Способ оценки патотипа и эпидемической/эпизоотической значимости штаммов Escherichia coli, выделенных в условиях сельскохозяйственного предприятия Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицинской и сельскохозяйственной микробиологии, ветеринарии, и может быть использовано для оценки преимущественного патотипа штаммов Escherichia coli (Е. coli) животного происхождения, выделенных от различных сельскохозяйственных животных и/или из смывов с абиотических поверхностей, водных источников, кормов, что необходимо для контроля эпидемической и эпизоотической ситуации в условиях сельскохозяйственного предприятия.

Известно, что Е. coli как комменсальный микроорганизм является постоянным обитателем кишечника млекопитающих и человека. Среди эшерихий встречаются как безусловные патогены - диареегенные штаммы (энтеропатогенные ЕРЕС, энтеротоксигенные ЕТЕС, группа шига-токсинпродуцирующих эшерихий - энтерогеморрагические ЕНЕС Е. coli и др.), так и экстраинтестинальные Е. coli (extraintestinal pathogenic Е. coli, ЕхРЕС), вызывающие инфекционные заболевания за пределами кишечного тракта [Allocati N., Michele М., Alexeyev M.F., Ilio D.C. Escherichia coli in Europe: An Overview. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2013; 10:6235-6254]. Многочисленные исследования показали, что животные штаммы могут представлять опасность для здоровья людей [Bélanger L., Garenaux А., Harel J. et al. Escherichia coli from animal reservoirs as a potential source of human extraintestinal pathogenic E. coli. FEMS Immunol Med Microbiol. 2011; 62:1-10; Manges A.R Escherichia coli and urinary tract infections: the role of poultry-meat. Clin Microbiol Infect. 2016; 22:122-129]. С одной стороны, выявлена возможность трансмиссии штаммов через продукты питания, в том числе, мясо птицы и крупного рогатого скота [Vincent С., Boerlin P., Daignault D. et al. Food Reservoir for Escherichia coli Causing Urinary Tract Infections Caroline. Emerging Infectious Diseases. 2010; 16(1):88-95]. С другой - наличие у представителей диареегенных Е. coli, ЕхРЕС и Е. coli животного происхождения сходных филогрупп, серотипов и генетических детерминант патогенности позволяет предположить, что животные штаммы могут быть резервуаром генов вирулентности, а также включать возбудителей антропозоонозных инфекций [Mora A., Viso S., López С.et al. Poultry as reservoir for extraintestinal pathogenic Escherichia coli 045:K1:H7-B2-ST95 in humans. Veterinary Microbiology. 2013; 167(3-4):506-512; Tivendale K.A., Logue С.М., Kariyawasam S. et al. Avian-pathogenic Escherichia coli strains are similar to neonatal meningitis E. coli strains and are able to cause meningitis in the rat model of human disease. Infection and Immunity. 2010; 78(8):3412-3419]. Природные штаммы могут либо сами выступать в качестве антропозоонозных патогенов, либо служить резервуаром детерминант вирулентности для Е. coli, обусловливающих инфекции у животных и человека [Belanger L., Garenaux A. Harel J. et al. Escherichia coli from animal reservoirs as a potential source of human extraintestinal pathogenic E.coli. FEMS Immunol Med Microbiol. 2011; 62:1-10; Bergeron C., Prussing C., Boerlin P. et al. Chicken as Reservoir for Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli in Humans, Canada. Emerging Infectious Diseases. 2012; 18:415-421]. Так, например, сельскохозяйственные животные - основной естественный резервуар и источник шига-токсинпродуцирующих Е. coli [Онищенко Г.Г. [и др.]. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году / Вестник Российской академии медицинских наук. 2015; 1: 70-81].

В настоящее время наблюдается рост числа инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями, что является одной из основных проблем общественного здравоохранения. Показано, что среди изолятов Е. coli, циркулирующих на предприятиях птицеводства и животноводства, более половины имеют множественную резистентность [Забровская А.В. Эпизоотологический анализ распространения антибиотикорезистентных штаммов возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных в северо-западном федеральном округе Российской Федерации // Диссертация на соискание д.в.н., 2019. 323 с.]. Особую значимость имеет растущая устойчивость микроорганизмов к антимикробным агентам класса цефалоспоринов, так как эта группа препаратов входят в составленный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) список антибиотиков, критически важных для медицины [Antibiotics in animal farming. Public health and animal welfare. https://www.ciwf.org.uk/media/3758863/Antibiotics-in-Animal-Farming-Public-Healthand-Animal-Welfare.pdf]. Выход антибиотикоустойчивых штаммов в окружающую среду через отходы животного происхождения увеличивает «резервуар сопротивления», существующий в микробиоме природных биотопов [Economou V., Gousia P. Agriculture and food animals as a source of antimicrobial-resistant bacteria. Infection and Drug Resistance. 2015; 8:49-61].

Принимая во внимание, что среди эшерихий млекопитающих и птиц встречаются как комменсальные, условно-патогенные представители, так и безусловные кишечные патогены, в настоящее время существует необходимость дифференцировки большого числа штаммов Е. coli, изолируемых от сельскохозяйственных животных при диарейном симптомокомплексе, мастите у коров и генерализованном колибактериозе (например, колисептицемии с поражением сердца, печени и других органов у птицы, крупного рогатого скота). Учитывая разнообразие биологических характеристик, широкий набор факторов вирулентности и детерминант антибиотикоустойчивости штаммов, имеющих сельскохозяйственное происхождение, их комплексная, экспрессная оценка необходима для контроля над эпидемической и эпизоотической ситуацией на предприятии.

Многие авторы предлагают научно-обоснованные программы совершенствования эпизоотологического мониторинга, которые успешно и эффективно применяются ветеринарными службами в соответствующих регионах [Журавлев Д.А. Совершенствование барьерной функции госветнадзора за безопасностью продуктов животноводства в конкретном субъекте федерации: дис. … канд. вет. наук / Д. А. Журавлев. Санкт-Петербург, 2007. 136 с.; Дмитриев С.И. Эпизоотологический мониторинг за эпизоотической и экологической безопасностью территории, прилегающей к Волгоградскому водохранилищу: автореф. дис. … канд. вет.наук / С.И. Дмитриев. Нижний Новгород, 2007. с. 456; Дружаева Н.А. Эпизоотологический мониторинг и микробиологическая безопасность продовольственной базы Северной зоны Нижнего Поволжья: дис. … канд. вет.наук / Н. А. Дружаева. Саратов, 2014. 177 с.]. Одновременно с определением морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств бактерий проводят серотипирование штаммов Е. coli в реакции агглютинации со специфическими О-агглютинирующими сыворотками. Недостатки прототипа: фенотипические методы имеют ограниченную способность для типирования Е. coli, как по биологическим свойствам, так и по признаку резистентности к антибактериальным препаратам. Патогенность штаммов оценивается по серогруппе выделенного возбудителя, то есть учитываются только диареегенные культуры Е. coli, однако возбудителями спорадических случаев и вспышек заболеваний могут являться и представители «нетипичных» серотипов шига-токсинпродуцирующих Е. coli. Кроме того, серологическая идентификация эшерихий в реакции агглютинации трудоемкая, дорогостоящая и требует наличия более 180 сывороток для типирования О-антигена, а также более 50 - для типирования Н-антигена.

Эпидемиологический надзор на сельскохозяйственных предприятиях включает обязательный мониторинг чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам с анализом тенденций изменения количества устойчивых штаммов бактерий, вызывающих инфекционные болезни животных.

На сегодняшний день известен способ микробиологического мониторинга устойчивости к антимикробным препаратам штаммов актуальных видов микроорганизмов, выделяемых от сельскохозяйственных животных и из продукции животного происхождения [Забровская А.В. Системы мониторинга устойчивости к антимикробным препаратам микроорганизмов, выделенных от животных и из продуктов животного происхождения. Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2014; 1:19-21]. Недостаток прототипа: фенотипические методы имеют ограниченную способность при оценке резистентности Е. coli к антибактериальным препаратам, в первую очередь, они не позволяют оценить тип бета-лактамаз, продуцируемых бактериями, тогда как некоторые ферменты, например, цефалоспориназы имеют эпидемиологическую значимость в связи с горизонтальным переносом кодирующих их генов.

Известен способ оценки штаммов условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при исследовании объектов окружающей среды и пищевых продуктов. В качестве маркеров их эпидемиологической значимости были предложены следующие признаки: способность к пленкообразованию, устойчивость к антибиотикам, способность к персистенции, лецитиназная, гемолитическая и антагонистическая активности [Нежвинская О.Е., Дудчик Н.В., Коломиец Н.Д., Тонко О.В., Дроздова Е.В. Методы оценки эпидемиологической значимости условно-патогенной микрофлоры. Здоровье и окружающая среда. 2015; 1(25):69-71]. Недостатки метода: традиционные фенотипические методы оценки отдельных свойств эшерихий не позволяют составить целостного представления о патогенном и эпидемическом потенциале циркулирующих Е. coli, что обусловлено, в том числе, невозможностью оценить все «критически» важные свойства.

Известен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на детекции генов, кодирующих шига-подобные токсины Е. coli [Кремлева А., Скоморина Ю., Белоусов В., Варенцова А., Полосенко О., Шепелин А. Оценка распространенности патогенных эшерихий в кормах на территории РФ в 2014-2018 годах. Комбикорма. 2020; 3:68-70]. Недостаток прототипа: в мониторинге патогенных Е. coli выявление с помощью ПЦР только гена шига-подобного токсина является недостаточным, так как будут упущены условно-патогенные экстраинтестинальные популяции эшерихий, а также антибиотикоустойчивые культуры с плазмидной локализацией генов, способные к быстрому распространению.

Наиболее близким прототипом для настоящего изобретения является система мониторинга патогенного потенциала энтеробактерий человека, позволяющая определять наличие генетических детерминант штаммов: аэробактин iuc, гемолизин hly, колибактин clb, способствующих вероятности возникновения и развития инфекционных заболеваний (патент на изобретение РФ №2662930 от 31.07.2018 «Система мониторинга патогенного потенциала энтеробактерий методом полимеразной цепной реакции»), в котором в качестве мишени используются вирулент-ассоциированные гены только экстраинтестинальной Е. coli человека. Недостатки прототипа: оценка вирулент-ассоциированных генов только экстраинтестинальной Е. coli человека не позволит выявить диареегенные патотипы эшерихий и оценить эпизоотическую ситуацию по колибактериозу на сельскохозяйственном предприятии.

Технический результат. Оптимальная и адекватная оценка патотипа (патогенного потенциала), а также эпидемической и эпизоотической значимости штаммов Е. coli, выделенных от сельскохозяйственных животных и/или циркулирующих в условиях сельскохозяйственных предприятий (изолированных из подстилки, кормов, абиотических поверхностей доильного оборудования и т.д.). Валидный способ контроля над распространением патогенных и цефалоспориноустойчивых полевых Е. coli с помощью простого, быстрого, дешевого и эффективного способа.

Указанный результат достигается за счет применения комплексной генотипической оценки биологических свойств штаммов, основанной на использовании ПЦР реакций, позволяющих детектировать как маркеры патогенности (диареегенных и экстраинтестинальных условно-патогенных популяций эшерихий), так и наиболее значимые детерминанты антибиотикоустойчивости.

Способ осуществляется следующим образом: после идентификации бактериологическим методом культуры Е. coli, изолированные от больных и/или павших животных, а также из подстилки, кормов, абиотических поверхностей доильного оборудования и т.д., дополнительно подвергают молекулярно-генетическому анализу методом ПЦР для обнаружения генов диареегенных (SHEC/ETEC) и ЕхРЕС (АРЕС или UPEC) популяций эшерихий со следующими праймерами (таблица 1). Для этого бактериальную петлю исследуемой культуры стерильно переносят в пробирки типа «Эппендорф» с 1 мл сверхчистой воды. Выделение тотальной ДНК для полимеразной цепной реакции проводят по методике, описанной Stone G.G. (1994), а именно, эппендорфы прогревают 10 минут при температуре 97°С в твердофазном термостате (например, «Термит», Россия), центрифугируют в ультрацентрифуге (например «Эппендорф», Германия) в течение 10 минут при 13000 об/мин, супернатант переносят в другую пробирку. Далее проводят амплификацию в соответствие с предложенными протоколами авторов, используя наборы праймеров. Патотип ЕНЕС/ЕТЕС определяют по наличию диареегенных: iha, stx1/2, estII - генов адгезйна, шига-подобного токсина и термостабильного энтеротоксина b соответственно; патотип АРЕС определяют по наличию генов экстраинтестинальных групп эшерихий: hlyF, colV - птичьего гемолизина, маркера плазмиды ColV, соответственно; патотип UPEC определяют по наличию генов: usp, papGII/III - уропатогенного специфического белка, пиелонефрит- и цистит-ассоциированных вариантов пилей, соответственно, а эпидемическую и эпизоотическую значимость определяют по наличию генов iss, bla_CTX-M - фактора выживаемости в сыворотке и бета-лактамазы, соответственно, далее составляют генетический профиль культуры и на основании присутствия соответствующих генов, определяют ее группу: DEC или ЕхРЕС, и патотип: ЕНЕС/ЕТЕС, АРЕС или UPEC, а также делают вывод об эпидемической и эпизоотической значимости выделенного штамма.

Примеры практического применения (таблица 2):

Пример 1. При падеже поголовья на птицеводческом хозяйстве г. Перми осуществлен контроль обсемененности внутренних органов птицы. Выделение и идентификацию бактерий осуществляли стандартным бактериологическим методом. Выделенные культуры отнесены к виду Е. coli, сделано заключение о вспышке колибактериоза. Выделение ДНК, ПЦР-реакции со всеми парами праймеров проводили как описано выше. Путем амплификации ДНК штамма RB5, выделенного из сердца птицы, был определен генотип hlyF, iss, bla_CTX-M (остальные маркеры в ПЦР реакциях были отрицательными). Данный штамм характеризовался патотипом близким к АРЕС (группа ЕхРЕС), имеющим эпидемическую и эпизоотическую значимость.

Пример 2. При падеже поголовья на птицеводческом хозяйстве г. Перми осуществлен контроль обсемененности внутренних органов птицы. Выделение и идентификацию бактерий осуществляли стандартными методами. Выделенные культуры отнесены к виду Е. coli. Генетическое исследование осуществляли аналогичным методом со всеми парами праймеров. Путем амплификации ДНК штамма RB36_12, выделенного из селезенки птицы, был определен генотип iha, estII, hlyF, iss, bla_CTX-M. Данный штамм характеризовался гибридным патотипом APEC/DEC, имеющим эпидемическую и эпизоотическую значимость.

Пример 3. Осуществлен плановый контроль инфицированности поголовья диареегенными эшерихиями в крупном животноводческом хозяйстве. Выделение и идентификацию бактерий осуществляли из подстилки животных стандартными бактериологическим методами. Выделенные культуры отнесены к виду Е. coli. Генетическое исследование штамма, изолированного от теленка К25, осуществляли аналогичным методом со всеми парами праймеров. Результат амплификации оказался отрицательным во всех реакциях. Определение группы и патотипа данного штамма затруднено, возможно комменсальный штамм, эпидемической и эпизоотической опасности нет.

Пример 4. При вспышке диареи у телят в крупном животноводческом хозяйстве проведено бактериологическое исследование испражнений животных. От одного из телят выделен штамм Е. coli К40. Генетическое исследование осуществляли аналогичным методом со всеми парами праймеров. Путем амплификации ДНК у выделенного штамма был определен генотип hlyF, iss, colV, bla_CTX-M. Штамм отнесен к группе ЕхРЕС, патотип АРЕС, характеризуется эпидемической и эпизоотической значимостью.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и сельскохозяйственной микробиологии, ветеринарии. Культуры Е. coli, изолированные от больных и/или павших сельскохозяйственных животных, а также из подстилки, кормов, поильных систем, абиотических поверхностей доильного оборудования идентифицируют бактериологическим методом. Дополнительно их подвергают молекулярно-генетическому анализу методом ПЦР. Патотип ЕНЕС/ЕТЕС определяют по наличию диареегенных: iha, stx1/2, estII - генов адгезина, шигаподобного токсина и термостабильного энтеротоксина b соответственно. Патотип АРЕС определяют по наличию генов экстраинтестинальных групп эшерихий: hlyF, colV - птичьего гемолизина, маркера плазмиды ColV соответственно. Патотип ПРЕС определяют по наличию генов: usp, papGII/III - уропатогенного специфического белка, пиелонефрит- и цистит-ассоциированных вариантов пилей соответственно. Эпидемическую и эпизоотическую значимость определяют по наличию генов iss, bla_CTX-M - фактора выживаемости в сыворотке и бета-лактамазы соответственно. Далее составляют генетический профиль культуры и на основании присутствия соответствующих генов определяют ее группу: DEC или ЕхРЕС, и патотип: ЕНЕС/ЕТЕС, АРЕС или UPEC. Также делают вывод об эпидемической и эпизоотической значимости выделенного штамма. Способ позволяет провести оптимальную и адекватную оценку патотипа (патогенного потенциала), а также эпидемической и эпизоотической значимости штаммов Е. coli, выделенных от сельскохозяйственных животных и/или циркулирующих в условиях сельскохозяйственных предприятий. Способ позволяет эффективно осуществлять контроль над распространением патогенных и цефалоспориноустойчивых полевых Е. coli. 2 табл., 4 пр.

Способ оценки патотипа и эпидемической/эпизоотической значимости штаммов Escherichia coli, выделенных в условиях сельскохозяйственного предприятия, включающий идентификацию бактериологическим методом культуры Е. coli, изолированной от больных и/или павших сельскохозяйственных животных, а также из подстилки, кормов, поильных систем, абиотических поверхностей доильного оборудования, отличающийся тем, что культуры Е. coli дополнительно подвергают молекулярно-генетическому анализу методом ПЦР, при этом патотип ЕНЕС/ЕТЕС определяют по наличию диареегенных: iha, stx1/2, estII - генов адгезина, шигаподобного токсина и термостабильного энтеротоксина b соответственно; патотип АРЕС определяют по наличию генов экстраинтестинальных групп эшерихий: hlyF, colV - птичьего гемолизина, маркера плазмиды ColV соответственно; патотип ПРЕС определяют по наличию генов: usp, papGII/III - уропатогенного специфического белка, пиелонефрит- и цистит-ассоциированных вариантов пилей соответственно, а эпидемическую и эпизоотическую значимость определяют по наличию генов iss, bla_CTX-M - фактора выживаемости в сыворотке и бета-лактамазы соответственно, далее составляют генетический профиль культуры и на основании присутствия соответствующих генов определяют ее группу: DEC или ЕхРЕС, и патотип: ЕНЕС/ЕТЕС, АРЕС или UPEC, а также делают вывод об эпидемической и эпизоотической значимости выделенного штамма.