Бесклеточная культуральная жидкость на основе штамма Bacillus subtilis, консервант для силоса и полифункциональное средство для растений с фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 A01N63/02 A61K35/742 C12R1/125 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии при применении штамма Bacillus subtilis 3Н [RU 2067616, опубл. 10.10.96], основы препарата-пробиотика «Бактиспорин» [RU 2130316, опубл. 20.05.1999], при этом являющимся также антагонистом патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных, а также продуцентом гидролитических ферментов (амилазы, протеазы, целлюлазы) и литических ферментов, а также бесклеточной культуральной жидкости на его основе.

В настоящее время препараты на основе живых бактерий рода Bacillus, находят широкое применение в различных областях. Поскольку эти бактерии вырабатывают большой спектр антибиотических веществ, они используются в качестве пробиотиков в медицине и ветеринарии (БАКТИСПОРИН [RU 2130316, опубл. 20.05.1999], СПОРОЛАКТ [RU 2035186, опубл. 20.05.1995], СПОРОБАКТЕРИН [WO 8909607, опубл. 19.10.1989], СУБАЛИН [RU 2035185, опубл. 31.01.1992], БИОСПОРИН [SU1722502, опубл. 30.03.19], лечебно-профилактических кормовых добавках (МОНОСПОРИН, ЦЕЛЛОБАКТЕРИН, БАЦЕЛЛ), а также в составе биофунгицидов для защиты растений от болезней (ФИТОСПОРИН [RU 2099947, опубл 25.12.1997].

В связи с выработкой большого набора гидролитических ферментов обосновано их применение в пищевой промышленности в качестве биологически активных добавок (далее - БАД), содержащих ферменты растительного или микробного происхождения (БАКТИСТАТИН), и применение в сельском хозяйстве в качестве силосных заквасок (БИОТРОФ).

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 (RU 2298032, опубл. 27.04.2007), выделенный в естественных условиях в микробиологической лаборатории ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Штамм проявляет широкий спектр антагонистической активности, низкую адгезивную активность, иммуномодулирующую активность, продуцирует комплекс гидролитических ферментов, таких как липаза, протеаза, амилаза.

Штамм Bacillus subtilis 3Н известен как антагонист возбудителей заболеваний желудочно-кишечного тракта у человека и предложен в качестве основы препарата-пробиотика «Бактиспорин» для лечения дисбактериоза у людей [RU 2067616, опубл. 10.10.1996, RU 2130316, опубл. 23.01.1997].

Однако применение штамма Bacillus subtilis 3Н и получаемой на его основе культуральной жидкости может быть гораздо шире благодаря сочетанию у штамма ряда полезных свойств.

Дальнейшие исследования свойств штамма показали, что штамм обладает способностью к выработке широкого круга гидролитических ферментов, в том числе целлюлазы, амилазы, протеазы, а также внеклеточных литических ферментов.

Гидролитические ферменты, способствующие расщеплению питательных субстратов и усвоению кормов, играют важную роль в обмене веществ у сельскохозяйственных животных. В настоящее время в условиях промышленного содержания животных и ускоренного роста высокопородистых рас и кроссов, у промышленных видов животных и птицы отмечается выраженная ферментопатия (недостаточный уровень выработки пищеварительных ферментов).

В связи с вышеизложенным большое значение имеет наличие продукции гидролитических ферментов у штаммов бактерий Bacillus subtilis, входящих в состав разрабатываемых кормовых добавок, как на основе бактериальной массы, так и на основе бесклеточной культуральной жидкости, содержащей внеклеточные метаболиты, в том числе гидролитические ферменты и другие биологические вещества.

Проблемой, которую решает настоящее изобретение, является выявление у штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н свойств по продуцированию ферментов и антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных, и получение бесклеточной культуральной жидкости на его основе для создания средств, обладающих биологической активностью.

Решение технической проблемы достигается тем, что у штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н выявлены свойства продуцента литических и гидролитических ферментов, таких как амилаза, протеаза, целлюлаза, и антагониста в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных. Штамм Bacillus subtilis 3Н депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России, г. Москва, под регистрационным номером В-12758. Дата депонирования 10.01.2017 г.

Решение технической проблемы достигается также тем, что у бесклеточной культуральной жидкости, полученной отделением клеточной массы из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758, выявлены свойства антагониста в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и животных, а также амилолитическая, протеолитическая и целлюлозолитическая активность.

Бесклеточную культуральную жидкость получают отделением клеточной массы посредством центрифугирования культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 при 6000 об/мин в течение 20 минут.

Бесклеточная культуральная жидкость применима в качестве полифункционального средства для растений, обладающего фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами. Возможно применение бесклеточной культуральной жидкости в качестве консерванта для силоса.

Штамм В. subtilis 3Н получен в результате селекции штамма Bacillus subtilis 534 (основы препарата-пробиотика Споробактерин) на устойчивость к антибиотику рифампицину сотрудниками НИИВС им. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат» г. Уфа. Штамм Bacillus subtilis 3Н проявляет устойчиость к антибиотикам: рифампицину, стрептомицину, пенициллину, линкомицину, обладает антагонистической активностью в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: подавляет рост стафилококков, протея, патогенной кишечной палочки, сальмонелл, шигелл, дрожжевых грибов, стрептококков и синегнойной палочки. Идентификация штамма проведена сотрудниками НИИВС им. Мечникова ГУЛ «Иммунопрепарат», г. Уфа, путем изучения морфологических, культуральных, биохимических свойств штамма согласно «Определителю бактерий Берджи» М.: Мир, 1997. Bacillus subtilis 3Н - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. Хорошо растут на простых питательных средах. На мясопептонном агаре, среде Гаузе №2 культура растет в виде шероховатой пленки беловато-бежевого цвета или образует единичные шероховатые колонии розовато-бежевого цвета с фестончатыми краями. Может образовывать до 20% гладких белых или прозрачных колоний.

На мясопептонном бульоне культура растет в виде беловатой пленки и придонного осадка, вызывая незначительное помутнение среды. Оптимальная температура для роста микроба (37±1)°С.

Штамм продуцирует протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Ферментирует глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, маннит без образования газа, мальтозу, не ферментирует лактозу. Гидролизует крахмал, казеин, мочевину, не расщепляет тирозин, утилизирует цитрат, образует аммиак и сероводород, не образует индол. Не растет в анаэробных условиях. Штамм Bacillus subtilis 3Н - невирулентен, нетоксичен и нетоксигенен.

Для изучения уровня гидролитических ферментов, вырабатываемых популяцией штамма Bacillus subtilis 3Н в процессе своего роста, провели выращивание биомассы в ферментере с отбором культуральной жидкости по часам выращивания. Культуральная жидкость штамма Bacillus subtilis 3Н содержала бактериальные клетки, метаболиты и остатки питательной среды. Для отделения экзометаболитов от клеточной бактериальной массы проводили центрифугирование культуральной жидкости при 6000 об/мин в течение 20 минут, таким образом, получали «культуральный супернатант» или бесклеточную культуральную жидкость.

Выращивание биомассы бактерий штамма Bacillus subtilis 3Н проводили методом периодического гомогенного глубинного культивирования на жидкой полусинтетической питательной среде, содержащей соли и пептон, в условиях аэрации и перемешивания. Выращивание проводили в течение 20 часов при температуре 37°С.

Проводили исследования уровня накопления гидролитических ферментов по часам культивирования в культуральной жидкости и бесклеточном культуральном супернатанте.

Для изучения целлюлозолитической активности из фильтровальной бумаги (источник целлюлозы) нарезают полоски размером 1,5×10 см, полоски взвешивают.

В каждую пробирку с культуральной жидкостью или культуральным супернатантом (источником фермента целлюлазы) по часам культивирования помещали полоски фильтровальной бумаги и инкубировали при 37°С в течение 24 ч.

После 24-часовой инкубации извлекали полоски фильтровальной бумаги, промывали, высушивали и взвешивали. По потере в весе полосок фильтровальной бумаги определяли целлюлозолитическую активность культуральной жидкости (Н.В. Курилов, Н.А. Севастьянова, В.Н. Коршунов и др. Изучение пищеварения у жвачных. Методические указания, Боровск, 1979, С. 64).

Данные по изучению уровня целлюлозолитической активности культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н и бесклеточной культуральной жидкости, полученной в процессе гомогенного глубинного культивирования на полусинтетической среде с пептоном, представлены в табл.1 и 2.

*3а единицу целлюлозолитической активности принимали снижение веса бумаги на 0,001 г. Испытания каждого образца культуральной жидкости проводили в трех повторностях.

Как показали проведенные исследования, целлюлозолитическая активность культурального супернатанта не ниже значений культуральной жидкости, содержащей бактерии. Таким образом, целлюлозолитические ферменты являются экзометаболитами бактерий штамма и культуральный супернатант можно использовать в кормовых пробиотических добавках.

С целью изучения продукции протеазы использовали агаризованный 2% раствор казеина на 0,1 М трис -НС1 буфере (ph 7-8).

Буфер подогревали до 55°С и смешивали в равных объемах с расплавленным раствором 2% агара, охлажденного до той же температуры. Полученный казеиновый агар разливали в условиях стерильности по 10 мл в стерильные чашки Петри и остужали. После застывания агара, делали лунки металлическим пробойником с диаметром 7 мм и вносили в лунку культуральную жидкость, содержащую метаболиты штамма вместе с бактериальными клетками, или бесклеточную культуральную жидкость штамма Bacillus subtilis и инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-24 часов. По окончанию инкубации в чашки наливали по 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и наблюдали в течение 3 мин за появлением прозрачных зон гидролиза вокруг посевов штамма бактерий в агаре. Результаты исследований представлены в табл.3.

Как показали проведенные исследования, в бесклеточной культуральной жидкости содержатся протеолитические ферменты в том же количестве, что и в культуральной жидкости, содержащей бактерии.

С целью изучения продукции амилазы штаммом бактерий Bacillus subtilis 3Н, готовили картофельный агар и разливали в чашки Петри.

Для этого, картофель промывали, нарезали ломтиками, заливали водой из расчета 130 г на 1 л воды, кипятили 30 мин, фильтровали и к фильтрату добавляли 20 г агара и 2 г натрия хлористого. Нагревали фильтрат, помешивая стеклянной палочкой до полного расплавления агара, разливали в пробирки по 10 мл, укупоривали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали в автоклаве 30 мин при 110°С.

Готовый картофельный агар разливали по 10 мл в стерильные чашки Петри. После застывания агара стерильным пробойником вырезали лунки размером 7 мм в диаметре и вносили культуральную жидкость штамма бактерий Bacillus subtilis или культуральный супернатант. Инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-24 часов.

После инкубации в чашки вносили по 5 мл 10% раствор йода и оценивали прозрачную зону гидролиза крахмала ферментом амилазой (табл. 4).

Как показали проведенные исследования, в бесклеточной культуральной жидкости содержатся амилолитические ферменты в том же количестве, что и в культуральной жидкости, содержащей бактерии.

Выработка гидролитических ферментов бактериями штамма Bacillus subtilis 3Н, способствуют улучшению обмена веществ у животных, поэтому могут увеличивать привесы при использовании культуральной жидкости штамма или его бесклеточного культурального супернатанта.

Провели исследования по оценке влияния культуральной жидкости (далее - к/ж) и культурального супернатанта (далее - к/с) штамма Bacillus subtilis 3Н на массу тела у мышей при пероральном введении.

Постановка опыта: мышам вводили «к/ж» и «к/с» (иначе - препарат) перорально по 0,2 мл препарата в течение 5 суток. Последующие 5 суток мышам препарат не вводили.

Вес измеряли групповым методом трехкратно: исходный вес (до начала ввода препарата), через 5 суток (по окончании ввода препарата) и через 10 суток (конец испытаний).

- привес 5 мышей в группе за 5 суток (разница веса мышей в исходном состоянии и после приема препарата);

5 суток - ежедневный прием препарата;

Последующие 5 суток без введения препарата (эффект последействия)

К1, К2 - контрольные группы - назначение физиологического раствора. Данные представлены в табл. 5.

Как следует из полученных данных, пероральное введение культуральной жидкости (к/ж) и культурального супернатанта (к/с) штамма Bacillus subtilis 3Н повышало привесы у мышей. Культуральный супернатант положительно влиял на обмен веществ даже в большей степени нежели культуральная жидкость, возможно в виду того, что бесклеточный супернатант не вызывает напряжения иммунитета у животных, которое способны оказать бактерии.

Поскольку штамм бактерий Bacillus subtilis 3Н предлагался к использованию в медицине (RU 2130316, опубл. 20.05.1999) не было проведено изучение спектра его антагонистической активности на возбудителей заболеваний у животных и на фитопатогенные штаммы грибов и бактерий, вызывающие заболевания растений. С целью изучения возможности использования штамма Bacillus subtilis 3Н в составе биологических фунгицидов, проведено изучение его антагонистической активности в отношении фитопатогенных возбудителей заболеваний у растений (табл. 6) и животных (табл. 7).

Исследование 20-часовой бактериальной культуральной жидкости штамма В. subtilis 3Н осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей по диагонали в центре чашки Петри с агаризованной картофельно-глюкозной средой. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельно-глюкозной средой без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов испытания культуральной жидкости штамма представлены в табл.6, 7.

Для изучения наличия литических ферментов в бесклеточном культуральном супернатанте штамма Bacillus subtilis 3Н провели испытания к/с в отношении тест-штаммов патогенных бактерий и грибов. Испытания проводили на чашках с картофлельно-глюкозным агаром, в котором пробойником диаметром 7 мм, делалось 2 ряда лунок по 3 лунки в каждом ряду с расстоянием между рядами 5 см.

В каждую чашку между лунками сеяли штрихом тест штаммы, в лунки с двух краев штриха помещали культуральный супернатант штамма. В контрольных чашках в лунки помещали физиологический раствор. Помещали чашки в термостат при 37°С. Учет результатов по грибным тест-штаммам проводили через 48-72 ч инкубирования, по бактериальным тест-штаммам - через 18-24 часа. Результат оценивали по величине зоны отсутствия роста тест-культур между 2 лунками. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельно-глюкозной средой без «к/с» исследуемого штамма. Полное отсутствие роста соответствовало - 50 мм зоны задержки роста.

Из данных табл. 6 следует, что штамм В. subtilis 3Н и культуральный супернатант (внеклеточные метаболиты) на его основе обладают широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающих заболевания растений и могут применяться в составе биофунгицидов и биобактериоцидов для защиты растений от заболеваний.

Из данных табл. 7 следует, что штамм В. subtilis 3Н и культуральный супернатант (внеклеточные метаболиты) на его основе обладают широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающих заболевания у животных, и могут быть использованы в составе ветеринарных препаратов - пробиотиков или пробиотических лечебно-профилактических кормовых добавках.

Для оценки влияния «к/ж» и «к//с» штамма В. subtilis 3Н на микробиоценоз кишечника животных, проведено изучение перорального введения 20 часовой культуральной жидкости, содержащей 0,6×10⁹ клеток/ бактерий в объеме 0,5 мл и 20 часового бесклеточного культурального супернатанта в дозе 0,5 мл. Бесклеточный культуральный супернатант (к/с) содержал только внеклеточные метаболиты штамма и не содержал живых бактерий.

Влияние «к/ж» и «к/с» штамма В. subtilis 3Н на микробиоценоз кишечника изучалось на группах по 10 белых опытных крыс, которых в течение 30 дней поили «к/ж» и «к/с» штамма В. subtilis 3Н в дозе по 0,5 мл на 1 крысу однократно. 10 контрольных животных получали адекватный объем физиологического раствора. Перед началом исследований и по окончании опыта фекалии животных в виде разведений в соответствии МУ (Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника. Метод. Рекомендации. Сост. проф. Р.В. Эпштейн-Литвак, д-р мед. наук Ф.Л. Вильшанская; М-во здравоохранения РСФСР, Гл. упр. НИИ и координации науч. исследований. - Москва: [б.и.], 1977) высевались на селективные и дифференциально-диагностические среды для определения основных групп микроорганизмов, обитающих в кишечнике. Данные по исследованию микробиоценоза кишечника представлены в табл. 8 и 9.

Из данных табл. 8 и 9 следует, что применение «к/ж» и «к/с» штамма В. subtilis 3Н у животных вызывает нормализацию кишечной микрофлоры у крыс опытной группы: увеличивается на порядок содержание бифидо- и лактобактерий, снижается количество условно-патогенной микрофлоры, в том числе стафилококков, энтерококков и дрожжеподобных грибов.

Таким образом можно заключить, что как бактериальная суспензия штамма В. subtilis 3Н, так и его бесклеточная культуральная жидкость (внеклеточные метаболиты штамма) проявляет пробиотические свойства. Поэтому можно использовать как культуру штамма В. subtilis 3Н, так и его метаболиты, содержащиеся в бесклеточной культуральной жидкости для создания пробиотических препаратов, кормовых добавок и силосных заквасок.

Таким образом, исходя из полученных, данных можно использовать штамм В. subtilis 3Н и его бесклеточную культуральную жидкость (внеклеточные метаболиты штамма) по новому назначению: в составе биофунгицидов и биобактерицидов в растениеводстве, в составе ветеринарных пробиотиков в ветеринарии, в составе лечебно-профилактических кормовых добавках и силосных заквасок в животноводстве, и в составе биологически активных добавок на основе внеклеточных метаболитов штамма.

Пример 1. Пример использования штамма В. subtilis 3Н в качестве консерванта для силоса.

Для изучения способности культуры штамма В. subtilis 3Н к силосованию, были поставлены модельные опыты по силосованию измельченной кукурузы. Для опытов использовали 20-часовую культуральную жидкость штамма В. subtilis 3Н и 20-часовой бесклеточный культуральный супернатант штамма В. subtilis 3Н. Опыт проводили в 3-х литровых банках в сравнении с известным консервантом для силоса - Биотроф 111.

Исходное сырье для силосования сырье получено в Чишминском районе Башкирии. Зеленая масса была измельчена, разложена тонким слоем на бумаге. По технологии применения Биотрофа 111, производили предварительное разведение консервантов в 600 раз (0,1 мл + 60 мл воды). Из раствора брали 5 мл консерванта разведенного и вносили в 45 мл воды. В распылитель наливали изучаемый консервант и опрыскивали из распылителя в дозе 0,1 мл на 1 кг зеленой массы (по технологии).

Зеленую массу закладывали в 3-х литровые банки. Каждый вариант закладки опыта с препаратом проводили в 3-х повторностях. Банки закрывали полиэтиленовыми крышками и помещали в темное место без прямого солнечного света.

Через 1 месяц определяли основные показатели качества силоса из заложенных вариантов согласно ГОСТ 23638-90 «Силос из зеленых растений». Данные приведены в таблице №10.

Как следует из полученных результатов, применение культуральной жидкости штамма В. subtilis 3Н в качестве консерванта для силоса не уступает по эффективности Биотрофу 111 и даже несколько превосходит его по показателям качества, при использовании культуральной жидкости В. subtilis 3Н с концентрацией микробных клеток 1×10⁸ кл/мл. Использование бесклеточного культурального супернатанта показывает чуть меньшую эффективность, чем культуральная жидкость, но также показатели лучше контроля и препарата «Биотроф».

Пример 2. Пример использования культуральной жидкости и бесклеточного культурального супернатанта штамма В. subtilis 3Н в качестве биофунгицида и ростстимулятора на проростках пшеницы.

Биологическю эффективность штамма В. subtilis 3Н подавлять инфекцию и стимулировать рост растений оценивали на проростках пшеницы методом рулонов (ГОСТ 12044-93).

Для проведения опыта использовали зерна мягкой яровой пшеницы сорта «Омская 35». Эффективность действия определили при проращивании обработанных культуральной жидкостью и бесклеточным культуральным супернатантом семян во влажных рулонах фильтровальной бумаги и полиэтилена.

Для определения биологической эффективности действия рулонным методом отобрали по 155 семян (50 семян в 3-х повторах) для каждого опыта.

Для проращивания семян использовали 1 слой увлажненной фильтровальной бумаги шириной 15 см и длиной 110 см. Семена пшеницы сорта «Омская 35» обрабатывают 54 мкл воды и исследуемыми препаратами. Время обработки 2 часа.

Полиэтиленовые рулоны стерилизуют 70%-ным спиртом. На этикетке записывают название культуры, сорта, номер опыты, дату закладки образца. Сверху кладут увлажненную фильтровальную бумагу, с правого края для возгонки воды используют полоску фильтровальной бумаги шириной 3 мм.

Семена пшеницы раскладывают в одну линию с интервалом 1 (2) см и на расстоянии 2-3 см от верхнего и боковых краев бумаги зародышами вниз.

Разложенные на бумаге семена накрывают такой же полоской увлажненной фильтровальной бумаги и сворачивают в рулон. Рулоны ставят вертикально в контейнеры с водой и помещают в термостат при температуре 22°С-25°С на 5 дней. При проращивании семян не допускают подсыхания рулонов. Затем рулоны выставляют на светоплощадку на 2 дня.

Спустя неделю после постановки опыта снимают следующие морфометрические показатели (вносят эти параметры в соответствующие таблицы):

а) длина корешка; б) длина ростка; в) количество корешков.

На основании фитоэкспертизы определяется суммарная инфекция, степень зараженности семян головневыми болезнями, уровень поражения проростков корневыми гнилями фузариозной или гельминтоспориозной этиологии.

Биологическая эффективность применения фунгицидов оценивается снижением количества пораженных растений степени поражения органов растения и снижением развития болезни. Учет процента развития болезни и степени повреждения растений проводят согласно принятым методикам.

Для расчета процента пораженных растений (распространенность болезни) пользуются формулой:

где p - распространенность болезни (%), П - количество больных растений в пробе, N - общее количество растений в пробе.

Расчет процента пораженных растений или их органов проводят при учете эффективности применения фунгицидов в борьбе с болезнями, которые обуславливают гибель растений или тех его частей, которые составляют урожай (головня, корневые гнили, увядание).

Для определения биологической эффективности при проведении обработок против заболеваний, которые приводят к снижению урожая в зависимости от интенсивности их проявления (пятнистости, налеты) вначале ведут расчет степени развития болезни по формуле 2:

где R - процент развития болезни, Σ а × б - сумма произведений числа растений на соответствующий им балл (%) поражения, N - общее количество учетных растений, листьев, плодов и т.д., К - наивысший балл (%) шкалы, по которой проводилась оценка поражений.

Расчет процента снижения пораженных растений (биологическая эффективность) возбудителями болезней на обработанных фунгицидами участках по отношению к контролю проводят по формуле 3.

где Бэф. - биологическая эффективность фунгицидов в процентах; Рк - показатель развития или распространения болезни на контроле; Ро - показатель развития или распространения болезни в опыте

Данные по биологической эффективности и ростстимулирующей активности приводятся в таблице 11.

В качестве контроля биологической эффективности использовали коммерческий биологический фунгицид «Фитоспорин МЖ».

Как следует из результатов опыта культуральная жидкость штамма В. subtilis 3Н и его бесклеточный культуральный супернатант могут быть использованы для создания биофунгицидов, поскольку проявляют биологическую активность по подавлению инфекции и обладают ростстимулирующей активностью.

Предложена группа изобретений: бесклеточная культуральная жидкость штамма бактерий Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 и применение ее в качестве полифункционального средства для растений и консерванта для силоса. Бесклеточную культуральную жидкость получают путем отделения клеточной массы от жидкости центрифугированием при 600 об/мин в течение 20 минут. Полученная бесклеточная культуральная жидкость обладает антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, и применяется в качестве полифункционального средства для растений. Указанная бесклеточная культуральная жидкость применяется также в качестве консерванта для силоса. Группа изобретений позволяет повысить выход сельскохозяйственных растений и повысить усвояемость растительного сырья для животных. 3 н.п. ф-лы, 11 табл., 2 пр.

1. Бесклеточная культуральная жидкость, полученная отделением клеточной массы из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 3Н ВКПМ В-12758 путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 20 мин.

2. Применение бесклеточной культуральной жидкости по п. 1 в качестве полифункционального средства для растений, обладающего фунгицидными, бактерицидными и ростстимулирующими свойствами.

3. Применение бесклеточной культуральной жидкости по п. 1 в качестве консерванта для силоса.