Штамм суспензионной культуры клеток полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) под обозначением NEFU-Avul-1 в условиях in vitro - для получения биомассы клеток Российский патент 2022 года по МПК C12N5/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности, суспензионному культивированию клеток растения на основе каллусных клеток дикорастущего представителя полыни обыкновенной, и может быть использовано в качестве растительного лекарственного сырья для получения вторичных метаболитов.

Штамм NEFU-Avul-1 суспензионных культур клеток полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Института физиологии растений РАН, регистрационный номер 117.

Заявленное изобретение представляет собой способ получения и выращивания суспензионной культуры клеток in vitro на основе каллусных культур клеток, полученных от стерильных проростков на основе семян дикорастущего растения полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), произрастающего в условиях криолитозоны.

Клеточные технологии дают возможность получения альтернативного растительного сырья в виде каллусов и суспензий клеток растений (лекарственных, редких, уникальных и еще не исследованных видов), аккумулирующих биологически активные вещества (БАВ) (вторичные метаболиты), которые могут храниться длительное время в лиофильно высушенном состоянии без потери фитохимического состава и физиологической активности (см. Янг Й., Асякина Л.К., Бабич О.О., Дышлюк Л.С., Сухих С.А., Попов А.Д., Костюшина Н.В. Изучение физико-химических свойств и биологической активности экстрактов из высушенной биомассы каллусных, суспензионных клеток и корневых культур in vitro // Техника и технология пищевых производств. - 2020. - Т. 50. №3. С. 480-492.).

Суспензионная культура клеток растений in vitro представляет собой гомогенную биомассу популяций клеток, выращенную в специальной жидкой питательной среде с добавлением регуляторов роста и при соответствующих условиях перемешивания, температурного и газового режимов, рН среды и других внешних факторов. Известно, что северные и арктические растения богаты вторичными метаболитами с антибактериальной, фунгистатической и противораковой активностью, что показано в исследованиях, проведенных А.А. Макаровым и другими исследователями (см. Сивцева С. В., Охлопкова Ж.М. Фунгистатическая активность экстрактов из некоторых дикорастущих растений Якутии // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. - 2016. -№6. - С. 106-113.; Чирикова Н.К., Оленников Д.Н. Фитохимические исследования дикорастущих лекарственных растений Якутии // Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере: сборник материалов III научно-практической конференции с международным участием и Научной школы по клеточной биотехнологии, Якутск, 04-08 июня 2018 года. - Якутск: Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова, 2018. - С. 23-25.; Lee S.E., Okhlopkova Z., Lim C. and Cho S. (2020). Dracocephalum palmatum Stephan extract induces apoptosis in human prostate cancer cells via the caspase-8-mediated extrinsic pathway. Chinese Journal of Natural Medicines 18(10), 793-800. https://doi.org/10.1016/S1875-5364(20)60019-X).

Полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.) довольно известна своим многовековым опытом применения в народной медицине как слабительное, потогонное, мочегонное, глистогонное средство, кроме того, проявляет хорошую антиоксидантную и антибактериальную активность (см. Pandey B.P., Thapa R. and Upreti A. (2017). Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of essential oil and methanol extract of Artemisia vulgaris and Gaultheria fragrantissima collected from Nepal. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 10, 952-959. https://doi.org/10.1016/j.apjtm.2017.09.005). Однако, в современной фармацевтической промышленности полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.) используется редко. Исследования последних лет показали наличие противовоспалительных, гиполипидемических, антималярийных, противоопухолевых, бронхорасширяющих и противосудорожных свойств (см. Давлатова М.С., Кароматов И.Д. Полынь обыкновенная // Биология и интегративная медицина. - 2017. - №5. - С.101-108.; Кароматов И.Д., Аминова М.З., Авезова Х.Ж. Противомалярийные средства растительного происхождения в народной и научной фитотерапии // Биология и интегративная медицина. - 2018. - №11, С.81-92.; Кароматов И.Д., Давлатова М.С.Лекарственные растения с противогельминтной и противоэхиноккозной активностью // Биология и интегративная медицина. - 2018. - №11. - С.116-130.).

Недавние исследования китайских ученых установили высокий антивирусный потенциал полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) против коронавирусной инфекции (см. Haq F.U., Roman M., Ahmad K., Rahman S.U., Shah S.M.A., Suleman N., Ullah S., Ahmad I. and Ullah W. (2020). Artemisia annua: Trials are needed for COVID-19. Phytotherapy Research 34(10), 2423-2424. https://doi.org/10.1002/ptr.6733; Orege J.I., Adeyemi S.B., Tiamiyu B.B., Akinyemi T.O., Ibrahim, Y.A. & Orege O.B. (2021). Artemisia and Artemisia-based products for COVID-19 management: current state and future perspective. Advances in Traditional Medicine. Springer.; Jia S., Luo H., Liu X., Fan X., Huang Z., Lu S., Shen L., Guo S., Liu Y., Wang Z., Cao L., Cao Z., Zhang X., Zhou W., Zhang J., Li J., Wu J., Xiao W. (2021). Dissecting the novel mechanism of reduning injection in treating Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) based on network pharmacology and experimental verification. Journal of Ethnopharmacology 273. https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.113871; Benkhaira N., Koraichi S.I. and Fikri-Benbrahim K. (2021). Ethnobotanical survey on plants used by traditional healers to fight against covid-19 in fez city, northern morocco. Ethnobotany Research and Applications 21. https://doi.org/10.32859/era.21.27.1-18).

На лекарственные свойства полыни во многом влияют содержащиеся в них эфирные масла и сесквитерпеновые лактоны (см. Сальникова Е.Н., Калинкина Г.И., Дмитрук С.Е. Химическое исследование флавоноидов полыни горькой (Artemisia absinthium L.), П. сиверса (A. sieversiana Willd.) и П. якутской (A. jacutica Drob.) // Химия растительного сырья. - 2001. - №3. - С.71-78). Эти свойства демонстрируют большую перспективность для дальнейшего использования в медицине, к примеру, противоопухолевый препарат «Арглабин» был разработан на основе сесквитерпенового γ-лактон - арглабина, выделенного из полыни гладкой (Artemisia glabella Kar.et Kir), эндемика Казахтанской флоры (см. Adekenov S. M. Artemisiaglabella Kar. Et Kir. - a source of the new antitumor preparation «Arglabin» // Phytomedicine. 2000. Vol.7. P. 103.; Randalova T.E., Atazhanova G.A., Adekenov S.M., Zhigzhitzhapova S.V., Radnaeva L.D. A the Chemical Composition of Plants of the Genus Artemisia containing Arglabin of Russian (Buryatia) and Kazakhstan’s floras // Czech Chem. Soc. Symp.Ser. - 2015. - N13. - P.163-173.). Кроме того, растения богаты фенольными соединениями, а именно флавоноидами, обладающими широким диапазоном биологической активности.

Известно, что в условиях Якутии биомасса полыни обыкновенной на сырой вес содержит: эфирное масло до 0,61%, аскорбиновую кислоту до 175 мг %, а также каротин, кумарины, сапонины и немного дубильных веществ. Листья содержат: до 130 мг % аскорбиновой кислоты и 11 мг % каротина, в них содержание эфирного масла достигает до 0,04-0,05%. В состав эфирного масла входят, в %: камфора (38,05), борнеол (6,21), окись кариофиллена (5,47), β-панасинсен (4,81), гермакрен D (4,49), α-пинен (0,81), камфен (3,75-5,25), неоинтермедиол (3,79-5,55) п-цимол (0,63), 1,8-цинеол (2,13), линалоол (0,71), транс-сабиненгидрат (0,37), терпинеол-4 (3,15), пиперитон (1,68), борнилацетат (1,43), лонгипинен (1,53), α-копаен (0,91), кариофиллен (1,16), β-селинен (2,09), пресилферфолан-9-α-ол (3,04), спатуленол (6,82-10,70), гексадеканаль (1,10), β-пинен (0,53), п-цимола (0,6), транс-β-оцимена (0,23) (см. Жигжитжапова С. В., Соктоева Т.Э., Раднаева Л.Д., Тараскин В.В., Намзалов Б.-Ц.Б. Фитохимическая характеристика полыни обыкновенной Artemisia vulgaris L., произрастающей на территории Бурятии // Вестник Бурятского государственного университета. Философия. - 2012. - №SC. С.74-77. doi:10.24412/Fgkb_GAP538; Жигжитжапова С. В., Намзалов Б.-Ц.Б., Дыленова Е.П., Раднаева Л.Д. Состав эфирных масел полыней рода Artemisia секции Artemisia (семейство Asteraceae), произрастающих в республике Бурятия // Химия растительного сырья. - 2018. - №2. - С.45-54.).

Выделяемое эфирное масло жидкое, обладает светло-желтым цветом и слабым запахом (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии. - Якутск: Якутское кн. изд-во, 1970. -178 с.). В фитомассе полыни обыкновенной также было обнаружено содержание артемизина - вещества, обладающего антиоксидантными свойствами (см. Федоров А.А., Ефремова М.И., Чирикова Н.К. Химический состав Уерэ ото (Artemisia vulgaris L.) как пищевого и лекарственного растения Якутии // Фундаментальные исследования. - 2014. - №11. - С. 1981-1983; Демидова Е.И., Кисилева А.Н., Стрелычева К.А., Коган Е.Г. Отдельное фармакогностическое изучение нефармакопейных лекарственных растений: белокопытник гибридный и полынь обыкновенная // Смоленский медицинский альманах. - 2017. - №1. С. 108-112).

При этом из открытых источников технические решения в области культивирования суспензионной культуры Artemisia vulgaris L. и получаемому штамму не выявлены.

Косвенными аналогами можно считать: 1) суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцы стелющиеся (Tribulus terrestris L.) (см. RU №2617956, кл. C12N 5/14, А01Н 5/00, опубл. 28.04.2017); 2) штамм суспензионных культур клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) (см. RU №2729981, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.08.2020). Известные штаммы характерны относительно низким индексом роста.

Задачей настоящего изобретения является получение суспензионной культуры клеток представителя рода Artemisia L. - Artemisia vulgaris L., в условиях мульти-шейкера с устойчивыми морфологическими и ростовыми характеристиками.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм суспензионной культуры Artemisia vulgaris L. (NEFU-Avul-1) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм суспензионной культуры Artemisia vulgaris L. (NEFU-Avul-1) впервые получен в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, включая оптимизацию питательной среды, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик.

Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу были взяты 5-недельные каллусы, полученные из листовых эксплантов стерильных проростков in vitro, индуцированные из семян центрально-якутской популяции дикорастущего представителя Artemisia vulgaris L.

Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре показана графическая схема в нормальной системе координат кривой роста суспензионной культуры Artemisia vulgaris L. при выращивании в колбах объемом 250 мл.

Для получения суспензионной культуры в качестве экспланта была взята каллусная культура листового происхождения, в асептических условиях при помощи пинцета в колбу с питательной средой (MS, с 0,5 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л НУК) помещали кусочек каллуса размером примерно 5-10 мм, после чего ставили их в шейкер для постоянного перемешивания при скорости 120 об/мин. Спустя 4 недели, при отсутствии признаков разрыхления каллуса до достояния суспензии, первичную суспензионную культуру пересаживают, со степенью разведения первичная культура:свежая питательная среда как 1:3. До разрыхления каллуса до состояния суспензии, среду меняют до 3-4 раз.

После перехода каллуса в суспензию, из полученной первичной суспензионной культуры, извлекали примерно 20 мл суспензии на 100 мл свежей питательной среды MS с составом гормонов 0,2 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК. При этом культивирование суспензии проводят в условиях темноты, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, на шейкере (PSU-20i, Орбитальный шейкер; BioSan, Латвия) при скорости перешивания 100±20 об/мин, цикл субкультивирования составляет 3 недели. Изобретение позволяет получить суспензионную культуру клеток полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) в условиях in vitro.

Состав питательной среды представлен в таблице 1.

Таким образом, получена суспензионная культура клеток Artemisia vulgaris L. из каллусных культур листового происхождения. Во время процесса оптимизации питательной среды были определены цитологические и ростовые характеристики. Исходя из этих данных культивируемый штамм можно отнести к жизнестойким и интенсивно растущим (см. диаграмму роста на фигуре и параметры роста в - таблице 2). Кроме того, суспензионная культура характеризуется стабильными ростовыми характеристиками и отсутствием сезонной зависимости.

Штамм суспензионной культуры клеток имеет следующие морфологические признаки: суспензионная биомасса преимущественно неморфогенная, однородная, бледной зеленовато-бежевой окраски. Состоит из дедифференцированных агрегатов паренхимоподобных иногда меристемоподобных клеток, а также содержит одиночные паренхимоподобные и меристемоподобные клетки. Форма клеток округлая и/или вытянутая и/или червеобразно-удлиненная.

Таблица 1
Состав питательной среды (NH₄NO₃) 1650 мг/л (KNO₃) 1900 мг/л (CaCl₂) 440 мг/л (MgSO₄x7H₂O) 370 мг/л (KH₂PO₄); 170 мг/л (MnSO₄x4H₂O) 22,3 мг/л (H₃BO₃) 6,2 мг/л (ZnSO₄x7H₂O) 8,6 мг/л (Na₂MoO₄x2H₂O) 0,25 мг/л (CuSO₄x5H₂O); 0,025 мг/л (CoCl₂ · 6Н₂О) 0,025 мг/л (KI) 0.83 мг/л (FeSO₄x7H₂O) 5,57 мг/л (Na₂ЭДТАx2H₂O) 7,45 мг/л Тиамин 0,1 мг/л Пиридоксин 0,5 мг/л Никотиновой кислота 0,5 мг/л Сахароза 30 г/л Инозитол 100 мг/л Гидролизат лактальбумина 500 г/л Нафтилуксусная кислота 0,5 мг/л 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота 0,5 мг/л 6-бензиламинопурин 0,2 мг/л Вода

Таблица 2
Ростовые характеристики суспензионной культуры Artemisia vulgaris L. Продолжительность культивирования, сутки Сырая биомасса,
г/мл 100 Сухая биомасса,
г/мл 100 1 1,0583 0,0473 20 38,9967 1,3582

Таблица 3
Сравнение индекса роста суспензионных культур разных видов растений Видовое название растений, номер штамма суспензионной культуры клеток Индекс роста
(по весу сухой биомассы, в г) Tribulus terrestris L. (RU2617956C2) 8,1 Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. (RU2729981C1) 9,98 Artemisia annua L. (NEFU-Avul-1) 22,37

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен штамм NEFU-Avul-1 суспензионных культур клеток полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Института физиологии растений РАН, регистрационный номер 117. Штамм используется для получения биомассы клеток Artemisia vulgaris L., характеризуется стабильными ростовыми и физиологическими параметрами, индекс роста в два раза выше, чем у аналогов. Культивируемые клетки не имеют сезонной зависимости. Заявленное изобретение может быть использовано в качестве растительного лекарственного сырья для получения вторичных метаболитов. 1 ил., 3 табл.

Штамм суспензионной культуры клеток полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.), регистрационный номер ВККК ВР 117 – для получения биомассы клеток.