СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА БИОМАТЕРИАЛА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПОЛОСТИ РТА ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ ПРИ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОМ ОБСЛЕДОВАНИИ Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и стоматологии, и может быть использовано для первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с муковисцидозом при стоматологическом обследовании.

Уровень техники

Известны способы первичного посева биоматериала, выделенного из дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием различных комбинаций наборов питательных сред: кровяного агара, шоколадного агара, универсальной хромогенной среды, селективной среды для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом, среды Сабуро; Мак-Конки, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, дезоксирибонуклеазной среды; с использованием агара Сабуро, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, среды Левенштейна-Йенсена; с использованием кровяного агара, шоколадного агара, агара Эндо, желточно-солевого агара, агара Сабуро, цетримидного агара и селективной среды BCSA для Burkholderia cepacia.

Известен способ первичного посева биоматериала с использованием кровяного агара, шоколадного агара, агара Эндо, желточно-солевого агара, агара Сабуро, цетримидного агара и селективной среды BCSA для Burkholderia cepacia. Суть способа заключается в первичном посеве биоматериала на чашки Петри с вышеуказанными средами с последующей инкубацией при 28-37°C. [Национальный консенсус «Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия», Москва, 2016 год].

Недостатками данного метода является отсутствие сред для культивирования анаэробов. Кроме того, часть сред являются дублирующими друг друга по ростовым свойствам искомых микроорганизмов.

Известен способ первичного посева биоматериала, выделенного с дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием 5 питательных сред: агара Мак-Конки, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, дезоксирибонуклеазной среды. Суть метода заключается в первичном посеве биоматериала на чашки Петри с вышеуказанными средами с последующей инкубацией при 35-37°C. [Lisa Saiman, Jane Seigel. Infection Control Recommendations for Patients With Cystic Fibrosis: Microbiology, Control Practices to Prevent Patien-to-Patient Transmission. The Official Journal of the Society for Healthcare Epidemiology of America. May 2003, Vol. 24, №5].

Недостатками данного способа являются отсутствие в предлагаемой схеме питательных сред для культивирования грибов и анаэробов, что ограничивает возможности их выделения из биоматериала.

Известен способ первичного посева биоматериала, выделенного из дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием 5 питательных сред: агара Сабуро, маннитолового солевого агара, селективной среды для Burkholderia cepacia, шоколадного агара, среды Левенштейна-Йенсена. Суть метода заключается в первичном посеве биоматериала на чашки Петри с вышеуказанными средами с последующей инкубацией при 28-37°C [Laboratory Standarts for Processing Microbiological Samples from People with cystic fibrosis. First edition. September 2010].

Недостатками указанного способа является отсутствие питательных сред для первичного выделения энтеробактерий и ряда других грамотрицательных палочек, а также гемолизирующих стрептококков и анаэробов.

За прототип принимается способ первичного посева биоматериала, выделенного с дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием 5 питательных сред: кровяного агара, шоколадного агара, универсальной хромогенной среды, селективной среды для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом, среды Сабуро. Суть метода заключается в посеве гомогенизированного материала из нижних дыхательных путей пациентов с муковисцидозом с использованием техники посева «штрихом» на поверхность чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, шоколадным агаром, универсальной хромогенной средой, селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом. Затем засеянные чашки с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, универсальной хромогенной средой инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов. Чашки с шоколадным агаром инкубируются при 35°С в атмосфере 5-7% СО₂ в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов. Засеянные чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубируются 24-48 часов при температуре 37°С, далее инкубируются до 14 суток при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов. На поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфинеколом производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов [Патент РФ на изобретение №2668406, заявка 2017122657, 27.06.2017, опубл.: 28.09.2018, Бюл. №28]. Недостатками данного способа является отсутствие в предлагаемой схеме питательных сред для анаэробов, что ограничивает возможности их выделения из биоматериала, а также отсутствие сред для выделения специфичной для полости рта микрофлоры.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является улучшение диагностики инфекционных стоматологических осложнений у пациентов с муковисцидозом путем получения в первичном посеве отделяемого из полости рта от пациентов с муковисцидозом максимального количества клинически значимых микроорганизмов. Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ посева с использованием предлагаемого набора питательных сред позволяет одномоментно выделить при первичном посеве микроорганизмы, имеющие клиническое значение при муковисцидозе: бактерии родов Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Achromobacter, Chryseobacterium, Brevundimonas, Inquilinus, Kingella, Staphylococcus, Mycobacterium, энтеробактерии и грибы, а также микроорганизмы, имеющие клиническое значение в развитии стоматологических заболеваний, в частности кариеса и заболеваний пародонта, такие как Capnocytophaga spp., Eikenella spp., Veilonella spp., Actinomyces spp., Aggregatibacter spp, Streptococcus spp., Porphyromonas spp. большинство из которых является облигатными анаэробами.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов первичного посева биоматериала, выделенного с дыхательных путей пациентов с муковисцидозом используется набор из 9 питательных сред, включающий: 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью [Atlas, Ronald M., 1946 -. Handbook of microbiological media. - Taylor & Francis, 2010-01-01], универсальную хромогенную среду [1. Pezzlo M (1998), Clinical Microbiology Reviews 1:268-280; 2. Wilkie M.E., Almond M.K., Marsh F.P. (1992),British Medical Journal 305:1137-1141; 3. Friedman M.P. et al. (1991), Journal of Clinical Microbiology, 29:2385-2389; 4. Murray P., Traynor P. Hopson D., (1992), Journal of Clinical Microbiology 30:1600-1601; 5. Soriano F., Ponte C., (1992), Journal of Clinical Microbiology 30:3033-3034; 6. Merlino et al. (1995) Abstr. Austr. Microbiol. 16(4):17-3.], селективную среду для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) содержащую бацитрацин и полимиксина сульфат [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2012/12473], Veilonella-агар [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03709], агар для анаэробов [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03707], Clostridium-агар [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03707], агар для лактобактерий [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03709], агар для бифидобактерий [Регистрационное удостоверение на медицинское изделие ФСЗ 2009/03707], а также агар Сабуро с хлорамфениколом.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного метода заключается в следующем: на поверхность двух чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, двух чашек с универсальной хромогенной средой, по одной чашке с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом, Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий производится посев биоматериала из ротовой полости пациентов с муковисцидозом, взятого при стоматологическом обследовании, с использованием техники посева «штрихом»; на поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов; затем по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов; чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубируются в аэробных условиях 24-48 часов при температуре 37°С, далее инкубируются до 14 суток при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов; по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашки с Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий инкубируются в анаэробных условиях 120 часов при температуре 37°С с просмотром после окончания срока инкубирования.

Предлагаемый способ позволяет получать точные качественные и количественные характеристики состояния микробиоценоза полости рта пациентов с муковисцидозом для улучшения диагностики инфекционных осложнений у данной группы больных.

Это может быть необходимо для проведения регулярного микробиологического мониторинга пациентов с муковисцидозом, а также для статистических исследований в рамках ведения ежегодного единого Регистра больных муковисцидозом в Российской Федерации [проект Регистр больных муковисцидозом Российской Федерации одобрен Комитетов по Этике ФГБНУ «МГНЦ» 20 декабря 2012 года].

В предложенном способе первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с муковисцидозом при стоматологическом обследовании предусмотрены следующие отличия: использование питательных сред для культивирования анаэробных микроорганизмов - Veilonella-агара, агара для анаэробов, Clostridium-агара, агара для лактобактерий, агара для бифидобактерий с применением культивирования в анаэробных условиях позволяет выявлять и дифференцировать парадонтопатогенные и кариесогенные виды бактерий, а использование универсальной хромогенной среды, 5% кровяного агара с дефибринированной бараньей кровью и селективной среды для культивирования Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом в дополнение к вышеуказанных средам позволяет выявлять в посеве возбудителей, специфичных для муковисцидоза, таких как Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Burkholderia spp., Chryseobacterium spp. и некоторых других редко встречающихся неферментирующих грамотрицательных бактерий.

Осуществление предлагаемого способа можно продемонстрировать на следующих примерах:

Пример 1.

Пациент Ф., 12 лет. Диагноз: муковисцидоз, смешанная форма, тяжелое течение. В лабораторию поступил материал, полученный при стоматологическом исследовании - отделяемое десневой борозды. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом.

Были получены следующие результаты:

Способ посева, указанный в прототипе Предлагаемый нами способ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В АЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью Escherichia coli 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Escherichia coli 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Селективная среда для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом Роста нет Роста нет Универсальная хромогенная среда Escherichia coli 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Escherichia coli 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Шоколадный агар Escherichia coli 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Агар Сабуро с хлорамфинеколом Роста нет Роста нет КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью Escherichia coli 10⁴
Streptococcus anginosus 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Универсальная хромогенная среда Escherichia coli 10⁴
Streptococcus anginosus 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Veilonella-агар Veilonella parvula 10⁴ Агар для анаэробов Capnocytophaga ochracea 10⁴
Eikenella corrodens 10⁴
Streptococcus anginosus 10⁴
Streptococcus oralis 10⁴
Streptococcus mitis 10⁴ Clostridium-агар Escherichia coli 10⁴
Streptococcus anginosus 10⁴
Capnocytophaga ochracea 10⁴ Агар для лактобактерий Streptococcus gordonii 10⁴
Eikenella corrodens 10⁴
Lactobacillus salivarius 10⁴ Агар для бифидобактерий Veilonella parvula 10⁴
Eikenella corrodens 10⁴

Таким образом, благодаря применению предлагаемого нами способа был получен рост 9 микроорганизмов на питательных средах, в то время как при использовании способа, указанного в прототипе, был получен рост 3 культур. При использовании предлагаемого нами способа посев был получен рост клинически значимой анаэробной парадонтопатогенной флоры - Veilonella parvula, Capnocytophaga ochracea, Eikenella corrodens, Streptococcus gordonii, Streptococcus anginosus, что было бы невозможно получить при использовании только перечня питательных сред, указанного в прототипе, ввиду метаболических особенностей, указанных микроорганизмов. Возможность своевременного выявления данных бактерий, и, как следствие, назначение терапии может способствовать снижению числа бактериально-ассоциированных стоматологических осложнений у пациентов с муковисцидозом.

Пример 2:

Пациент А., 16 лет, Диагноз: муковисцидоз, смешанная форма, тяжелое течение. В лабораторию поступил материал, полученный при стоматологическом исследовании - отделяемое протока правой околоушной слюной железы. Произведен первичный посев двумя способами: способом, описанном в прототипе, а также предлагаемым нами способом.

Были получены следующие результаты:

Способ посева, указанный в прототипе Предлагаемый нами способ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В АЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью Rothia mucilaginosa 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Rothia mucilaginosa 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Селективная среда для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом Burkholderia cenocepacia 10³ Burkholderia cenocepacia 10³ Универсальная хромогенная среда Rothia mucilaginosa 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Rothia mucilaginosa 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Шоколадный агар Rothia mucilaginosa 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Агар Сабуро с хлорамфинеколом Candida albicans 10³ Candida albicans 10³ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью Streptococcus intermedius 10³
Streptococcus gordonii 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Универсальная хромогенная среда Streptococcus intermedius 10³
Streptococcus gordonii 10³
Streptococcus salivarius 10³
Streptococcus pasasanguinis 10³ Veilonella-агар Veilonella atypica 10³ Агар для анаэробов Actinomyces odontolyticus 10³ Clostridium-агар Streptococcus intermedius 10³
Streptococcus gordonii 10³
Aggregatibacter aphorophilis 10³ Агар для лактобактерий Actinomyces odontolyticus 10³
Lactobacillus salivarius 10³ Агар для бифидобактерий Actinomyces odontolyticus 10³
Aggregatibacter aphorophilis 10³

Таким образом, благодаря предлагаемому нами способу, был получен рост 11 микроорганизмов на питательных средах, в то время как при использовании способа, указанного в прототипе, был получен рост 5 культур. Среди выделенных с использованием предлагаемого нами способа посева бактерий были представители парадонтопатогенной флоры - Actinomyces odontolyticus, Aggregatibacter aphorophilis, Streptococcus intermedius, Streptococcus gordonii, Veilonella atypica. Из приведенного перечня возбудителей при посеве с использованием только перечня сред из способа, указанного в прототипе, невозможно получение роста указанных микроорганизмов ввиду их метаболических особенностей.

Таким образом, использование предлагаемого нами способа позволяет получать более широкий диапазон возбудителей при первичном посеве, как среди имеющих значение в развитии бактериальных осложнений при муковисцидозе, так специфических возбудителей стоматологических инфекций.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и стоматологии. Осуществляют посев на поверхность двух чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, двух чашек с универсальной хромогенной средой, по одной чашке с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом, Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий производится посев биоматериала из ротовой полости пациентов с муковисцидозом, взятого при стоматологическом обследовании, с использованием техники посева «штрихом». На поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов. Затем по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов. При этом чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубируются в аэробных условиях 24-48 часов при температуре 37°С, далее инкубируются до 14 суток при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов; по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашки с Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий инкубируются в анаэробных условиях 120 часов при температуре 37°С с просмотром после окончания срока инкубирования. Изобретение может быть использовано для первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с муковисцидозом при стоматологическом обследовании. Целью изобретения является получение точных качественных и количественных характеристик микробиоценоза полости рта пациентов с муковисцидозом. 2 пр.

Способ первичного посева биоматериала, выделенного из полости рта пациентов с муковисцидозом при стоматологическом обследовании, отличающийся тем, что на поверхность двух чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью, двух чашек с универсальной хромогенной средой, по одной чашке с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом, Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий производится посев биоматериала из ротовой полости пациентов с муковисцидозом, взятого при стоматологическом обследовании, с использованием техники посева «штрихом»; на поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производится посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 суток с ежедневными просмотрами посевов; затем по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов с ежедневным просмотром посевов; чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубируются в аэробных условиях 24-48 часов при температуре 37°С, далее инкубируются до 14 суток при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов; по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашки с Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий инкубируются в анаэробных условиях 120 часов при температуре 37°С с просмотром после окончания срока инкубирования.