ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 A61K35/66 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штамм из бактерий рода Bacillus, являющийся антагонистом по отношению к штаммам болезнетворных микроорганизмов, вызывающих заболевания у людей, сельскохозяйственных животных и растений.

В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенных бактерий и грибов (бациспецин-БМ, фитоспорин) (1, 2), в медицине (биоспорин, бактиспорин, споробактерин) (3-5), ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных (БЦЛ бактоцеллолактин, субалин, споролакт) (6-8). В основе вышеперечисленных препаратов - пробиотиков предложены разные штаммы бактерий рода Bacillus, обладающие антагонизмом в отношении патогенных бактерий и грибов, вызывающих заболевания либо растений, либо животных и людей. Однако нет штаммов, обладающих спектром антагонистической активности, достаточным для одновременной защиты от патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания у растений, людей и животных.

Задачей изобретения является селекция штамма из бактерий рода Bacillus, обладающего антагонистической активностью против патогенных штаммов бактерий и грибов, вызывающих заболевания растений, человека и сельскохозяйственных животных и который можно использовать для защиты от комплекса болезней, вызываемых грибами и бактериями.

Наиболее близким к изобретению является штамм В. subtilis 10 ВИЗР (9), обладающий широким спектром антагонистической активности к фитопатогенным грибам, на основе которого получен биопрепарат алирин Б. Однако штамм не подавляет роста патогенных бактерий и неизвестна его антагонистическая активность в отношении штаммов грибов, вызывающих заболевания человека и животных.

Целью изобретения является новый штамм бактерий рода Bacillus, обладающий антагонистической активностью в отношении патогенных грибов и бактерий, вызывающих заболевания растений, человека и сельскохозяйственных животных.

Штамм Bacillus subtilis 11 В выделен из здорового растения пшеницы в Уфимском районе. Идентификацию штамма проводили по "Определителю бактерий Берджи" М. Мир, 1997.

Штамм депонирован под номером ВКМ В-2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999 г.

Культура штамма характеризуется следующими свойствами: В. subtilis ВКМ В-2218 Д - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре дают обильный рост. На МПА образует серовато-белые мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки и осадка. Через 18 часов роста в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки, размером 2-3х0,6 мкм, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. Клетки подвижны. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры овальные, размер 0,9х0,6 мкм, расположены в клетке эксцентрично.

Культура ферментирует глюкозу, в-галактозу, лактозу, сахарозу и мальтозу. Не разлагает маннит, инозит, сорбит и арабинозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат натрия с глюкозой, пропионат и малонат натрия не использует, слабо растет в анаэробных условиях. Характеризуется наличием аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, отсутствием фенилаланилдезамилазы, орнитиндекарбоксилазы. Образует ацетилметилкарбинол.

Редуцирует нитраты, не образует газ на среде с нитратами в анаэробных условиях. Не образует индол и сероводород.

Культура штамма была проверена на безвредность (вирулентность, токсичность и токсигенность).

Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясо-пептонном агаре в течение 24 часов при температуре 37^oС. Выросшую биомассу смывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/ в мл. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (16±1) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно перорально (по одной дозе ежедневно в течение 5 дней). Результаты испытаний представлены в табл.1 (см. в конце описания).

С целью более полного изучения безопасности штамма при пероральном введении были испытаны высокие дозы штамма при разовом пероральном введении мышам (табл.2). Установлено, что разовое введение per os высоких доз штамма - (10-20)•10⁹ кл/мл не приводит к снижению веса животных на первые сутки после введения и в последующие дни вес животных увеличивается.

Для исследования токсичности (табл. 3) штамм выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 часов при 37^oС, смывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия, готовили суспензии, содержащие от 1,0 до 5,0 млрд. клеток в 1 мл, которые затем инактивировали прогреванием при 100^oС в течение 1 часа. Суспензии вводили способами, описанными при изучении вирулентности.

Для изучения токсигенности (табл. 4) штамм выращивали в течение 10 суток на мясо-пептонном бульоне при температуре 37^oС. По истечении срока культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную жидкость. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный мясо-пептонный бульон.

Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности штамма.

Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность штамма в отношении тест культур патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений (табл. 5), человека и животных (табл. 6). Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N2. Посевы инкубировали в термостате при 37^oС в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37^oС по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N2 без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов испытания представлены в табл. 5, 6.

Из данных таблиц следует, что штамм В. subtilis 11 В обладает широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающим заболевания человека, животных и растений, что создает возможность создания на его основе препарата-пробиотика, способного лечить широкий круг заболеваний и использоваться в медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной практике.

Использованные источники информации
1. Вялых Л.К., Мелентьев Л.И. Индукция устойчивости к ржавчине у ячменя и пшеницы, вызываемая препаратом Бациспецин БМ / Микробиол. охрана биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия: Тез. докл. Всес. симп. -Оренбург, 1991. -С. 23-24.

2. Менликеев М.Я., Смирнов В.В., Байгузина Ф.А. и др. Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней / Патент N 2099947, RU, C 12 N/20, опубл. 25.12.97, бюл. N 12.

3. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека // А. с. N 1722502. - SU - А 61 К 39/02, публ. 30.03.92.

4. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В. / Лечебно-профилактический препарат Бактиспорин// Патент N 2130316, приор. 23.01.97.

5. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний // Международная заявка. N 89/09607, WO, публ. 19.10.1989.

6. Ивановский А. А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. - Бюл. N 20.

7. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин / RU Патент N2035185, опубл. 31.01.92. - Бюл. N 14.

8. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт // Патент N 2035186. - RU. - А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

9. Новикова И. И., Литвиненко А.И., Нугуманова Т.А., Калько Г.В. Штамм бактерий Bacillus subtilis для получения препарата против фитопатогенных грибов // Патент N 2081167 RU. - С 12 N 1/20, опубл. 10.06.97. Бюл. N 16.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Bacillus subtilis, являющийся антагонистом по отношению к штаммам болезнетворных микроорганизмов, вызывающих заболевания у растений, людей и сельскохозяйственных животных. Штамм выделен из здорового растения пшеницы в Уфимском районе и депонирован под номером ВКМ В-2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН. 6 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis 11 В, депонированный под номером ВКМ В-2218Д в коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, обладающий широкой антагонистической активностью по отношению к штаммам болезнетворных микроорганизмов, вызывающих заболевания у растений, людей и сельскохозяйственных животных.