СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР С РАЗНЫМ ЭПИДЕМИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/04 C12R1/63 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом.

Холера продолжает оставаться одной из актуальных проблем для мирового здравоохранения. Существование эндемичных очагов холеры в ряде стран Азии и Африки обусловливает ежегодные эпидемии и вспышки этой инфекции и создает постоянную угрозу ее заноса на другие территории, включая Российскую Федерацию.

Возбудителем текущей 7-й пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор, являются Vibrio cholerae биовара Эль Тор, геном которого в процессе эволюции претерпел значительные изменения. Если на протяжении первых трех десятилетий (1961-1990 гг.) эпидемии и вспышки холеры были вызваны типичными штаммами возбудителя, то современный период пандемии (с 1991 г. - по настоящее время) характеризуется глобальным распространением в мире высокопатогенных генетически измененных штаммов (геновариантов) V. cholerae биовара Эль Top [7]. Установлено, что более высокая вирулентность геновариантов по сравнению с типичными штаммами связана в основном с иной структурой оперона ctxAB, кодирующего холерный токсин (XT) - ключевой фактор вирулентности возбудителя холеры. У типичных вибрионов Эль Тор в нуклеотидной последовательности гена ctxAB, определяющей продукцию В-субъединицы XT, в позициях 115 и 203 присутствует тимин (Т), тогда как у геновариантов - цитозин (Ц) [6]. Вместе с тем, геноварианты, вытеснившие типичные штаммы во многих эндемичных по холере регионах, различаются между собой эпидемическим потенциалом, т.е. способностью быстро проникать на территорию многих стран мира и вызывать там эпидемии холеры. Изменение эпидемического потенциала геновариантов обусловлено изменчивостью их генетических свойств, связанных как с вирулентностью, так и с адаптацией возбудителя к меняющимся условиям окружающей среды

К настоящему времени известно, что важную роль в широком распространении возбудителя холеры Эль Тор играют два острова пандемичности - VSP-I (от англ. Vibrio seventh pandemic island) и VSP-II [8]. Остров пандемичности VSP-I состоит из 11 генов и является одним из наиболее стабильных генетических маркеров штаммов V. choleras биовара Эль Тор. В то же время остров пандемичности VSP-II, содержащий 30 открытых рамок считывания (vc0489-vc0517), продукты которых, видимо, определяют высокий уровень устойчивости возбудителя холеры к стрессовым воздействиям, является вариабельным. К настоящему времени, помимо интактного VSP-II, известно о пяти его вариантах, идентифицированных в разных странах. Все эти варианты острова пандемичности отличаются от интактного VSP-II наличием делеций разной протяженности [9]. Анализ распространенности штаммов с разными вариантами VSP-II показал, что среди эпидемических штаммов, изолированных в последнее десятилетие, доминируют изоляты, содержащие в VSP-II протяженную делецию, захватывающую сегмент ДНК, включающий 21 ген из 30 известных. Глобальное рапространение штаммов с такой структурой VSP-II означает наличие у них высокого эпидемического потенциала. Вытеснение этими штаммами ранее возникших геновариантов с интактным VSP-II или геновариантов, имеющих в VSP-II короткие делеции, захватывающие лишь 2-4 гена, указывает на снижение эпидемического потенциала последних. В связи с тем, что в эндемичных очагах холеры циркулируют штаммы с разным эпидемическим потенциалом, способные нанести в разной степени ущерб здоровью населения и экономике страны, актуальным является дифференциация штаммов с высоким и низким эпидемическим потенциалом.

Из патентной информации известен способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов V. cholerae Эль Тор и V. cholerae O139 по их адгезивной способности [3]; способ детекции и определения биовара, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления с использованием метода мультилокусной ПЦР [4]. Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности, позволяющая осуществлять идентификацию природных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность [1]; мультиплексная ПЦР тест-система с использованием праймеров на видоспецифический ген hapA и основных генов вирулентности ctxA, tcpA и toxR, позволяющая одновременно проводить идентификацию штаммов V. cholerae и дифференцировать их по эпидемической значимости [2].

Описанные способы и тест-системы предназначены для детекции и идентификации штаммов холерного вибриона, определения их серогруппы и биовара, дифференциации типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор по эпидемической значимости, однако они не способны выявлять токсигенные генетически измененные штаммы возбудителя текущей пандемии холеры.

Известны способ и тест-система для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae 01, определения их биовара и дифференциации V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и измененные варианты методом ПЦР [5], согласно которому мультиплексную ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров: одна - к генам rfbO1, cas3 и ctxB^Class, вторая - к генам rfbOl, rtxC и ctxB^Et. Изобретение позволяет быстро и достоверно выявлять биовар холерных вибрионов 01 серогруппы, определять их токсигенность и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на типичные изоляты и измененные варианты. Вместе с тем, это изобретение не способно дифференциировать токсигенные геноварианты с разным эпидемическим потенциалом, что является необходимым для совершенствования методов молекулярно-эпидемиологического мониторинга возбудителя холеры.

Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке информативного и быстрого способа, а также тест-системы для дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор по их эпидемическому потенциалу.

Техническим результатом изобретения является возможность дифференциации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с высоким и низким эпидемическим потенциалом на основе структуры острова пандемичности VSP-II.

Технический результат достигается способом дифференциации штаммов по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующимся тем, что ПЦР проводят в реакционной смеси с использованием праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, с температурой отжига праймеров 60°C в течение 30 сек при числе циклов амплификации равном 35. Дифференциацию проводят по структуре VSP-II путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых штаммов и фрагментов генов, характерных для штаммов с интактным VSP-II, с короткой делецией VSP-II и VSP-II - с протяженной делецией. При этом к штаммам с низким эпидемическим потенциалом относят штаммы с интактным островом пандемичности VSP-II, для которых характерно наличие ампликонов фрагментов генов vc0497, vc0502 и vc0514, и штаммы с короткой делецией в VSP-II, для которых характерно наличие ампликонов генов vc0502 и vc0514, а к штаммам с высоким эпидемическим потенциалом - штаммы с протяженной делецией VSP-II, для которых характерно наличие ампликона фрагмента гена vc0514.

Технический результат также достигается тест-системой для дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, включающей компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, содержащие смесь праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, взятых в соотношении 1:1:1:1:1:1 соответственно, а также компоненты для анализа результатов.

Выбор ДНК-мишеней осуществлялся на основании анализа нуклеотидных последовательностей острова пандемичности VSP-II у токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в современный период 7-й пандемии и содержащих разные типы этого геномного острова. В качестве первой мишени был выбран ген vc0514, кодирующий метил-акцепторный белок хемотаксиса, наличие которого характерно для всех типов VSP-II. В качестве второй мишени был выбран ген vc0502, кодирующий пили IV типа, присутствующий в геноме штаммов с интактным островом пандемичности и штаммов, несущих короткую делецию VSP-II. В качестве третьей мишени был выбран ген vc0497, кодирующий регулятор транскрипции, и присутствующий только в геноме штаммов с интактным VSP-II. Праймеры сконструированы авторами с помощью программы Oligo 6.0 на основании представленных в базе данных нуклеотидных последовательностей выбранного гена и являются высокоспецифичными.

Праймеры на гены vc0514, vc0502, vc0497 обеспечивают соответственно образование фрагментов размерами 604 п.н., 761 п.н., 320 п.н. и подобраны таким образом, чтобы минимизировать вероятность их неспецифического отжига.

Праймеры были проверены на возможность образования шпилечных структур с высокими температурами плавления, а также образования димерных соединений как одноименных праймеров, так и разноименных праймеров между собой. Размер получаемых фрагментов был подобран для упрощения процесса визуализации и учета результатов.

Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР.

Заявляемая тест-система разделена на 3 комплекта:

комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), 2 пластиковые пробирки с нуклеосорбентом;

комплект 2 содержит компоненты для проведения ПЦР, включающий 2 пластиковые пробирки с реакционной смесью (праймеры, дНТФ и вода), 1 пластиковую пробирку с 10-кратным буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК токсигенного геноварианта V. cholerae биовара Эль Тор с интактным VSP-II, 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК токсигенного геноварианта V. cholerae биовара Эль Тор, несущего VSP-II с короткой делецией, и 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК токсигенного геноварианта V. cholerae биовара Эль Тор, несущего VSP-II с протяженной делецией;

комплект 3 содержит компоненты для учета результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий ТАЕ буфер, 2 флакона с агарозой для электрофореза и 1 флакон с буфером для нанесения проб.

Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы.

а) Выделение ДНК (комплект 1).

б) Проведение ПЦР (комплект 2).

ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 35 циклов из 96°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 7 мин.

в) Анализ результатов (комплект 3).

Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР осуществляют методом горизонтального гельэлектрофореза в 2% агарозном геле. Учет результатов ПЦР-анализа проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствии с идентификационной таблицей (табл.1).

Способ осуществляют следующим образом.

Подготовка проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа в резиновых или латексных перчатках. Бактериальные взвеси клеток холерного вибриона, выросших на питательной среде, готовят в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлористого по стандартному образцу мутности 5 единиц (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1×10⁹ микробных клеток в 1 мл для холерного вибриона. Взвеси гетерологичных микроорганизмов готовят в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц (ОСО 42-28-59-85П), что соответствует 1×10⁹ м.к./мл для Е. coli, Sh. flexneri, S. enteritidis. Затем 10-кратными разведениями в 0,9% стерильного раствора натрия хлорида доводят до концентрации 1×10³ м.к./мл.

Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». В пробирки с тестируемыми микробными взвесями (1×10⁹ м.к./мл) в объеме 4,5 мл добавляют 0,5 мл 0,1% натрия мертиолята (разведение 1:1000) до конечной концентрации 0,01% (разведение 1:10000), прогревают при (56±1)°С в течение 30 мин. После чего отбирают по 0,1 мл и переносият в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем к 100 мкл образцов, обработанных мертиолятом натрия и разлитых в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий буфер на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения ДНК, и инкубируют 15 минут при температуре (65±1)°С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.

а) Выделение ДНК осуществляют с использованием комплекта 1.

Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Все реагенты комплекта добавляют отдельными наконечниками с помощью автоматических микропипеток.

Раствор 1 прогревают при температуре 60-65°С до полного растворения кристаллов, после чего добавляют к обеззараженным пробам в объеме 300 мкл. Пробы тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и инкубируют при температуре 65°С. Сорбент тщательно ресуспендируют на микроцентрифуге/встряхивателе. В каждую пробирку вносят 25 мкл подготовленного сорбента, перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе 30 с и оставляют в штативе на 2 минуты. Процедуру повторяют дважды. Затем пробирки центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.

К осадку добавляют 300 мкл раствора 2. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния, центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.

К осадку добавляют 500 мкл раствора 3. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния и центрифугируют при 12000 g в течение 30 с. Супернатант удаляют, отмывку раствором 3 повторяют.

К осадку добавляют 400 мкл ацетона. Содержимое перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе, затем центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют. Осадок высушивают при температуре 65°С в течение 5-7 мин.

К осадку добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и выдерживают при температуре 65°С в течение 10 мин, встряхивая на микроцентрифуге/встряхивателе 2-3 раза. По окончании взвесь центрифугируют при 12000 g в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную ДНК.

б) Постановку ПЦР проводят с использованием комплекта 2.

Компоненты 2 комплекта извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок и готовят реакционные смеси для проведения ПЦР.

Для проведения реакции отбирают необходимое количество пробирок, соответствующее числу исследуемых проб, и еще 4 - для трех положительных (ПК-М818, ПК-Р17644 и ПК-Л3226) и одного отрицательного контролей. Для приготовления реакционной смеси смешивают 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, содержащего BSA, рН 8,4, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 2,5 мкл 2 мМ дНТФ, 2 мкл 25 мМ раствора MgCl₂, по 6 пмоль каждого праймера и деионизованной воды до 15 мкл в расчете на одну реакцию. В подготовленные пробирки вносят по 10 мкл пробы. В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирки с положительными контролями соответственно по 10 мкл ДНК из пробирок ПК-М818, ПК-Р17644 и ПК-Л3226. В качестве положительных контролей используют ДНК штамма V. cholerae М818 Эль Тор биовара (vc0497⁺, vc0502⁺, vc0514⁺), V. cholerae P17644 Эль Top биовара (vc0497^-, vc0502⁺, vc0514⁺) и штамма V. cholerae Л3226 Эль Тор биовара (vc0497^-, vc0502^-, vc0514⁺).

Амплификацию ДНК осуществляют с использованием программируемого термостата, например, «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) при следующих температурных режимах (по матричному способу регулирования): температура денатурации - 95°С в течение 5 мин; 35 циклов - денатурация ДНК при температуре 95°С в течение 30 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек, синтез комплементарной цепи при температуре 72°С - 30 сек; заключительный синтез комплементарной цепи при температуре 72°С в течение 7 мин.

в) Анализ результатов проводят с использованием комплекта 3.

Для приготовления рабочего буфера для электрофореза (1×TAE буфер) 20 мл 50×ТАЕ буфера переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до одного литра. Буферные емкости камеры для электрофореза заполняют 1×TAE буфером так, чтобы он покрывал гель слоем 3-5 мм.

Для подготовки 50 мл 2% агарозного геля к 1 г агарозы добавляют 50 мл 1×TAE буфера. Агарозу доводят до кипения, охлаждают до 50°С, вносят 0,5 мкг/мл бромида этидия и заливают в специальную ванночку, устанавливают гребенку и оставляют застывать. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. К реакционной ПЦР-смеси добавляют 5 мкл буфера для нанесения проб, перемешивают при помощи того же наконечника и вносят в карманы геля.

Камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 10 В/см. Электрофоретическое разделение продолжают в течение 50 мин до прохождения лидирующим красителем около 4/5 длины трека (рекомендуемая длина трека - 10 см).

Оценивают результаты ПЦР-анализа по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

На чертеже приведена электрофореграмма ампликонов, полученных при постановке мультиплексной ПЦР. На дорожках 1-6 представлены штаммы близкородственных видов - V. mimicus, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, а также энтеробактерий - Е. coli, Sh. flexneri, S. enteritidis, у которых отсутствует остров пандемичности VSP-II; дорожках 7-11 штаммы V. cholerae М1429, М1430, P18899, Л-3225, Л-4150, с протяженной делецией VSP-II; дорожках 12-15 штаммы V. cholerae М1275, М1293, М1270, М1264, содержащие интактный остров пандемичности; дорожке 16 - штамм V. cholerae P17647 с короткой делецией VSP-II. На дорожках 17-19 представлены положительные контроли ПК-М818, ПК-17644, ПК-Л-3226, характеризующие интактный VSP-II, VSP-II с короткой делецией и VSP-II с протяженной делецией соответственно. Дорожка 20 - отрицательный контроль.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Для оценки эффективности ПЦР тест системы использовали две группы эпидемических штаммов V. cholerae биовара Эль Тор: 28 генетически измененных штаммов, содержащих в геноме профаг СТХ с геном ctxB классического типа, которые были изолированы в России с 1993 г. по 2011 г. При оценке структуры их острова пандемичности с помощью разработанной тест-системы было установлено, что у 21 штамма определяется образование трех фрагментов размером 761 п.н., 604 п.н. и 320 п.н., как и у штамма М818, взятого в качестве контрольного, у 1 штамма, выделенного в Ачинске в 1997 г. - двух фрагментов размером 761 п. н. и 604 п. н., как у контрольного штамма Р17644. Из этого следует, что данная группа штаммов, изолированных в 1993-2001 гг., относится к геновариантам возбудителя холеры с низким эпидемическим потенциалом. Вторая группа состоит из 6 штаммов, VSP-II которых имеет протяженную делецию, поскольку для них характерно образование в ПЦР только одного фрагмента размером 604 п.н., соответствующего гену vc0514, общему для всех вариантов. Эти штаммы, изолированные в последние годы (2004-2012), являются геновариантами с высоким эпидемическим потенциалом, которые практически вытеснили геноварианты с низким эпидемическим потенциалом во многих регионах мира. В настоящее время согласно результатам анализа литературных и собственных данных токсигенные генетически измененные штаммы, в VSP-II которых отсутствовал бы ген vc0514, не выявлены. Этот ген характерен для всех известных типов VSP-II. Данные ПЦР анализа сведены в таблицу 2.

Представленные результаты, полученные с помощью разработанной на основе мультилокусной ПЦР тест-системы, полностью совпадают с данными монолокусного ПЦР анализа с использованием 12 пар праймеров, а также в ряде случаев подтверждены секвенированием.

Таким образом, разработанная мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации геновариантов возбудителя холеры Эль-Тор с высоким и низким эпидемическим потенциалом специфична и эффективна. Показанная возможность быстрого обнаружения недавно сформированных вариантов V. cholerae с высоким эпидемическим потенциалом, глобальное распространение которых во многих странах мира стало реальным фактом, позволяет рекомендовать эту ПЦР тест-систему для использования в качестве дополнительного метода при проведении эпидемиологических расследований.

Список литературы

1. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ №2404257, опубликован 20.11.10 г.

2. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001. 6:11-16.

3. Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae O139 по их адгезивной способности. Патент РФ №2332460, опубликован 27.08.2008 г.

4. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления. Патент РФ 2360972, опубликован 10.07.09 г.

5. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ 2458141, опубликован 10.08.12 г.

6. Dziejman M., Balon E., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: Genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99:1556-1561.

7. Nair G. В., Qadri F., Holmgren J. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006, 44:4211-4213.

8. O'Shea Y. A., Finnan S., Reen F. J. et al. The Vibrio seventh pandemic island-II is a 26,9 kb genomic island present in Vibrio cholerae El Tor and O139 serogroup isolates that shows homology to a 43,4 kb genomic island in V. vulnificus. Microbiology. 2004, 150:4053-4063.

9. Taviani E., Grim C,J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP II genomic islands using comparative genomic analysis // FEMS Microbiol. Lett. 2010, 308:130-137.

Таблица 1 Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной ПЦР и тест-система для его осуществления Размер ампликонов   vc0497 vc0502 vc0514 Результаты дифференциации 320 п.н. 761 п.н. 604 п.н. + + + Низкий эпидемический потенциал (интактный VSP-II или VSP-II с короткой делецией) - + + - - + Высокий эпидемический потенциал (VSP-II с протяженной делецией)

Таблица 2 Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной ПЦР и тест-система для его осуществления № пп Штамм Год выделения Место выделения Тестируемые гены Тип VSP-II Эпид. потенциал vc0497 vc0502 vc0514 1 М1275 1993 Дагестан + + + П Н 2 M1297 1993 Дагестан + + + П Н 3 M1278 1993 Дагестан + + + П Н 4 M1279 1993 Дагестан + + + П Н 5 M1264 1993 Краснодар + + + П Н 6 M1272 1993 Сочи + + + П Н 7 M1299 1993 Сочи + + + П Н 8 M1271 1993 Татарстан + + + П Н 9 M1270 1993 Татарстан + + + П Н 10 M1298 1993 Сочи + + + П Н 11 M1266 1994 Пермь + + + П Н 12 M1295 1994 Дагестан + + + П Н 13 M1287 1994 Дагестан + + + П Н 14 M1288 1994 Дагестан + + + П Н 15 M1286 1994 Дагестан + + + П Н 16 M1293 1994 Дагестан + + + П Н 17 М1269 1994 Магнитогорск + + + П Н 18 Р17647 1997 Ачинск - + + КД Н 19 M1326 1998 Дагестан + + + П Н 20 М1328 1998 Дагестан + + + П Н 21 М1345 2001 Татарстан + + + П Н 22 М1349 2001 Татарстан + + + П Н 23 М1429 2004 Башкирия - - + ПД В 24 М1430 2005 Тверь - - + ПД В 25 Р18899 2006 Мурманск - - + ПД В 26 Л-3225 2010 Москва - - + ПД В 27 Л-4150 2010 Москва - - + ПД В 28 301 2011 Таганрог - - + ПД В Примечания: П - прототипный VSP-II, КД - VSP-II с короткой делецией, ПД - VSP-II с протяженной делецией, Н - низкий эпидемический потенциал, В - высокий эпидемический потенциал.

Изобретения относятся к области медицинской микробиологии и касаются способа дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор и тест-системы. Охарактеризованный способ включает проведение ПЦР с использованием специфических праймеров к генам vc0497, vc0502 и vc0514 из острова пандемичности VSP-II. Охарактеризованная тест-система содержит компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, включающие, в частности, смесь праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, взятых в соотношении 1:1:1:1:1:1 соответственно. Изобретения позволяют быстро и достоверно дифференцировать токсигенные генетически измененные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор на геноварианты с низким и высоким эпидемическим потенциалом. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с низким и высоким эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующийся тем, что ПЦР проводят в реакционной смеси с использованием праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, с температурой отжига праймеров 60°C в течение 30 с при числе циклов амплификации равном 35, дифференциацию проводят по структуре VSP-II путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых штаммов и фрагментов генов, характерных для штаммов с интактным VSP-II, с короткой делецией VSP-II и VSP-II с протяженной делецией, при этом к штаммам с низким эпидемическим потенциалом относят штаммы с интактным островом пандемичности VSP-II, для которых характерно наличие ампликонов фрагментов генов vc0497, vc0502 и vc0514, и штаммы с короткой делецией в VSP-II, для которых характерно наличие ампликонов фрагментов генов vc0502 и vc0514, а к штаммам с высоким эпидемическим потенциалом относят штаммы с протяженной делецией VSP-II, для которых характерно наличие ампликона фрагмента гена vc0514.

2. Тест-система для дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с низким и высоким эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, содержащая компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, компоненты для анализа результатов, отличающаяся тем, что компоненты для проведения ПЦР содержат смесь праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, взятых в соотношении 1:1:1:1:1:1 соответственно.