Способ первичного посева клинического материала для выделения нетуберкулезных микобактерий Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для первичного посева клинического материала для выделения нетуберкулезных микобактерий.

Уровень техники

Нетуберкулезные микобактерий - разнообразная группа микроорганизмов, отличающихся культуральными, биологическими и морфологическими свойствами. По данным ряда авторов около 90 видов могут иметь потенциальное или доказанное клиническое значение [Н. Jorgensen, М.А. Pfaller, Karen С.С.et al. Manual of clinical microbiology. 11th ed./ Washington, DC: ASM Press, cop. 2015. 2 vol.]. В Российской Федерации используются стандартные методы выделения нетуберкулезных микобактерий, основанные на деконтаминации клинического материала перед посевом на яичные среды и в жидкие среды для культивирования микобактерий туберкулезного комплекса [Приказ Минздрава России от 21.03.2003 N 109 (ред. от 05.06.2017) "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"]. Зарубежные авторы описывают возможность культивирования нетуберкулезных микобактерий на обычных средах [Lynne S. Garcia. Editor in chief, original and second editions, / editor in chief Henry D. Isenberg Clinical microbiology procedures handbook-2nd ed. update) ASM Press American Society for Microbiology 2007; 311-320].

Однако, при этом, если не использовать предварительную деконтаминацию, сопутствующая микрофлора, находящаяся в клиническом материале, значительно затрудняет выделение нетуберкулезных микобактерий.

В связи с вышеописанными особенностями необходим поиск новых способов первичного посева клинического материала для выделения нетуберкулезных микобактерий.

Известен способ первичного посева клинического материала с предварительной деконтаминацией и последующим посевом на плотные питательные среды (Левенштейна-Йенсена и Финн-2), а также в жидкую питательную среду Миддлбрука [Приказ Минздрава России от 21.03.2003 N 109 (ред. от 05.06.2017) "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"].

Недостатками данного способа является необходимость проведения деконтаминации при работе с нестерильным в норме клиническим материалом, которая может снизить ростовые свойства нетуберкулезных микобактерий и привести к получению ложноотрицательных результатов, т.к. часть нетуберкулезных микобактерий, особенно быстрорастущих, обладают чувствительностью к действию используемых деконтаминантов, и, как следствие, они не будут выделены из клинического материала при описанном способе посева [Н. Jorgensen, М.А. Pfaller, Karen С.С.et al. Manual of clinical microbiology. 11th ed./ Washington, DC: ASM Press, cop.2015. 2 vol.].

В научной литературе имеются данные о возможности культивирования микроорганизмов, не заявленных производителем на универсальных хромогенных средах. Так описан способ культивирования бактерий рода Leptotrichia на поверхности пластинчатой среды «Уриселект» [Патент на изобретение №2441908 RU, Способ культивирования бактерий рода Leptotrichia - резидентов микрофлоры полости рта].

Недостатком данного способа является отсутствие данных о возможностях культивировании нетуберкулезных микобактерий на универсальных хромогенных средах.

Известен способ посева клинического материала на селективную среду для выделения Burkholderia cepacia complex, который позволяет выделять некоторые быстрорастущие нетуберкулезные микобактерий без предварительной деконтаминации [Charles R. Esther Jr. Detection of rapidly growing mycobacteria in routine cystic fibrosis cultures JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 2011, p. 1421-1425]. Данный способ принимается за прототип.

Недостатками данного способа является ограничение ростовых свойств основы селективных сред для культивирования Burkholderia cepacia complex, что не позволяет выделять медленнорастущие нетуберкулезные микобактерий, требующие дополнительных ростовых факторов.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является улучшение выделения нетуберкулезных микобактерий из клинического материала при первичном посеве.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов клинический материал без предварительной деконтаминации засевается на плотную питательную среду «Uriselect 4» с селективной добавкой, содержащей 200 ME бацитрацина и 300000 ME полимиксина сульфата из расчета на 1000 мл готовой среды. Посевы инкубируются при температуре 37°С в течение 7 суток, с последующим доращиванием культур при температуре 28°С в течение 21 суток.

Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ посева с использованием универсальной хромогенной среды и селективной добавки позволяет выделить нетуберкулезные микобактерий при первичном посеве без проведения предварительной деконтаминации материала.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного способа заключается в следующем: клинический материал, полученный от пациента, без предварительной деконтаминации засевают на плотную питательную среду «Uriselect 4» с селективной добавкой, содержащей 200 ME бацитрацина и 300000 ME полимиксина сульфата из расчета на 1000 мл готовой среды с последующим культивированием посевов при температуре 37°С в течение 7 суток и в дальнейшем доращиванием посевов при температуре 28°С в течение 21 суток. Посевы ежедневно просматриваются на предмет наличия роста микроорганизмов. В случае появления роста проводится идентификация выросших культур с использованием биохимических, молекулярно-генетических или протеомных методов.

Предлагаемый способ позволяет осуществлять первичный посев клинического материала для выделения нетуберкулезных микобактерий без проведения предварительной деконтаминации.

Использование предлагаемого способа не требует применения дорогостоящего оборудования, позволяет получить рост нетуберкулезных микобактерий при первичном посеве клинического материала.

Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующих примерах:

Пример 1.

Пациент С, 69 лет. Диагноз: хроническая обструктивная болезнь легких, тяжелое течение. В лабораторию поступил клинический материал - бронхоальвеолярный лаваж. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом.

В результате посева способом, описанном в прототипе на селективной питательной среде для выделения Burkholderia cepacia complex (OFPBL-агар) роста микрофлоры не выявлено.

При посеве предлагаемым способом на 14 сутки культивирования выявлен рост микроорганизма, идентифицированного с использованием MALDI ToF масс-спектрометра как Mycobacterium avium.

Пример 2.

Пациент П., 10 лет. Диагноз: муковисцидоз, легочная форма, тяжелое течение. В лабораторию поступил клинический материал, представленный мокротой.

При посеве с деконтаминацией на среды Левеншейн-Йенсен и Финн-2 получен рост культуры P. aeruginosa на 2-е сутки культивирования. При последующем культивировании дополнительной микрофлоры выявлено не было.

При посеве предлагаемым способом на 6 сутки культивирования выявлен рост чистой культуры Mycobacterium abscessus, идентифицированной с использованием MALDI ToF масс-спектрометра.

Дополнительно проведено исследование, подтверждающее возможность выделения предлагаемым способом при первичном посеве из клинического материала следующих видов нетуберкулезных микобактерий: М chelonae, М. farcinogenes, М. abscessus, М. gordonae, М. avium, М. kansasii, М. chimaera, М. intracellulare, М. peregrinum, М. fortuitum, М. frederiksbergense, М. szulgai, М. porcinum, М. bohemicum, М. marseillense, М. celatum, М. europaeum, М. monacense, М. scrofulaceum, М. senegalense.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предложен способ первичного посева клинического материала пациента для выделения нетуберкулезных микобактерий. Способ включает посев клинического материала без предварительной деконтаминации на плотную питательную среду «Uriselect 4», содержащую 200 ME бацитрацина и 300000 ME полимиксина сульфата из расчета на 1000 мл готовой среды, с последующим культивированием посевов при 37°С в течение 7 суток и в дальнейшем доращиванием посевов при 28°С в течение 21 суток. Изобретение обеспечивает идентификацию нетуберкулезных микобактерий на универсальных хромогенных средах. 2 пр.

Способ первичного посева клинического материала на плотные питательные среды, отличающийся тем, что клинический материал, полученный от пациента, без предварительной деконтаминации засевают на плотную питательную среду «Uriselect 4» с селективной добавкой, содержащей 200 ME бацитрацина и 300000 ME полимиксина сульфата из расчета на 1000 мл готовой среды, с последующим культивированием посевов при температуре 37°С в течение 7 суток и в дальнейшем доращиванием посевов при температуре 28°С в течение 21 суток.