СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОВЫШЕНИЯ ПОРИСТОСТИ ЖЕЛАТИНА ПУТЕМ МОДИФИКАЦИИ ЕГО РИБОЗОЙ И ХЛОРИДОМ НАТРИЯ Российский патент 2022 года по МПК C09H5/00 C07C47/12 

Настоящее изобретение относится к биомедицине, а именно к способам улучшения физических свойств и повышения пористости желатина для изготовления биомедицинских клеточных продуктов.

В настоящее время желатин является одним из основных естественных материалов, который используется для создания структурных компонентов матрикса большинства биомедицинских клеточных продуктов. Это связано с его способностью переносить значительные физические нагрузки и хорошей совместимостью с биологическими объектами (Deo K, Singh K, Peak C, Alge D, Gaharwar A. Bioprinting 101: Design, Fabrication, and Evaluation of Cell-Laden 3D Bioprinted Scaffolds. Tissue Eng Part A. 2020; 26(5-6): 318-338. doi:10.1089/ten.TEA.2019.0298).

Основной недостаток использования чистого желатина для этих целей заключается в низкой термостабильности и ферментативной устойчивости, что приводит к потере структурных свойств желатина даже при незначительном повышении температуры или при воздействии малого количества гидролитических ферментов. Повышение пористости желатина позволяет заселять в ограниченном объеме желатина большее число клеток. Сегодня существуют различные способы повышения термостабильности, ферментативной устойчивости и пористости желатина.

В результате проведенного патентно-информационного поиска были обнаружены ряд аналогов. Так был найден способ повышения термостабильности желатина с помощью 1% раствора глутарового альдегида (Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baharvand, H., & Daemi, H. (2018). Chemical crosslinking of biopolymeric scaffolds: Current knowledge and future directions of crosslinked engineered bone scaffolds. International Journal of Biological Macromolecules, 107, 678–688, doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.08.184). Способ показал себя эффективным для повышения механических свойств желатина за счет сшивания желатина путем Шифф-реакции, однако для данного способа необходима длительная процедура промывки ввиду токсичности глутарового альдегида.

Прямым аналогом является патент РФ № 2687559. Способ включает смешивание 20% раствора желатина с 0,1% раствором глутарового альдегида, приготовленных на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде, в объемном соотношение растворов 9:1 соответственно, с последующей инкубацией смеси в течение 30 минут при температуре 4°С и экспозиции смеси в чашке Петри в течение 30 минут при температуре 37°С и влажности воздуха 50-70%. Предлагаемый способ позволяет получить модифицированный желатин, обладающий повышенной температурной стойкостью более трех дней.

Недостатками способа являются использование высокотоксичного вещества для модификации желатина, необходимость тщательной промывки от избытка глутарового альдегида.

Также был найден патент US №5834232A. Патент включает в себя несколько способов модификации желатина и коллагена путем добавления трансглутаминазы. Так для получения модифицированного желатина был приготовлен раствор №1: смешать лиофилизат человеческого фактора роста XIII A2 димера, содержащего 13.2 мг фактора XIII, 0.66 мкмоль этилендиаминтетрауксусной кислоты, 6.60 мкмоль глицина и 0.13 г бычьей сыворотки, с 1 мл дистиллированной воды. Далее приготовить раствор №2: 10% по весу водный раствор желатина телячьей кожи типа A оставить при температуре 37⁰С до полного растворения желатина, затем желатин оставить на ночь при температуре 4°C, после поместить на 2 часа в условия комнатной температуры, после чего снова растворить при температуре 37° и смешать с 4% по весу раствором CaCl2 в Трис-буфере (25 мкмоль Трис, pH 7.4, 120 ммоль NaCl, 0.2% NaN3). Полученный раствор распределить по 1-мл пробиркам. Далее в каждую пробирку добавить по 1 мг раствора №1 и 10 единиц бычьей сыворотки. Пробирки инкубировать при температуре 27° C до полного перехода смеси из состояния геля в жидкое, величину вязкости измерять каждые 290 минут. По результатам измерений был сделан вывод, что полученный модифицированный желатин обладает высокой термостабильностью и ферментативной устойчивостью. Однако необходимость использования бычьей сыворотки увеличивает время и стоимость каждого приготовления модифицированного желатина.

Технический результат от использования способа:

1. Возможность создать устойчивый к ферментам в течение 285 минут и повышенным температурам в течение 1 недели скаффолд с сохранением его 3D архитектоники.

2. Низкая стоимость реагентов: хлорида натрия и рибозы.

3. Простота способа: протокол приготовления модифицированного желатина не требует специального дорогостоящего оборудования.

Рибоза представляет собой моносахарид, хорошо растворимый в воде и способный при незначительном температурном воздействии входить в реакцию Майяра с полипептидами (Wattanachant, S., Muhammad, K., Mat Hashim, D., & Rahman, R. A. Effect of crosslinking reagents and hydroxypropylation levels on dual-modified sago starch properties. Food Chemistry. 2003; 80(4): 463–471. doi:10.1016/S0308-8146(02)00314-X). На примере исследования рыбьего желатина было показано, что полипептиды после реакции Майяра имеют более крепкие ковалентные связи, что повышает их термостабильность и ферментативную устойчивость (Kchaou, H., Benbettaïeb, N., Jridi, M., Abdelhedi, O., Karbowiak, T., Brachais, C.-H. Enhancement of structural, functional and antioxidant properties of fish gelatin films using Maillard reactions. Food Hydrocolloids. 2018; 83: 326–339. doi:10.1016/j.foodhyd.2018.05.011). Данный эффект можно экстраполировать на пищевой желатин, поскольку он также является продуктом гидролиза коллагена.

Для создания высокой пористости в желатине существуют несколько способов. Наиболее эффективным показал себя способ выщелачивания, в котором в качестве соли чаще всего используется хлорид натрия, который при добавлении в желатин в концентрации выше 25% от массовой доли, подвергается перекристаллизации. После вымывания избытка хлорида натрия из пространств, ранее занятых частицами NaCl, образуется множество макро- и микропор (Lee S., Kim Y., Chong M., Hong S., Lee Y. Study of gelatin-containing artificial skin V: fabrication of gelatin scaffolds using a salt-leaching method. Biomaterials. 2005; 26(14): 1961-1968. doi:10.1016/j.biomaterials.2004.06.032).

Способ получения модифицированного желатина осуществляют следующим образом.

Приготавливают 20% раствор желатина, смешивают его с рибозой до достижений 4,5% ее содержания в смеси и добавлением хлорида натрия в весовом соотношении 2:1 соответственно, после чего смесь помещается на 72 часа в термостат при температуре 50°С. После инкубирования образцы промывают в дистиллированной воде в течение 48 часов.

Изобретение было проверено в нескольких экспериментах, основанных на изучении пористости, термостабильности и ферментативной устойчивости при температуре 37⁰С раствора желатина и его следующих модификаций: желатин 20%; желатин и глутаровый альдегид с хлоридом натрия в соотношении 9:1; желатин и рибоза с массовой долью рибозы 4,5% с хлоридом натрия в весовом соотношении 2:1; 3:1; 9:1; 10:1 соответственно; желатин и рибоза с массовой долью рибозы 4,5%.

Оценка пористости производилась на основе данных сканирующей электронной микроскопии. Путем оценки размера пор в образцах было выявлено, что наибольший размер пор достигнут в модификации желатин 20% и рибоза 4,5% с хлоридом натрия 2:1 (фиг.).

Сканирующая электронная микроскопия, разрешение 400 мкм. Выявлены многочисленные поры со средним диаметром 63,3 мкм.

Эксперименты по изучению термостабильности желатина и его модификаций при 37°С (таблица 1) показали статистически значимое (ANOVA, p<0,05, α<0,05, F=180,6, Fкр=4,8) повышение времени начала растворения желатина в модификации желатин 20% и рибоза 4,5% с хлоридом натрия 2:1.

Эксперименты по изучению ферментативной устойчивости желатина и его модификаций при 37°С (таблица 2) показали статистически значимое (ANOVA, p<0,05, α<0,05, F=69,9, Fкр=4,9) повышение времени начала растворения желатина и статистически значимое (ANOVA, p<0,05, α<0,05, F=123,7, Fкр=4,9) повышение времени его полного растворения в модификации желатин 20% и рибоза 4,5% с хлоридом натрия 2:1.

Таблица 1. Оценка термостабильности желатина разных модификаций

Вид модификации желатина Время начала растворения (мин) Время окончания растворения (мин) Желатин 20% 40 75 Желатин 20% + глутаровый альдегид 2,5% и хлорид натрия 9:1 73 более 20160 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 2:1 97 10080 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 3:1 75 10080 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 9:1 68 10080 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 10:1 60 10080 Желатин 20% + рибоза 4,5% 10080 более 20160

Таблица 2. Оценка ферментативной устойчивости желатина

разных модификаций

Вид модификации желатина Время начала растворения (мин) Время окончания растворения (мин) Желатин 20% 30 57 Желатин 20%+ глутаровый альдегид 2,5% и хлорид натрия 9:1 67 10080 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 2:1 45 285 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 3:1 26 50 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 9:1 25 40 Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 10:1 22 33 Желатин 20% + рибоза 4,5% 113 10080

Изобретение относится к области биомедицины, а именно к повышению температурной стабильности и ферментативной устойчивости желатина при изготовлении клеточных продуктов. В частности, описывается способ повышения пористости, термостойкости и ферментативной устойчивости желатина путем модификации его рибозой и хлоридом натрия, который включает в себя смешивание 20% раствора желатина с рибозой до 4,5% содержания рибозы и добавление к полученной смеси хлорида натрия в соотношении 2:1 соответственно с дальнейшей инкубацией смеси на 72 часа при температуре 50°С и промывкой в дистиллированной воде в течение 48 часов. Технический результат - увеличение ферментоустойчивости и термостабильности скаффолда с сохранением его 3D-архитектоники по недорогой и простой технологии. 1 ил., 2 табл.

Способ повышения пористости, термостабильности и ферментативной устойчивости желатина при модификации его рибозой и хлоридом натрия, включающий смешивание 20% раствора желатина с рибозой до 4,5% весового содержания рибозы и добавление к полученной смеси хлорида натрия в количестве по отношению к массе смеси 2:1 с дальнейшей инкубацией смеси в течение 72 часов при температуре 50°С и промывкой в дистиллированной воде в течение 48 часов.