Способ выявления нейронов при люминесцентной микроскопии Советский патент 1987 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может быть использовано при изучении организации нервных центров и характера дивергенции аксонных коллатералей в го лозном и спинном мозге, а также при изучении проводящих путей в периферической нервной системе.

Цель изобретения - уменьшение диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур мозга благодаря использованию приму- лина с добавкой диметилсульфоксида, обеспечивающих высокую степень связывания с белками цитоплазмы.

Пример 1. Животному (белая крыса) производят микроинъекцию в мозг (в разные отделы хвостового ядра) 1 мкл 30%-ного водного раствора пероксидазы хрена и 1 мкл 10%-ного водного раствора примулина с добавлением 2% днметилсульфоксида. Через два дня животное перфузируют фиксатором - раствором параформальдегида и из фиксированной ткани мозга изготавливают на замораживающем микротом срезы толщиной 30 мкм. Производится гистохимическая окраска срезов (из- вестньм способом). Срезы промывают 30 мин в холодном фосфатном буфере (0,1 М рН 7,2) с добавлением 10% сахарозы, натягиванзт на предметные стекла и высушивают, а затем обезвоживают в спиртах, просветляют в толуоле и заключают в нелюминесцирую- щую среду (эпон 812). Наблюдение окрашенных примулином и пероксидазой хрена нейронов производится в обычном свете, и свете люминесценции при длине волны возбуждающего света 300- 450 нм. Двухцветное свечение клеток темно-синее и золотистое - указывает на двоййое их окрашивание флюорохро- мом JH ферментом.

П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, однако концентрация примулина в инъецируемом растворе меняется. Интенсивная аккумуляция красителя в нейронах наблюдается при концентрации его в инъецируемом растворе 5-10%. При увеличении концентрации красителя увеличивается и интенсивность его аккумуляции в нейроП р и м е р 5. Способ осуществляют 45 по примеру 1 за исключением изменения кислотности фосфатного буфера. Кислотность среды является важным параметром для восстановления свечения окрашенных примулином клеток. Лучшее 50 восстановление свечения достигнуто при кислотности изотонического фосфатного буфера 7,0-7., 2. Оптимальное значение кислотности среды при рН

7,1. Уменьшение кислотности буфера иах. 10%-ный водный раствор примулина (рН больше 7,2) приводит к неполному является наиболее оптимальным, одна- восстановлению свечения, а увеличение ко такой раствор является уже на сы- кислотности буфера (рН меньше 7,0) щенным для данного красителя. Сниже- вызывает изменение спектра эмиссии ние концентрации примулина (менее 5%) люминесцирующих клеток.

приводит к ум.еньшенню свечения меченных флюорохромом клеток.

Приме р 3. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением концентрации диметилсульфоксида (детергента) в инъецируемом растворе примулина. Более эффективный захват красителя в зоне микроинъекции и его ретроградный аксонный транспорт наблюдается при концентрации диметилсульфоксида 1,5-2%. Увеличение концентрации диметилсульфоксида (более 2%) приводит к деструктивным изменениям ткани в зоне микроинъекции, а уменьшение его концентрации (менее 1,5%) снижает его эффективность как детергента. Оптимальное значение концентрации диметилсульфоксида составляет 1 ,8%.

Зависимость интенсивности флюоресценции окрашенных примулином нейронов от его концентрации и концентрации детергента (диметилсульфоксида) в инъецируемом растворе приведена

в табл. -1 . П р и м е р 4. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением длительности промывания срезов. Промывание срезов в холодном изотоническом фосфатном буфере восстанавливает частично погашенную люминесценцию клеток после гистохимической окраски. Длительность промывания составляет 20- 30 мин, оптимальное время 25 мин. При сокращении этого времени (менее 20 мин) не наблюдается полного восстановления свечения окрашенных примулином клеток, а при удлинении промывания (более 30 мин) происходит вымывание красителя из клеток, что снижает интенсивность их флюоресценции.

П р и м е р 5. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением изменения кислотности фосфатного буфера. Кислотность среды является важным параетром для восстановления свечения окрашенных примулином клеток. Лучшее восстановление свечения достигнуто при кислотности изотонического фосфатного буфера 7,0-7., 2. Оптимальное значение кислотности среды при рН

Зависимость уровня восстановления флюоресценции окрашенных примулином нейронов от времени отмывания приведена в табл. 2.

Оптимальные значения указанных

параметров (концентрация красителя и диметилсульфоксида, время отмывания, кислотность буфера) получены в опытах на 170 крысах и 10 кошках.

Предлагаемый способ по сравнению с известными способами обладает большей чувствительностью и точностью, так как в качестве одного из красителей используется водньй раствор при- мулина с диметилсульфоксидом. Примесь диметилсульфоксида превращает приму- лин в транспортно-специфический краситель, длительное время удерживаемый в цитоплазме меченых клеток in vivo и in vitro. Примулин способен к прочному связыванию с белками цитоплазмы меченного им нейрона при отсутствии диффузии красителя из клетки. Примулин обладает высоким квантовым вы-

римечание. За исходный уровень (100%) флюоресценции берут интенсивность свечения примулина в срезах мозга в случае использования насыщенного раствора фгаоорохрома и 1,8% детергента.

ходом, устойчив при ультрафиолетово облучении.

Формула изобретения

Способ выявления нейронов при люминесцентной микроскопии путем микроинъекции красителя в мозг с последующим введением пероксидазы хрена и приготовлением гистологического препарата, отличающийся тем, что, с целью уменьшения диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур мозга, в качестве красителя используют состав, содержащий примулин и диметил- сульфоксид при следующих соотношениях компонентов, мас.%:

Примулин5-10

Диметилсульфоксид 1,5-2,0 ВодаОстальное

далее .после введения пероксидазы хрена мозг промывают в изотоническом фосфатном буфере рН 7,0-7,2 в течение 20-30 мин.

Таблица 1

р и м е ч а/н и е. За исходный уровень ( 100%) флюоресценции клеток берут интенсивность свечения флюорохрома (при- мулина) в фиксированных в формалине и не подвергнутых гистохимической окраске срезах мозга.

Редактор Н.Тупица

Составитель Л.Соловьев

Техред А.Кравчук Корректор А.Обручар

Заказ 2500/34Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблица2

Изобретение относится к гистологии. Для Уменьшения диффузии красителя из клеток и неспецифического свечения других структур в мозг вводят раствор пероксидазы хрена и краситель, содержащий, мас.%: прта1улин 5-10, диметилсульфоксид 1,5-2 и вода - остальное. Готовят гистологические препараты. Срезы промывают в изотоническом фосфатном буфере рН 7-7,2 в течение 20-30 мин. 2 табл.