Система мониторинга патогенного потенциала энтеробактерий методом полимеразной цепной реакции Российский патент 2018 года по МПК C12Q1/6806 C12Q1/6809 C12Q1/689 

По существующим правилам и нормам исследование санитарно-эпидемической безопасности воды, а также пищевых продуктов включает в себя выявление санитарно-показательных микроорганизмов, являющихся индикатором микробного загрязнения. Существующие экспресс-системы биомониторинга ориентированы на выявление видов-индикаторов загрязнения, в то время как болезнетворный потенциал как условно-патогенных, так и патогенных микроорганизмов может существенно различаться у разных штаммов.

Одним из ключевых фенотипических маркеров персистентного профиля бактерий является антилизоцимная активность, которая отражает, главным образом, способность клетки к продукции экскретируемых соединений, обеспечивающих инактивацию лизоцима в питательной среде (Андрющенко С.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В. Гомологи гена периплазматического ингибитора лизоцима PliC и их роль в антилизоцимной активности энтеробактерий // Микробиология. 2013, №3, С. 302-311).

Одним из базовых маркеров патогенности бактерий ввиду широкой распространенности является гемолизин - порообразующий токсин. Гемолизин (фактор цитотоксичности) продуцируют различные микроорганизмы, в том числе рода Escherichia-Shigella (Bielaszewska М., Aldick Т., Bauwens A., Karch Н. Hemolysin of enterohemorrhagic Escherichia coli: structure, transport, biological activity and putative role in virulence // Int. J. Med. Microbiol. 2014; V. 304 N. 5-6, P.: 521-529).

Некоторые штаммы Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae продуцируют аэробактин - сидерофор, связывающий железо для дальнейшего переноса внутрь бактериальной клетки с целью его накопления в биотопах, бедных железом (таких как мочевыводящий тракт), что также является фактором патогенности (Searle L.J., Porcelli I., Sheppard S.K., Lucchini S. Variation in siderophore biosynthetic gene distribution and production across environmental and faecal populations of Escherichia coli // PLoS One, 2015, V. 10, N. 3, e0117906).

Генотоксин-колибактин - токсин поликетидной природы, способный проникать в ядро клетки хозяина и связываться там с ДНК, нарушая нормальный процесс репликации, становясь фактором риска развития злокачественных опухолей (прежде всего - прямой кишки (Johnson J.R., Johnston В., Kuskowski М.А., Nougayrede J.P., Oswald E. Molecular epidemiology and phylogenetic distribution of the Escherichia coli pks genomic island // J. Clin. Microbiol., 2008, V. 46, N. 12, P: 3906-3911).

Энтеротоксин типа С - самотранспортирующийся токсин острой диареи, обладающий способностью инактивировать лизоцим - важный фермент защиты хозяина (Mellies J.L., Navarro-Garcia F., Okeke I., Frederickson J., Nataro J.P., Kaper J.B. espC pathogenicity island of enteropathogenic Escherichia coli encodes an enterotoxin // Infect. Immun., 2001, V. 69, N. 1, P: 315-324).

Определение факторов вирулентности и персистенции микроорганизмов доступно с помощью существующих микробиологических методов, но все данные способы обладают существенными недостатками: большие затраты труда и времени (1-3 суток) необходимого для проведения анализа выделяемых микроорганизмов, что не позволяет использовать их для задач массового микробиологического мониторинга.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает высокой специфичностью - выявляется уникальный фрагмент ДНК, специфичный для данного возбудителя и отсутствуют ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами, выявляемыми методами иммунологической диагностики. Экстремальная чувствительность реакции, обеспечиваемая выявлением даже единичных клеток возбудителей, позволяет использовать ПЦР в тех случаях, когда другие методы диагностики не дают положительного результата. Кроме того, длительность стандартного ПЦР-анализа от этапа выделения ДНК с электрофоретической детекцией обычно не превышает 1,5 часов. Проведение ПЦР в формате «реального времени» (ПЦР-РВ) позволяет ускорить получение результата до 30-60 минут, что имеет большое значение в проведении массового микробиологического мониторинга (ПЦР «в реальном времени» // Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.; под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова; 2-е изд., испр. и доп. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 233 с.)

Известен способ определения опасности микробиологической загрязненности воды, описанный в заявке RU 2576030 (С1), опубл. 27.02.2016, определяющий наличие микроорганизмов по их флуоресценции при возбуждении ультрафиолетовым излучением в пробе воды. Однако данный способ не обладает специфичностью по определению таксономической принадлежности и болезнетворных факторов микроорганизмов.

Известен способ выявления кишечных вирусов в клинических образцах и воде методом мультиплексной ПЦР, описанный в заявке RU 2506317 (С2), опубл. 10.02.2014, имеющий сходную цель и метод проведения диагностики, но направленный на выявление вирусных патогенов, тогда как предлагаемый способ включает определение только патогенов бактериальной природы.

Известен способ определения наличия бактерий Escherichia coli O157:Н7 в биологических и пищевых образцах на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, описанный в заявке RU 2569196 (С1), опубл. 20.11.2015, сходный по выявляемому объекту, но использующий иную методику его идентификации - с привлечением иммунологических методов, а также не выявляющий в предлагаемом способе генетические детерминанты патогенности энтеробактерий.

Наиболее близким аналогом является набор для выявления ДНК различных групп диарогенных эшерихий в объектах окружающей среды и клиническом материале методом ПЦР "АмплиСенс® Эшерихиозы-FL" (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва). Данный набор реагентов позволяет выявлять гены патогенности диареегенных кишечных палочек: кодирующие способность к адгезии (еае), инвазии(ipaH), шигаподобные токсины (stx1 и stx2) и энтеротоксины (lt), тогда как предлагаемый способ направлен на выявление генов секретируемых ингибиторов лизоцима типа С (pliCc и pliCp), гемолизина (hlyA и hlyС), аэробактина (iucB, iucC и iucA), колибактина (clbB и clbN) и энтеротоксина (espCp и espCc).

Техническим результатом заявляемого изобретения является выявление пяти известных генетических детерминант факторов патогенности энтеробактерий в пробе ДНК, выделенной из исследуемого материала.

Технический результат достигается способом, при котором для положительного заключения о наличии в пробе генов патогенности энтеробактерий в клиническом материале либо в материале из объектов окружающей среды для постановки ПЦР-анализа используются следующие пары праймеров:

3'-5'

Для хромосомного гомолога гена ингибитора лизоцима pliСс:

Для плазмидного гомолога гена ингибитора лизоцима рliСр:

Для гена биосинтеза аэробактина iucA:

Для гена биосинтеза аэробактина iucB:

Для гена биосинтеза аэробактина iucC:

Для гена продукции гемолизина hlyA:

Для гена активации гемолизина hlyC:

Для хромосомного гомолога гена энтеротоксина espCc:

Для плазмидного гомолога гена энтеротоксина espCp:

Для гена биосинтеза колибактина clbB:

Для гена биосинтеза колибактина clbN:

Изобретение поясняется чертежами: на фиг. 1 показан пример фореграммы.

Пример выполнения анализа:

1 этап - постановка реакции амплификации:

Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл приготовляется из набора праймеров и реагентов в составе: 2 мкл 25 мМ раствора магния хлорида, 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Б, 1,6 мкл 2,5 мМ раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 0,5 мкл 10 мкМ смеси праймеров, 0,2 мкл 5 ед/мкл раствора Taq-полимеразы и 8,7 мкл деионизованной воды. ДНК-проба, выделенная из исследуемого источника вносится в подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл. С целью предотвращения испарения воды из реакционной смеси, на ее поверхность наслаивается 20-30 мкл стерильного парафинового масла. Реакция проводится в ДНК-амплификаторе в течение 30 циклов при температуре отжига 62°С для праймерных пар ко всем вышеуказанным маркерным последовательностям. Время проведения ПЦР составляет 1 час.

2 этап - визуализация результатов амплификации:

Получаемые ампликоны подвергаются агарозному гель-электрофорезу. С этой целью раствор, содержащий амплифицированную ДНК, смешивается с 4 мкл. 10-кратного буфера для внесения с бромфеноловым синим и по 20 мкл полученной смеси вносится в лунки 3% агарозного геля. Электрофорез проводится в ТВЕ-буфере однократной концентрации с 50 мкг/мл этидия бромида в качестве люминесцентного красителя при напряженности поля 10 В/см в течение 18 мин (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М.: Мир, 1984. - 479 с.).

Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводится в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм на установке гель-документирования «Vilber Lourmat» с последующей фотофиксацией изображения.

В качестве маркера молекулярной массы нуклеиновых кислот используется линейный маркер «pUC/MspI» (ООО «Лаборатория Медиген», Россия) в количестве 0,8 мкг. регистрация результатов производится на основе наличия либо отсутствия полос люминесценции бромида этидия в агарозном геле, расположенных в диапазоне молекулярных масс, соответствующих локализации маркерных фрагментов до 208 нуклеотидных пар.

3 этап - интерпретация результатов:

Положительная реакция определяется при наличии полосы люминесценции в геле в положении, соответствующем молекулярной массе положительной контрольной пробы, как показано на фореграмме, где рliСс, рliСр, iucA - пары проб для выявления соответствующих генов, внесенные в вышерасположенные на фореграмме лунки ТВЕ-геля, О - опытные пробы, K - положительные контрольные пробы, с нижележащими на фореграмме полосами люминесценции.

Для верификации работоспособности реакции в качестве положительных контролей и замены маркера молекулярной массы нуклеиновых кислот применяются препараты ДНК, выделенные из чистых культур:

штамм Salmonella enterica АТСС 14028 - для хромосомного гомолога рliСс;

штамм Klebsiella pneumoniae ICIS-278_PBV - для плазмидного гомолога гена рliСр, для генов биосинтеза аэробактина iucB, iucC и iucA;

штамм Е. coli М-17 - для гена биосинтеза колибактина clbN, clbB;

штамм Е. coli ICIS-228 - для гена продукции гемолизина hlyA, hlyC;

штамм Е. coli ICIS-238 - для хромосомного гомолога гена энтеротоксина типа С espCc;

штамм Е. coli ICIS-248 для плазмидного гомолога гена энтеротоксина типа С espCp.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение предназначено для выявления и идентификации в пробах ДНК, выделенных из чистых культур, клинических образцов, проб пищевых продуктов и элюатов, полученных в результате концентрирования из воды, генетических детерминант пяти факторов патогенности бактерий группы кишечной палочки методом ПЦР с помощью набора маркерных детерминант 25 затравочных пар. Преимуществом заявляемого изобретения является выявление маркеров патогенности, что позволяет усовершенствовать технику ПЦР-анализа для диагностики микроорганизмов с выраженным патогенным потенциалом, который определяет возникновение инфекционного заболевания и его тяжесть, а также факторами персистенции, обуславливающими вероятность хронизации процесса и формирование бактерионосительства. Изобретение может иметь применение в эпидемиологических службах для мониторинга эпидемиологической обстановки. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Способ определения патогенного потенциала, т.е. вероятности энтеробактерий родов Escherichia, Shigella, Klebsiella, Salmonella вызывать инфекционные и гнойно-воспалительные заболевания, методом полимеразной цепной реакции, включающий выявление следующих генетических детерминант с использованием праймеров указанных последовательностей:

хромосомного гомолога гена ингибитора лизоцима pliCc - SEQ ID NO 1,2;

плазмидного гомолога гена ингибитора лизоцима pliCp - SEQ ID NO 3, 4;

гена биосинтеза аэробактина iucA - SEQ ID NO 5, 6, либо SEQ ID NO 7, 8;

гена биосинтеза аэробактина iucB - SEQ ID NO 9, 10, 11;

гена биосинтеза аэробактина iucC - SEQ ID NO 12, 13;

гена продукции гемолизина hlyA - SEQ ID NO 14, 15;

гена активации гемолизина hlyC - SEQ ID NO 16, 17;

хромосомного гомолога гена энтеротоксина espCc - SEQ ID NO 18, 19;

плазмидного гомолога гена энтеротоксина espCp - SEQ ID NO 20, 21;

гена биосинтеза колибактина clbB - SEQ ID NO 22, 23;

гена биосинтеза колибактина clbN - SEQ ID NO 24, 25;

при этом штаммы вышеуказанных видов, препараты выделенной ДНК которых демонстрируют положительный результат двухкратного ПЦР-анализа с указанными праймерами хотя бы по двум генам не более одной из таких детерминант, как аэробактин iuc, гемолизин hly или колибактин clb, считаются имеющими средний патогенный потенциал;

штаммы вышеуказанных видов, препараты выделенной ДНК которых демонстрируют положительный результат двухкратного ПЦР-анализа с указанными праймерами хотя бы по двум генам хотя бы одной из таких детерминант, как ингибиторы лизоцима рНС или энтеротоксин espC, либо хотя бы двух таких детерминант, как аэробактин iuc, гемолизин hly или колибактин clb, считаются имеющими высокий патогенный потенциал; все остальные исследуемые системой штаммы считаются имеющими низкий патогенный потенциал.

2. Набор праймеров для осуществления способов по п. 1 включает олигонуклеотиды следующих последовательностей:

SEQ ID NO 1 GATCCCATTTACCCTCTTTCTCG

SEQ ID NO 2 CATCGGGATCATCTCGTTTACC

SEQ ID NO 3 CGATGAAGCGGGCTGTTAGTGGTT

SEQ ID NO 4 TACGGCTTGCAGTTGCTCAGGATG

SEQ ID NO 5 GAGCAGCCGCAAAGCCAGACCAA

SEQ ID NO 6 GCACCAGGCCGTAATCCGCTTCA

SEQ ID NO 7 GGAGCAGCCGCAAAGCCAGACC

SEQ ID NO 8 GCCGAAACCAGCAGCGAATCACC

SEQ ID NO 9 GTGGCCTGCATCTGCTGGTTGGTG

SEQ ID NO 10 GTGCGCTGCGTACGTGGCTCATTC

SEQ ID NO 11 GTGCGCTGCGTACGGGGCTCAT

SEQ ID NO 12 CGCTGGCTGAAACCGGATGAAAGT

SEQ ID NO 13 ACCACCCGGAACAGTTGCGTAAGC

SEQ ID NO 14 GGAACAAAAGCTGCAGCGGGTATC

SEQ ID NO 15 GCAGCAGCCAGGAAAGAAAGAGGA

SEQ ID NO 16 ATGGCCATTATCTGTTTTTGCTAT

SEQ ID NO 17 ACTTTCTTTCTCCCGACATCCA

SEQ ID NO 18 GAGCTGGACGGTGTGGATTTGTTC

SEQ ID NO 19 CTCGCCGTGTACTGATTGTCGTGA

SEQ ID NO 20 ACTGGCGGTCGGATTACTGAG

SEQ ID NO 21 GCTTTATTCGCTGCACTTCCTG

SEQ ID NO 22 ACGGGAAATGCACAGAGGTCACT

SEQ ID NO 23 TAGCGAACGCCGGGTAAACAC

SEQ ID NO 24 GCCCCTGCACATCATCAATC

SEQ ID NO 25 GCTACGCCATCGCTCCTAATAC