Способ выявления гепарина в крови Российский патент 2018 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза.

Гепарин - это сульфатированный полисахарид, играющий в организме важную роль в различных физиологических и патологических процессах, таких как свертывание крови, транспорт липидов, воспаление, иммунный ответ, дифференциация и рост клеток, тромбоэмболические осложнения. Гепарин также используется как антикоагулянт при лечении тромботических осложнений, сердечно-сосудистых заболеваний, при проведении экстракорпоральных методов детоксикации, искусственном кровообращении и т.п. Терапевтическая концентрация гепарина колеблется от 0,2-1,2 ед/мл в послеоперационном периоде и до 2-18 ед/мл при кардиохирургических операциях [Dai Q, Liu W, Zhuang X, Wu J, Zhang H, Wang P: Ratiometric Fluorescence Sensor Based on a Pyrene Derivative and Quantification Detection of Heparin in Aqueous Solution and Serum. Anal Chem 2011, 83:6559-6564]. Недостаточная доза гепарина при проведении гепаринотерапии может привести к тромботическим осложнениям, избыток вводимого гепарина может осложниться геморрагическим синдромом. Поэтому выявление гепарина в образцах крови имеет большое практическое значение. Известны различные методы выявления гепарина в крови.

В работах Долгова В.В. и Свирина П.В. рассмотрены способы определения гепарина в крови с помощью хромогенных субстратов. Гепарин определяют опосредованно: используя его способность усиливать комплексообразование фактора Ха или тромбина с эдтитромбином и тем самым подавлять активность этих протеаз, после чего определяют их остаточную активность. Тест может выполняться в разных модификациях: как кинетический метод, определение по начальной скорости или метод по конечной точке. На результаты теста с хромогенными субстратами не оказывают влияния продукты деградации фибрина. Однако этот тест требует специального лабораторного оборудования, адаптированных биохимических анализаторов, хромогенных субстратов. Он не может выполняться у постели больного. Также этими авторами рассмотрен и способ определения гепарина с помощью коагуляционных методов. Определение основано на ингибировании свободного фактора свертывания крови Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавлением реактивов, содержащих фосфолипиды с адсорбированными на них фактором V, протромбином, фибриногеном из бычьей плазмы и CaCl₂. Автоматизация этого метода затруднена, так как сигнал достаточно слабый для оптического метода. Тест может выполняться на цельной крови на коагулометрах с механической системой регистрации. Метод также требует специального оборудования и может выполняться только в лабораторных условиях [Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М., Тверь, ООО издательство «Триада», 2005, с. 129-130].

Наиболее близким техническим решением является способ определения гепарина в крови путем тромбоэластографии - метода, основанного на графической регистрации изменений вязкости и упруго-эластических свойств крови в процессе образования фибринового сгустка. Тромбоэластография (ТЭГ), в отличие от классических клотинговых исследований, отображает кинетику всех стадий формирования тромба, а также фибринолиз (Авдушкина Л.А., Вавилова Т.В. Метод тромбоэластографии/ тромбоэластометрии в оценке системы гемостаза: прошлое и настоящее. Референтные интервалы. Ж. Клинико-лабораторный крнсилиум., Санкт-Петербург, 2009, №5, с. 26-33). Ротационная тромбоэластография (РОТЭГ) является усовершенствованной и переработанной формой классической тромбоэластографии. В 2003 году метод был переименован в ротационную тромбоэластометрию (РОТЭМ). В основе ТЭГ и РОТЭМ лежат одни и те же фундаментальные принципы работы, имеются сходства оборудования, графики изображения, но есть и различия. В отличие от ТЭГ в РОТЭМ предусмотрено не ручное, а автоматическое пипетирование исследуемых образцов, ТЭГ измеряет эластичность сгустка крови при движении кюветы, РОТЭМ - при движении оси, передача сигнала в ТЭГ электромеханическая, а в РОТЭМ - оптическая. Параметры, регистрируемые ТЭГ и РОТЭМ схожи.

- R (Reaction Time в ТЭГ) или СТ (Clotting time в РОТЭМ) - время от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин;

- К (ТЭГ) или CFT (Clot formation time в РОТЭМ) - время изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин;

- Угол α - (Angle deg в ТЭГ и РОТЭМ) - отражает скорость свертывания крови, процесс полимеризации фибрина;

- MA (Maximum amplitude в ТЭГ) или MCF (Maximum clot firmness в РОТЭМ) максимальная амплитуда кривой, характеризующая плотность образовавшегося сгустка, зависящая от функции и количества тромбоцитов, от концентрации фибриногена, содержания XIII фактора свертывания крови.

- LY30, LY45, LY60 (ТЭГ и РОТЭМ) - оценка фибринолиза, %.

Для выявления гепарина в образцах крови ТЭГ/РОТЭМ выполняют с цельной или стабилизированной цитратом кровью, а полученные результаты сравнивают с данными ТЭГ/РОТЭМ, выполненными с теми же образцами крови, но с добавлением гепариназы (кюветы, покрытые гепариназой в ТЭГ или добавляемый реактив в РОТЭМ). Гепариназа - это фермент, продуцируемый Flavobacterium heparinum, который нейтрализует гепарин путем энзиматического расщепления альфа-гликозидных связей в месте связывания с антитромбином III. Уменьшение R, K и увеличение угла α и МА в ТЭГ или уменьшение СТ, CFT и увеличение угла α и MCF в РОТЭМ свидетельствуют о наличии в пробе гепарина [Т.Н. Гриневич; А.В. Наумов и др. Ротационная тромбоэластометрия (ROTEM), Журнал ГрГМУ, 2010, №1, с.7-9]. Однако тест с гепариназой требует использования дорогостоящих реактивов или кювет, что ограничивает его широкое применение.

Сущность изобретения.

Технический результат заключается в упрощении выявления гепарина в пробах крови с высокой точностью за счет изменения параметров тромбоэластограммы, выполненной с нативной цитратной кровью с добавлением полибрен-кальциевого реактива, который нейтрализует гепарин, по сравнению с тромбоэластограммой, выполненной с нативной цитратной кровью с добавлением только 0,2 М кальция хлорида.

Технический результат достигается тем, что выявление гепарина в пробах крови, проводят путем выполнения тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и инактиватора гепарина, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по показателям времени от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин (R), времени изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин (K), по показателям максимальной амплитуды (МА) и угла альфа (угол α) в пробе с инактиватором по сравнению с пробой без него, отличающийся тем, что в качестве инактиватора гепарина используют полибрен в конечной концентрации 15-30 мкг/мл, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по укорочению показателей R и K и увеличению МА и угла α в пробе с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и полибрена по сравнению с пробой с цельной цитратной кровью и добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида.

Способ осуществляется следующим образом.

Кровь больного для исследования набирают в пробирку, содержащую 3.2% раствор трехзамещенного двуводного цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови). ТЭГ выполняют на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Используют два канала тромбоэластографа. На первом канале в кювету для тромбоэластографии вносят 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. На втором канале тромбоэластографа в чистую кювету вносят 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида с полибреном (полибрен-кальциевый реактив), затем 340 мкл цельной цитратной крови. Концентрация полибрена в готовом для проведения исследования растворе составляет 15-30 мкг/мл. Выполняют тромбоэластографию. При сравнении двух тромбоэластограмм, выполненных с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и полибрена в конечной концентрации 15-30 мкг/мл отмечают показатели времени R, K, угла альфа и максимальной амплитуды.

В отличие от лабораторных методов определения гепарина предлагаемый метод может осуществляться с цельной кровью, т.е. без центрифугирования крови и получения плазмы крови. Метод может осуществляться у постели больного. В отличие от методов ТЭГ с гепариназой и РОТЭМ с гепариназой для настоящего метода не нужно специальных кювет с гепариназой, а использование полибрен-кальциевого реактива делает его значительно дешевле, что позволит широко использовать метод.

Особенностью метода является создание полибрен-кальциевого реактива для ТЭГ и выявление с его помощью гепарина в образцах крови. Полибрен или гексадиметрина бромид является синтетическим положительно заряженным полимером (поликатионом), в то время как гепарин является сильной органической кислотой (полианионом) (фиг. 1) (Sigma-Aldrich: Hexadimethrine Bromide. Technical Bulletin). Полибрен, связываясь с гепарином, нейтрализует его действие. Нейтрализующий эффект длится несколько часов (Preston FW, Hohf R, Trippel О: The neutralization of heparin with polybrene. Q Bull Northwest Univ Med Sch 1956, 30:138-43). Имеется прямая корреляция между количеством гепарина и количеством полибрена, способным нейтрализовать его действие. Полибрен позволяет измерять гепарин в дозах от 0,6 ед/мл плазмы в организме, в то время как по Ли-Уйату время свертывания крови не определяется. 0,04 мг полибрена нейтрализует гепарин в дозе, удлиняющей время свертывания в 2-6 раз, 0,08 мг - в дозе, удлиняющей время свертывания 8 раз (Grann V, Homewood K, Golden W: Polybrene Neutralization as a Rapid Means of Monitoring Blood Heparin Levels. AJCP 1972, 58:26-32). Нейтрализующий эффект полибрена после применения аппарата искусственного кровообращения был показан как в опытах на собаках, так и в клинической практике на больных (Rothnie N., Kinmonth J.: The Neutralization Of Heparin After Perfusion: A Comparison Of Protamine And "Polybrene." Br Med J 1960, 2:1194-1197).

В методе ТЭГ полибрен-кальциевый реактив для определения гепарина в образцах плазмы или цельной крови не применялся.

Таким образом, отличительными особенностями метода являются:

1) Принцип действия полибрен-кальциевого реактива, заключающийся в анио-катионном взаимодействии с гепарином, отличается от гепариназного, где расщепление гепарина происходит путем энзиматического воздействия;

2) Графическое изображение процесса свертывания крови с полибрен-кальциевым реактивом, что ранее в методе тромбоэластографии никогда не использовалось;

3) Использование цельной крови, не требующей центрифугирования, для определения наличия в ней гепарина в крови с помощью полибрен-кальциевого реактива, в отличие от коагулогических методов, где тест выполнялся на плазме, полученной в результате центрифугирования крови.

4) Создание полибрен-кальциевого реактива, в котором подобраны концентрация полибрена и кальция хлорида, позволяющие выполнять этот тест с помощью тромбоэластографии.

5) Создание реактива, который позволил значительно удешевить метод, сделав его широко доступным для применения на территории России, выполнив таким образом задачу импортозамещения.

Была подобрана концентрация полибрена, позволяющая нейтрализовать гепарин в крови у больных, которым проводилась гепаринотерапия. Для контроля за антикоагулянтной терапией гепарином забиралась кровь больных, получающих гепарин, путем венепункции периферической вены в пробирку S-Monovette, содержащую 3.2% раствор цитрата натрия. Затем выполнялась тромбоэластография с цельной цитратной кровью путем добавления к 340 мкл крови 20 мкл 0,2 М кальция хлорида (фиг. 2) и тромбоэластография с кюветами с гепариназой путем добавления к 340 мкл крови 20 мкл 0,2 М кальция хлорида в кювете с гепариназой (фиг. 3). На двух других каналах тромбоэластографа выполнены тромбоэластограммы с цельной цитратной кровью путем добавления к 340 мкл крови 20 мкл полибрен-кальциевого реактива с различной концентрацией полибрена: фигура 4-15 мкг/мл, фигура 5-30 мкг/мл. При сравнении тромбоэластограмм с различными концентрациями полибрена наиболее близкими по значению параметров R, K, угол альфа, МА с ТЭГ в кюветах с гепариназой выявлен полибрен-кальциевый реактив с концентрацией полибрена 15-30 мкг/мл (фиг. 4, 5).

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Корреляционный анализ изменений параметров тромбоэластограммы в тестах с полибрен-кальциевым реактивом и кюветах с гепариназой у больных, получающих гепарин.

Проведен корреляционный анализ изменений параметров R, K, угла α и МА при выполнении проб с полибрен-кальциевым реактивом и в кюветах с гепариназой по сравнению с нативными образцами крови у больных, получающих гепарин. Как указано выше, при наличии в крови гепарина добавление к пробе крови кроме кальция хлорида полибрена или гепариназы приводит к укорочению R, K и увеличению угла альфа и максимальной амплитуды по сравнению с образцами цельной цитратной крови, выполненной с добавлением только 0,2 М кальция хлорида. Исследовано 74 образца крови, полученных у 56 больных, получавших нефракционированный гепарин в различных дозах. Кровь получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette с 3.2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови).

ТЭГ выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Использовали три канала тромбоэластографа. В кювету первого канала тромбоэластографа вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. В кювету второго канала тромбоэластографа вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида и гепариназу, затем 340 мкл цельной цитратной крови. На третьем канале тромбоэластографа в кювету вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида и полибрен до конечной концентрации в кювете 15 или 30 мкг/мл. После чего провели тромбоэластографию и сравнили изменения показателей R, K, углов α и максимальную амплитуду в пробах с гепариназой и полибреном (второй и третий каналы ТЭГ) по сравнению с пробами с цитратной кровью первого канала.

Выявлена сильная корреляция (r=0,9839, р=0,001) (фиг. 6) при сравнении разницы между изменениями величины R в тестах с нативной цитратной кровью и цитратной кровью после добавления гепариназы или полибрен-кальциевого реактива. Это означает, что полибрен-кальциевый реактив вызывал схожие с гепариназой изменения показателя R на тромбоэластограмме при наличии в пробе гепарина.

Также сильная корреляция имеется между изменениями величины МА при нейтрализации гепарина с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом (r=0,964, р=0,001) (фиг. 7). Это означает, что полибрен-кальциевый реактив вызывает схожие с гепариназой изменения максимальной амплитуды на тромбоэластограмме при наличии в пробе гепарина.

При сравнении показателей угла α в пробах с гепариназой и полибреном (фиг. 8) коэффициент корреляции составил 0,827; р<0,001, что также свидетельствует о схожих изменениях.

При сравнении изменений показателя K в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 9) коэффициент корреляции составил 0,979; р<0,001. Следовательно, полибрен-кальциевый реактив и гепариназа, нейтрализуя гепарин, вызывают схожие изменения K.

Таким образом, при анализе изменений параметров тромобоэластограммы (R, K угла α и МА) в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом по сравнению с цитратной кровью без нейтрализации гепарина установлены схожие изменения этих показателей. То есть ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом позволяет выявить гепарин в пробах крови с высокой точностью при относительной простоте исследования.

Пример 2. Полибрен-кальциевый реактив в выявлении гепарина с помощью ТЭГ в крови у больного лимфомой.

Больной Г., 27 лет, диагноз лимфома Беркитта, получает гепарин в виде непрерывной внутривенной инфузии в дозе 800 ед/ч. Для контроля за антикоагулянтной терапией у больного взята кровь путем венепункции периферической вены в пробирку S-Monovette, содержащую 3.2% раствор цитрата натрия. В результате гепаринотерапии у больного активированное частичное тромбопластиновое время составляло 40 сек, тромбиновое время 44 сек. Выполнена тромбоэластография с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида 340 мкл крови (фиг. 10). На двух других каналах тромбоэластографа выполнены тромбоэластограммы с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида и полибрена 340 мкл крови до конечной концентрации полибрена в кювете 15 мкг/мл (фиг. 11), и с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция и гепариназы 340 мкл крови (фиг. 12). При сравнении тромбоэластограммы с нативной цитратной кровью (фиг. 10) и тромбоэластограммой с полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 11) и в гепариназной (фиг. 12) отмечено укорочение времени R, K, увеличение угла α и максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образце крови гепарина.

Таким образом, заявленный способ обеспечивает выявление гепарина в пробах крови больного с высокой точностью при относительной простоте исследования.

Пример 3. Изменения тромбоэластограммы после добавления к пробе полибрен-кальциевого реактива у больной до и после назначения болюсно большой дозы гепарина.

Больной Л., 71 года, диагноз ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, рестеноз огибающей артерии. 12.10.2017 г., во время проведения коронарографии и баллонной ангиопластики огибающей артерии выполнена инфузия 5000 ME гепарина. Выполнена тромбоэластография до и после инфузии гепарина. Для контроля за антикоагулянтной терапией у больного взята кровь путем венепункции периферической вены в пробирку S-Monovette, содержащую 3.2% раствор цитрата натрия. Исследование цельной цитратной крови до инфузии гепарина проведено путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида 340 мкл крови (фиг. 13). На другом канале тромбоэластографа выполнена тромбоэластограмма с цельной цитратной кровью путем добавления к 20 мкл 0,2 М кальция хлорида и полибрена 340 мкл крови до конечной концентрации полибрена в кювете 15 мкг/мл (фиг. 14).

После внутривенного введения 5000 ед гепарина активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) не определяется. Выполнена повторно тромбоэластография без добавления и с добавлением полибрен-кальциевого реактива. В нативной цитратной крови отмечается резкое удлинение показателя R, K, а угол α и МА не определяются, фактически сгусток не образуется (фиг. 15). В пробе с полибрен-кальциевым реактивом отмечено образование сгустка, нейтрализация действия гепарина, укорочение времени R, K, увеличение угла α, максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образце крови гепарина (фиг. 16).

Пример 4. Изменения тромбоэластограммы у больной до назначения гепарина и после длительной внутривенной инфузии нефракционированного гепарина.

Больная К., 62 лет. Поступила в связи с сахарным диабетом II типа в стадии декомпенсации, синдромом «диабетической стопы». При поступлении АЧТВ 28 сек, тромбиновое время 21 сек, протромбин по Квику 60%, фибриноген 5,4 г/л. По данным ТЭГ с цитратной нативной кровью и 20 мкл 0,2М кальция хлорида выявлена гиперкоагуляция (фиг. 17). Гиперкоагуляция выявлялась и в пробе с гепариназой (фиг. 18) и полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 19). Причем использование гепариназы и полибрен-кальциевого реактива при отсутствии в крови гепарина существенно не влияло на результаты тромбоэластографии (фиг. 17, 18, 19).

Была начата постоянная внутривенная инфузия нефракционированного гепарина со скоростью 1300 ед/ч. АЧТВ при этом удлинилось до 48 ск, тромбиновое время - 30 с. После начала терапии гепарином отмечена гипокоагуляция по данным тромбоэластограммы с нативной цитратной кровью (фиг. 20). В тромбоэластограммах в кюветах с гепариназой (фиг. 21) и с полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 22) отмечено значимое укорочение R, K, увеличение угла и максимальной амплитуды по сравнению с цитрат нативной кровью (рис. 20), что свидетельствует о действии гепарина и наличии его в пробах крови.

Пример 5. Исследование полибрен-кальциевого реактива в сравнении с гепариназой после назначения болюсно большой дозы гепарина.

Больная З., 29 лет. У больной хроническая почечная недостаточность, в связи с чем проводятся сеансы заместительной почечной терапии. Во время проведения диализа антикоагуляцию обеспечивали гепарином в виде болюсного введения в дозе 7500 ед. Через 15 мин после начала процедуры выполнена тромбоэластография с цельной цитратной кровью, в кюветах с гепариназой и с полибрен-кальциевыми реактивами в конечной концентрации 30, 20, 15 и 10 мкг/мл. В нативной цитратной крови отмечается резкое удлинение периода R, угол альфа К и МА не определяются, фактически сгусток не образуется (фиг. 23). В пробе с гепариназой показано некоторое укорочение периода R (фиг. 24), однако из-за наличия в крови большой дозы гепарина сохраняется гипокоагуляция, т.е. количества гепариназы, находившейся в кювете, недостаточно для инактивации антикоагулянта. В пробах с полибрен-кальциевым реактивом (фиг. 25, 26, 27) отмечено образование сгустка, нейтрализация действия гепарина, укорочение периодов R, К увеличение угла альфа, максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образцах крови гепарина. Использование полибрен-кальциевого реактива с конечной концентрацией полибрена в кювете менее 15 мкг/мл менее эффективно (фиг. 27, 28).

Таким образом, индукция образования сгустка в цельной цитратной крови методом тромбоэластографии добавлением полибрен-кальциевого реактива, содержащего 0,2 М раствора кальция хлорида и полибрен до конечной концентрации 15-30 мкг/мл, позволяет выявлять наличие гепарина при введении больших доз гепарина, когда даже не определяются клоттинговые тесты.

Изобретение относится к медицине, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза. Способ выявления гепарина в пробах крови заключается в том, что выполняют тромбоэластографию с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида и тромбоэластографии с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида и инактиватора гепарина, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по показателям времени от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин (R), времени изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин (K), по показателям максимальной амплитуды (МА) и угла альфа (угол α) в пробе с инактиватором по сравнению с пробой без него, при этом в качестве инактиватора гепарина используют полибрен в конечной концентрации 15-30 мкг/мл, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по укорочению показателей R и K и увеличению МА и угла α в пробе с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида и полибрена по сравнению с пробой с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2М кальция хлорида. 5 пр., 28 ил

Способ выявления гепарина в пробах крови, заключающийся в том, что выполняют тромбоэластографию с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и тромбоэластографию с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и инактиватора гепарина, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по показателям времени от начала свертывания до образования первых волокон фибрина, мин (R), времени изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления, мин (K), по показателям максимальной амплитуды (МА) и угла альфа (угол α) в пробе с инактиватором по сравнению с пробой без него, отличающийся тем, что в качестве инактиватора гепарина используют полибрен в конечной концентрации 15-30 мкг/мл, а наличие в пробе крови гепарина выявляют по укорочению показателей R и K и увеличению МА и угла α в пробе с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида и полибрена по сравнению с пробой с цельной цитратной кровью с добавлением раствора 0,2 М кальция хлорида.