Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro Российский патент 2018 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию корней растения вздутоплодника сибирского, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений – пиранокумаринов, которые широко используются в фармацевтической промышленности.

Вздутоплодник сибирский зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств РФ в качестве лекарственного растительного сырья. Его корневища и корни обладают вазодилатирующими (сосудорасширяющими), гипотензивными, адренолитическими и спазмолитическими свойствами. Используется при производстве препаратов спазмолитического действия «Димидин» и «Фловерин», а также комплексного препарата сердечно-сосудистого действия «Сафинор».

При этом известно, что вздутоплодник сибирский занесен в Красную книгу Якутии. Заготовка растения в природе может привести к уничтожению природных популяций.

Кроме того, корни растения вздутоплодника накапливают тяжелые металлы: цинк, никель, селен и молибден, соответственно использование растений, произрастающих на не контролируемых участках, несет большой риск для здоровья человека (см. Алексеева С.И. Перспективы получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского // Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Годичное собрание ОФР, науч. конф. и школа для мол. уч., 18-24 сент. 2017 г., Судак: сб. мат. докл. / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов. – М: Изд-во АНО «Центр содействия научной, образовательной и просветительской деятельности «Соцветие», 2017. - 393 с).

Вздутоплодник сибирский растет по склонам сопок, в танацетовых степях и среди разнотравья лесостепей, в моховолишайниковой тундре и в сухих руслах рек (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.). Ареал произрастания вздутоплодника сибирского делят на три фрагмента: селенгинский, даурский и забайкальский. Также существуют отдельные очаги произрастания растения в Красноярском крае, Читинской и Иркутской области, в Якутии и на западе Амурской области. Основные запасы лекарственного сырья вздутоплодника сибирского находятся в Читинской области.

Корни и корневища вздутоплодника сибирского содержат кумарины и пиранокумарины (винсадин и дигидросамидин, изофлоидикарпин, скополетин, умбеллиферон), эфирные масла, гликозиды (мениантин и мелиатин), флавоновые гликозиды (рутин, гиперозид), уксусная и изовалериановая кислота, крахмал. Эфирное масло вздутоплодника сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Растение концентрирует железо, цинк, никель, селен и молибден (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.).

Авторами не установлены данные о получении адвентивных корней in vitro вздутоплодника сибирского.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) с характерными морфологическими параметрами и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) впервые получен в условиях in vitro.

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты растения in vitro вздутоплодника сибирского, которые помещают в агаризованную питательную среду соответствующего гормонального состава в качестве экспланта. В результате был получен штамм адвентивных корней.

Причем, для получения растения in vitro в качестве эксплантов используют зрелые семена вздутоплодника. Семена стерилизуют перекисью водорода (H₂O₂) в течение 5 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем трехкратно отмывают в течение 5 мин в дистиллированной стерильной воде. Стерильные семена помещают на твердую питательную среду без гормонов.

Для экспериментов используют твердую питательную среду следующего состава:

NH₄NO₃ 1650,000 ±2,0000 мг KNO₃ 1900,000 ±2,0000 мг MgSO₄x7H₂O 370,000 ±1,0000 мг KH₂PO₄ 170,000 ±0,1000 мг CaCl₂x2H₂O 440,000 ±0,5000 мг H₃BO₃ 6,200 ±0,0100 мг MnSO₄x4H₂O 22,300 ±0,0200 мг ZnSO₄x7H₂O 8,600 ±0,0100 мг KI 0,830 ±0,0010 мг Na₂MoO₄x2H₂O 0,250 ±0,0010 мг CuSO₄x5H₂O 0,025 ±0,0001 мг CoCl₂x6H₂O 0,025 ±0,0001 мг FeSO₄x7H₂O 2,785 ± 0,001 мг Na-ЭДТА 3,725 ±0,001 мг Тиамин 0,100 ±0,0010 мг Пиридоксин 0,100 ±0,0010 мг Сахароза 30000,000 ±100,0000 мг Вода 1000 мл Агар 5000 мг

Полученную в результате растение in vitro помещают в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина.

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве используют 1/3 адвентивных корней.

Полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. В процессе культивирования определяют морфологические характеристики.

Штамм (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) ВС-1 идентифицирован и депонирован в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, 127276, Москва, И-276, ул. Ботаническая, 35.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: корни имеют одинаковые ответвления, темно-оранжевой окраски.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы корней отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу корней получают после лиофильной сушки.

При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 25 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в таблице и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) из семян через растения in vitro, обладающие стабильными ростовыми параметрами и морфологическими характеристиками, причем, получение соединений может быть выполнено вне сезонной зависимости производства.

Таблица

Ростовые параметры адвентивных корней вздутоплодника сибирского

Показатели Значения Индексы роста по:
весу сухой биомассы
весу сырой биомассы 5±0,5
5±0,5 Удельная скорость роста, сут^-1 0,12 ±0,05 Время удвоения, сут. 12 ±2

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава: NH₄NO₃ 1650,000±2,0000 мг, KNO₃ 1900,000±2,0000 мг, MgSO₄×7H₂O 370,000±1,0000 мг, KH₂PO₄ 170,000±0,1000 мг, CaCl₂×2H₂O 440,000±0,5000 мг, Н₃ВО₃ 6,200±0,0100 мг, MnSO₄×4H₂O 22,300±0,0200 мг, ZnSO₄×7H₂O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na₂MoO₄×2H₂O 0,250±0,0010 мг, CuSO₄×5H₂O 0,025±0,0001 мг, CoCl₂×6H₂O 0,025±0,0001 мг, FeSO₄×7H₂O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг, дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. Изобретение позволяет получить адвентивные корни вздутоплодника сибирского в условиях in vitro с отсутствием сезонной зависимости их получения. 1 табл.

Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян вздутоплодника перекисью водорода в течение 5 мин, ополаскивание, трехкратное отмывание в течение 5 мин в дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов, следующего состава:

NH₄NO₃ 1650,000±2,0000 мг, KNO₃ 1900,000±2,0000 мг, MgSO₄×7H₂O 370,000±1,0000 мг, KH₂PO₄ 170,000±0,1000 мг, CaCl₂×2H₂O 440,000±0,5000 мг, Н₃ВО₃ 6,200±0,0100 мг, MnSO₄×4H₂O 22,300±0,0200 мг, ZnSO₄×7H₂O 8,600±0,0100 мг, KI 0,830±0,0010 мг, Na₂MoO₄×2H₂O 0,250±0,0010 мг, CuSO₄×5H₂O 0,025±0,0001 мг, CoCl₂×6H₂O 0,025±0,0001 мг, FeSO₄×7H₂O 2,785±0,001 мг, Na-ЭДТА 3,725±0,001 мг, тиамин 0,100±0,0010 мг, пиридоксин 0,100±0,0010 мг, сахароза 30000,000±100,0000 мг, вода 1000 мл, агар 5000 мг,

дальнейшее помещение растений, полученных in vitro, в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина, при этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели, при пересеве используют 1/3 адвентивных корней, полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов.