Способ повышения термостойкости желатина при модификации его флавоноидами Российский патент 2018 года по МПК A61K38/00 A61K31/352 

Настоящее изобретение относится к способам повышения термостойкости биообъектов (желатина) с использованием флавоноидов (дигидрокверцитина и арабиногалактана) и может быть использовано для изготовления биомедицинских клеточных продуктов. Необходимость повышения термостойкости желатина связана с требованиями к термостабильности биомедицинских клеточных продуктов.

Желатин - перспективный структурный компонент биомедицинских клеточных продуктов, способный образовывать подложки для различных клеточных линий /1, Ji S and Guvendiren М (2017) Recent Advances in Bioink Design for 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Front. Bioeng. Biotechnol. 5:23. doi: 10.3389/fbioe.2017.00023/.

Существенное ограничение использования желатина, заключается в его низкой термостабильности, приводящей к нарушению структуры даже при незначительном повышении температуры образца. Имеющиеся способы повышения термостойкости желатина, заключаются в использовании химических веществ, таких как формальдегид или глутаровый альдегид (2, Ai Н, Mills D.K., Jonathan A.S. et al. Gelatin-glutaraldehyde cross-linking on silicone rubber to increase endothelial cell adhesion and growth. In Vitro Cell.Dev.Biol. - Animal (2002) 38:487. doi: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO;2; 3, Yue, K. et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials (2015) 73, 254-271. doi:https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.045/.

В связи с этим, можно выделить следующие недостатки этих способов:

1. Токсичность указанных альдегидов для клеток, что существенно затрудняет применение подобных образцов в биомедицинских клеточных продуктах.

2. Необходимость глубокой очистки полученных образцов желатина от остатков альдегидов для снижения уровня цитотоксичности.

3. Отсутствие стандартных процедур применения химических модификаторов, в частности альдегидов, для повышения термостабильности желатина при его использовании в качестве компонентов биомедицинских клеточных продуктов.

Дигидрокверцетин - биологический флавоноид, используемый в медицинской и косметологической области /4, Л.С. Коренеева, В.А. Доровских и др. Эффективность применения дигидрокверцетина при экспериментальной гипергликемии. Дальневосточный медицинский журнал (2009) №1, 90-92/. При этом, существуют научные данные о способности дигидрокверцетина образовывать химические сшивки между отдельными волокнами коллагена, повышая стойкость последнего к химическим и физическим факторам /5, Yu.V. Shatalin, V.S. Shubina. A New Material Based on Collagen and Taxifolin: Preparation and Properties. Biophysics (2015) 3, №60; 474-478/. Это позволяет предположить подобный эффект дигидрокверцетина на молекулы желатина, так как он является продуктом гидролиза коллагена. Помимо этого, дигидрокверцетин - сильный антиоксидант /6, Л.Р. Якупова, В.Р. Хайрулилина и др. Антиокислительная активность флавоноидов коры лиственницы сибирской. Башкирский химический журнал (2007) 14, №1; 51-54/, что является его преимуществом среди других химических модификаторов в связи с возможным дополнительным цитопротективным эффектом. Однако дигидрокверцетин имеет низкие показатели растворимости в нейтральных по pH растворов, что затрудняет его использование с клеточными культурами. Данное ограничение позволяет обойти добавление к дигидрокверцетину арабиногалактана, способствующего повышению гидрофильности смеси /7. Пат. 2421215. Композиция с повышенной фармакологической активностью на основе дигидрокверцетина и растительных полисахаридов (варианты) /Душкин А.В., Метелева Е.С., Тихонов В.П. и др. Зарегистрированный в государственном реестре Российской Федерации 15 апреля 2010 г./

В результате проведенного патентно-информационного поиска ближайший аналог выявлен не был.

Задачей изобретения является создание способа повышения термостойкости желатина без использования цитотоксичных веществ.

Сущность изобретения заключается в приготовлении раствора 20% желатина, смешивании его в объеме 10 мл с 1 мл 10% раствора дигидрокверцетина и арабиногалактана (весовое соотношение сухих веществ - 1:3) в объемном соотношение растворов - 9:1, приготовленного на изотоническом растворе NaCl. Полученный после смешивания раствор помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 22°С и влажности воздуха 55-75%.

Способ получения модифицированного желатина осуществляют следующим образом. Приготавливают раствор №1 - 20% желатина на изотоническом растворе NaCl, после чего помещают его на 30 минут в термостат с температурой 56°С для ускорения растворения вещества. Приготавливают раствор №2 - 10% раствор дигидрокверцетина и арабиногалактана (весовое соотношении сухих веществ - 1:3) на изотоническом растворе NaCl. После полного растворения желатина, его раствор охлаждают до комнатной температуры (22-23°С). Производят смешивание раствора №1 и раствора №2 в объемном соотношении 9:1. Полученный после смешивания раствор помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 22°С и влажности воздуха 55-75%, что позволяет добиться полимеризации желатина. Избытки раствора №2, не вступившие в химическую реакцию, удаляются путем двукратного промывания образца физиологическим раствором после полимеризации желатина.

Изобретение основано на экспериментальных исследованиях термостойкости образцов желатина. Способ был отработан в серии экспериментальных работ, основанных на изучении разложения желатина и его модификаций при комнатной температуре (22-23°С) и при 37°С. Получены следующие данные: в исследованиях термостойкости желатина и его модификаций при 37°С, 20% раствор желатина начинал свое растворение на 60±5 секунд, полное разложение 130±10,5 секунд; 20% раствор желатина с добавленным 10% раствором дигидрокверцетина (объемное соотношение 9:1) - начало растворения 85±6,3 секунды, полное разложение 167±8,3 секунды. 20% раствор желатина с добавлением композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана - начало растворения 98±7 секунд, полное разложение 190±9,1 секунда. Статистическая значимость полученных результатов оценивалась параметрическим методом с использованием t-критерий Стьюдента при p<0,01. Выявлены достоверные различия времени начала растворения и времени полного растворения образцов 20% желатина и образцов 20% желатина, модифицированных 10% раствором композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана, что свидетельствует о повышении термостойкости желатина при его модификации композицией дигидрокверцетина и арабиногалактана. При этом отличия между образцами с использованием дигидрокверцетина и дигидрокверцетина и арабиногалактана также статистически значимы, что свидительствует о положительном влиянии добавления арабиногалактана на термостойкость желатина. Также исследовалась термостойкость желатина и модифицированного желатина при комнатной температуре (22-23°С). Полученные результаты следующие: термостабильность 20% раствора желатина - 14±0,3 часа, термостабильность 20% раствора желатина, модифицированного 10% раствором дигидрокверцетина (объемное соотношение 9:1) - 27±1,5 часов, термостабильность 20% раствора желатина, модифицированного 10% раствором композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана - 36±2,2 часа. Данные результаты статистически значимы при p<0,01 при использовании параметрического метода с применением t-критерий Стьюдента.

Технический результат от использования способа - повышение термостабильности желатина при применении композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана (весовое соотношение 1:3) с возможным цитопротективным действием, что может быть использовано для создания биомедицинских клеточных продуктов, например, органотипической структуры печени для изучения токсикологических свойств потенциальных лекарственных молекул.

Литература

1. Ji S and Guvendiren М (2017) Recent Advances in Bioink Design for 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Front. Bioeng. Biotechnol. 5:23. doi: 10.3389/fbioe.2017.00023.

2. Ai H, Mills D.K., Jonathan A.S. et al. Gelatin-glutaraldehyde cross-linking on silicone rubber to increase endothelial cell adhesion and growth. In Vitro Cell.Dev.Biol. - Animal (2002) 38:487. doi: 10.1290/1071-2690(2002)038<0487:GCOSRT>2.0.CO.

3. Yue, K. et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials (2015) 73, 254-271. doi: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.045.

4. Л.С. Коренеева, B.A. Доровских и др. Эффективность применения дигидрокверцетина при экспериментальной гипергликемии. Дальневосточный медицинский журнал (2009) №1, 90-92.

5. Yu.V. Shatalin, V.S. Shubina. A New Material Based on Collagen and Taxifolin: Preparation and Properties. Biophysics (2015) 3, №60; 474-478.

6. Л.Р. Якупова, B.P. Хайрулилина и др. Антиокислительная активность флавоноидов коры лиственницы сибирской. Башкирский химический журнал (2007) 14, №1; 51-54.

7. Пат. 2421215. Композиция с повышенной фармакологической активностью на основе дигидрокверцетина и растительных полисахаридов (варианты) / Душкин А.В., Метелева Е.С., Тихонов В.П. и др. Зарегистрированный в государственном реестре Российской Федерации 15 апреля 2010 г.

Изобретение относится к биомедицине, а именно к повышению температурной стабильности желатина при изготовлении клеточных продуктов. Способ повышения термостойкости желатина при модификации его смесью дигидрокверцетина и арабиногалактана, включающий смешивание 20% раствора желатина с 10% раствором дигидрокверцетина и арабиногалактана, при весовом соотношении дигидрокверцетина и арабиногалактана 1:3, при этом растворы приготовлены на изотоническом растворе NaCl и смешаны в объемном соотношении растворов 9:1, далее смесь помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 22°С и влажности воздуха 55-75%. Вышеописанный способ позволяет эффективно повысить термостойкость желатина.

Способ повышения термостойкости желатина при модификации его смесью дигидрокверцетина и арабиногалактана, включающий смешивание 20% раствора желатина с 10% раствором дигидрокверцетина и арабиногалактана, при весовом соотношении дигидрокверцетина и арабиногалактана 1:3, при этом растворы приготовлены на изотоническом растворе NaCl и смешаны в объемном соотношении растворов 9:1, далее смесь помещают в чашку Петри на 30 минут при температуре 22°С и влажности воздуха 55-75%.