СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS Российский патент 1998 года по МПК C12N9/56 C12N9/56 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, производству бактерийных и ферментных препаратов.

Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основной для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. Ферментные препараты с различной активностью выделяют из культуральных супернатантов, полученных при гомогенном глубинном культивировании различных штаммов бактерий рода Bacillus [1, 2]. Биомасса при этом является неиспользуемым отходом производства.

В то же время в известных способах получения бактерийных препаратов на основе биомассы Bacillus subtilis, выращенной на жидких питательных средах в условиях аэрации и перемешивания [3] , производственным отходом является бесклеточная культуральная жидкость, содержащая гидролитические ферменты в различных количествах.

Наиболее близким по техническому решению к заявленному является способ получения протеолитических ферментов путем совместного культивирования бактерий Bacillus thuringiensis v. galleriae 69-6 - продуцента инсектицида и Bacillus thuringiensis v. galleriae GFP-51 - продуцента протеазы [4]. При такой технологии выращивания за одну ферментацию получают два продукта - ферментный препарат и биологический инсектицид.

В известном способе полученную культуральную жидкость, содержащую два продуцента, разделяют центрифугированием на биомассу и супернатант, из которого в последующем методом ацетонового осаждения выделяют ферментный комплекс.

Недостатками описанной технологии являются присутствие балластной примеси биомассы второго штамма в препарате инсектицида из-за одновременного культивирования двух штаммов; нетехнологичный, трудоемкий и энергоемкий этап центрифугирования для разделения культуральной жидкости, а также ацетоновый способ осаждения целевого продукта, требующий использования оборудования во взрывобезопасном исполнении и небезопасный для обслуживающего персонала.

Задачей настоящего изобретения является создание технологии, позволяющей одновременно получать протеолитические ферменты и препарат-пробиотик.

Поставленная задача решена подбором производственного штамма, биомассы которого по своим свойствам является основной препарата-пробиотика и способна в процессе жизнедеятельности продуцировать протеазу, отработкой оптимальных условий его культивирования для накопления антагонистически активной биомассы и высокого уровня протеолитической активности фермента в культуральной жидкости, а также разработкой способа выделения и очистки ферментного комплекса.

Сущность изобретения заключается в использовании антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 3H (ГИСК N 248), обладающего способностью продуцировать нейтральную протеазу [5] . Процесс культивирования штамма проводят при посевной дозе (3 - 5)•10⁹ кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70 - 90%. Супернатант отделяют от биомассы методом микрофильтрации с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика.

Решение поставленной задачи иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Bacillus subtilis 3H высевают на 2 матраса с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы и помещают в термостат при 37^oC на 18 - 20 ч. Далее смытую с агара микробную взвесь засевают в аппарат культивирования для подращивания на жидкой среде того же состава в объеме 5 л и растят 3 - 4 ч. до достижения культурой фазы экспоненциального роста.

Далее эту культуру в дозе (1,0 ±0,5)•10⁹ кл/мл используют в качестве посевного материала для проведения основного процесса в реакторе "Биор" вместимостью 100 л. Выращивание проводят при температуре 37^oC, насыщении среды кислородом 70 - 80%, перемешивании со скоростью вращения мешалки 400 об/мин, в течение 16 - 20 ч. до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.

В полученной при этом способе культуральной жидкости уровень протеолитической активности колеблется в пределах 10±3 ПЕ/г, а количество микробных клеток составляет (20 ± 5)•10⁹ кл/мл.

Протеолитическую активность культуральной жидкости определяют методом Ансона при нейтральных значениях pH. Антагонистическую активность биомассы оценивают методом отсроченного антагонизма к тестовым штаммам патогенных микроорганизмов, и она составляет не менее 10 мм задержки роста.

Ферментсодержащий супернатант отделяют от биомассы методом микрофильтрации в плоскокамерных аппаратах, заправленных мембранами "Мифил". Биомассу используют для получения бактериального препарата-пробиотика.

После микрофильтрации протеолитическая активность культуральной жидкости падает до 2,0 - 4,0 ПЕ/г из-за неспецифической сорбции фермента на мембранах "Мифил".

Очищенный от микробных клеток ферментсодержащий пермеат концентрируют на отечественной ультрафильтрационной установке AP-2,0, изготовленной на основе волокон ВПУ-15. Для снижения неспецифической сорбции фермента мембраны установки перед ультрафильтрацией обрабатывают 0,5%-ным раствором альбумина, а затем отмывают нейтральным фосфатным буфером. Фермент концентрируют до объема 3,8 ± 0,3 л и достижения активности (50 ± 5) ПЕ/г. После чего проводят стерилизующую фильтрацию.

Таким образом, использование в данном примере посевной дозы, достаточной для получения биомассы, не обеспечивает высокого уровня активности фермента в культуральной жидкости.

Пример 2. Штамм Bacillus subtilis 3H высевают на 10 матрасов с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы, и помещают в термостат при 37^oC на 18 - 20 ч. Далее смытую с агара культуру засевают в реактор "Биор" вместимостью 100 л, содержащий 32 л синтетической питательной среды. Подращивание проводят при температуре 37^oC, 80 - 90%-ном насыщении среды кислородом, перемешивании со скоростью вращения мешалки 430 об/мин в течение 9 - 10 ч. до достижения концентрации микробных клеток 10•10⁹. Затем доливают в реактор 40 л той же среды, при этом посевная доза должна составлять (4,2 ± 0,2) • 10⁹ кл/мл. Скорость вращения мешалки увеличивают до 450 об/мин, температурный режим и оксигенацию сохраняют без изменений в течение 14 - 16 ч. до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности.

Уровень протеолитической активности культуральной жидкости, полученной при этих условиях, колеблется в пределах 46 ± 6 ПЕ/г. Далее ферментосодержащий супернатант отделяют от биомассы методом микрофильтрации, используя мембраны "Мифил", при этом его протеолитическая активность остается на уровне 12 ± 3 ПЕ/г.

Полученный пермеат концентрируют ультрафильтрацией, как в примере 1, до объема (10,5 ± 0,5) л активности 50 ± 5 ПЕ/г и подвергают стерилизующей фильтрации. Биомассу используют для получения препарата-пробиотика.

Пример 3. Культивирование проводят, как в примере 2. Но фермент отделяют от биомассы методом микрофильтрации, используя мембраны "Millipore", "Pall", "Gelman Sciense", что позволяет сохранять протеолитическую активность культурального супернатанта в пределах 46 ± 6 ПЕ/г, а конечный объем фермента соответствует 60 ± 1 л.

Биомассу используют для получения препарата-пробиотика.

Поскольку уровень активности полученного фермента соответствует уровню его активности в концентратах, произведенных по примерам 1 и 2, то в данном случае может быть исключен этап дальнейшего концентрирования целевого продукта. Стерилизующую фильтрацию проводят сразу после микрофильтрации, используя мембраны фирм "Millipore", "Pall", "Gelman Sciense". Полученный фермент используют в жидкой форме или лиофильно высушивают.

Сравнительная характеристика получения фермента и биомассы по примерам 1 - 3 представлена в таблице.

Из данных таблицы следует, что способ получения биомассы и фермента по примеру 3 обеспечивает более высокий выход фермента.

Таким образом, при использовании предлагаемого способа повышается коэффициент использования оборудования, так как за один цикл культивирования из одного реактора можно получить два продукта - протеолитический фермент и бактериальный препарат-пробиотик; расход питательной среды сокращается вдвое, продукты культивирования используются полностью, что предлагается возможность организации безотходного производства.

Источники информации.

1. А. с. СССР N 899646, кл. C 12 N 9/54, 23.01.82. Способ получения щелочной протеазы.

2. Патент DE N 3834550, кл. C 12 N 9/54, 19.04.90. Протеолитический фермент, его получение и применение.

3. Патент РФ N 2056855, кл. A 61 K 35/74, 27.03.96. Способ получения препарата Споробактерин".

4. А.с. СССР N 1316239, кл. C 12 N 9/54, 30.07.91. Способ получения протеолитических ферментов.

5. Патент РФ N 2067616, кл. C 12 N 1/20, 10.10.96. Штамм бактерий Bacillus subtilis, несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения препарата "Бактиспорин".

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства бактерийных и ферментных препаратов. Используют антагонистически активный штамм Bacillus subtilis 3H (ГИСК 248), обладающий способностью продуцировать нейтральную протеазу. Культивирование штамма проводят при посевной дозе (3 - 5) x 10⁹ кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70 - 90%. Культуральную жидкость отделяют от биомассы микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика. Протеолитическая активность культуральной жидкости 46 ± 6 ПЕ/г, готового концентрата 50 ± 5 ПЕ/г. 1 табл.

Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus, включающий культивирование бактерий рода Bacillus на жидкой питательной среде в условиях аэрации и перемешивания, отделение ферментсодержащей культуральной жидкости и биомассы с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что для культивирования используют штамм Bacillus subtilis 3Н (ГИСК N 248), процесс культивирования проводят при посевной дозе (3 - 5) • 10⁹ кл/мл, исходной концентрации растворенного в среде кислорода 0,8 - 1,8 г/л, отделение ферментосодержащей культуральной жидкости от биомассы проводят микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого продукта.