Способ оценки токсического действия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, на лабораторных животных Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 B82B1/00 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, общей токсикологии и нанотоксикологии и касается критериев диагностики токсического действия биметаллических нанокомпозитов, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Установлено, что применение чистого гадолиния в высоких концентрациях приводит к кумуляции его в организме, развитию нефротоксических и нейротоксических эффектов, панкреатиту, гемолизу эритроцитов и, в ряде случаев, развитию анафилактической реакции [1-4]. Одним из способов решения данной проблемы является применение гадолиния в наноформе [5]. Способность наночастиц металлов создавать агломераты явилась одной из причин разработки биметаллического нанокомпозита железо-гадолиний - Fe-Gd, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана (АГ), не подверженного агломерации.

Для вновь синтезированных нанокомпозитов металлов необходимо проведение исследования их токсичности. В литературе встречаются исследования, в которых показано, что нанопрепараты оксида гадолиния обладают цитотоксическими свойствами [6-12]. Они способны ингибировать экспрессию антиапоптотитческого белка Bcl-2 и одновременно усиливать экспрессию проапоптотического белка Вах, подавляющего защитные функции Вс1-2, что приводит к развитию в клетке апоптоза [13, 14].

Известен способ диагностики ртутной энцефалопатии у мелких лабораторных животных, включающий проведение обзорной микроскопии срезов головного мозга животных, с изучением соотношения количества измененных и неизмененных нейронов и электронной микроскопии с определением степени увеличения площади ядра нейронов на препаратах животных опытной и контрольной групп. Данный способ предназначен для определения изменений в клетках животных, подвергавшихся воздействию ртути [15].

Известен способ оценки токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана (АГ), на ткань головного мозга крыс в отдаленном периоде, включающий внутрижелудочное введение препарата в организм животных, последующую декапитацию, изготовление срезов коры головного мозга, их окрашивание на антитела к белку caspase-3, проведение обзорной микроскопии полученных препаратов, при которой подсчитывают количество патологически измененных нейронов без экспрессии каспазы 3, число патологически измененных нейронов с экспрессией каспазы 3, количество нормальных нейронов без экспрессии каспазы 3, количество нормальных нейронов с экспрессией каспазы 3, общее количество нейронов на единицу площади среза, после чего по изменению количества названных показателей в опытной и контрольной группах делают заключение о развитии патологического процесса [16].

Задачей изобретения является разработка технологии оценки последствий воздействия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана на экспериментальных животных и расширение арсенала методов оценки патологических нарушений у экспериментальных животных.

Поставленная задача решается путем проведения гистологического и иммуногистохимического анализа ткани головного мозга белых крыс после воздействия биметаллического нанокомпозита, содержащего наночастицы железа и гадолиния, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана, с последующей морфометрической обработкой и интерпретацией полученных результатов.

Способ осуществляется следующим образом: животным опытной группы перорально с помощью зонда вводят биметаллический нанокомпозит в дозе 500 мкг/кг в течение 10 дней. Животным контрольной группы также перорально с помощью зонда давали дистиллированную воду. После окончания воздействия, животных опытной и контрольной групп декапитируют. Затем, готовят срезы тканей сенсомоторной коры головного мозга обеих групп.m,Далее, часть срезов окрашивают гематоксилином и эозином по общепринятой методике [17], другую часть срезов окрашивают на антитела к белкам теплового шока 70 (БТШ 70). При проведении обзорной микроскопии определяют на единицу площади количество нейронов с экспрессией БТШ 70 и клеток астроглии. Вычисляют изменение количества нейронов с экспрессией БТШ 70 и клеток астроглии в препаратах опытной группы относительно аналогичных показателей в препаратах контрольной группы. При снижении числа клеток астроглии в 1,16 раза в опытной группе по сравнению с контрольной группой и увеличении числа нейронов с экспрессией БТШ 70 в опытной группе в 11,5 раз по сравнению с контрольной группой, делают заключение о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга.

Предлагаемый способ отличается от прототипа [16] критериями морфометрических изменений в нейронах сенсомоторной коры головного мозга, с помощью которых диагностируют поражение ткани головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Таким образом, заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине (токсикологии, фармакологии, патологической физиологии, патологической анатомии) для верификации моделирования патологических состояний центральной нервной системы животных. Технология оценки безопасности нанопрепаратов, основанная на морфологическом анализе структурных изменений внутренних органов и тканей организма и молекулярной диагностике экспрессии внутриклеточных белков, позволит не допускать к производству и применению лекарственные формы и диагностические препараты, способные вызывать отдаленные последствия воздействия.

Для определения информативных морфометрических критериев для определения токсичности биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита проведен эксперимент на 20 особях беспородных белых крыс-самцов массой от 200 до 260 грамм

Животным опытной группы (10 особей) перорально, через зонд, на протяжении 10 дней вводили водный раствор биметаллического нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана (АГ Fe-Gd)) из расчета 500 мкг/кг. Животные контрольной группы (10 особей) получали на протяжении 10 дней перорально с помощью зонда 0,5 мл дистиллированной воды. После окончания воздействия животные были декапитированы. После декапитации головной мозг от каждого исследуемого животного был извлечен и фиксирован в нейтральном буферном растворе формалина (10%), обезвожен этанолом восходящей концентрации (70, 80, 90, 95 и 100%) и помещен в гомогенизированную парафиновую среду для гистологических исследований HistoMix (BioVitrum, Россия). Далее, с помощью микротома МС-1 (Россия), изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм. Для исследования биологического ответа организма на субклеточном уровне применяли иммуногистохимический метод определения активности проапоптотического белка caspase 3 (NeoMarkers, США), антиапоптотического белка bcl-2 (Dako, Дания) и стресс-белка БТШ 70 (NeoMarkers, США). Полученные на микротоме срезы были помещены на полизиновые стекла (Thermo Scientific, Германия) и окрашены на антитела к исследуемым белкам, в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Дополнительно для проведения морфометрической оценки структуры сенсомоторной коры головного мозга проводили окраску гематоксилином и эозином. Окрашенные срезы фиксировались полистиролом и накрывались покровным стеклом. После высыхания полистирола полученные микропрепараты просматривали на светооптическом исследовательском микроскопе. Исследование полученных срезов осуществляли при помощи светооптического исследовательского микроскопа Olympus ВХ 51 (Япония) с вводом микроизображений в компьютер при помощи камеры Olympus (Япония).

Далее при помощи системы микроскопии и анализа Image Scope М были проанализированы заранее выбранные параметры анализа полученных фотоматериалов: общее количество нормальных нейронов на единицу площади, количество гиперхромных нейронов, количество актов нейронофагии, количество клеток астроглии, количество нейронов с экспрессией проапоптотического белка каспаза 3, антиапоптотического белка bcl-2 и стресс-белка БТШ 70. Изменение показателя выражалось в отношении количественного показателя образца опытной группы к значению аналогичного показателя из контрольной группы. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0» (Statsoft Inc., США).

Статистическую значимость различий в независимых выборках определяли по методу Манна - Уитни. Достигнутый уровень значимости признаков - при р≤0,05.

Как видно из таблицы, наиболее информативными являются изменения показателей числа клеток астроглии и числа нейронов с экспрессией БТШ 70.

Число клеток астроглии в опытной группе по сравнению с контрольной снизилось в 11.6 раза (203,0:174,0=11.6).

Количество нейронов с экспрессией БТШ 70 в опытной группе по сравнению с контрольной увеличилось в 11,5 раз (23,0:2,0=11,5).

Данные изменения свидетельствуют о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана.

Предлагаемый способ диагностики позволяет оценить воздействие биметаллических нанокомпозитов на экспериментальных животных и расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных, повышает точность верификации токсического воздействия биметаллического нанокомпозита, так как при оценке изменений в ткани коры головного мозга выявляют не только структурные повреждения, но непосредственно изменения в белковых комплексах нейрона.

Литература

1. Шевцов М. АЯковлева., Л.Ю., Николаев Б.П. Магнитные наночастицы в диагностике и терапии злокачественных опухолей головного мозга // Лучевая диагностика и терапия. 2013. №3 (4). С. 29-39.

2. Наполов Ю.К., Лукьянов С.В., Свиридов Н.К., Воржанов А.А. Проблема безопасности применения хелатов гадолиния как рентгеноконтрастных средств // Медицинская визуализация. 2004. №5. С. 130-136.

3. Наполов Ю.К., Коробкова И.З., Черкавская О.В., Горгадзе Т.Т., Калиничев А.С. Теории патогенеза побочного действия рентгеноконтрастных средств // Вестник рентгенологии и радиологии. 2006. №5. С. 54-62.

4. Раптанова В.А., Сперанская А.А., Прошин С.Н. Контраст-индуцированные нефропатии (фармакология рентгеноконтрастных средств) // ЕДИАТР. 2016. Т. VII №1.C. 97-105.

5. Тимербаев А.Р. Роль масс спектрометрии в разработке и внедрении в медицину металлсодержащих наночастиц // Журнал аналитической химии. 2015. Т. 70. №9. С. 899-915.

6. Туранская С.П., Турелик М.П., Петрановская А.Л., Туров В.В., Горбик П.П. Нанокомпозиты в нейтронозахватной терапии // Поверхность. 2010. №2 (17). С. 355-374.

7. De Stasio G., Casalbore P., Pallini R., Gilbert В., Ciotti M.T., Rosi G., Festinesi A., Larocca L.M., Rinelli A., Perret D., Mogk D.W., Perfetti P., Mehta M.P., Mercanti D. Gadolinivim in human glioblastoma cells for gadolinium neutron capture therapy // Cancer Research. 2001. V. 61. P. 4272-4277.

8. Наврузов C.H., Ходжаева H.X., Кулабдуллаев Г.А., Абдуллаева Г.А., Ким А.А., Джураева Г.Т. Медико-биологические исследования по нейтрон-захватной терапии на атомном реакторе ИЯФ АН РУз // Злокачественные опухоли. 2015. №1. С. 10-23.

9. Yin J.C, Chen D.Q., Zhang Y., Li C.R., Liu L.Z., Shao Y.Z. MRI relaxivity enhancement of gadolinium oxide nanoshells with a controllable shell thickness // Physical chemistry chemical physics. 2018. Vol. 20 (15). P. 10038-10047.

10. Hsu B.Y.W., Tan A., Seifalian A.M., Li X.; Wang J. Relaxivity and toxicological properties of manganese oxide nanoparticles for MRI applications // RSC Advances. 2016. Vol. 6 (51). P. 45462-45474.

11. Шибаев А.В., Гервиц Л.Л., Филиппова О.Е., Гуляев М.В., Анисимов Н.В., Пирогов Ю.А., Хохлов А.Р. Новый двумодальный контрастный агент для магнитно-резонансной томографии // Журнал радиоэлектроники. 2016. №3. С. 1-8.

12. Орлова М.А., Трофимова Т.П., Орлов А.П., Шаталов О.А., Наполов Ю.К., Свистунов А.А., Чехонин В.П. Противоопухолевая активность производных фуллерена и возможности их использования для адресной доставки лекарств // Онкогематология. 2013. №2. С. 83-89.

13. Попов А.Л., Татарникова О.Г., Шекунова Т.О., Попова Н.Р., Баранчиков А.Е., Иванов В.К., Козик В.В. Исследование воздействия нанокристаллического диоксида церия, допированного гадолинием (Cel-xGdx02-y), на функциональное состояние и жизнеспособность клетоклинии NCTC clone L929 // Вестник Томского государственного университета. Химия. 2017. №8. С. 68-87.

14. Alarifi S., Huma A., Alkahtani S., Alessia M. Regulation of apoptosis through bcl-2/bax proteins expression and DNA damage by nano-sized gadolinium oxide // International Journal of Nanomedicine. 2017. №12. P. 4541-4551.

15. Е.А.Титов, Л.М. Соседова. Способ диагностики ртутной энцефалопатии у мелких лабораторных животных: Пат. 2471247 RU: 27.12.2012.

16. Титов Е.А., Новиков М.А., Соседова Л.М. Способ оценки токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана, на ткань головного мозга лабораторных животных в отдаленном периоде воздействия: Пат. 2578545 RU: 12.01.2015

17. Коржевский Д.Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов. СПб.: Кроф, 2005. 48 стр.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, общей токсикологии и нанотоксикологии и касается критериев диагностики токсического действия биметаллических нанокомпозитов, инкапсулированных в природную полимерную матрицу арабиногалактана. Способ оценки токсического действия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, на лабораторных животных заключается в том, что токсикант животным опытной группы вводят перорально в дозе 500 мкг/кг в течение 10 дней, дистиллированную воду животным контрольной группы вводят перорально по 0,5 мл на протяжении 10 дней, изготавливают срезы коры головного мозга, одну часть срезов тканей коры головного мозга животных контрольной и опытной групп окрашивают гематоксилином и эозином, другую - на антитела к белку теплового шока 70, проводят обзорную микроскопию полученных препаратов, подсчитывают на единицу площади среза количество клеток астроглии и количество нейронов с экспрессией белка теплового шока 70, сравнивают полученные показатели обеих групп животных и при снижении числа клеток астроглии в 1,16 раза и увеличении числа нейронов сенсомоторной коры с экспрессией белка теплового шока 70 в 11,5 раз в опытной группе по сравнению с контрольной делают заключение о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана. 1 табл.

Способ оценки токсического действия биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана, на лабораторных животных, включающий воздействие на животных опытной группы токсикантом, на животных контрольной группы дистиллированной водой с последующим изготовлением срезов коры головного мозга, их окрашиванием гематоксилином и эозином, и микроскопией, отличающийся тем, что токсикант животным опытной группы вводят перорально в дозе 500 мкг/кг в течение 10 дней, дистиллированную воду животным контрольной группы вводят перорально по 0,5 мл на протяжении 10 дней, одну часть срезов тканей коры головного мозга животных контрольной и опытной групп окрашивают гематоксилином и эозином, другую - на антитела к белку теплового шока 70, проводят обзорную микроскопию полученных препаратов, подсчитывают на единицу площади среза количество клеток астроглии и количество нейронов с экспрессией белка теплового шока 70, сравнивают полученные показатели обеих групп животных и при снижении числа клеток астроглии в 1,16 раза и увеличении числа нейронов сенсомоторной коры с экспрессией белка теплового шока 70 в 11,5 раз в опытной группе по сравнению с контрольной делают заключение о развитии патологического процесса в ткани сенсомоторной коры головного мозга при воздействии биметаллического феррум-гадолиниевого нанокомпозита, инкапсулированного в природную полимерную матрицу арабиногалактана.