РАЗРАБОТКА ИММУНОГЕНА НА ОСНОВЕ В-КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2018 года по МПК C07K16/00 A61K39/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/761419, зарегистрированной 6 февраля 2013 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Способы и композиции для разработки иммуногена при помощи разработки В-клеточной линии дифференцировки в гуманизированных иммуноглобулиновых локусах не относящихся к человеку животных. Способы и композиции для разработки иммуногенов для создания вакцин, в которых используются не относящиеся к человеку животные с гуманизированными иммуноглобулиновыми локусами. Итеративные процессы первичных и повторных иммунизаций не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы, для определения кандидатных иммуногенов для применения в качестве вакцин и для создания нейтрализующих антител широкого спектра действия против инфекционных агентов и патогенов. Разработка человеческих вакцин в животных, содержащих гуманизированный иммуноглобулин.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННОМ ФИНАНСИРОВАНИИ

[0003] Данное изобретение было сделано при государственной поддержке по Гранту № UM1-AI100645, присужденному Национальным институтом здоровья (НИЗ) и национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (НИАИЗ). Государство обладает определенными правами на данное изобретение.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Вакцины против человеческих патогенов очень нужны, но их трудно получить. Существует в лучшем случае несколько подходящих способов или систем, позволяющих подвергать человеческую иммунную систему воздействию человеческого инфекционного агента или патогенна и получать полезную информацию, которую можно использовать для разработки подходящей вакцины, которая индуцирует у субъекта-человека иммунитет к представляющему интерес инфекционному агенту или патогену. Зачастую это не этично и не практично подвергать субъектов-людей воздействию иммуногенов, полученных из патогена или инфекционного агента, в процессе разработки вакцины, а системы, в которых используются не относящиеся к человеку животные, как правило, не подходят для получения полезной информации по человеческой иммуногенности.

[0005] Хотя люди могут вырабатывать нейтрализующие антитела широкого спектра действия против инфекционных агентов, а эпитопы, связываемые этими антителами, можно определить, эпитопы парадоксальным образом являются относительно неэффективными как иммуногены при их применении в качестве кандидатных вакцин. Это происходит потому, что эпитопы, распознаваемые нейтрализующими антителами широкого спектра действия, не являются теми эпитопами, которые связывают антитела на ранней стадии, такие как те, которые присутствуют на рецепторах ранних В-клеток (BCR) из исходного набора человеческих иммуноглобулинов. Таким образом, вакцинирование субъекта-человека иммуногеном, который содержит эпитоп нейтрализующего антитела широкого спектра действия, только в редких случаях может, если вообще может, привести к появлению у человека-субъекта какого-либо существенного иммунитета к инфекционному агенту. Что означает, что определение важного эпитопа, который реагирует с нейтрализующим антителом широкого спектра действия, часто является бесполезным в отношении потенциальной вакцины. Это существенное наблюдение приводит к выводу, что клональное развитие В-клеток до зрелых В-клеток, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия, стимулируется иммуногенами, которые не идентичны эпитопу, связываемому нейтрализующим антителом широкого спектра действия. Проблема, как кажется, является комплексной и связана с развитием ранних В-клеток.

[0006] Чтобы разработать рациональный процесс создания эффективных вакцин на основе того, что называется развитием В-клеток и человеческим иммунным ответом на человеческие инфекционные агенты, необходима подходящая система для разработки кандидатных вакцин - система, которая позволяет оценить, каким образом человеческий иммунный ответ взаимодействует с иммуногенами и их вариантами, чтобы в конечном итоге получить В-клеточную линию, которая вырабатывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия к эпитопу человеческого инфекционного агента или патогена, и в ходе этого процесса выявить вариант иммуногена, который может служить вакциной, способной индуцировать выработку нейтрализующих антител широкого спектра действия у человеческой популяции в целом. Этот процесс включает поиск ключевого иммуногена, который может примировать исходный набор человеческих иммуноглобулинов, и при помощи тщательно отобранных бустерных иммуногенов осуществить процесс клональной селекции В-клеток для получения зрелой В-клетки, которая экспрессирует нейтрализующие антитела широкого спектра действия.

[0007] В данной области техники существует потребность в композициях и способах создания вакцин, которые подходят для иммунизации людей против человеческих инфекционных агентов. В данной области техники существует потребность в рациональных способах разработки иммуногенов, для применения их в качестве вакцин для людей. В данной области техники существует потребность в гуманизированных системах, например, гуманизированных животных, которых можно использовать в указанных способах для создания вакцин и кандидатных вакцин для иммунизации людей против человеческих инфекционных агентов. Существует потребность в платформе нечеловеческого происхождения, которая может воспроизводить ответ человеческих В-клеток, для создания вакцин к инфекционным агентам при помощи стимуляции развития необходимых В-клеток посредством применения вариантов иммуногенов, что в конечном итоге приведет к развитию необходимых В-клеток, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия против представляющих интерес инфекционных агентов. Также существует потребность в использовании гуманизированных животных для дополнительной разработки нейтрализующих антител широкого спектра действия к эпитопам инфекционных агентов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Предложены композиции и способы для разработки вакцин, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированные последовательности иммуноглобулина, включающие итеративные процессы, которые включают применение выбранных иммуногенов для получения В-клеточных клонов из исходного набора (например, незрелых В-клеток, содержащих рецепторы ранних В-клеток), которые после созревания превращаются в В-клетки, вырабатывающие необходимые антитела, которые избирательно связывают конкретные иммуногены, при этом один или более из выбранных иммуногенов применяются в качестве вакцин. Описаны композиции и способы создания иммунных клеток (в генетически модифицированных не относящихся к человеку животных), которые связывают конкретные, представляющие интерес иммуногены, включая развитие иммунных клеток от исходного или немутированного состояний до зрелого или гипермутированного состояний, которые специфически связывают представляющий интерес инфекционный агент, и применение одного или более из представляющих интерес иммуногенов, которые достигли этих состояний, в приготовлении вакцин, чтобы вызвать у нуждающегося в этом субъекта иммунный ответ на представляющий интерес инфекционный агент, например, чтобы индуцировать у представляющего интерес субъекта иммунитет к представляющему интерес инфекционному агенту и появление популяций иммунных клеток, которые экспрессируют последовательности иммуноглобулина, которые связывают представляющие интерес антигены. Предложены способы создания вакцин, в которых используются грызуны с гуманизированными последовательностями иммуноглобулина.

[0009] Предложены композиции и способы для упрощения разработки иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированные иммуноглобулиновые локусы. Предложены композиции и способы использования не относящихся к человеку животных для выявления при помощи промежуточных предшественников В-клеток и В-клеток, содержащих немутированные рецепторы (например, исходного набора В-клеток или набора В-клеток, характеризуемого перестройками в зародышевой линии, которые не были мутированы или не были соматически гипермутированы), иммуногенов для разработки вакцин против инфекционных агентов, которые вызовут выработку из человеческого набора иммуноглобулинов зрелых В-клеток, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия. Предложены композиции и способы для проведения циклов первичных и повторных иммунизаций с применением вариантов иммуногенов и, необязательно, адъювантов, которые генерируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия, чтобы таким образом выявить варианты иммуногенов, способные стимулировать набор ранних или исходных В-клеток (например, набор, отображающий перестройки в зародышевой линии), при этом варианты иммуногенов индуцируют выработку нейтрализующего антитела широкого спектра действия против инфекционного иммуногена.

[00010] Предложены общие способы создания вакцин против человеческих инфекционных агентов и патогенов в не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы.

[00011] Также предложены композиции и способы использования не относящихся к человеку животных, имеющих ограниченный набор иммуноглобулинов (например, ограниченный набор человеческой тяжелой цепи).

[00012] В одном аспекте предложены способы и композиции, в которых применяется иммуноген, разработанный на основе В-клеточной линии дифференцировки в не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы (например, иммунизированная мышь VELOCIMMUNE®), для итеративной разработки иммуногенов для вакцин против инфекционных заболеваний.

[00013] В одном варианте реализации изобретения компоненты агента инфекционного заболевания применяют в качестве антиген-специфических меток для определения предшественников защитных антител в неиммунизированных или неинфицированных гуманизированных мышах VELOCIMMUNE® или применяют такие же реагенты и сходные стратегии для определения иммуноген-индуцированньгх клональных линий дифференцировки антител против инфекционного агента, которые развиваются в необходимом направлении. Затем эти антитела используют в качестве матриц для итеративной разработки вакцины, во время которой определяют группу новых иммуногенов и, необязательно, адъювантов для того, чтобы сделать субдоминатный или непредпочтительный в ином случае путь созревания В-клеток доминантным. В одном варианте реализации изобретения в условиях вакцинации получают достаточные для защиты уровни антител в плазме крови и тканях.

[00014] В одном аспекте не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированные иммуноглобулиновые локусы (например, иммунизированные мыши VELOCIMMUNE®), используются для разработки иммуногенов для вакцин, включая: применение костного мозга преиммунной невакцинированной мыши для выделения антиген-специфических исходных В-клеток, которые связываются с антиген-специфическими реагентами инфекционного агента, содержащего нейтрализующие эпитопы широкого спектра действия; выделяют антитела, соответствующие рецепторам исходных В-клеток (BCR), и получают их рекомбинантным путем; а иммуногены выбирают на основании их высокой аффинности связывания с этими BCR для определения иммуногенов, которые будут стимулировать созревание нейтрализующих линий дифференцировки В-клеток широкого спектра действия в периферических лимфатических узлах и селезенке.

[00015] В одном аспекте не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированные иммуноглобулиновые локусы (например, иммунизированных мышей VELOCIMMUNE®), вакцинируют существующими иммуногенами, которые сами по себе являются антигенными по отношению к нейтрализующим антителам широкого спектра действия, которые необходимо индуцировать; затем индуцированные антитела выделяют путем получения моноклональных антител из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных мышей; получают антитела рекомбинантным способом; а затем большинство зрелых антител необходимой линии дифференцировки используют в качестве матрицы для дополнительного стимулирования необходимой линии дифференцировки до полной экспрессии необходимой функции, например, защитной эффекторной функции против инфекционного агента. В одном варианте реализации изобретения защитная функция включает нейтрализацию вируса, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность против инфицированных инфекционным агентом клеток, предотвращение проникновения инфекционного агента через мукозальный барьер и блокирование попадания инфекционного агента в клетки-мишени.

[00016] В одном аспекте предложен способ получения иммуногена, который приводит к выработке в не относящемся к человеку животном, содержащем гуманизированный Ig-локус, нейтрализующего антитела широкого спектра действия против инфекционного агента, включающий итерирование и скрининг кандидатных иммуногенов для разработки вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки, при этом итерирование и скрининг включают:

[00017] (a) определение первого эпитопа инфекционного агента, который связывается с нейтрализующим антителом широкого спектра действия;

[00018] (b) получение второго эпитопа, который специфически связывает первое промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом второй эпитоп не идентичен первому эпитопу;

[00019] (c) получение третьего эпитопа, который специфически связывает второе промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом третий эпитоп не идентичен второму эпитопу; и

[00020] (d) применение третьего эпитопа в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00021] В одном варианте реализации изобретения указанный способ дополнительно включает получение четвертого эпитопа, который специфически связывает третье промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом четвертый эпитоп применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00022] В одном варианте реализации изобретения указанный способ дополнительно включает получение пятого эпитопа, который специфически связывает четвертое промежуточное антитело-предшественник нейтрализующего антитела широкого спектра действия, при этом пятый эпитоп применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00023] В одном варианте реализации изобретения первый, второй, третий, четвертый или пятый эпитоп связывает немутированное антитело-предшественник. В одном варианте реализации изобретения первый, второй, третий, четвертый или пятый эпитоп, который связывает немутированное антитело-предшественник, применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00024] В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник представляет собой антитело исходной В-клетки. В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник презентируется на ранней В-клетке как антитело IgM. В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник претерпевает перестройку генных сегментов зародышевой линии перед сменой класса.

[00025] В одном аспекте предложен способ создания вакцины против инфекционного агента в не относящемся к человеку животном, которое содержит гуманизированный иммуноглобулиновый локус, включающий проведение первичной и повторной иммунизации вариантами эпитопа инфекционного агента, при этом эпитоп инфекционного агента связывается с нейтрализующим антителом широкого спектра действия. В одном варианте реализации изобретения первичные и повторные иммунизации вариантами эпитопа инфекционного агента проводят до тех пор, пока не обнаружится вариант, который после иммунизации исходного не относящегося к человеку животного с гуманизированным Ig-локусом приводит к выработке нейтрализующего антитела широкого спектра действия. В одном варианте реализации изобретения вариант, который приводит к выработке нейтрализующего антитела широкого спектра действия, применяют в качестве вакцины против инфекционного агента.

[00026] В одном аспекте предложен способ разработки нейтрализующего антитела широкого спектра действия (BNAb) в не относящемся к человеку животном, содержащем гуманизированный иммуноглобулиновый локус, включающий обработку животного первым структурным вариантом эпитопа иммуногена, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия, создание возможности развития у животного первого иммунного ответа на первый структурный вариант и исследование антител животного для получения нейтрализующего антитела широкого спектра действия против иммуногена. В одном варианте реализации изобретения указанный способ включает обработку животного вторым структурным вариантом эпитопа иммуногена, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия, создание возможности развития у животного второго иммунного ответа и исследование антител животного для получения нейтрализующего антитела широкого спектра действия против иммуногена, при этом иммуноген, первый структурный вариант и второй структурный вариант не являются идентичными.

[00027] В одном аспекте предложен способ использования не относящегося к человеку животного, содержащего гуманизированный иммуноглобулиновый локус, в алгоритме определения немутированного антитела-предшественника, включающий введение не относящемуся к человеку животному первого варианта иммуногена, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия. В одном варианте реализации изобретения в указанном алгоритме применяется количественный анализ на основании числа разных VDJ-комбинаций (приблизительно 10⁹) по сравнению с числом возможных нуклеотидных последовательностей сопоставимой длины (приблизительно 4³⁵⁰). Указанный алгоритм на основании обратного анализа последовательности нейтрализующего антитела широкого спектра действия подбирает наиболее правдоподобного предшественника или предшественников.

[00028] В одном варианте реализации изобретения немутированные предшествующие VDJ определяют путем моделирования скорости соматических мутаций, вероятности того, что заданный нуклеотид будет находиться в мутированных состояниях, и числа пассажей, необходимых для соматической гипермутации. Смотрите, например, Haynes et al. (2012) B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study, Nature Biotech. 30(5): 423-433 (включенную в данный документ посредством ссылки, в частности, смотрите, например, Box 4).

[00029] В одном аспекте предложен способ использования не относящегося к человеку животного с гуманизированным иммуноглобулиновым локусом для оптимизации и валидации иммуногенов для разработки вакцины против инфекционного агента, включающий проведение первичной и повторной иммунизаций представляющим интерес иммуногеном не относящегося к человеку животного для разработки вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки. В одном варианте реализации изобретения проводят первичную и повторную иммунизацию не относящегося к человеку животного первым предварительно выбранным иммуногеном, вторым предварительно выбранным иммуногеном и n-ным предварительно выбранным иммуногеном до тех пор, пока не относящееся к человеку животное не будет экспрессировать антитело широкого спектра действия против инфекционного агента. В одном варианте реализации изобретения первый предварительно выбранный иммуноген, второй предварительно выбранный иммуноген и n-ный предварительно выбранный иммуноген является эффективной вакциной против инфекционного агента. В одном варианте реализации изобретения n-ный означает третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой, восьмой, девятый или десятый.

[00030] В одном аспекте предложен способ создания вакцины, которая вызывает у субъекта-человека выработку нейтрализующего антитела широкого спектра действия против представляющего интерес инфекционного агента, включающий проведение первичной и повторной иммунизации не относящегося к человеку животного, содержащего Ig-локус, вариантами эпитопа инфекционного агента, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия, при этом в процессе первичной и повторной иммунизации применяются варианты эпитопа инфекционного агента, которые не связывают нейтрализующее антитело широкого спектра действия, но приводят к выработке у не относящегося к человеку животного нейтрализующего антитела широкого спектра действия, которое связывает представляющий интерес инфекционный агент.

[00031] В одном аспекте предложен способ создания вакцины, которая вызывает у субъекта-человека выработку антитела широкого спектра действия против представляющего интерес инфекционного агента, включающий определение антитела широкого спектра действия, которое нейтрализует представляющий интерес инфекционный агент, создание вариантов эпитопа, связываемых нейтрализующим антителом широкого спектра действия, до тех пор, пока эффективный вариант не приведет к выработке антитела широкого спектра действия, которое нейтрализует представляющий интерес инфекционный агент, и применение эффективного варианта в качестве вакцины против представляющего интерес инфекционного агента.

[00032] В одном аспекте предложен способ разработки вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки, включающий: (а) иммунизацию не относящегося к человеку животного, которое содержит гуманизированный иммуноглобулиновый локус, представляющим интерес первым иммуногеном, при этом первый представляющий интерес иммуноген содержит множество эпитопов; (b) создание возможности развития у не относящегося к человеку животного иммунного ответа на первый представляющий интерес иммуноген, при этом иммунный ответ включает создание нечеловеческих В-клеток, которые экспрессируют человеческие VDJ тяжелой цепи иммуноглобулина и человеческие VJ-домены легкой цепи иммуноглобулина; (с) выделение из не относящегося к человеку животного клонально родственных В-клеток памяти, которые специфически связывают первый представляющий интерес эпитоп первого представляющего интерес иммуногена; (d) определение данных по VDJ и VJ последовательностям для VDJ и VJ последовательностей В-клеток памяти; (е) применение определенных данных по VDJ и VJ последовательностям для определения VDJ и VJ последовательностей немутированного рецептора В-клеток (BCR) и, необязательно, VDJ и VJ последовательностей одного или более промежуточных предшественников между BCR и В-клеткой памяти; и, (f) создание второго иммуногена с повышенной аффинностью (по сравнению с первым иммуногеном) к BCR и/или промежуточному антителу-предсшественнику, при этом второй иммуноген можно применять в качестве вакцины против представляющего интерес первого иммуногена для субъектов-людей.

[00033] В одном варианте реализации изобретения первый представляющий интерес иммуноген представляет собой или получен из инфекционного агента или патогена. В одном варианте реализации изобретения инфекционный агент или патоген представляет собой вирус, бактерию, грибок или паразита. В одном варианте реализации изобретения инфекционный агент выбран из ВИЧ-1, гепатита С, вируса лихорадки Денге и ВПЧ.

[00034] В одном варианте реализации изобретения первый представляющий интерес иммуноген представляет собой белок или пептид, а второй представляющий интерес иммуноген представляет собой структурный вариант первого представляющего интерес иммуногена. В одном варианте реализации изобретения структурный вариант содержит замещение одной или более аминокислот белка или пептида. В одном варианте реализации изобретения первый иммуноген представляет собой белок с посттрансляционной модификацией (например, гликозилированием или наличием небелковой группы, например, липида), а второй представляющий интерес иммуноген представляет собой вариант посттрансляционной модификации.

[00035] В одном варианте реализации изобретения VDJ получены из человеческого генного сегмента V_H1-69 и человеческого D- и человеческого J-сегмента.

[00036] В одном аспекте предложен способ разработки вакцины против инфекционного агента или патогена, включающий использование не относящегося к человеку животного, которое содержит гуманизированный локус иммуноглобулина, в качестве

[00037] В одном аспекте применяемые в данном тексте нейтрализующие антитела широкого спектра действия представляют собой антитела, которые существуют у субъектов-людей, инфицированных представляющим интерес инфекционным агентом, при этом антитела способны нейтрализовать инфекционный агент в культуре. В одном варианте реализации изобретения антитела способны предотвращать инфицирование клетки, которую указанные инфекционные агенты, как правило, могут инфицировать в отсутствие антител.

[00038] В различных аспектах инфекционный агент или патоген выбран из вируса (например, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), например, ВИЧ-1, штамма вируса гриппа, вируса папилломы человека (ВПЧ), гепатита С, гепатита В, гепатита А, Денге), бактерии, грибка, паразита (например, штамма или вида малярии) и т.д.

[00039] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное, содержащее гуманизированный локус иммуноглобулина, при этом животное иммунизировано вариантом эпитопа инфекционного агента, с которым связывается первое нейтрализующее антитело широкого спектра действия, и при этом животное в результате иммунизации вариантом эпитопа содержит второе нейтрализующее антитело широкого спектра действия, которое нейтрализует тот же самый эпитоп того же самого инфекционного агента, причем второе нейтрализующее антитело широкого спектра действия не является идентичным с первым нейтрализующим антителом широкого спектра действия.

[00040] Предложены композиции и способы для определения иммуногенов для применения в качестве вакцин против инфекционных агентов и для разработки нейтрализующих антител широкого спектра действия против инфекционных агентов, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированный локус иммуноглобулина, который экспрессирует популяцию В-клеток, полученную из полного набора человеческих вариабельных генов тяжелой цепи, функционально связанных с множеством человеческих D-сегментов и с множеством человеческих J-сегментов; при этом вариабельные сегменты функционально связаны с константной областью, например, человеческой или нечеловеческой константной областью в трансгене, или эндогенной нечеловеческой константной областью, функционально связанной в эндогенном нечеловеческом локусе с набором человеческой тяжелой цепи. В различных вариантах реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит полный неперестроенный вариабельный набор человеческой к и/или λ легкой цепи в трансгене, связанном с геном константной области человека или грызуна (например, мыши или крысы), или в эндогенном нечеловеческом локусе легкой цепи, функционально связанном с геном константной области грызуна (например, мыши или крысы).

[00041] Предложены композиции и способы определения иммуногенов для применения в качестве вакцин против инфекционных агентов и для разработки нейтрализующих антител широкого спектра действия против инфекционных агентов, в которых используются не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированный локус иммуноглобулина, который экспрессирует популяцию В-клеток, полученную из не более чем одного или не более чем двух представителей семейства вариабельных областей тяжелой цепи (например, V_H1-69 и/или ее полиморфов; V_H1-2 и/или ее полиморфов), функционально связанных с множеством человеческих D-сегментов и с множеством человеческих J-сегментов; при этом вариабельные сегменты функционально связаны с константной областью, например, человеческой или нечеловеческой константной областью в трансгене, или эндогенной нечеловеческой константной областью, функционально связанной в эндогенном нечеловеческом локусе с ограниченным набором человеческой V_H. В различных вариантах реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит полный неперестроенный вариабельный набор человеческой к и/или к легкой цепи в трансгене, связанном с геном константной области человека или грызуна (например, мыши или крысы), или в эндогенном нечеловеческом локусе легкой цепи, функционально связанном с геном константной области грызуна (например, мыши или крысы).

[00042] Предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные, иммунизированные человеческими инфекционными агентами, при этом не относящиеся к человеку животные содержат неперестроенные сегменты гена вариабельной области человеческого иммуноглобулина, которые способны перестраиваться и образовывать гены, которые кодируют последовательности вариабельной области, функционально связанные с эндогенными нечеловеческими константными областями, а кодируемые последовательностями вариабельные домены специфически связывают инфекционный агент. В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное иммунизировано иммуногеном, который представляет собой вариант иммуногена, который связывает человеческое нейтрализующее антитело широкого спектра действия, например, нейтрализующее антитело широкого спектра действия, выделенное из пациента, инфицированного инфекционным агентом. В одном варианте реализации изобретения иммуноген, которым иммунизировано не относящееся к человеку животное, не является идентичным иммуногену, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия.

[00043] В одном аспекте не относящееся к человеку животное с гуманизированным генным локусом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и гуманизированным генным локусом вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина используют для исследования (или использования в циклах первичных и повторных иммунизаций) иммуногенов для применения в качестве вакцин против человеческих инфекционных агентов или патогенов. В одном варианте реализации изобретения иммуногены получены из, но не идентичны иммуногенам, которые связывают нейтрализующие антитела широкого спектра действия против инфекционного агента или патогена. В одном варианте реализации изобретения идентичность исследуемого иммуногена составляет около 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% или 60% по отношению к иммуногену, который связывает нейтрализующее антитело широкого спектра действия.

[00044] В различных аспектах не относящиеся к человеку животные, содержащие гуманизированный локус иммуноглобулина, содержат, например, вставку одного или более неперестроенных генных V-, D- и J-сегментов человеческой тяжелой цепи и/или неперестроенных генных V- и J-сегментов человеческой легкой цепи, как в трансгене (полностью человеческом или состоящем из человеческой вариабельной и нечеловеческой константной областей), так и функционально связанных с нечеловеческой константной областью в эндогенном нечеловеческом локусе.

[00045] В различных вариантах реализации изобретения генетически модифицированный локус тяжелой цепи содержит эндогенный ген Adam6a, ген Adam6b или их оба, а генетическая модификация не влияет на экспрессию и/или функцию эндогенного гена Adam6a, гена Adam6b или их обоих.

[00046] В различных вариантах реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит эктопически присутствующий ген Adam6a, ген Adam6b или их оба. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6a представляет собой нечеловеческий ген Adam6a. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6a представляет собой мышиный ген Adam6a. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6a представляет собой человеческий ген Adam6a. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6b представляет собой нечеловеческий ген Adam6b. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6b представляет собой мышиный ген Adam6b. В одном варианте реализации изобретения ген Adam6b представляет собой человеческий ген Adam6b.

[00047] В различных вариантах реализации изобретения один или более из неперестроенных генных V-, D- и J-сегментов человеческой тяжелой цепи и/или неперестроенных генных V- и J-сегментов человеческой легкой цепи присутствуют в ограниченном наборе, например, количество человеческих тяжелых и/или легких генных сегментов, присутствующих у не относящегося к человеку животного, меньше, чем полный человеческий набор соответствующих генных сегментов. В различных аспектах человеческие генные сегменты вставлены в эндогенный локус (непосредственным образом или при помощи кассеты, содержащей рекомбиназу), а эндогенные неперестроенные генные сегменты остаются в геноме не относящегося к человеку животного. В конкретном варианте реализации изобретения человеческие генные сегменты вставлены между крайним 3' нечеловеческим генным сегментом и первым нечеловеческим константным геном. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых присутствуют эндогенные нечеловеческие вариабельные генные сегменты, их инактивируют, например, путем инверсии или частичного удаления.

[00048] В одном аспекте не относящееся к человеку животное является грызуном, например, мышью или крысой.

[00049] В одном аспекте не относящееся к человеку животное содержит множество неперестроенных человеческих генных V- и J-сегментов легкой цепи, функционально связанных с константной областью (например, человеческой или нечеловеческой константной областью в эндогенном Ig-локусе или в трансгене), а неперестроенный локус человеческой тяжелой цепи ограничен не более чем одной, или не более чем двумя или не более чем тремя генными сегментами V_H, функционально связанными с одним или более человеческими D-сегментами или с одним или более человеческими J-сегментами в эндогенном Ig-локусе или в трансгене.

[00050] В одном аспекте не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу, которая содержит модификацию в зародышевой линии, которая приводит к тому, что не более чем один, или не более чем два, или не более чем три человеческих генных сегмента V_H являются функционально связанными с множеством человеческих генных D-сегментов и с множеством человеческих генных J-сегментов, при этом мышь или крыса содержит множество неперестроенных человеческих Vκ и Jκ и/или человеческих Vλ, и Jλ, генных сегментов, функционально связанных с человеческим или нечеловеческим геном константной области. В одном варианте реализации изобретения множество неперестроенных человеческих Vκ и Jκ и/или человеческих Vλ, и Jλ генных сегментов функционально связано с эндогенными генами константной области в эндогенном локусе нечеловеческой легкой цепи.

[00051] В одном аспекте предложен способ получения антитела широкого спектра действия против представляющего интерес иммуногена, включающий:

[00052] (а) примирование не относящегося к человеку животного путем введения первого иммуногена, полученного из представляющего интерес антигена, при этом не относящееся к человеку животное содержит:

[00053] (i) генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более человеческих генных сегментов V_H, множество человеческих генных сегментов D_H и множество человеческих J-сегментов, при этом генные сегменты V_H, D_H и J_H функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи,

[00054] (ii) генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более человеческих генных Vκ-сегментов и один или более человеческих генных Jκ-сегментов, при этом генные сегменты Vκ и Jκ функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи, и

[00055] при этом первый иммуноген содержит множество эпитопов;

[00056] (b) создание возможности развития у не относящегося к человеку животного иммунного ответа на первый иммуноген, при этом иммунный ответ включает генерацию нечеловеческих В-клеток, которые экспрессируют последовательности VDJ тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина (IgH) и VJ легкой цепи человеческого иммуноглобулина (IgL);

[00057] (с) выделение клонально родственных В-клеток из не относящегося к человеку животного, которое экспрессирует рецептор В-клеток (BCR), который специфически связывает первый эпитоп первого иммуногена;

[00058] (d) получение аминокислотных последовательностей IgH VDJ и IgL VJ, экспрессируемых рецептором В-клеток (BCR) клонально родственных В-клеток;

[00059] (е) получение из последовательностей IgH VDJ и IgL VJ аминокислотных последовательностей VDJ и VJ немутированного рецептора В-клеток (BCR) и одной или более аминокислотных последовательностей VDJ и VJ промежуточного предшественника рецептора В-клеток (BCR), экспрессируемого В-клетками на промежуточном этапе дифференцировки; и

[00060] (f) разработку множества иммуногенов, которые с повышенной аффинностью связываются с немутированным рецептором В-клеток (BCR) или промежуточным предшественником рецептора В-клеток (BCR);

[00061] (g) усиление иммунного ответа у не относящегося к человеку животного путем введения не относящемуся к человеку животному второго иммуногена, выбранного из множества иммуногенов из (f), при этом второй иммуноген содержит второй эпитоп, отличный от первого эпитопа; и

[00062] (h) получение антитела широкого спектра действия из не относящегося к человеку животного согласно (g).

[00063] В одном варианте реализации изобретения иммунный ответ у не относящегося к человеку животного усиливают путем серийного введения множества иммуногенов, определенных на этапе (е) до тех пор, пока не относящееся к человеку животное не начинает вырабатывать антитело широкого спектра действия.

[00064] В одном варианте реализации изобретения иммунный ответ у не относящегося к человеку животного усиливают путем введения комбинации из множества иммуногенов, определенных на этапе (е).

[00065] В одном варианте реализации изобретения представляющий интерес антиген представляет собой или получен из инфекционного агента или патогена, а антитело широкого спектра действия представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия против инфекционного агента или патогена.

[00066] В одном варианте реализации изобретения инфекционный агент или патоген выбран из группы, состоящей из вируса, бактерии, грибка и паразита.

[00067] В одном варианте реализации изобретения инфекционный агент выбран из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гепатита А, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса лихорадки Денге и вируса папилломы человека (ВПЧ).

[00068] В одном варианте реализации изобретения все или по существу все функциональные эндогенные генные сегменты V_H D_H и J_H в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина были удалены или сделаны нефункциональными, а генетически модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит единичный человеческий генный сегмент V_H или его полиморфный вариант, один или более человеческих генных сегментов D_H и один или более человеческих генных сегментов J_H.

[00069] В одном варианте реализации изобретения генетически модифицированный локус тяжелой цепи содержит эндогенный ген Adam6a, ген Adam6b или их оба, а генетическая модификация в локусе тяжелой цепи не влияет на экспрессию или функцию эндогенного гена Adam6a, гена Adam6b или их обоих.

[00070] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит эктопически присутствующий ген Adam6a, ген Adam6b или их оба.

[00071] В одном варианте реализации изобретения единичный человеческий генный сегмент V_H выбран из группы, состоящей из генных сегментов V_H1-2, V_H1-3, V_H1-8, V_H1-18, V_H1-24, V_H1-45, V_H1-46, V_H1-58, V_H1-69, V_H2-5, V_H2-26, V_H2-70, V_H3-7, V_H3-9, V_H3-11, V_H3-13, V_H3-15, V_H3-16, V_H3-20, V_H3-21, V_H3-23, V_H3-30, V_H3-30-3, V_H3-30-5, V_H3-33, V_H3-35, V_H3-38, V_H3-43, V_H3-48, V_H3-49, V_H3-53, V_H3-64, V_H3-66, V_H3-72, V_H3-73, V_H3-74, V_H4-4, V_H4-28, V_H4-30-1, V_H4-30-2, V_H4-30-4, V_H4-31, V_H4-34, V_H4-39, V_H4-59, V_H4-61, V_H5-51, V_H6-1, V_H7-4-1, V_H7-81 и их полиморфных вариантов.

[00072] В одном варианте реализации изобретения единичный человеческий генный сегмент V_H представляет собой человеческий генный сегмент V_H1-69 или его полиморфный вариант.

[00073] В одном варианте реализации изобретения единичный человеческий генный сегмент V_H представляет собой человеческий генный сегмент V_H1-2 или его полиморфный вариант.

[00074] В одном варианте реализации изобретения единичный человеческий генный сегмент V_H представляет собой человеческий генный сегмент V_H4-59 или его полиморфный вариант.

[00075] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное является грызуном.

[00076] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное является мышью или крысой.

[00077] В одном варианте реализации изобретения нуклеотидная последовательность константной области представляет собой нуклеотидную последовательность человека или грызуна.

[00078] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное является мышью, а нуклеотидная последовательность константной области представляет собой нуклеотидную последовательность константной области мыши.

[00079] В одном варианте реализации изобретения все или по существу все функциональные эндогенные генные сегменты V_H, D_H и J_H в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина были сделаны нефункциональными, а человеческие генные сегменты V_H, D_H и J_H присутствуют в трансгене.

[00080] В одном варианте реализации изобретения человеческие генные сегменты V_H, D_H и J_H функционально связаны с эндогенной нуклеотидной последовательностью константной области в эндогенном нечеловеческом локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

[00081] В одном варианте реализации изобретения генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина содержит замещение всех или по существу всех функциональных генных Vκ-сегментов, генных Jκ-сегментов одним или более человеческими генными Vκ-сегментами и одним или более генными Jκ-сегментами, при этом человеческие генные Vκ-сегменты и генные Jκ-сегменты функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи.

[00082] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Vκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных генных Vκ-сегментов человеческими генными Vκ-сегментами, выбранными из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40 и их комбинаций.

[00083] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Jκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных нечеловеческих генных Jκ-сегментов иммуноглобулина человеческими генными Jκ-сегментами, выбранными из Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 и их комбинаций.

[00084] В одном варианте реализации изобретения один или более из человеческих сегментов Vκ и Jκ функционально связаны с эндогенной нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи в эндогенном нечеловеческом локусе.

[00085] В различных аспектах предложены антитела широкого спектра действия, получаемые любым из описанных в данном документе способов.

[00086] В различных аспектах предложены нейтрализующие антитела широкого спектра действия против инфекционного агента или патогена, получаемые любым из описанных в данном документе способов.

[00087] Далее способы и композиции описаны в приведенном данном документе подробном описании изобретения, включая, без ограничений, дополнительное описание разработки иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки и дополнительное описание не относящихся к человеку животных с гуманизированными иммуноглобулиновыми локусами, которые все можно использовать в сочетании с любым из описанных в данном документе аспектов и вариантов реализации изобретения, если не указано иное или если иное не очевидно из контекста.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[00088] ФИГ. 1 иллюстрирует общие этапы подхода к разработке вакцины на основе В-клеточной линии дифференцировки. На первом этапе Ab1, Ab2, AB3 и Ab4 относятся к четырем разным клональным линиям дифференцировки антител из В-клеток памяти периферической крови, из которых одна или более вырабатывает защитное антитело, которое необходимо индуцировать. Этап 2 включает получение немутированных предшественников (НП) и промежуточных антител (ПА) в клональной линии дифференцировки антител. Этап 3 включает применение (НП) и (ПА) в качестве матриц для разработки иммуногенов с высокой аффинностью связывания НП и ПА. Эта схема иллюстрирует общую схему обратного пути от эпитопа инфекционного агента, который связывает зрелое нейтрализующее антитело широкого спектра действия, до немутированного предшественника В-клетки (например, НП), который связывает примирующий иммуноген. В процессе развития В-клеток НП развивается в ПА, которое связывает антиген для повторной иммунизации, - процесс, который повторяют до получения зрелого нейтрализующего антитела широкого спектра действия. Итеративный процесс дает возможность определить подходящие иммуногены (антигены для первичной и повторной иммунизации), которые могут служить при разработке вакцин для выработки зрелых нейтрализующих антител широкого спектра действия. Смотрите, Haynes et al. (2012) B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study, Nature Biotech. 30(5): 423-433.

[00089] На ФИГ. 2 приведены два типа гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®, которые можно использовать в этом подходе. Верхняя панель: гуманизированная мышь VELOCIMMUNE® с замещением мышиных эндогенных последовательностей (закрашенные символы) человеческими геномными последовательностями (закрашенные символы); нижняя панель: V_H-ограниченная гуманизированная мышь VELOCIMMUNE® с единичным генным сегментом V_H1-9, замещающим все эндогенные мышиные генные сегменты V_H, функционально связанным с человеческими D и человеческим J генными сегментами; для упрощения на панели человеческой V_H1-69 не показан гуманизированный κ-локус. Аналогичным путем можно использовать других V_H-ограниченных гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®.

[00090] На ФИГ. 3А показаны подгруппы нормальных В-клеток иммунных клеток в костном мозге, селезенке и брюшной полости гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® по сравнению с BL/6 мышами дикого типа.

[00091] На ФИГ. 3В показаны подгруппы нормальных В-клеток иммунных клеток в пейеровых бляшках для гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®.

[00092] На ФИГ. 4 показано развитие нормальной Т-клетки и развитие миелоидной клетки иммунных клеток для гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®. Верхняя панель: BL/6 мыши дикого типа; нижняя панель: V_H-ограниченная гуманизированная мышь VELOCIMMUNE® с единичным генным сегментом V_H1-9, замещающим все эндогенные мышиные генные сегменты V_H. T_FH: B220^-TCRβ⁺CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Foxp3^-; T_FR: B220^-TCRβ⁺CD4⁺CXCR5⁺PD-1+Foxp3⁺.

[00093] На ФИГ. 5А показаны плазменные направленные против оболочечных белков ВИЧ-1 ответы гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® на иммунизацию оболочечными АЕ-белками ВИЧ. Белок А244 gp120 (Alam, S.M. et al. (2013) Antigenicity and Immunogenicity of RV144 Vaccine AIDSVAX Clade E Envelope Immunogen Is Enhanced by a gp120 N-Terminal Deletion, J. Virol. 87: 1554-68).

[00094] На ФИГ. 5B показаны плазменные направленные против оболочечных белков ВИЧ-1 ответы гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® на иммунизацию мембранно-проксимальным внешним участком (MPER) gp41 липосомного антигена. Линии на графике, слева направо, представляют мышиное RE506, мышиное RE506, мышиное RE507 и мышиное RE508. Гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® иммунизировали в.б. MPER 656-GTH1 липосомами/R848/оСрg/ липидом А.

[00095] На ФИГ. 6 показана схема липосомно-пептидного иммуногена gp41 MPER (слева), применяемого на ФИГ. 5, содержащего нейтрализующие эпитопы для нейтрализующих антител широкого спектра действия против ВИЧ-1 2F5 и 4Е10 (Dennison, S.M. et al., (2009) Stable Docking of Neutralizing Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp41 Membrane-Proximal External Region Monoclonal Antibodies 2F5 and 4E10 Is Dependent on the Membrane Immersion Depth of Their Epitope Regions, J. Virol, 83: 10211-10223). Верхняя кривая:

[00096] ФИГ. 7 иллюстрирует возможность применения тетрамера В-клетки, соответствующего нейтрализующему эпитопу gp41 2F5 MPER (Verkoczy, L et al. (2009) Functional, Non-Clonal IgM^a-Restricted В Cell Receptor Interactions with the HIV-1 Envelope gp41 Membrane Proximal External Region, PLoS One 4(10): e7215, 2009), для определения и выявления предшественников исходных В-клеток этой линии дифференцировки у преиммунных гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Глоссарий

[00097] Употребляемый в данном документе термин «антитело широкого спектра действия» включает антитела, вырабатываемые В-клетками, которые могут связывать множество эпитопов антигенных детерминант антигена. В одном варианте реализации изобретения антитело широкого спектра действия обладает полиреактивностью, направленной против различных эпитопов или антигенных детерминант. В одном варианте реализации изобретения антитело широкого спектра действия включает аутореактивные антитела, экспрессируемые В-клетками-предсшественниками, незрелыми аутореактивными В-клетками или промежуточными В-клетками.

[00098] Употребляемый в данном документе термин «нейтрализующее антитело широкого спектра действия» включает антитела, вырабатываемые В-клетками, которые нейтрализуют разные штаммы конкретного инфекционного агента или патогена.

[00099] Употребляемый в данном документе термин «немутированное антитело-предшественник» или «НП» включает антитела, экспрессируемые исходной В-клеткой. В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник презентируется на ранней В-клетке как антитело IgM. В одном варианте реализации изобретения немутированное антитело-предшественник претерпевает перестройку генных сегментов зародышевой линии перед сменой класса.

[000100] Употребляемый в данном документе термин «промежуточные антитела» или «ПА» включает антитела, вырабатываемые промежуточными компонентами в клональной линии дифференцировки, генерируемой путем созревания аффинности исходной В-клетки в зародышевом центре.

[000101] Употребляемый в данном документе термин «зародышевый центр» включает локацию в иммунных тканях, в которой дендритные и другие клетки презентируют контактный антиген В-клеток, хелперные Т-клетки осуществляют контакт с В-клетками, после чего происходит смена класса и соматическая гипермутация.

[000102] Способы и композиции, в которых используется разработка иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки в не относящихся к человеку животных, содержащих гуманизированный иммуноглобулиновый локус (например, гуманизированных мышах VELOCIMMUNE®), для итеративной разработки иммуногенов для вакцин от инфекционных заболеваний. Это можно осуществить посредством применения компонентов агента инфекционного заболевания в качестве антиген-специфических меток для определения предшественников защитных антител в неиммунизированных или неинфицированных гуманизированных мышах VELOCIMMUNE® или, применяя такие же реагенты и сходные стратегии для определения иммуноген-индуцированных клональных линий дифференцировки антител против инфекционного агента, которые развиваются в необходимом направлении, и получая затем эти антитела для применения в качестве матриц для итеративной разработки вакцины, конечной целью чего является определение группы новых иммуногенов для того, чтобы сделать субдоминатный или непредпочтительный в ином случае путь созревания В-клеток доминантным, и, таким образом, получить в условиях вакцинации достаточные для защиты уровни антител в плазме крови и тканях.

[000103] Большое количество инфекционных заболеваний характеризуется наличием наружных оболочек или шипов вирионов, к которым можно создавать нейтрализующие антитела, но по разным причинам их создание не является рутинной процедурой. Примеры таких инфекций включают ВИЧ-1, гепатит С, грипп и лихорадку Денге (обзор приведен в Haynes, BF et al. (2012) B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study, Nature Biotech 30: 423-433). Для преодоления многих препятствий в индукции таких защитных противоинфекционных антител была предложена стратегия, названная разработкой иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки, в которой осуществляют выделение клональных линий дифференцировки редких антител, их рекомбинантную экспрессию и применение в качестве матриц для разработки вакцины.

[000104] Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® представляют наиболее оптимальный вариант мышей, несущих гуманизированные Ig-локусы. Полный комплект человеческих генных сегментов V_H, Vκ, D, J_H и Jκ замещает эндогенные локусы. Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® способны к рекомбинации со сменой класса, соматической гипермутации и селекции на основе аффинности в зародышевых центрах - таким образом, они представляют отличную и уникальную модель для быстрой вакцинации или для отбора перед вакцинацией исходных предшественников для применения в разработке иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки для разработки новых иммуногенов в целях создания вакцины против инфекционных агентов. Гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®, которые избирательно экспрессируют ограниченный набор V_H или только одну человеческую V_H (такую как V_H1-69, которая представляет собой только один репрезентативный пример), также можно с успехом применять в этих целях.

[000105] Для разработки иммуногенов для вакцин гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® можно использовать двумя способами. Во-первых, костный мозг преиммунной невакцинированной мыши можно использовать для выделения антиген-специфических исходных В-клеток, которые связываются с антиген-специфическими реагентами инфекционного агента, содержащего нейтрализующие эпитопы широкого спектра действия, выделить антитела, соответствующие рецепторам исходных В-клеток (BCR), и получить их рекомбинантным путем, а иммуногены выбрать на основании их высокой аффинности связывания с этими BCR для определения иммуногенов, которые будут избирательно стимулировать созревание необходимых нейтрализующих линий дифференцировки В-клеток широкого спектра действия в периферических лимфатических узлах и селезенке. Во-вторых, гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® также можно вакцинировать существующими иммуногенами, которые сами по себе являются антигенными по отношению к нейтрализующим антителам широкого спектра действия, которые необходимо индуцировать, затем выделить индуцированные антитела путем получения моноклональных антител из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных мышей, получить антитела рекомбинантным способом, а затем использовать большинство зрелых антител необходимой линии дифференцировки в качестве матрицы для дополнительного стимулирования необходимой линии дифференцировки до полной экспрессии необходимой функции, например, защитной эффекторной функции против инфекционного агента. Защитная функция может включать нейтрализацию вируса, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность против инфицированных инфекционным агентом клеток, предотвращение проникновения инфекционного агента через мукозальный барьер и блокирование попадания инфекционного агента в клетки-мишени.

[000106] Таким образом, описанные процессы позволяют определять иммуногены путем итеративной разработки на основе применения полученных от гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® антител в качестве матриц для компонентов новых вакцин.

[000107] Неудачная иммунизация людей компонентами оболочек или эпитопов человеческого патогена представляет основную проблему в общественном здравоохранении. Иммунная система человека не всегда способна вырабатывать нейтрализующие антитела широкого спектра действия против человеческих патогенов, включая некоторые наиболее клинически значимые патогены. Эти проблемы объясняются множеством причин (обзор приведен в Haynes, B.F. et al. (2012) B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study, Nature Biotech. 30(5): 423-433). Какими бы не были причины, понятно, что существует огромная потребность в улучшенных и более практичных системах для манипуляции с иммунными клетками для разработки большего количества нейтрализующих антител широкого спектра действия против клинически значимых антигенов. В частности, существует огромная потребность в эффективных нечеловеческих системах для управления развитием и разработкой клонов В-клеток.

[000108] Так как антитела получены исключительно из В-клеток, которые (как правило) прошли масштабную селекцию, для разработки подходящих клональных В-клеточных линий, которые экспрессируют нейтрализующие антитела широкого спектра действия, необходимо всестороннее понимание онтогенеза В-клеток и основных моментов развития В-клеток. Таким же важным, как понимание в мельчайших деталях онтогенеза В-клеток, является доступность системы, с которой можно проводить манипуляции, чтобы извлечь преимущества из понимания онтогенеза В-клеток. В данном случае полезными могут оказаться грызуны с гуманизированными иммуноглобулиновыми локусами, которые генерируют В-клетки, экспрессирующие антитела с человеческими последовательностями. На сегодняшний день наилучшей кандидатной системой является гуманизированная мышь VELOCIMMUNE® от Regeneron, которая содержит замещение эндогенного мышиного неперестроенного локуса тяжелой цепи человеческим неперестроенным локусом тяжелой цепи; и замещение эндогенного мышиного неперестроенного κ-вариабельного генного локуса человеческим неперестроенным локусом κ легкой цепи; при этом человеческие неперестроенные локусы функционально связаны с эндогенными мышиными константными областями. Смотрите, например, патент США №7105348, патент США №6596541, заявки на патент США №2007/0061900, 2011/0258710, 2011/0283376, 2012/0322108; которые все включены в данный документ посредством ссылки. Также можно использовать не относящихся к человеку животных с ограниченным локусом тяжелой цепи, например, V_H1-69 мышей; смотрите, например, USSN 13/653456, включенную в данный документ посредством ссылки.

[000109] Предложены композиции и способы для разработки иммуногенов для вакцины с использованием животных, которые содержат гуманизированные иммуноглобулиновые локусы. В процессе разработки вакцин или кандидатных вакцин используют не относящихся к человеку животных (например, грызунов, например, мышей и крыс), которые были генетически модифицированы таким образом, чтобы содержать вариабельные домены человеческого иммуноглобулина и/или человеческие неперестроенные вариабельные генные сегменты тяжелой цепи и неперестроенные вариабельные генные сегменты легкой цепи (например, κ, λ или κ и λ).

Виды не относящихся к человеку животных с гуманизированными иммуноглобулиновыми локусами

[000110] В различных аспектах подходящие гуманизированные не относящиеся к человеку животные для генерации В-клеток для применения в описанных в данном документе способах включают, например, гуманизированных мышей VELOCIMMUNE®, описанных, например, в US 20012/0322108 А1, US 2007/0061900 А1, US 2011/0258710 А1, US 2001/0283376 A1, патенте США №6596541, патенте США №7105248, которые все включены в данный документ посредством ссылки. Другие подходящие не относящиеся к человеку животные включают, например, не относящихся к человеку животных, содержащих ограниченный набор тяжелой цепи, описанных в USSN 13/653456, зарегистрированной 17 октября 2012 г.; а также не относящихся к человеку животных, раскрытых в USSN 61/658466, зарегистрированной 12 июня 2012 г., и USSN 61/663131, зарегистрированной 22 июня 2012; при этом каждая заявка и патент включены в данный документ посредством ссылки.

[000111] Преимущества гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® включают то, что они демонстрируют нормальное использование вариабельной области и множественности J-сегментов, нормальную соматическую гипермутацию, нормальные количества и распределение В-клеток в селезенке и лимфатических узлах, нормальную дифференцировку В-клеток в костном мозге, нормальное аллельное исключение, нормальное соотношение κ:λ, легких цепей, нормальные сывороточные уровни всех изотипов Ig (IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgE, IgA), нормальные иммунные ответы на антигены-мишени и нормальную способность к стабильной генерации, при этом «нормальный» относится к однопометным мышам дикого типа. Большинство, если не все, из этих уникальных характеристик гуманизированных мышей VELOCIMMUNE® важны для оптимальной разработки иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки для разработки вакцин. Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® (с ограниченными или неограниченными вариабельными локусами тяжелой цепи) по меньшей мере частично представляют собой превосходную платформу для разработки иммуногена на основе В-клеточной линии дифференцировки для разработки вакцин, так как они являются прекрасным источником предшественников В-клеток из костной ткани, которые соответствуют исходному человеческому набору, и являются крайне необходимым реагентом для разработки иммуногена (смотрите, например, ФИГ. 1, антитело НА (немутированное антитело)), а также прекрасным источником промежуточных антител-предшественников (смотрите, например, ФИГ. 1, ПА1, ПА2, ПА3), которыми можно легко проводить первичную и повторную иммунизацию для манипуляции с антителами-предшественниками, экспрессирующими человеческие вариабельные домены.

[000112] Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® (те, которые используются в данном изобретении и не содержат ограниченный набор) содержат замещение эндогенных мышиных генных сегментов V, D и J полным человеческим набором функциональных сегментов V, D и J, функционально связанных с мышиным локусом тяжелой цепи. Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® (те, которые используются в данном изобретении и не содержат ограниченный набор) также содержат замещение эндогенных мышиных генных сегментов κ V и J полностью человеческим набором функциональных генных сегментов Vκ и Jκ.

Не относящиеся к человеку животные с ограниченными наборами тяжелой цепи: V_H1-69 и другие

[000113] Гуманизированные мыши VELOCIMMUNE® с ограниченными наборами, например, используемые в данном изобретении V_H1-69 мыши, содержат замещение эндогенного мышиного локуса всех функциональных V-, D- и J-сегментов тяжелой цепи единичным человеческим генным сегментом V_H1-69 (присутствующим без полиморфов), функционально связанным с множеством человеческих D-сегментов и с множеством человеческих J-сегментов, которые функционально связаны с эндогенным мышиным локусом тяжелой цепи иммуноглобулина.

[000114] Мышь с ограниченным репертуаром тяжелой цепи в некоторых обстоятельствах представляет собой удобный инструмент, например, как в данном случае, для создания клональных линий В-клеток, которые можно применять в разработке иммуногена при разработке вакцин, так как хорошо известно, что определенные человеческие генные сегменты демонстрируют повышенную частоту использования против определенных инфекционных агентов или патогенов. [000243] Полученные из V_H1-69 тяжелые цепи наблюдали в большом количестве наборов антиген-специфических антител, имеющих терапевтическую значимость. Например, V_H1-69 часто наблюдали в транскриптах тяжелой цепи набора IgE лимфоцитов периферической крови у маленьких детей с атопическим заболеванием (Bando et al. (2004) Characterization of V_Hε gene expressed in PBL from children with atopic diseases: detection of homologous V_H1-69 derived transcripts from three unrelated patients, Immunology Letters 94: 99-106). Полученные из V_H1-69 тяжелые цепи с высокой степенью соматической гипермутации также встречаются в В-клеточных лимфомах (Perez et al, (2009) Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulin variable genes and frequent use of V_H 1-69 and V_H4-59 segments, British Journal of Dermatology 162: 611-618), при этом некоторые полученные из V_H1-69 тяжелые цепи преимущественно с последовательностями зародышевой линии (т.е. слабой или отсутствующей гипермутацией) наблюдали среди аутоантител у пациентов с заболеваниями крови (Pos et al. (2008) V_H1-69 germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura, Journal of Thrombosis and Haemostasis 7: 421-428).

[000115] Кроме того, было обнаружено, что в нейтрализующих антителах против вирусных антигенов, таких как ВИЧ, грипп и гепатит С (HCV) используются зародышевые и/или соматически мутированные полученные из V_H1-69 последовательности (Miklos et al., (2000) Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin V_H genes show frequent use of V_H1-69 with distinctive CDR3 features, Blood 95(12): 3878-3884; Kunert et al. (2004) Characterization of molecular features, antigen-binding, and in vitro properties of IgG and IgM variants of 4E10, an anti-HIV type I neutralizing monoclonal antibody, Aids Research and Human Retroviruses 20(7): 755-762; Chan et al. (2001) V_H1-69 gene is preferentially used by hepatitis С virus-associated В cell lymphomas and by normal В cells responding to the E2 viral antigen, Blood 97(4): 1023-1026; Carbonari et al, (2005) Hepatitis С virus drives the unconstrained monoclonal expansion of V_H1-69-expressing memory В cells in type II cryoglobulinemia: A model of infection-driven lymphomagenesis, Journal of Immunology 174: 6532-6539; Wang и Palese (2009) Universal epitopes of influenza virus hemagglutinins?, Nature Structural & Molecular Biology 16(3): 233-234; Sui et al. (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses, Nature Structural & Molecular Biology 16(3): 265-273; Marasca et al. (2001) Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use of V_H1-69 and V_H4-34 Segments in Hepatitis С Virus-Positive and Hepatitis С Virus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma, Am. J. Pathol. 159(1): 253-261).

[000116] При этом выше были перечислены только неограничивающие примеры не относящихся к человеку животных, которых можно использовать в качестве платформы для создания В-клеточных клонов. Для генерации В-клеточных популяций также можно использовать других гуманизированных грызунов, включая системы, которые используют полностью человеческие трансгены или химерные человеческие вариабельные/нечеловеческие константные трансгены, при этом не относящиеся к человеку животные могут представлять собой мышей, крыс или других не относящихся к человеку животных, например, других грызунов. Кроме того, подходящие гуманизированные не относящиеся к человеку животные могут содержать полный или частичный набор генных сегментов тяжелой и/или легкой цепей. В различных аспектах все, что требуется, это способность не относящегося к человеку животного к развитию В-клеточного клона, экспрессирующего вариабельный домен, который является нейтрализующим и имеет широкий спектр действия (или связывает представляющий интерес патоген с преимущественно необходимыми характеристиками, например, высокой авидностью, высокой специфичностью и т.д.), который может дополнительно развиваться для демонстрации необходимых характеристик.

[000117] Таким образом, описанные в данном документе не относящиеся к человеку животные (например, грызуны, например, мыши или крысы) применимы в способах разработки вакцин против человеческих патогенов на основе способов с применением В-клеточной линии дифференцировки, описанных в данном документе.

[000118] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное (например, грызун, например, мышь или крыса), содержащее модифицированный эндогенный нечеловеческий локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий замещение всех функциональных генных V-сегментов единичным человеческим генным V-сегментом (или единичным человеческим генным V-сегментом, присутствующим в виде множества полиморфных форм или числа копий), при этом нечеловеческий локус тяжелой цепи иммуноглобулина неспособен к перестройке для образования вариабельного гена тяжелой цепи, который получен из генного V-сегмента, отличного от единичного человеческого генного V-сегмента (или одной из полиморфных форм или копий).

[000119] В одном варианте реализации изобретения единичный человеческий генный V-сегмент представляет собой V_H1-69. В одном варианте реализации изобретения единичный человеческий генный V-сегмент представляет собой V_H1-2.

[000120] В одном варианте реализации изобретения локус содержит по меньшей мере один человеческий или нечеловеческий генный сегмент D_H и один человеческий или нечеловеческий генный сегмент J_H. В конкретном варианте реализации изобретения локус содержит человеческий генный сегмент D_H и человеческий генный сегмент J_H. В конкретном варианте реализации изобретения локус содержит человеческий генный сегмент J_H. В другом конкретном варианте реализации изобретения локус содержит человеческий генный сегмент V_H1-69 (присутствующий в виде единичной копии или множественных копий разных полиморфных вариантов), все функциональные человеческие генные сегменты D_H и все функциональные человеческие генные сегменты J_H. В другом конкретном варианте реализации изобретения локус содержит человеческий генный сегмент V_H1-2 (присутствующий в виде единичной копии или множественных копий разных полиморфных форм), все функциональные человеческие генные сегменты D_H и все функциональные человеческие генные сегменты J_H. В одном варианте реализации изобретения человеческие генные сегменты V, D и J (или генные сегменты V и J) функционально связаны с мышиным геном константной области в эндогенном мышином локусе тяжелой цепи. В конкретном варианте реализации изобретения мышиный локус тяжелой цепи содержит набор дикого типа мышиных последовательностей константной области иммуноглобулина.

[000121] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное (например, грызун, например, мышь или крыса), содержащее модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит набор V-сегмента тяжелой цепи, ограниченный в отношении идентичности V-сегмента, и который содержит один или более D-сегментов и один или более J-сегментов или один или более J-сегментов. В одном варианте реализации изобретения V-сегмент тяжелой цепи представляет собой человеческий сегмент. В одном варианте реализации изобретения один или более D-сегментов представляют собой человеческие D-сегменты. В одном варианте реализации изобретения один или более J-сегментов представляют собой человеческие J-сегменты. В одном варианте реализации изобретения один или более D-сегментов и один или более J-сегментов представляют собой человеческие D-сегменты и человеческие J-сегменты.

[000122] В одном варианте реализации изобретения модифицированный локус представляет собой нечеловеческий локус. В одном варианте реализации изобретения нечеловеческий локус модифицирован по меньшей мере одной последовательностью человеческого иммуноглобулина.

[000123] В одном варианте реализации изобретения существует ограничение одним представителем семейства V-сегментов. В одном варианте реализации изобретения один представитель семейства V-сегментов присутствует в двух или более копиях. В одном варианте реализации изобретения один представитель семейства V-сегментов присутствует в виде двух или более вариантов (например, двух или более полиморфных форм представителя семейства V-сегментов). В одном варианте реализации изобретения один V-сегмент является представителем человеческого семейства V-сегментов. В одном варианте реализации изобретения один представитель семейства V-сегментов присутствует в большом количестве вариантов, которые наблюдаются в человеческой популяции в отношении этого варианта.

[000124] В одном варианте реализации изобретения существует ограничение одним человеческим генным сегментом V_H1-69. В одном варианте реализации изобретения человеческий генный сегмент V_H1-69 присутствует в двух или более копиях. В одном варианте реализации изобретения человеческий генный сегмент V_H1-69 присутствует в виде двух или более вариантов (например, двух или более полиморфных форм человеческого гена V_H1-69). В одном варианте реализации изобретения человеческий генный сегмент V_H1-69 присутствует в большом количестве вариантов, которые наблюдаются в человеческой популяции в отношении человеческого генного сегмента V_H1-69.

[000125] В одном варианте реализации изобретения существует ограничение одним человеческим генным сегментом V_H1-2. В одном варианте реализации изобретения человеческий генный сегмент V_H1-2 присутствует в двух или более копиях. В одном варианте реализации изобретения человеческий генный сегмент V_H1-2 присутствует в виде двух или более вариантов (например, двух или более полиморфных форм человеческого гена V_H1-2). В одном варианте реализации изобретения человеческий генный сегмент V_H1-2 присутствует в большом количестве вариантов, которые наблюдаются в человеческой популяции в отношении человеческого генного сегмента V_H1-2.

[000126] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное, содержащее гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит единичный функциональный человеческий V-сегмент.В одном варианте реализации изобретения единичный функциональный человеческий V-сегмент выбран из сегментов V_H1-2, V_H1-3, V_H1-8, V_H1-18, V_H1-24, V_H1-45, V_H1-46, V_H1-58, V_H1-69, V_H2-5, V_H2-26, V_H2-70, V_H3-7, V_H3-9, V_H3-11, V_H3-13, V_H3-15, V_H3-16, V_H3-20, V_H3-21, V_H3-23, V_H3-30, V_H3-30-3, V_H3-30-5, V_H3-33, V_H3-35, V_H3-38, V_H3-43, V_H3-48, V_H3-49, V_H3-53, V_H3-64, V_H3-66, V_H3-72, V_H3-73, V_H3-74, V_H4-4, V_H4-28, V_H4-30-1, V_H4-30-2, V_H4-30-4, V_H4-31, V_H4-34, V_H4-39, V_H4-59, V_H4-61, V_H5-51, V_H6-1, V_H7-4-1 и V_H7-81. В одном варианте реализации изобретения единичный функциональный человеческий V-сегмент представляет собой сегмент V_H1-69; в конкретном варианте реализации изобретения единичный функциональный человеческий V-сегмент присутствует в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 полиморфных формах, которые можно обнаружить в человеческой популяции. В одном варианте реализации изобретения единичный функциональный человеческий V-сегмент представляет собой сегмент V_H1-2; в конкретном варианте реализации изобретения единичный функциональный человеческий V-сегмент присутствует в 1, 2, 3, 4 или 5 полиморфных формах, которые можно обнаружить в человеческой популяции.

[000127] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный набор генных V-сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом не относящееся к человеку животное дополнительно содержит один или более человеческих вариабельных сегментов к легкой цепи иммуноглобулина (Vκ). В одном варианте реализации изобретения один или более Vκ-сегментов функционально связаны с одним или более человеческими J-сегментами. В конкретном варианте реализации изобретения J-сегменты представляют собой человеческие Jκ-сегменты. В другом конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное не экспрессирует λ легкую цепь иммуноглобулина. В другом конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное не содержит функциональный человеческий или функциональный эндогенный вариабельный локус λ легкой цепи иммуноглобулина.

[000128] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное является грызуном. В одном варианте реализации изобретения грызун выбран из мыши и крысы.

[000129] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Vκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных Vκ-сегментов одним или более функциональными человеческими Vκ-сегментами. В дополнительном конкретном варианте реализации изобретения замещение осуществляют при помощи всех или по существу всех функциональных человеческих Vκ-сегментов иммуноглобулина.

[000130] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Vκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных генных Vκ-сегментов человеческими генными Vκ-сегментами, выбранными из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40 и их комбинаций.

[000131] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Jκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных нечеловеческих Jκ-сегментов иммуноглобулина одним или более функциональными человеческими Jκ-сегментами иммуноглобулина. В дополнительном конкретном варианте реализации изобретения замещение осуществляют при помощи всех или по существу всех функциональных человеческих Jκ-сегментов иммуноглобулина.

[000132] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Jκ-локусе всех или по существу всех функциональных эндогенных нечеловеческих генных Jκ-сегментов иммуноглобулина человеческими JK-сегментами, выбранными из Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 и их комбинаций.

[000133] В конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит набор V-сегментов, состоящий преимущественно из единичного V-сегмента и/или его полиморфных вариантов. В одном варианте реализации изобретения единичный V-сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой человеческий сегмент V_H1-69, а не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение всех функциональных нечеловеческих D_H-сегментов функциональными человеческими D_H-сегментами и дополнительно содержит замещение всех функциональных нечеловеческих J_H-сегментов функциональными человеческими J_H-сегментами, при этом локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связан с человеческой или нечеловеческой генной последовательностью константной области. В конкретном варианте реализации изобретения генная последовательность константной области является эндогенной нечеловеческой генной последовательностью константной области. В конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное перестраивает сегменты в нечеловеческом локусе тяжелой цепи иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую человеческую последовательность V_H1-69, человеческую последовательность D_H, человеческую последовательность J_H и мышиную последовательность константной области.

[000134] В конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит набор V-сегментов, состоящий преимущественно из единичного V-сегмента и/или его полиморфных вариантов. В одном варианте реализации изобретения единичный V-сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой человеческий сегмент V_H1-2, а не относящееся к человеку животное дополнительно содержит замещение всех функциональных нечеловеческих D_H-сегментов функциональными человеческими D_H-сегментами и дополнительно содержит замещение всех функциональных нечеловеческих J_H-сегментов функциональными человеческими J_H-сегментами, при этом локус вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина функционально связан с человеческой или нечеловеческой генной последовательностью константной области. В конкретном варианте реализации изобретения генная последовательность константной области является эндогенной нечеловеческой генной последовательностью константной области. В конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное перестраивает сегменты в нечеловеческом локусе тяжелой цепи иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую человеческую последовательность V_H1-2, человеческую последовательность D_H, человеческую последовательность J_H и мышиную последовательность константной области.

[000135] В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное, содержащее ограниченный набор V-сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом при этом не относящееся к человеку животное содержит один или более человеческих вариабельных сегментов λ легкой цепи (Vλ). В одном варианте реализации изобретения один или более Vλ-сегментов функционально связаны с одним или более человеческими J-сегментами. В конкретном варианте реализации изобретения J-сегменты представляют собой человеческие Jλ-сегменты. В другом конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное не экспрессирует к легкую цепь. В другом конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное не содержит функциональный человеческий или функциональный вариабельный локус к легкой цепи.

[000136] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всего или по существу всего функционального нечеловеческого иммуноглобулина.

[000137] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных нечеловеческих Vλ-сегментов иммуноглобулина одним или более функциональными человеческими Vλ-сегментами иммуноглобулина. В дополнительном конкретном варианте реализации изобретения замещение осуществляют при помощи всех или по существу всех функциональных человеческих Vλ-сегментов иммуноглобулина.

[000138] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных нечеловеческих Vλ-сегментов фрагментом кластера А человеческого локуса λ легкой цепи. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент кластера А человеческого локуса λ легкой цепи содержит человеческие генные сегменты Vλ, от Vλ3-27 до Vλ3-1.

[000139] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных нечеловеческих Vλ-сегментов фрагментом кластера В человеческого локуса λ легкой цепи. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент кластера В человеческого локуса λ легкой цепи содержит человеческие генные сегменты Vλ от Vλ5-52 до Vλ1-40.

[000140] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных нечеловеческих Vλ-сегментов фрагментом кластера А и фрагментом кластера В человеческого локуса λ легкой цепи, при этом результат замещения содержит человеческие генные сегменты Vλ от Vλ5-52 до Vλ3-1.

[000141] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных нечеловеческих Vλ-сегментов по меньшей мере 12 человеческими генными сегментами Vλ, по меньшей мере 28 человеческими генными сегментами Vλ или по меньшей мере 40 человеческими генными сегментами Vλ.

[000142] В одном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит замещение всех или по существу всех функциональных нечеловеческих генных Jλ-сегментов иммуноглобулина одним или более функциональными человеческими генными Jλ-сегментами иммуноглобулина. В дополнительном конкретном варианте реализации изобретения замещение осуществляют при помощи всех или по существу всех функциональных человеческих генных Jλ-сегментов иммуноглобулина. В различных вариантах реализации изобретения функциональные человеческие генные Jλ-сегменты включают Jλ1, Jλ2, Jλ3 и Jλ7.

[000143] В конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное содержит локус вариабельной области тяжелой цепи (V_H) иммуноглобулина, который содержит только единичный V_H-сегмент, при этом единичный V_H-сегмент представляет собой человеческий сегмент V_H1-69 или человеческий сегмент V_H1-2, и дополнительно содержит замещение всех функциональных нечеловеческих D_H-сегментов функциональными человеческими D_H-сегментами, и дополнительно содержит замещение всех функциональных нечеловеческих J_H-сегментов функциональными человеческими J_H-сегментами, при этом локус V_H-области функционально связан с человеческой или нечеловеческой генной последовательностью константной области. В конкретном варианте реализации изобретения генная последовательность константной области является нечеловеческой генной последовательностью константной области, например, эндогенной нечеловеческой константной генной последовательностью. В конкретном варианте реализации изобретения не относящееся к человеку животное перестраивает сегменты в нечеловеческом локусе тяжелой цепи иммуноглобулина с образованием гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую человеческую последовательность V_H1-69 (или человеческую последовательность V_H1-2), человеческую последовательность D_H, человеческую последовательность J_H и эндогенную нечеловеческую последовательность константной области.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ скрининга антитела широкого спектра действия против представляющего интерес антигена из патогена, который представляет собой ВИЧ, вирус гриппа или вирус гепатита С, включающий: (а) введение первого иммуногена, полученного из представляющего интерес антигена, мыши из линии мышей, содержащей в своей зародышевой линии: (i) ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий единичный человеческий неперестроенный генный сегмент V_H, который является человеческим генным сегментом V_H1-69 или его полиморфным вариантом, один или более человеческих генных сегментов D_H и один или более человеческих генных сегментов J_H функционально связанных с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи, (ii) генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более человеческих генных сегментов Vκ и один или более человеческих генных сегментов Jκ, причем генные сегменты Vκ и Jκ функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи, и при этом первый иммуноген содержит множество эпитопов; (b) создание у мыши возможности развития иммунного ответа на первый иммуноген, при этом иммунный ответ включает генерацию В-клеток мыши, которые экспрессируют последовательности VDJ тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина (IgH) и последовательности VJ легкой цепи человеческого иммуноглобулина (IgL); (c) выделение клонально родственных В-клеток из мыши, которая экспрессирует рецептор В-клеток (BCR), который специфически связывает первый эпитоп первого иммуногена; (d) определение аминокислотных последовательностей VDJ IgH и VJ IgL указанного рецептора В-клеток (BCR) клонально родственных В-клеток; (e) получение из последовательностей VDJ IgH и VJ IgL аминокислотных последовательностей VDJ и VJ немутированного рецептора В-клеток (BCR); и одной или более аминокислотных последовательностей VDJ и VJ промежуточного предшественника рецептора В-клеток (BCR) указанных В-клеток на промежуточном этапе дифференцировки; (f) обеспечение множества вторых иммуногенов, содержащих вторые эпитопы, отличные от первого эпитопа, которые с повышенной аффинностью связываются с немутированным рецептором В-клеток (BCR) или промежуточным предшественником рецептора В-клеток (BCR) по сравнению с первым иммуногеном; (g) серийное введение другой мыши указанной линии вторых иммуногенов, выбранных из множества вторых иммуногенов со стадии (f), серийное введение, начиная со второго иммуногена, в немутированный BCR и далее вторых иммуногенов в промежуточные BCR последовательно более удаленные филогенетически от немутированного BCR; и (h) определение, включает ли иммунный ответ у мыши со стадии (g) антитело широкого спектра действия, которое связывает множество вторых эпитопов. Изобретение позволяет получить эффективный способ скрининга антител. 10 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ скрининга антитела широкого спектра действия против представляющего интерес антигена из патогена, который представляет собой ВИЧ, вирус гриппа или вирус гепатита С, включающий:

(а) введение первого иммуногена, полученного из представляющего интерес антигена, мыши из линии мышей, содержащей в своей зародышевой линии:

(i) ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий единичный человеческий неперестроенный генный сегмент V_H, который является человеческим генным сегментом V_H1-69 или его полиморфным вариантом, один или более человеческих генных сегментов D_H и один или более человеческих генных сегментов J_H, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи,

(ii) генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий один или более человеческих генных сегментов Vκ и один или более человеческих генных сегментов Jκ, причем генные сегменты Vκ и Jκ функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи, и при этом первый иммуноген содержит множество эпитопов;

(b) создание у мыши возможности развития иммунного ответа на первый иммуноген, при этом иммунный ответ включает генерацию В-клеток мыши, которые экспрессируют последовательности VDJ тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина (IgH) и последовательности VJ легкой цепи человеческого иммуноглобулина (IgL);

(c) выделение клонально родственных В-клеток из мыши, которая экспрессирует рецептор В-клеток (BCR), который специфически связывает первый эпитоп первого иммуногена;

(d) определение аминокислотных последовательностей VDJ IgH и VJ IgL указанного рецептора В-клеток (BCR) клонально родственных В-клеток;

(e) получение из последовательностей VDJ IgH и VJ IgL аминокислотных последовательностей VDJ и VJ немутированного рецептора В-клеток (BCR); и одной или более аминокислотных последовательностей VDJ и VJ промежуточного предшественника рецептора В-клеток (BCR) указанных В-клеток на промежуточном этапе дифференцировки;

(f) обеспечение множества вторых иммуногенов, содержащих вторые эпитопы, отличные от первого эпитопа, которые с повышенной аффинностью связываются с немутированным рецептором В-клеток (BCR) или промежуточным предшественником рецептора В-клеток (BCR) по сравнению с первым иммуногеном;

(g) серийное введение другой мыши указанной линии вторых иммуногенов, выбранных из множества вторых иммуногенов со стадии (f), серийное введение, начиная со второго иммуногена, в немутированный BCR и далее вторых иммуногенов в промежуточные BCR последовательно более удаленные филогенетически от немутированного BCR; и

(h) определение, включает ли иммунный ответ у мыши со стадии (g) антитело широкого спектра действия, которое связывает множество вторых эпитопов.

2. Способ по п. 1, в котором первый и второй иммуногены со стадий (а) и (g) вводят в виде липосомального комплекса.

3. Способ по п. 1, в котором представляющий интерес антиген представляет собой или получен из инфекционного агента или патогена, и антитело широкого спектра действия представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия против инфекционного агента или патогена.

4. Способ по п. 1, в котором все или по существу все функциональные эндогенные генные сегменты V_H, D_H и J_H в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина были удалены или сделаны нефункциональными.

5. Способ по п. 4, в котором

ограниченный локус тяжелой цепи иммуноглобулина содержит эндогенный ген Adam6a, ген Adam6b или оба, и генетическая модификация в локусе тяжелой цепи не влияет на экспрессию или функцию эндогенного гена Adam6a, гена Adam6b или их обоих; или в котором мышь содержит эктопически присутствующий ген Adam6a, ген Adam6b или оба.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором нуклеотидная последовательность константной области тяжелой или легкой цепи представляет собой нуклеотидную последовательность человека или грызуна.

7. Способ по любому из пп. 1-5, в котором нуклеотидная последовательность константной области представляет собой нуклеотидную последовательность константной области мыши.

8. Способ по любому из пп. 1-5, в котором человеческие генные сегменты V_H, D_H и J_H функционально связаны с эндогенной нуклеотидной последовательностью константной области в эндогенном нечеловеческом локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

9. Способ по любому из пп. 1-5:

(а) в котором генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина содержит замещение всех или по существу всех функциональных генных сегментов Vκ и генных сегментов Jκ одним или более человеческими генными сегментами Vκ и одним или более человеческими генными сегментами Jκ, при этом человеческие генные сегменты Vκ и человеческие генные сегменты Jκ функционально связаны с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи; и/или

(b) в котором мышь содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Vκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных генных сегментов Vκ человеческими генными сегментами Vκ, выбранными из группы, состоящей из Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, Vκ2-40 и их комбинации; и/или

(c) в котором мышь содержит замещение в эндогенном нечеловеческом Jκ-локусе иммуноглобулина всех или по существу всех функциональных эндогенных нечеловеческих генных сегментов Jκ иммуноглобулина человеческими генными сегментами Jκ, выбранными из Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 и их комбинаций.

10. Способ по п. 9, в котором один или более из человеческих сегментов Vκ и Jκ функционально связаны с эндогенной нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи в эндогенном нечеловеческом локусе.

11. Способ по любому из пп. 1-5, в котором все или по существу все функциональные эндогенные генные сегменты V_H, D_H и J_H в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина становятся нефункциональными, и человеческие генные сегменты V_H, D_H и J_H присутствуют в трансгене.