СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ НЕРВНОЙ КЛЕТКИ Российский патент 2020 года по МПК A61B5/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может быть применено в гистологических исследованиях головного и спинного мозга.

Известные способы окрашивания ткани (аналоги) для гистологических исследований основаны на применении различных красителей, которыми обрабатывают срезы [2, 3, 5]. Показательным примером может служить способ Ниссля, применяемый для окрашивания нервной ткани. Указанный способ включает перекрашивание срезов, фиксированных в спирте, основным анилиновым красителем с последующей отмывкой избытка красителя спиртом. При этом составные части клетки сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окраске клетки участвуют ядерные структуры и вещества, находящиеся в цитоплазме, – тигроидные глыбки, глыбки Ниссля или вещество Ниссля [5, 6. 7, 8].

Существенными недостатками известных способов-аналогов являются: низкая сопоставимость получаемых результатов при сравнении опытной и контрольных групп, а также препаратов, изготовленных в разное время, в разных лабораториях и не одним и тем же лаборантом. Это связано с тем, что дифференцирование проводится «на глаз». Другим недостатком является сложность и длительность процесса окрашивания (до 48 часов).

Известен Способ окрашивания нервной клетки [4], включающий обработку срезов 0,2% забуференным раствором крезилового фиолетового прочного с рН 3,8 в течении 25 с последующим дифференцированием после заключения срезов в бальзам в лучах ультра-фиолетового облучения, например ртутно-кварцевой горелки ПРК-2, в течении 30-45 мин при удалении препаратов от горелки на расстоянии до 1 метра. Время облучение препаратов зависело от толщины среза, чем тоньше срез, тем меньше экспозиция облучения препарата.

Недостатком способа является эмпирический подход к реализации способа, что затрудняет сопоставления результатов в разных фазах эксперимента. Кроме этого нет единого критерия для выполнения окраски в разных лабораториях.

Близким по техническому решению является способ окрашивания нервной ткани, предложенный И.В. Викторовым (1969) [3]. Этот способ включает окраску срезов 10-15 мин в 0,05%-0,2% забуференном растворе крезилового фиолетового прочного с pH 3,6-3,8, отмывание красителя в подкисленном 96° спирте или в растворе спирта и крепкого аммиака и заключение срезов в бальзам.

Описанный способ основан на свойстве базофильного вещества нервных клеток избирательно адсорбировать краситель при определенном значении pH красящего раствора [7, 8].

Недостатком способа является необходимость дифференцировать срезы мозговой ткани «на глаз», что снижает качество окраски и сопоставимость получаемых результатов. Существенным недостатком также является вымывание красителя из клетки в процессе дифференцирования. В результате клетки, содержащие малое количество базофильного вещества, полностью обесцвечиваются. При неполном удалении дифференцирующего раствора снижается срок хранения (долговечность) окрашенных препаратов, которые быстро обесцвечиваются. Способ требует затраты времени как на приготовления красителя, так и на само окрашивание среза.

Техническим результатом настоящего изобретения явилось улучшение качества окраски нервной клетки, интенсификация и ускорение процесса окрашивания, стандартизация процессов при реализации способа.

Поставленная цель достигается тем, что для окрашивания нервной клетки в качестве красителя применяют предварительно нагретый в термостате до температуры 22±0,5°С 0,2-05% водный раствор амидола (солянокислый 2,4-диаминофенол), в который погружают после депарафинизации срезы на предметных стеклах, которые предварительно подогревают в термостате при температуре 22±0,5°С. Оптимальная толщина срезов под окрашивания амидолом от 12 до 20 мкм. Окрашивания срезов осуществляют в термостате при температуре 22±0,5°С в течении от 8 до 14 мин в зависимости от концентрации раствора красителя и толщины среза (табл. 1 и 2).

Таблица 1

Время окрашивания срезов толщиной 12 мкм в свежеприготовленном растворе амидола в зависимости от концентрации раствора

Концентрация раствора амидола (%) 0,2 0,3 0,4 0,5 Время окрашивания (мин) 14 12 10 8

Таблица 2

Время окрашивания срезов в свежеприготовленном 0,5% растворе амидола

Толщина среза (мкм) 12 14 18 20 Время окрашивания (мин) 8 10 12 14

После окрашивания срезы последовательно ополаскиваются в двух стаканах с дистиллированной водой по 30 сек в каждом.

Способ может быть реализован при концентрации раствора амидола от 0,6% до 1,5% и более процентов. При использовании раствора амидола более 0,5% сокращается время, но микроструктуры прорабатываются чрезвычайно грубо и сливаются в сплошное темное пятно. Лучшая проработка микроструктур была получена при применении 0,2-0,5% раствора амидола. Амидол способен окрашивать и другие биологические ткани (мышцы, соединительную ткань, железистую ткань, ткани паренхиматозных органов и т. п.). Существующие способы окрашивания этих тканей не однозначны в трактовке состояния микроструктур, поэтому при разработке способа за основу взят способ окрашивания нервной клетки.

Пример применения предложенного способа

Амидол хорошо растворим в воде. Для приготовления окрашивающего раствора берут навеску амидола и растворяют ее в дистилляте.

Пример. Объект исследования – мозжечок кошки. Фиксация 10% раствором нейтрального формалина [1]. Заливка блока в парафин. Делают срезы толщиной 12 мкм и наклеивают их на предметное стекло. После депарафинизации среза предметные стекла помещают в термостат на 2-3 мин при температуре 22±0,5°С. Затем предметные стекла погружают в емкость с 0,2% раствор амидола, причем раствор амидола в емкости был предварительно нагрет в термостате до температуры 22±0,5°С. Окрашивание срезов осуществляется в течении 8 мин в термостате при температуре 22±0,5°С. Окрашенные срезы последовательно ополаскиваются в двух стаканах с дистиллированной водой по 30 сек в каждом. Затем просветляют и заключают в бальзам по общепринятой методике [8].

Результаты окрашивания: на препарате (фиг. 1) помимо хорошо проработанных микроструктур цитоплазмы клеток Пуркинье видны структуры ядра. Базофильное вещество нервных клеток насыщено красителем. На микрофотографии отчетливо видно, что нервные клетки имеют неодинаковую плотность окраски базофильного вещества, что может быть истолковано как различное функциональное состояние нервной клетки в момент забора материала на исследование.

Положительный эффект:

1. Сокращено время и упрощен процесс приготовления красителя;

2. Сокращено время окрашивания срезов;

3. Не требует дифференцировки, что исключает появление артефактов;

4. Обеспечивает сопоставимость результатов исследования при сравнении препаратов контрольной группы с опытными, а также изготовленных в разных лабораториях, разное время и разными исследователями;

5. Выявляются помимо ядрышек и другие структуры ядра;

6. Имеется возможность применения методик количественного определения функционального состояния клетки по интенсивности окрашивания цитоплазматических и ядерных структур [9];

7. Созданы условия для экспресс-диагностики материалов биопсии;

9. Создана предпосылка для автоматизации процесса окрашивания с применением робототехники.

Литература

1. Абакаров М.Х., Виноградов А.А. Способ перфузионной фиксации головного мозга у экспериментального животного (авт. св. №1636719) // Открытия и изобретения. – 1991. –№ 11.

2. Автандилов Г.Г. Новые методы и техника гистологических исследований. – Нальчик, 1960. – 103 с.

1. Викторов И.В. Окраска нервной ткани забуференным раствором крезилового фиолетового прочного // Современные методы морфологических исследований. – М., 1969. – С. 7-10.

2. Декларационный патент UA 55584 А, G01N1/30, G01N33/48, A61B5/04, опубл. 05.04.2003 бюл. 4.

3. Дьердь Кисели. Практическая микротехника и гистохимия. – Будапешт, 1982. – С.45-51.

4. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистохимия. – М.: Мир, 1969. – 646 с.

5. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники (5-е изд.). – М.: Искусство, 1969. – С. 118, 150, 181, 188.

6. Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Иностранная литература, 1953. – 718 с.

7. Тихомиров Ю.Т. Определение объема капиллярной сети шишковидной железы человека методом фотометрии // Архив АГЭ. – 1970. – Т. 59. – №11. – С. 98 – 102.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к способу окрашивания нервной клетки. Способ окрашивания нервной клетки включает обработку срезов раствором красителя, обезвоживание и заключение в бальзам, при этом срезы толщиной от 12 до 20 мкм окрашивают от 8 до 14 мин в термостате при температуре 22±0,5°С в свежеприготовленном 0,2-0,5% растворе амидола, по завершении окрашивания срезы последовательно ополаскиваются по 30 сек в двух порциях дистиллированной воды. Предложенный способ является эффективным для окрашивания нервных клеток. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ окрашивания нервной клетки, включающий обработку срезов раствором красителя, обезвоживание и заключение в бальзам, отличающийся тем, что срезы толщиной от 12 до 20 мкм окрашивают от 8 до 14 мин в термостате при температуре 22±0,5°С в свежеприготовленном 0,2-0,5% растворе амидола, а по завершении окрашивания срезы последовательно ополаскиваются по 30 сек в двух порциях дистиллированной воды.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время окрашивания срезов зависит от толщины среза и концентрации раствора амидола – при увеличении толщины среза от 12 до 20 мкм увеличивается время окрашивания от 8 до 14 мин, а при увеличении концентрации раствора амидола от 0,2 до 0,5% уменьшается время окрашивания с 14 до 8 мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед окрашиванием предметные стекла с парафинированными срезами и раствор амидола нагреваются в термостате до температуры 22±0,5°С.