Способ одновременного выявления нейронов и астроцитов на гистологических препаратах нервной ткани Российский патент 2018 года по МПК G01N1/30 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к области гистологических исследований нервной системы, в частности головного мозга, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине и биологии.

Известны способы приготовления гистологического препарата нервной ткани, включающие фиксацию в формалине, приготовление целлоидиновых срезов и их окрашивание по Нисслю или импрегнацию азотнокислым серебром [ L и др. «Layers I and VI of the visual cortex in the rabbit. A correlated Golgi and у S1» 1989 г.; Отеллин B.A., Коржевский Д.Э. «Иммуноцитохимическое выявление астроцитов в срезах головного мозга в сочетании с окраской по Нисслю» 2004 г., Коржевский Д.Э., Гиляров А.В Основы гистологической техники. 2010 г.; Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. «Гистологическая и микроскопическая техника»].

Известен быстрый способ комбинированной окраски препаратов по Гольджи и Нисслю, позволяющий выявлять нейрональную морфологию и цитоархитектонику [Pilati N. at al. «Rapid Method Combining Golgi and Nissl Staining to Study Neuronal Morphology and Cytoarchitecture», 2008 г.], который является прототипом предлагаемого способа.

Однако описанные способы не позволяют осуществлять одновременное окрашивание нервных клеток и выявление на этом же препарате астроцитов.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выявления тигроидного вещества и телец Маринеско в нейронах, окрашенных крезилвиолетом (модифицированный метод Ниссля), а также импрегнированных нитратом серебра нейронов и астроцитов на одном срезе головного мозга.

Способ осуществляют следующим образом.

Фиксацию мозга лабораторных животных проводят либо методом прижизненной перфузии 10% раствором нейтрального формалина на фосфатно-солевом буфере через левый желудочек сердца, в случае исследования коры головного мозга образцы ткани либо методом погружения, в последнем случае мозг фиксируют в течение 10-14 дней в часто сменяемом 10% растворе нейтрального формалина.

Фиксированный препарат мозга переносят в 10% раствор нитрата серебра, в котором выдерживают в течение 3-4 дней в темном месте при комнатной температуре. Применяют стандартную процедуру обезвоживания ткани с последующим заключением в парафин. На микротоме изготавливают серийные гистологические срезы толщиной 5-30 микрометров и наносят на предметные стекла.

Предварительно приготавливают растворы №1 и №2 следующего состава:

раствор №1:

формальдегид 37-40% - 20 мл, кислота лимонная - 500 мг, кислота азотная концентрированная - 2 капли вода дистиллированная - 100 мл;

раствор №2:

крезилвиолет - 100 мг, вода дистиллированная - 100 мл,

После депарафинизации в ксилоле препараты проводят по спиртам понижающей концентрации, споласкивают в двух порциях дистиллированной воды и проводят повторную импрегнацию в 10% растворе нитрата серебра в течение 5-8 минут в термостате при 40°С в темноте.

В течение времени термостатирования приготавливают новый раствор для окраски путем растворения 8 капель раствора №1 и 8 капель концентрированного гидроксида аммония в 50 мл дистиллированной воды.

Вынутые из термостата препараты без промывки переносят в свежеприготовленный раствор на время от 40 с до 1 мин, затем, чтобы остановить реакцию, погружают их в 1% раствор гидроксида аммония на 1 минуту и промывают в трех сменах дистиллированной воды.

После промывки препараты помещают на 1 мин в 5% раствор тиосульфата натрия и снова промывают их дистиллированной водой в течение 5 мин. Затем производят докраску в предварительно подогретом растворе крезилвиолета (раствор №2) на ацетатном буфере в термостате при 60°С в течение 15-20 мин, после чего вновь промывают дистиллированной водой.

На завершающем этапе препараты последовательно погружают в 100% спирт на 5-8 мин, в карбол-ксилол на 1 мин и дважды по 5 мин в орто-ксилол, далее заключают срезы канадским бальзамом под покровные стекла.

На фиг. 1 представлена микрофотография 5-го слоя цингулярной коры головного мозга крысы при увеличении 40×. Препарат подготовлен и окрашен по вышеописанному способу. Белыми стрелками обозначены окрашенные и импрегнированные объекты: А - астроциты, М - тельца Маринеско, Н - нейроны.

Предложенный способ позволяет сохранить высокое качество структуры ткани, и с помощью сочетанной двойной окраски выявлять тигроидное вещество и тельца Маринеско в нейронах, окрашенных крезилвиолетом, а также импрегнированные нитратом серебра нейроны и астроциты при различных функциональных состояниях.

Метод прост для воспроизведения, не требует использования дорогостоящих и опасных для здоровья веществ, возможен для исследования архивного материала, хранящегося в парафиновых блоках, обработки тонких срезов.

Литература

1. Layers I and VI of the visual cortex in the rabbit. A correlated Golgi and у S1, L, Ramo C, Contamina-Gonzalvo P, de Carlos JA. J Hirnforsch. 1989; 30(2):163-73.

2. Основы гистологической техники - Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. - Практическое руководство. 2010 г.

3. "Гистологическая и микроскопическая техника. Руководство. А.Г. Сапожников, А.Е. Доросевич. Смоленск. "САУ" 2000 год.

4. A. Nadia, Matthew Barker, Sofoklis Panteleimonitis, Revers Donga, and Martine Hamann. // Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 2008, Volume 56(6): 539-550.

Изобретение относится к медицине, а именно к области гистологических исследований нервной системы, в частности головного мозга, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине и биологии. Предложенный способ обеспечивает одновременное выявление нейронов и астроцитов на гистологических препаратах нервной ткани путем сочетанной двойной окраски тигроидного вещества и телец Маринеско в нейронах, импрегнированных нитратом серебра, раствором N1, содержащим формальдегид, лимонную и концентрированную азотную кислоту и воду, с докраской крезилвиолетом. 1ил.

Способ одновременного выявления нейронов и астроцитов на гистологических препаратах нервной ткани, включающий фиксацию препарата в 10% растворе нитрата серебра в течение 3-4 дней в темноте при комнатной температуре, стандартную процедуру обезвоживания, заключение в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 30 микрометров, нанесение на предметные стекла, депарафинизацию в ксилоле, отличающийся тем, что предварительно приготавливают растворы №1 и №2 следующего состава:

раствор №1:

формальдегид 37-40% 20 мл кислота лимонная 500 мг кислота азотная концентрированная 2 капли вода дистиллированная 100 мл

раствор №2:

крезилвиолет 100 мг вода дистиллированная 100 мл,

затем после депарафинизации препараты проводят по спиртам понижающей концентрации, споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, проводят повторную импрегнацию в 10% растворе нитрата серебра в течение 5-8 минут в термостате при 40°C в темноте, в течение этого времени приготавливают раствор для окраски путем растворения 8 капель раствора №1 и 8 капель концентрированного гидроксида аммония в 50 мл дистиллированной воды, после чего препараты без промывки переносят в свежеприготовленный раствор на время от 40 с до 1 мин, затем погружают их в 1% раствор гидроксида аммония на 1 минуту и промывают в трех сменах дистиллированной воды, после чего препараты помещают на 1 мин в 5% раствор тиосульфата натрия, промывают их дистиллированной водой в течение 5 мин и производят докраску в растворе №2 на ацетатном буфере в термостате при 60°C в течение 15-20 мин, затем вновь промывают дистиллированной водой, после чего последовательно погружают препараты в 100% спирт на 5-8 мин, в карбол-ксилол на 1 мин и дважды по 5 мин в орто-ксилол, далее заключают срезы канадским бальзамом под покровные стекла.