Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. для получения биомассы клеток Российский патент 2020 года по МПК C12N5/00 

Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. для получения биомассы клеток

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию клеток растения вздутоплодника сибирского и может быть использовано для получения биомассы клеток Phlojodicarpus sibiricus.

Вздутоплодник сибирский зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств РФ в качестве лекарственного растительного сырья. Корневища и корни вздутоплодника сибирского обладают вазодилатирующими (сосудорасширяющими), гипотензивными, адренолитическими и спазмолитическими свойствами и использовались при производстве препаратов спазмолитического действия «Димидин» и «Фловерин», а также комплексного препарата сердечно-сосудистого действия «Сафинор». В настоящее время производство названных препаратов приостановлено из-за отсутствия сырья. В свою очередь, вздутоплодник сибирский занесен в Красную книгу Якутии. Заготовка его в природе может привести к уничтожению природных популяций.

Из литературы также известно, что корни растения вздутоплодника накапливают тяжелые металлы: цинк, никель, селен и молибден, соответственно, использование растений, произрастающих на не контролируемых участках, может нести большой риск для здоровья человека (см. Алексеева С.И. Перспективы получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского // Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Годичное собрание ОФР, науч. конф. и школа для мол. уч., 18-24 сент. 2017 г., Судак: сб. мат. докл. / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов – М: Изд-во АНО «Центр содействия научной, образовательной и просветительской деятельности «Соцветие», 2017. - 393 с).

Вздутоплодник сибирский растет по склонам сопок, в танацетовых степях и среди разнотравья лесостепей, моховолишайниковой тундре и в сухих руслах рек (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.). Ареал произрастания вздутоплодника сибирского делят на три фрагмента: селенгинский, даурский и забайкальский. Существуют отдельные очаги произрастания растения на территориях Красноярского края, Читинской и Иркутской областей, в Якутии и на западе Амурской области. Основные запасы лекарственного сырья вздутоплодника сибирского находятся в Читинской области.

Корни и корневища вздутоплодника сибирского содержат кумарины и пиранокумарины (винсадин и дигидросамидин, изофлоидикарпин, скополетин, умбеллиферон), эфирные масла, гликозиды (мениантин и мелиатин), флавоновые гликозиды (рутин, гиперозид), уксусная и изовалериановая кислота, крахмал. Эфирное масло вздутоплодника сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Растение концентрирует железо, цинк, никель, селен и молибден (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.).

Кроме того, известен способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro (см. RU № 2666920, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.09.2018).

При этом авторами из открытых источников не обнаружено сведений о способах получения каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) с характерными морфологическими параметрами и отсутствием сезонной зависимости их получения.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм каллусной культуры клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) впервые получен в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик культур клеток.

Штамм культуры клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институте физиологии растений РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, регистрационный номер 96.

Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты асептические проростки, выращенные из семян вздутоплодника сибирского, которые помещают в агаризованную питательную среду в качестве экспланта. В результате был получен штамм каллусной культуры клеток со следующими биотехнологическими характеристиками: жизнеспособность 70 %, индекс роста 4,14, продуктивность 0,29 г/(л×сут), в стандартных условиях не обладает морфогенным потенциалом.

Таким образом, каллусные культуры клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) получены из асептических проростков, выращенных из семян вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) южно-якутской популяции.

Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре 1 представлено изображение каллусной культуры клеток P. sibiricus листового происхождения; на фигуре 2 - каллусной культуры клеток P. sibiricus гипокотильного происхождения; на фигуре 3 - каллусной культуры клеток P. sibiricus корневого происхождения.

Семена стерилизовали 0,5 % раствором натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты («Жавельон/НовелтиХлор», Франция) в течение 10 мин, промывали стерильной дистиллированной водой и высевали на агаризованную среду Мурасиге-Скуга (MS) без добавления фитогормонов. Семядольные листья, гипокотили и корни асептических проростков использовали для получения каллусной культуры клеток.

Каллусную культуру клеток индуцировали на чашках Петри с агаризованной средой MS, дополненной 2,4-Д (1 мг/л) и БАП (0,5 мг/л).

Состав агаризованной питательной среды:

NH₄NO₃ 1650 мг/л KNO₃ 1900 мг/л MgSO₄x7H₂O 370 мг/л KH₂PO₄ 170 мг/л CaCl₂x2H₂O 440 мг/л H₃BO₃ 6,2 мг/л MnSO₄x4H₂O 22,3 мг/л ZnSO₄x4H₂O 8,6 мг/л KI 0,83 мг/л Na₂MoO₄x2H₂O 0,25 мг/л CuSO₄x5H₂O 0,025 мг/л CoCl₂x6H₂O 0,025 мг/л FeSO₄x7H₂O 27,8 мг/л Na-ЭДТА 37,3 мг/л Инозитол 100 мг/л Тиамин 0,1 мг/л Пиридоксин 0,5 мг/л Никотиновая кислота 0,5 мг/л Сахароза 30 г/л Агар 8 г/л

Получены каллусные культуры клеток листового, гипокотильного и корневого происхождения (см. фиг. 1, 2, 3).

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве используют 1/3 каллусных культур.

В первичной каллусной культуре (первые 2 цикла культивирования) наблюдали ризогенез, в процессе отбора морфогенный потенциал исчез. В последующие циклы культивирования в стандартных условиях (согласно паспорту) каллусная культура характеризируется преобладанием клеток меристемоподобного типа.

Анализ роста каллусной культуры клеток вздутоплодника сибирского проводили по показателю сухой биомассы.

Индекс роста (I):

I=X_max/X₀, где X_max и X₀ – количество биомассы в начале цикла выращивания и максимальное ее значение, соответственно.

Индекс роста по сухой массе(I_ms):

I_ms=5,8/1,4=4,14

Удельная скорость роста (µ, сут.^-1) равна тангенсу угла наклона экспоненциальной фазы ростовой кривой в полулогарифмической системе координат:

µ=tgα/t, где t – время культивирования (сут.^-1)

Удельная скорость роста по сухой массе:

µ_ms=(1,53-0,33)/12=0,1 сут.^-1

Время удвоения биомассы (τ, сут.) – зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения: τ=ln2/µ.

Время удвоения биомассы по показателю сухой массы:

τ_ms=ln2/ 0,1 сут.^-1= 6,9 сут.

Продуктивность P – максимальное значение Pi = (Xi − Xo) / (ti −to), где Xo и Xi − содержание сухой биомассы в начале культивирования и в момент времени ti , соответственно. Результаты представлены в таблице.

Штамм вздутоплодника сибирского обладает следующими признаками: наличие как рыхлых, так и плотных участков ткани; окраска каллусов была преимущественно бело-желтого цвета, в процессе культивирования наблюдалось появление коричневых участков каллусной ткани. Жизнеспособность клеток в течение цикла составила не ниже 70%.

Таким образом, была впервые получена каллусная культура клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.). Удобство такого способа получения каллусов состоит в отсутствии сезонной зависимости от роста интактных растений и в сохранении их природного ареала.

Таблица

Производные параметры роста каллусных культур клеток

вздутоплодника сибирского

Показатель роста Производные параметры роста I µ^* (сут.^-1) τ, (сут.) P, г/(л×сут) Сухая биомасса 4,14 0,1 6,9 0,29

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol., полученный в условиях in vitro, идентифицированный и депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институте физиологии растений РАН, регистрационный номер 96. Штамм используется для получения биомассы клеток Phlojodicarpus sibiricus и отличается наличием как рыхлых, так и плотных участков ткани, окраской каллусов преимущественно бело-желтого цвета, причем, в процессе культивирования наблюдается появление коричневых участков каллусной ткани. Жизнеспособность клеток в течение цикла составляет не ниже 70 %. 3 ил., 1 табл.

Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol., регистрационный номер ВККК ВР 96, для получения биомассы клеток.