в мышцах задней поверхности бедра у животных, получавших обработку. Профилирование РНК проводили на мышцах задней поверхности бедра, выделяемых у крысы на сутки 15, как описано выше. Результаты этих исследований демонстрировали, что все 13 генов, которые повышались более чем в 5 раз в ответ на обработку статином, снижались при обработке HRS(1-506) (см. таблицу E11 и фигуры 14-15).

Транскрипционный анализ, проведенный на мышцах задней поверхности бедра крыс, обрабатываемых статином, выявлял, что на 10 генов, связанных с диабетом/метаболическим синдромом, (фигура 16) и несколько генов домашнего хозяйства (данные не показаны) не оказывала существенного влияния обработка HRS. В отличие от этого, транскрипционный анализ, проведенный на мышцах задней поверхности бедра крыс, обрабатываемых статином, в отношении 26 маркеров иммунных клеток, выявлял значительные изменения большого числа генов (см. фигуры 17-19), включая дозозависимое ингибирование экспрессии ITGAL(CD11a), CD11b, CD8a, CD8b, CD18, CCR5 и PTPPC (CD45R). Кроме того, HRS(1-506) являлся эффективным в отношении снижения экспрессии ряда воспалительных маркерных генов, включая IL6, MCP1, IL10 и IFN-гамма (см. фигуры 20-21). Транскрипционные изменения также наблюдали для 14 генов, связанных с адгезией, развитием и фиброзом (см. фигуры 22-23), гена Neb сократимости мышц (данные не показаны) и генов, ассоциированных со слабостью, атрофией мышц и миогенезом (см. фигуры 24-25).

Заключение. Снижение уровней CK, тропонина I в сыворотке и дегенерация/некроз мышечных клеток и воспаление мышц наблюдали у животных, получавших более высокие дозы HRS(1-506) 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг в отличие от животных, получавших носитель или низкую дозу 0,3 мг/кг HRS(1-506). Данные профилирования РНК подтверждают эти результаты, демонстрируя снижение экспрессии CD8a, IL-6, MCP-1 и MMP-9 в мышцах задней поверхности бедра крыс, обрабатываемых статином, которых дозировали более высокими дозами HRS(1-506). Активация этих генов, вероятнее всего, обусловлена повышенной инфильтрацией иммунных клеток в поврежденную мышечную ткань. На основании идентичности экспрессируемых генов инфильтрирующие иммунные клетки с большой вероятностью принадлежат к одному или более следующим ниже типам клеток: T-клетки, дендритная клетка, NK-клетки и макрофаги/моноциты. Все эти типы клеток были ассоциированы с воспалением мышц, и способность полипептидов HRS, включая HRS(1-506), опосредовать существенное ингибирование притока таких иммунных клеток позволяет предположить, что полипептиды HRS, такие как HRS(1-506), являются эффективными иммунорегуляторами, которые способны действовать как эффективные иммуномодуляторы в широком диапазоне воспалительных и аутоиммунных заболеваний и нарушений.

ПРИМЕР 11

Оценка полипептидов HRS для лечения мышечной дистрофии

Мышечная дистрофия Дюшена (DMD) обусловлена мутациями в гене, кодирующем дистрофин, субсарколеммный белок, функционирующий в ассоциированным с дистрофином гликопротеиновом комплексе (DGC). Этот комплекс соединяет внутриклеточный цитоскелет с внеклеточным матриксом. DGC сконцентрирован на Z-линиях саркомера и обеспечивает передачу силы через мышечное волокно. Нарушение этой связи приводит к нестабильности мембраны, которая в конечном итоге приводит к разрывам сарколеммы. Приток внеклеточного кальция изменяет молекулярные процессы, такие как мышечное сокращение, и активирует протеолитическую активность. Пораженные мышечные волокна подвергаются некрозу или апоптозу и высвобождают митогенные хемоаттрактанты, которые инициируют воспалительные процессы. Циклы дегенерации и регенерации в конечном итоге приводят к необратимой атрофии мышц и замене на фиброзную и жировую ткань.

Мышца обладает потенциалом регенерации посредством активации недифференцированных миогенных клеток-предшественников (сателлитных клеток), которые обычно являются покоящимися и располагаются между базальной мембраной и мышечными волокнами. После активации сателлитные клетки пролиферируют и асимметрически делятся, где дочерние клетки имеют отличную судьбу клеток. Только одна из дочерних клеток дифференцируется, развивается до стадии миобласта, а затем сливается с другими миобластами или с поврежденными мышечными волокнами с индукцией восстановления мышечных волокон. Другая дочерняя клетка остается в пролиферирующем состоянии или возвращается в покоящееся состояние. Генетические мутации, ответственные за DMD, также присутствуют в сателлитных клетках. Таким образом, способность восстанавливать нормальную мышечную функцию остается затрудненной. Небольшое число мышечных волокон способно продуцировать функциональный дистрофин, главным образом вследствие вторичных мутаций в миогенных клетках-предшественниках, которые восстанавливают рамку считывания. Однако эти так называемые ревертантные волокна представлены в очень незначительном меньшинстве для уменьшения патологии дефицита дистрофина. Предполагают, что истощение совокупности сателлитных клеток в результате циклов дегенерации и регенерации в значительной степени способствует заболеванию.

Модель DMD на мышах mdx характеризуется спонтанной мутацией в экзоне 23 гена Dmd, вносящей преждевременный стоп-кодон. Патология мышей mdx характеризуется хорошо гистологически определенными стадиями, сходными с патологией человека. Неонатальная мышечная ткань по-видимому не поражается. Некротические или апоптотические процессы в сочетании с воспалением возникают приблизительно в возрасте 3 недель. Процессы регенерации инициируются приблизительно в возрасте 6 недель и продолжаются, при этом чередуясь с дегенерацией, до возраста 12 недель. У мышей mdx выявляют снижение их способности к регенерации в более старшем возрасте (>65 недель), при этом некротические процессы продолжаются. Вследствие того, что процессы дегенерации являются сходными с процессами, наблюдаемыми при патологии человека, отличия в регенерации могут составлять один из ключевых факторов восстановления свойственной мышечной функции.

Таким образом, эта модель на мышах предоставляет собой систему in vivo для тестирования влияния полипептидов HRS на дегенерацию мышечных клеток, регенерацию и воспаление в генетической среде, имеющей непосредственное отношение к заболеванию человека и лечению мышечных дистрофий.

Целью этого исследования являлась оценка эффективности HRS(1-506) в отношении устранения связанных с возрастом эффектов генетического дефекта гена дистрофина в отношении прогрессирующей потери мышечной функции на модели на мышах mdx, на что указывают измененные уровни циркулирующих ферментов и изменения экспрессии генов, ассоциированных с мышечной функцией, и воспалительных маркеров в ответ на обработку HRS(1-506).

С этой целью в группах по 8 животных (мыши C57B:/10SCSn-Dmd^mdx/J, в возрасте шести недель на начало исследования) вводили посредством в/в инъекции носитель, HRS(1-506) (3 мг/кг) или положительный контроль (дексаметазон) (1 мг/кг) один раз в сутки в течение 14 суток.

Протокол и способы. Мышей взвешивали на сутки 1, 8 и 15 исследования. Тест мышечной функции на основе виса на проволоке проводили для оценки мышечной силы на сутки 1, 8 и 15. Образцы сыворотка получали на сутки 1, 8, (из хвостовой вены) и сутки 15 (при умерщвлении), чтобы использовать их в анализе циркулирующих ферментом (Idexx). Анализ CBC проводили на крови, выделяемой на сутки 15 пред эвтаназией крыс. На сутки 15 крыс подвергали эвтаназии и кусочек передней большеберцовой мышцы и диафрагмы помещали в 10% NBF для заливки в парафин и окрашивания H&E для получения срезов (Premier Laboratory).

Результаты. Не наблюдали значимых отличий в весе, времени виса или данных CBC для животных, обрабатываемых HRS(1-506) или дексаметазоном (DEX), по сравнению с необрабатываемыми контролями на сутки 8 или 15 исследования (данные не показаны). Однако наблюдали снижение уровней CK, AST и LDH в сыворотке у мышей, обрабатываемых HRS(1-506) и дексаметазоном, по сравнению с контролями носителем (фигура 26).

Результаты демонстрируют, что дозирование только в течение 14 суток наблюдали соответствующее снижение циркулирующих уровней ряда сывороточных маркеров воспаления мышц, включая уровни CK, AST и LDH, что указывает на то, что HRS(1-506) обладает терапевтической эффективностью на модели мышечной дистрофии Дюшена (DMD) на мышах mdx.

ПРИМЕР 12

Оценка влияния антител к HRS на развитие тазово-плечевой мышечной дистрофии

Тазово-плечевая мышечная дистрофия типа 2B (LGMD2B) обусловлена потерей функциональных мутаций в гене дисферлина. Дисферлин преимущественно экспрессируется в скелетной и сердечной мышце, а также в моноцитах, макрофагах и других тканях, где он локализован в цитоплазматических везикулах и клеточной мембране. Дисферлин, по-видимому, участвует в слиянии мембран и направленной миграции, а также восстановительных процессах. LGMD2B представляет собой мышечное заболевание с поздним началом (подростки/молодежь), которое характеризуется прогрессирующей симметричной мышечной слабостью и заметно агрессивной иммунной/воспалительной патологией. В биопсиях мышц, как правило, выявляют заметную инфильтрацию воспалительных клеток, состоящих преимущественно из макрофагов/маркеров активации макрофагов (HLA-DR, HLA-ABC, CD86), цитотоксических T-клеток CD8⁺ и T-клеток CD4⁺, наряду с дегенерацией/регенерацией мышечных волокон.

Мыши SJL/J характеризуются делецией внутри рамки считывания 171 п.н. в 3'-точке сплайсинга экзона 45 дисферлина. У них развивается спонтанная миопатия, которая является ассоциированной с выраженным воспалением мышц в процессе их старения. В совокупности эти признаки делают мышей SJL/J генетическим гомологом миопатий человека с дефицитом дисферлина. Воспалительные изменения в мышцах мышей SJL/J, как правило, начинаются приблизительно в возрасте 4-6 недель и характеризуются инфильтрацией активированных макрофагов с последующей инфильтрацией T-клеток CD4+. В возрасте 6 месяцев инфильтрат состоит преимущественно из макрофагов наряду с некрозом некоторых мышечных волокон. К 16 месяцам мышечные волокна полностью дегенерируют и замещаются жиром и коллагеном.

Хотя биохимические и гистологические признаки линии SJL/J были относительно хорошо задокументированы, функциональные причины прогрессирования миопатии не были полностью охарактеризованы, в частности на ранних стадиях заболевания, которые с большой вероятностью являются пригодными для оценки потенциальных стратегий лечения. Для непосредственной оценки потенциальной роли эндогенных полипептидов HRS в регуляции воспалительных процессов при работе на линии SJL/J, мышей иммунизировали полноразмерной HRS для связывания любой эндогенной HRS. Если HRS участвует в регуляции воспалительных процессов в мышце, то такой подход должен приводить к индукции воспаления мышц. Таким образом, эта модель на мышах обеспечивает дополнительное подтверждение роли полипептидов HRS в модулировании дегенерации, регенерации мышечных клеток и воспаления в генетической среде, имеющей непосредственное отношение к заболеванию человека и лечению мышечных дистрофий.

Для индукции антител к полноразмерной HARS мышей SJL/J иммунизировали посредством подкожной иммунизации полным адъювантом Фрейнда (CFA) на сутки 1 и повторную иммунизацию антигеном с IFA проводили на сутки 15 и 29 для дополнительной стимуляции продукции антител.

Протокол и способы. Группу из 8 животных самцов мышей SLJ/J (JAX labs), (в возрасте восеми недель на начало исследования) иммунизировали 0,2 мг полноразмерной HRS мыши (mHRS) через подкожное введение полного адъюванта Фрейнда на сутки 1, 15 и 29. Для определения продукции антител на сутки 10, 25 и 43 выделяли сыворотку. Мыши умерщвляли на сутки 43 и собирали мышцы задней поверхности бедра и легкие (легкие наполняли) для гистологических исследований (окрашивание H&E срезов (Premier Laboratory). В сыворотке, выделяемой на сутки 43 (Idexx), анализировали уровни циркулирующих ферментов.

Результаты: У мыши SJL/J, иммунизированных подкожно mHisRS, вырабатывался устойчивый иммунный ответ на полноразмерную HisRS (фигура 27A). Не наблюдали значительных изменений в уровнях циркулирующих ферментов у иммунизированных мышей по сравнению с контролями носителем, хотя уровни CK незначительно повышались в группах иммунизированных HRS (данные не показаны). Однако в мышечной ткани у мышей, иммунизированных HisRS, четко выявляли некоторые области клеточной инфильтрации и миозита (фигура 27B), и в соответствии с такой гистопатологией у двух иммунизированных мышей выявляли признаки миозита.

ПРИМЕР 13

Разработка стабилизирующего состава для полипептидов HRS

Для определения оптимальный условий буфера для хранения полипептидов HRS использовали поэтапный подход для оптимизации условий основного состава. Эти исследования включали определение оптимального диапазона pH, предпочтительного стабилизационного буфера и эксципиента(ов) для поддержания стабильности и растворимости белка.

Исследования проводили с белками, хранящимися в "контрольном буфере" (20 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,0) в концентрации 2 мг/мл. Исходные рабочие растворы HRS(1-506) получали разбавлением стоковой концентрации белка (12,5 мг/мл, хранящейся при -80°C) до концентрации 2 мг/мл в соответствующих буферах до конечного объема 9,1 мл. Затем разбавленные белки подвергали диализу против 2 л желаемого буфера в течение ночи с использованием 10 кДа MWCO кассет для диализа Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher) при 2-8°C (P/N: 66810), а на следующие сутки затем подвергали диализу в 2 л свежем буфере в течение 4 часов.

После диализа образцы тестировали для определения значений измеряемых параметров в момент времени ноль и распределяли по 5 мл полистироловым пробиркам (BD FalCon, №352859) в объеме 1 мл/условие. Пробирки закрывали крышками и крышки оборачивали парафильмом. Визуальный осмотр проводили перед диализом и после него. Анализы, проводимые для каждого образца, включали внешний вид, pH, дифференциальную сканирующую флуорометрию, мутность и опалесценцию, анализ эксклюзионной ВЭЖХ (SE-ВЭЖХ) и анализ SDS-PAGE.

Аналитические способы

Внешний вид. Внешний вид белков оценивали визуальным осмотром по двум категориям: A) опалесценция и B) частицы. Категория A: 1=прозрачный; 2=незначительно опалесцирующий; 3=опалесцирующий; категория B: 1= частицы отсутствуют; 2=частицы присутствуют; 3=волокно(а). Результаты выражали в виде "категория A с последующей категорией B". Например, результат "1,1" означает прозрачный раствор без частиц.

pH. pH образца измеряли с использованием pH-метра ACCumet BasiC AB15 plus (Fisher SCientifiC) с микрозондом (ACCumet eleCtrode, кат. №13-620-292). Калибровку и измерение проводили по инструкциям производителя.

Оптическая плотность. Оптическую плотность при 280 нм, 340 нм и 580 нм измеряли с использованием спектрофотометра SpeCtraMax M2 (MoleCular DeviCes). В каждый момент времени использовали 100 мкл необработанных (чистых) образцов для регистраций при A340 (мутности) и A580 (опалесценции). Оставшиеся образцы центрифугировали в течение 5 минут при 14000 rCf и разбавляли супернатанты в 4 раза в соответствующих буферах, и измеряли оптическую плотность при A280.

Дифференциальную сканирующую флуорометрию (DSF) проводили на образцах белка путем наблюдения флуоресценции как функцию интенсивности флуоресценции липофильного красителя во время тепловой денатурации. Исследования проводили на образцах после того, как их разбавляли до 0,5 мг/мл в 100 мкл конечного объема PBS pH 7,0 (150 мМ NaCl, 20 мМ фосфата) и смешивали с раствором красителя с тепловым сдвигом, который получали разбавлением исходного раствора (Applied Biosystems/Life TeChnologies, P/N 4461146) в 20 раз в сверхчистой дистиллированной воде (GibCo, P/N 10977). Пять мкл разбавленного красителя добавляли к 100 мкл образца. Смесь высевали в 384-луночный оптически чистый реакционный планшет (Applied Biosystems/ Life TeChnologies P/N 4309849) при 20 мкл в каждую лунку и повторения в 4 лунках на образец. Регистрацию показаний планшета проводили посредством устройства для ПЦР в реальном времени ViiA 7 (Applied Biosystems/Life TeChnologies, P/N 4453552). Протокол тепловой денатурации начинался со скорости изменения 1,6°C/с, до установления температуры 25°C, где в этот момент устройство удерживало эту температуру в течение 2 минут, перед дальнейшим повышением температуры до 99°C при скорости 0,5°C/с, где в этот момент температуру удерживали еще в течение 2 минут.

Анализ эксклюзионной ВЭЖХ (SE-ВЭЖХ) проводили на очищенных образцах белка с использованием TSKgel Super SW3000, 4,6 мм ID×30 см, размер частиц 4 мкм, колонка 250 Å (Tosoh, 18675) с использованием подвижной фазы 200 мМ фосфата Na, 150 мМ NaCl pH 7,0, при скорости потока 0,3 мл/минуту, с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1260, оборудованной вакуумным дегазатором, насосом для двухкомпонентных/четырехкомпонентных смесей, термостатированным автоматическим дозатором, термостатированным отделением колонки, детектором на диодной матрице (DAD) и хроматографическим программным обеспечением Chemstation. Неразбавленные образцы (40 мкг) каждого белка инъецировали поле короткого центрифугирования. Для обеспечения точности теста использовали образец для пригодности системы (бычий сывороточный альбумин, BSA, Thermo SCientifiC, P/N: 23209) и внутренний контроль (HRS дикого типа) для прогона перед прогоном образцов.

Анализ SDS-PAGE. Для оценки фрагментации и агрегации SDS-гели в восстановительных и невосстановительных условиях прогоняли в каждый момент времени. Десять мкг образцов каждого белка вносили на дорожку и анализировали с использованием системы XCell SureloCk Mini-Cell (Invitrogen) с использованием 4-12% Bis-Tris предварительно подготовленных гелей NuPAGE, 1,5 мм×10 лунок (Invitrogen PN NP0335BOX) и подвижного буфера NuPAGE MES SDS (Invitrogen PN NP0002) или подвижного буфера NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen PN NP001) по инструкциям производителей. Восстанавливающий образец буфер получали из 4x исходного раствора (0,25M Tris, 8% SDS, 40% глицерин, 0,008% бромфеноловый синий, 20% 14,3M βME), невосстанавливающий образец буфер получали без меркаптоэтанола. Предварительно окрашенные маркеры молекулярных масс получали от Invitrogen (см. Blue Plus2, Invitrogen PN LC5925). Гели окрашивали InstantBlue (Expedeon PN ISB1L) по инструкциям производителя.

Предварительные исследования эффектов pH и гистидина на термостабильность. Поисковые исследования стабильности проводили с использованием меченой 6xHis полноразмерной HARS и меченой 6xHis HRS(1-506). Полноразмерный белок подвергали диализу в 20 мМ натрий-фосфатном буфере при указанных значениях pH (pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 или 7,5) посредством диализа в течение ночи в буферах при соответствующем pH. Результаты анализа DSF демонстрировали, что существуют два тепловых перехода для HRS при инкубации при pH 7-7,5. Первый переход происходит при 48°C, на который указывает стрелка на фигуре 28A, и основной переход в этом диапазоне pH происходил приблизительно при 54°C. Основные переходы температур для инкубации при каждом условии pH приведены в таблице E12. Анализ SE-ВЭЖХ выявлял сходные уровни пиков высокомолекулярных соединений (HMW) для образцов, хранящихся при pH 6,5-7,5, и значительно более высокое содержание HMW в образцах, хранящихся приблизительно при pH 5,5 (данные не показаны). Также наблюдали осаждение в образце, хранящемся в буфере с pH 5,5, и этот образец в дальнейшем не оценивали.

Таблица E12
Температуры основных тепловых переходов для полноразмерной HARS pH T_m 7,5 54,2 7,0 54,2 6,5 52,9 6,0 47,7 5,5 не определяли

Таким образом, результаты этих предварительных исследований подтверждают, что оптимальный pH находится в диапазоне приблизительно от 6,5 до pH 7,5, и дальнейшие более подробные исследования проводили в этом диапазоне pH, как более подробно описано ниже.

Для определения, может ли добавление экзогенного гистидина влиять на стабильность HARS, проводили предварительные исследования стабильности в диапазоне концентраций гистидина от 0,1 до 50 мМ. Результаты экспериментов в диапазоне от 0,5 до 10 мМ гистидина представлены на фигуре 28B, и эффект более широкого диапазона концентраций приведен в таблице E13.

Таблица E13
Влияние гистидина на термостабильность HRS(1-506) Концентрация His (мМ) T_m Низкий диапазон (от 0,01 до 0,5 мМ) 0 48,03 0,01 48,03 0,03 48,21 0,05 48,38 0,08 49,08 0,1 49,08 0,2 49,96 0,3 50,31 0,4 50,83 0,5 51 Высокий диапазон (от 0,5 до 50 мМ) 0 48,03 0,5 52,23 1 53,81 2 54,68 3 55,73 5 56,26 10 57,49 50 56,94

Результаты этих экспериментов демонстрируют, что добавление экзогенного гистидина является эффективным в широком диапазоне концентраций для стабилизации структуры полипептидов HRS. Этот эффект является заметным при концентрации гистидина уже при 0,03 мМ и начинает достигать своего максимума при концентрациях приблизительно 5 мМ и выше. Таким образом, концентрации гистидина в диапазоне приблизительно от 0,03 мМ до 50 мМ являются эффективными для стабилизации полипептидов HRS, и концентрации гистидина в диапазоне приблизительно от 2 мМ приблизительно до 50 мМ обеспечивают значительно улучшенную тепловую стабилизацию полипептидов HRS.

Подробная характеристика влияния pH на стабильность полипептида HRS. Влияние pH на стабильность HRS(1-506) оценивали в широком диапазоне условий инкубации и с более подробной аналитической характеристикой в диапазоне pH от 6,0 до 7,5. Эти исследования проводили аналитическими способами, описанными выше, и с образцами, инкубируемыми при 5°C, комнатной температуре и 37°C в течение периода до одной недели. Результаты этих исследований приведены в таблице E14.

Таблица E14
Оценка оптимального pH Оптическая плотность Концентрация SE-HPLC Условия буфера Внешний вид A340 A580 A280 (мг/мл) %HMW % основного пика %LMW 20 мМ Фосфата Na, 150 мМ NaCl, pH 7,0 T ноль 1,1 0 -0,001 0,338 2,1 0,3 97,0 2,7 3 часа 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ Фосфата Na, pH 7,5 T ноль 1,1 0 -0,008 0,313 2,0 0,3 96,9 2,8 3 часа 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

7 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C ++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ Фосфата Na, pH 7,0 T ноль 1,1 + 0,069 0,343 2,2 0,7 96,3 3,0 3 часа 5 C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C +++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ Фосфата Na, pH 6,5 T ноль 1,3 0 0,000 0,320 2,0 0,6 96,4 3,0 3 часа 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

3 часа 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C +++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ Фосфата Na, pH 6,0 T ноль 1,1 0 0,006 0,327 2,1 0,4 96,4 3,1 3 часа 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ Для A340: “+++++” =A340>2,0; “++++”=A340>1,5, но <2,0; “+++”=A340>1,0, но <1,5; “++”=A340>0,5, но <1,0; “+”=A340>0,05, но <0,5; и “0”=A340<0,05 Для % HMW: “+++++” = %HMW>5,0; “++++”=%HMW>4,0, но <5,0; “+++”=%HMW>3,0, но <4,0; “++” %HMW>2,0, но <3,0; “+”=%HMW >1,0, но <2,0; и “0”=%HMW <1,0

В целом результаты позволяют предположить, что белок являлся относительно стабильным при инкубации в буфере с pH в диапазоне приблизительно от pH 7,0 приблизительно до pH 7,5, однако что проблемы потенциальной деградация и агрегации начинаются появляться при более низких значениях pH. На основании тестируемых условий и полученных результатов анализа был сделан вывод, что оптимальный диапазон pH для хранения полипептидов HRS находится в диапазоне приблизительно от pH7,0 приблизительно до 7,5.

Подробная характеристика влияния различных композиций буфера на стабильность полипептида HRS. Влияние композиции буфера на стабильность HRS(1-506) оценивали с использованием трех альтернативных буферных систем на основе фосфатного буфера, цитратного буфера и гистидинового буфера при трех значениях pH 7,3, 7,0 и 6,5. Эти исследования проводили с использованием аналитических способов, описанных выше, и с образцами, инкубируемыми при 5°C, комнатной температуре и 37°C в течение периода до одной недели, и результаты приведены в таблице E15.

Таблица E15
Оценка оптимального буфера Оптическая плотность Концентрация SE-ВЭЖХ Условия буфера Внешний вид A340 A580 A280 (мг/мл) %HMW % основного пика %LMW 50 мМ Фосфата Na, pH 7,3 T ноль 1,1 0 -0,008 0,292 1,8 0,3 96,4 3,3 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37C +++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ Фосфата Na, pH 7,0 T ноль 1,1 0,009 0,001 0,291 1,8 0,3 96,4 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

50 мМ Фосфата Na, pH 6,5 T ноль 0,009 0,001 0,290 1,8 0,5 96,0 3,5 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ цитрата, pH 7,3 T ноль 1,1 -0,011 0,287 1,8 96,4 3,2 2 суток 5 C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ цитрата, pH 7,0 T ноль -0,001 -0,008 0,294 1,8 0,2 96,6 3,2 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ цитрата, pH 6,5 T ноль -0,001 -0,010 0,287 1,8 0,3 96,6 3,1 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина pH 7,3 T ноль -0,008 -0,016 0,242 1,5 0,4 96,1 3,5 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

2 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина pH 7,0 T ноль -0,003 -0,014 0,253 1,6 0,4 96,3 3,3 2 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина pH 6,5 T ноль 0,327 0,080 0,269 1,7 0,4 96,4 3,2 2 суток 5C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток ком. темп. ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C ++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 2 суток 37C +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ Для A340: “+++++”=A340>2,0; “++++”=A340>1,5, но <2,0; “+++”=A340>1,0, но <1,5; “++”=A340>0,5, но <1,0; “+”=A340>0,05, но <0,5; и “0”=A340<0,05 Для % HMW: “+++++”=%HMW>5,0; “++++”=%HMW>4,0, но <5,0; “+++”=%HMW>3,0, но <4,0; “++” %HMW>2,0, но <3,0; “+”=%HMW>1,0, но <2,0; и “0”=%HMW<1,0

Результаты и выводы. Гистидиновый буфер в диапазоне приблизительно от pH 7,0 до pH 7,4 обладал лучшими характеристиками в этих исследованиях. Гистидиновый буфер также улучшал стабильность при хранении полипептида HRS при ~8°C (данные не показаны). Для полипептидов HRS так же демонстрировали хорошую стабильность в цитратных буферах в широком диапазоне значений pH (pH 6,7-7,3).

Широкий диапазон приемлемых значений pH, наблюдаемых для цитратных буферов, по сравнению с гистидиновыми буферами позволяет предположить, что буферы на основе гистидина и цитрата представляют собой потенциально привлекательные буферные системы-кандидаты для дальнейшей оценки в качестве буферов для хранения полипептидов HRS.

Подробная характеристика влияния различных эксципиентов на стабильность полипептида HRS. Влияние композиции буфера на стабильность HRS(1-506) оценивали с использованием ряда потенциальных эксципиентов, включая сахарозу, маннит, трегалозу, сорбит, аргинин, глицин, глицерин и высокое содержание соли (280 мМ NaCl). Эти исследования проводили аналитическими способами, описанными выше, и в образцах, инкубируемых при 5°C, комнатной температуре и 37°C в течение периода до одной недели, и результаты приведены в таблицах E16 и E17.

Таблица E16
Оценка оптимальных эксцепиентов Оптическая плотность Концентрация SE-ВЭЖХ Условия буфера Внешний вид A340 A580 A280 (мг/мл) %HMW % основного пика %LMW T_m 50 мМ L-гистидина pH 7,3 T ноль 1,1 0,024 0,010 0,300 1,9 0,8 97,2 2,0 56,94 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ сахарозы pH 7,3 T ноль 1,1 0,005 -0,008 0,318 2,0 0,7 97,3 2,0 57,64 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

50 мМ L-гистидина + 280 мМ маннита pH 7,3 T ноль 0,017 0,001 0,321 2,0 0,8 97,4 1,7 57,46 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ трегалозы pH 7,3 T ноль 1,1 0,013 0,000 0,342 2,2 0,8 97,5 1,7 57,64 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ сорбита pH 7,3 T ноль -0,035 -0,051 0,263 1,7 0,8 97,4 1,8 57,64 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ аргинина pH 7,3 T ноль 0,007 0,001 0,344 2,2 0,7 97,3 1,9 58,34 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ глицина pH 7,3 T ноль 0,037 0,022 0,333 2,1 0,8 97,3 1,8 57,29 3 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

50 мМ L-гистидина + 280 мМ глицерина pH 7,3 T ноль 0,033 0,017 0,284 1,8 0,9 97,3 1,8 57,29 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ +++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C +++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ NaCl pH 7,3 T ноль 0,060 0,046 0,353 2,2 0,7 97,5 1,9 59,74 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ Для A340: “+++++”=A340>2,0; “++++”=A340>1,5, но <2,0; “+++”=A340>1,0, но <1,5; “++”=A340>0,5, но <1,0; “+”=A340>0,05, но <0,5; и “0”=A340<0,05
Для % HMW: “+++++”=%HMW>5,0; “++++”=%HMW>4,0, но <5,0; “+++”=%HMW>3,0, но <4,0; “++” %HMW>2,0, но <3,0; “+”=%HMW>1,0, но <2,0; и “0”=%HMW<1,0

Эти результаты демонстрируют значительные улучшения стабильности полипептидов HRS в присутствии гистидинового буфера в диапазоне от pH 7,0 до pH 7,5 и в присутствии хлорида натрия, аргинина, сахарозы, трегалозы, сорбита и/или глицина. Для дальнейшей оценки возможности получения составов с дополнительными стабилизационными характеристиками оценивали комбинации, перечисленные в таблице E17.

Таблица E17
Оценка дополнительных оптимальных эксцепиентов Оптическая плотность Концентрация SE-ВЭЖХ Условия буфера Внешний вид A340 A580 A280 (мг/мл) %HMW % основного пика %LMW T_m 50 мМ L-гистидина +280 мМ сахарозы +0,05% PS80 pH 7,3 T ноль 1,1 0,020 0,004 0,380 2,4 1,3 97,0 1,7 58,35 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ аргинина +0,05% PS80 pH 7,3 T ноль 1,1 0,010 0,001 0,361 2,3 1,1 97,2 1,7 56,08 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 280 мМ NaCl+0,05% PS80 pH 7,3 T ноль 0,012 0,002 0,372 2,3 1,3 97,0 1,7 62,03 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 140 мМ NaCl+0,05% PS80 pH 7,3 T ноль 1,1 0,015 0,005 0,376 2,4 1,2 97,1 1,7 61,15 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ ++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина + 140 мМ NaCl+2% трегалозы +0,05% PS80 pH 7,3 T ноль 0,009 -0,001 0,357 2,2 1,2 97,1 1,8 61,15 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37 C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина +140 мМ NaCl+2% сахарозы +0,05% PS80 pH 7,3 T ноль 0,005 -0,004 0,366 2,3 1,1 97,2 1,8 61,15 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

3 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37 C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ +++++ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина +140 мМ NaCl+2% сахарозы +0,05% PS20 pH 7,3 T ноль 0,007 -0,001 0,385 2,4 0,1 97,9 1,9 60,98 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 50 мМ L-гистидина +140 мМ NaCl+2% сахарозы +0,1% плюроника F68 pH 7,3 T ноль 0,015 0,008 0,352 2,2 0,2 97,9 1,9 60,10 3 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 5C 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 часа ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ

7 суток ком. темп. 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 3 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 7 суток 37C + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ + НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 5X замораживание-оттаивание 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ 0 НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛИ Для A340: “+++++”=A340>2,0; “++++”=A340>1,5, но <2,0; “+++”=A340>1,0, но <1,5; “++”=A340>0,5, но <1,0; “+”=A340>0,05, но <0,5; и “0”=A340<0,05
Для % HMW: “+++++”=%HMW>5,0; “++++”=%HMW>4,0, но <5,0; “+++”=%HMW>3,0, но <4,0; “++” %HMW>2,0, но <3,0; “+”=%HMW>1,0, но <2,0; и “0”=%HMW<1,0

Результаты. С использованием этих буферных систем наблюдали незначительное изменение или отсутствие изменений мутности или образования HMW агрегатов, когда образцы инкубировали при 5°C или при комнатной температуре. Однако наблюдали зависящие от времени увеличения этих параметров для всех образцов, при инкубации при 37°C. Все составы характеризовались очень незначительным изменением после 5 циклов замораживания-оттаивания.

В целом условия PS20 (гистидин/сахароза/PS20) и F68 (гистидин/сахароза/F68) оказывали лучший эффект на основании анализа SE-ВЭЖХ в отношении образования высокомолекулярных агрегатов, и эти средства были способны значительно снижать образование пиков HMW, когда полипептиды HRS инкубировали при 37°C в течение периода до 7 суток.

Касательно образования мутности (A340) добавление аргинина оказывали лучший эффект с последующим добавлением соли (условия 280 мМ NaCl и 140 мМ NaCl), подтверждая, что эти средства эффективно снижают или предотвращают агрегацию и денатурацию полипептидов HRS при инкубации в течение длительных периодов времени при 37°C. В этих условиях полисорбат 80, полисорбат 20 и плюроник F68 также эффективно снижали образование мутности и HMW агрегатов, как определяют анализом ВЭЖХ. В этих исследованиях сахароза и трегалоза, по-видимому, являются примерно сравнимыми, и оба средства существенно ингибируют денатурацию и агрегацию белка, как определяют по снижению образования мутности и HMW после длительной инкубации при 37°C.

На основании этих исследований можно легко получать стабилизацию полипептидов HRS путем использования гистидиновых буферов в диапазоне pH приблизительно от 7,0 до 7,5. Неожиданно дополнительное добавление хлорида натрия в диапазоне приблизительно от 100 мМ приблизительно до 300 мМ обеспечивало дополнительную стабилизацию этих буферов, приводя к дальнейшему увеличению T_m до 61°C (данные не показаны) и сниженной денатурации при длительной инкубации при 37°C. Стабильность можно дополнительно повышать путем добавления сахара, такого как трегалоза, в диапазоне приблизительно от 0,2% до 5%, или сахарозы в диапазоне приблизительно от 0,2% до 5%. Также добавление поверхностно-активных веществ, включая полисорбат 20 или 80 или плюроник F68, в диапазоне приблизительно от 0,01 до 1% дополнительно улучшало общую стабильность, в частности при инкубации в течение длительных периодов времени при 37°C. Дополнительные улучшения общей стабильности белка также с большой вероятностью можно получать путем добавления восстановителей (антиоксидантных средств) и/или и хелатирующих средств, как описано в настоящем описании.

На основании этих исследований иллюстративные составы для полипептидов HRS, демонстрирующих повышенную стабильность, включают буферы, содержащие один или более компонентов, перечисленных в таблице E18.

Таблица E18
Иллюстративные компоненты буфера для стабилизации полипептидов HRS Компонент Функция Иллюстративный диапазон Гистидин Буферизация pH от 2 мМ до 50 мМ; pH от 7,0 до 7,5 Цитрат Буферизация pH от 2 мМ до 50 мМ; pH от 6,5 до 7,5 Фосфат Буферизация pH от 2 мМ до 50 мМ; pH от 7,0 до 7,5 NaCl Ионная сила 100 мМ-300 мМ Трегалоза Эксципиент от 0,2% до 5% Сахароза Эксципиент от 0,2% до 5% Аргинин Эксципиент от 0,2% до 5% Полисорбат 20 Поверхностно-активное вещество от 0,01 до 1% Полисорбат 20 Поверхностно-активное вещество от 0,01 до 1% Плюроник F68 Поверхностно-активное вещество от 0,01 до 1% Цистеин Антиоксидант от 0,1 до 5 мМ Метионин Антиоксидант от 0,1 до 5 мМ N-ацетилцистеин Антиоксидант от 0,1 до 5 мМ EDTA Хелатирующее средство от 0,1 до 2 мМ

Группа изобретений относится к медицине и касается терапевтической композиции для уменьшения воспаления ткани, содержащей полипептид гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) длиной 500-506 аминокислот, который состоит из SEQ ID NO:70 (HRS(1-506)) или отличается от SEQ ID NO: 70 делецией и/или консервативной заменой 1-6 аминокислот и не содержит остатков 507-509 SEQ ID NO:1, где: a) полипептид HRS является по меньшей мере на 95% чистым, b) полипептид HRS является менее чем на 5% агрегированным и c) композиция имеет уровни эндотоксинов менее чем 10 ЕЭ/мг белка. Группа изобретений также касается способа лечения заболевания, ассоциированного с аутоантителом, включающего введение нуждающемуся в этом индивидууму указанной композиции; способа уменьшения воспаления ткани, включающего введение нуждающемуся в этом индивидууму указанной композиции. Группа изобретений обеспечивает значительное улучшение физических и биологических характеристик полипептида гистидил-тРНК-синтетазы. 6 н. и 21 з.п. ф-лы, 28 ил., 29 табл., 13 пр.

1. Терапевтическая композиция для уменьшения воспаления ткани, содержащая полипептид гистидил-тРНК-синтетазы (HRS) длиной 500-506 аминокислот, который состоит из SEQ ID NO:70 (HRS(1-506)) или отличается от SEQ ID NO:70 делецией и/или консервативной заменой 1-6 аминокислот и не содержит остатков 507-509 SEQ ID NO:1, где: a) полипептид HRS является по меньшей мере на 95% чистым, b) полипептид HRS является менее чем на 5% агрегированным и c) композиция имеет уровни эндотоксинов менее чем 10 ЕЭ/мг белка.

2. Композиция по п. 1, где длина полипептида HRS составляет 506 аминокислот.

3. Композиция по п. 1, где полипептид HRS состоит из SEQ ID NO:70.

4. Композиция по п. 1, где длина полипептида HRS составляет 505 аминокислот.

5. Композиция по п. 4, где полипептид HRS состоит из остатков 2-506 SEQ ID NO:70 (HRS(2-506)).

6. Композиция по п. 1, где полипептид HRS содержит мутацию по меньшей мере одного остатка цистеина.

7. Композиция по п. 6, где по меньшей мере один остаток цистеина выбран из Cys174, Cys191, Cys224, Cys235 и Cys455.

8. Композиция по п. 1, где полипептид HRS обладает повышенной биологической активностью, стабильностью и/или гомогенностью относительно полипептида SEQ ID NO:1 (полноразмерной HRS человека) в сравнимых условиях в диапазоне от 4 до 40°C и pH 6,0-8,0.

9. Композиция по п. 8, где условия включают температуру 20-25°C (комнатную температуру) или 37°C и pH 7,0-7,5 необязательно в течение периода 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток.

10. Композиция по п. 8, где повышенная активность включает абсолютное увеличение противовоспалительной активности или специфического связывания с антителом к Jo-1 по меньшей мере на 10%.

11. Композиция по п. 8, где полипептид HRS характеризуется сниженным образованием межцепочечных дисульфидных связей в восстановительных условиях относительно полипептида SEQ ID NO:1 (полноразмерной HRS).

12. Композиция по п. 8, где полипептид HRS обладает сниженной гетерогенностью заряда относительно полипептида SEQ ID NO:1 (полноразмерной HRS).

13. Композиция по 8, где полипептид HRS характеризуется сниженным образованием высокомолекулярных агрегатов в растворе относительно полипептида SEQ ID NO:1 (полноразмерной HRS).

14. Композиция по п. 8, где повышенная гомогенность включает по меньшей мере 10% повышение монодисперсности полипептида HRS относительно полипептида SEQ ID NO:1.

15. Композиция по п. 1, где полипептид HRS характеризуется увеличенным выходом растворимого белка при рекомбинантной продукции в E. coli относительно полипептида SEQ ID NO:1 (полноразмерной HRS).

16. Композиция по п. 1, где полипептид HRS является слитым с гетерологичным партнером по слиянию, необязательно T-клеточным лигандом.

17. Способ лечения заболевания, ассоциированного с аутоантителом, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтической композиции по п. 1.

18. Способ по п. 17, где терапевтическую композицию вводят индивидууму до появления симптомов заболевания.

19. Способ по п. 17, где полипептид HRS приводит к уменьшению воспаления мышц или легких.

20. Способ по п. 17, где полипептид HRS индуцирует толерантность.

21. Способ по п. 17, где заболевание выбрано из группы, состоящей из воспалительных миопатий, включая воспалительные миопатии, полимиозит, дерматомиозит и родственные нарушения, перекрестный синдром полимиозит-склеродермия, миозит с тельцами включения (IBM), синдром анти-синтетазы, интерстициальную легочную болезнь, артрит и синдром Рейно.

22. Способ уменьшения воспаления ткани, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции по п. 1.

23. Способ по п. 22, где ткань выбрана из мышцы, ткани желудочно-кишечного тракта, легкого и кожи.

24. Способ лечения мышечной дистрофии, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции по п. 1.

25. Способ по п. 24, где мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Дюшена, мышечной дистрофии Беккера, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, тазово-плечевой мышечной дистрофии, плече-лопаточно-лицевой мышечной дистрофии, миотонической дистрофии, окулофарингеальной мышечной дистрофии, дистальной мышечной дистрофии и наследственной мышечной дистрофии.

26. Способ лечения рабдомиолиза или повреждения мышц, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции по п. 1.

27. Способ лечения кахексии или мышечной атрофии, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции по п. 1.