Способ введения тритиевой метки в органические соединения Советский патент 1984 года по МПК C07B23/00 

эо

;о Изобретение относится к способам введения тритиевой метки в органические соединения и может найти применение в биохимии. Известен способ получения меченных тритием органических соединений согласно которому вещество, нанесенное на пористую поверхность, обрабатывают газообразным тритием, активированным разрядным методом. t Недостатком данного метода являетоя использование больших количеств газообразного трития, что значительно снижает радиохимический выход меченых соединейнй и требует специаль ньпс мер по утилизации избыточного трития и его циркуляции. Кроме того установка, применяемая в разрядном методе, сложна в аппаратурном оформлении. Наиболее близок к предлагаемому способ введения тритиевой метки в органические соединения, основанный на термической активации газообразного трития, согласно которому органическое соединение наносят в виде тонкой пленки на внутреннюю поверхность стеклянного реакционного сосуда, по оси котЪрого размещена ВОЛБфрамовая нить, зат«гм реакционный со суд вакуумируют, охлаждают жидким азотом, вводят тритий до давления торр, нагревают вольфрамовую нить до 1600-2000 К в течение 0,5 мин, удаляют избыток трития и смьШают подходящим растворителем со стенок реакционного сосудамеченое соединение, которое отмывают от лабильного трития и подвергают дальнейшей очистке. Недостатками известного способа являются трудность нанесения исходного вещества в виде тонкой пленки на стеклянную поверхность, неоднородность образующейся пленки, низкая производительность процесса, обусловленная тем, что создать достаточно тонкую пленку удается при навесках вещества не более 1 мг, высокая степень разложения вещества в процессе взаимодействия с газообра ным тритием и низкий радиохимический выход (не более 0,03%). Цель изобретения - повьшение прои водительности процесса и увеличение радиохимического выходамеченых соединений. Поставленная цель достигается 1тем, что согласно способу введения 1 02 тритиевой метки в органические соединения, заключающемуся в том, что органическое соединение, нанесенное на хроматографическую бумагу, подвергают воздействию газообразного трития, активиров ного на раскаленной вольфрамовой нити, в качестве подложки для нанесения исходных соединений используют xpo aтoгpaфичec кyю бумагу. Применение предлагаемого способа позволяет повысить производительность процесса путем увеличения количест- , ва наносимого на подложку исходного соединения до 10 мг (с 1 мг в известном способе) и радиохимический выход конечных продуктов (до 30%). Кроме того, имеется возможность получать меченные тритием соединеспособа разрушаются (например, 1,2-димиристоил-Зп-глицеро-3-фосфохолин). Способ включает следующие стадии: нанесение органического соединения на хроматографическую бумагу; помещение бумаги с нанесенным органичесКИМ соединением в реакционный сосуд; вакуумирование реакционного сосуда с одновременным охлаждением внешних стенок сосуда жидким азотом; вьгоедение газообразного трития в реакционный сосуд; активирование газообразного трития подачей напряжения на вольфрамовую нить, находящуюся внутри реакционного сосуда; откачивание избыточного газообразного трития; отключение реакционного сосуда от вакуумной системь и смывание меченого соединения с бумаги соответствующим растворителем. . Пример 1.На бумагу марки ФНС размером 220x100 мм наносят 10,0 мг 28-изокаприлоил-ЗК-рксиметил-У бутиролактона (А-фактора). Помещают ее в реакционный сосуд (диаметр 75 мм, высота 100 мм), вакуумируют, охлаждают жидким азотом. Затем напускают в реакционный сосуд газообразный тритий (50 мКи), нагревают вольфрамовую нить, размещенную вдоль оси реакционного сосуда, до 2200 К(время облучения 30 с), откаивают остаточное количество газообазного трития, вновь подают свежую орцию газообразного трития (50 мКи) повторяют облучение. После откачи избыточного газообразногр трития нимают охлаждение, смывают с филь3 - 10 тровальной бумаги вещество хлорофор мом (3x30 мл) и после хроматографической очистки на колонке со сферическим силикагелем (фракция 10-20 мкм в системе метанол-хлороформ получают 3,0 мг (30%) меченого соединения с удельной радиоактивностью 0,26 Ки /ммоль. Пример 2. На бумагу марки ФНС размером 220x100 мм наносят 6 мг тетрафторбората триэтилоксония Бумагу помещают в реакционный сосуд (диаметр 75 мм, высота 100 мм), вакуумируют, охлаждают жидким азотом, подают газообразный тритий ( мКи) нагревают вольфрамовую нить до -ч/ 2200 К (время облучения 30 с). Удаляют остатки газообразного трития, снимают охлаждение, напускают в систему инертный .газ, отсоединяют реакционный сосуд, смывают вещество с бумаги сухим хлористым метиленом и получают 1,2 мг (20%) тетрафторбо рата тризтилоксония с удельной ради активностью А Ки/ммоль. Пример 3. На бумагу марки НФС размером 220x100 мм, предварительно промытую смесью хлороформ метанол (1:1) наносят 1,75 мг 1,2димиристоил-8п-глицеро-3-фосфохолина. Бумагу с веществом помещают в реакционный сосуд (диаметр 75 мм, высота 100 MM)Jвакуумируют, охлаж. дают жидким азотом, подают газообра ный тритий двумя порциями по 10 мКи нагревая каждый раз вольфрамовую нить до л- 2200 К (время облучения 30 с). После облучения откачивают остаток газообразного трития, снимают охлаждение, отсоединяют реакционный сосуд и смывают вещество с бумаги 100 мл смеси хлороформ-метанол () отмывают от лабильного трития, упаривают досуха, остаток очищают препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле КСК , (фракция больше 150 меш) в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4). Пятно с Rf 0,40 вычищают и экстрагируют смесью хлороформ-метанол (1:1). Чистоту полученного меченого фосфолипида контролируют тонкЬслойной хроматографией на силуфоле в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4)j используя соответствующее немеченое соединение в качест ве свидетеля. В итоге получают меченое соединение с удельной радиоак тивностью 0,02 Ки/ммоль. Пример 4. 40мг этилового эфира гп-аминобензойной кислоты наносят на хроматографическую бумагу Ватман № 1 (220x100 мм). Проводят обработку аналогично примеру 1. Напуск газообразного трития (80 мКи) проводят 1 раз. Вещество смывают с бумаги этанолом и после отмывки от .лабильного трития остаток очищают и идентифицируют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем фирмы Fastman (США) в системе толуол-метанол (10:1), используя немеченый этил- п -аминобензоат в качестве свидетеля. В итоге получают конёчньй продукт с удельной радиоактивностью 0,135 Ки/ммоль. Пример 5. На фильтровальную бумагу (марка ФНС) размером 220x100 мм наносят 1 мг тРНК из Е. coti (мол. масса « 25000) и обрабатывают аналогично примеру 1, напуская газообразный тритий (30 мКи) 1 раз. Вещество смывают с бумаги водой, элюат пропускают через небольшую колонку cDEAE-целлюлрзой , адсорбированную тРНК.отмывают от лабильного трития .буферньм раствором с рН 4,5 (0,1 М NaCi, 10 мМ MaCf, 10 мМ AcONa) и затем смывают с колонки 1 М NaCl. Выход меченой тРНК 75%, удельная радиоактивность 0,3 Ки/ммоль. Сохранение структуры и функции меченой тРНК доказано тремя методами: при электрофорезе в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (8 М мочевины при рН 8,3 и 40 С) для иЛсодной и меченой тРНК получают идентичные электрофореграммы, причем распределение 3Н совпадает с расположением полос тРНК при окрашивании ме- тиленовым синим; по идентичности -связьтания фенилаланина меченой и исходной тРНК (опыты с фенилаланином- in vitro), по сохранению меченой тРНК способности к образованию тройных комплексов с фенилаланином и 70 s рибосомами Е. coli. П р и М е р 6. На фильтровальную бумагу (220x100 мм) марки ФНС наносят 5 мг декапептида ангиотензина I и обрабатывают аналогично примеру 1 (однократньй напуск 30 мКи газообразного трития), Вещество смывают с бумаги водой и лабильный тритий отмьг вают, лиофилизуя водный раствор и

повторяя операции растворения и лиофилизации. Затем препарат очищают хроматографией на колонке (DEAE-ceфадекс А 25), элюируя ангиотензин I с помощью 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5). Выход меченого ангиотензина I 1,6 мг (32%), удельная радиоактивность 0,4 Ки/ммоль.

По данным тонкослойной хроматографии на силу(1)оле в системе изопропанол-метанол-вода-аммиак (1,5:9:1,5 : 1)-, меченый и немеченый препараты ангиотензина I идентичны.

Показатели

Количество исходного А-фактора, мг

Кратность обновления поверхности

Выход меченого А-фактора (после хроматографической

Показатели предлагаемого и извест ного способов приведены в таблице.

Таким образом, описываемый способ введения тритиевой метки в органические соединения позволяет повысить производительность процесса, увеличить радиохимический выход конечных соединений и получить меченные тритием соединения, которые в условиях способа-прототипа полностью раз рушаются.

Тип подложки Стекло I Бумага

10

100

СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ТРИТИЕВОЙ МЕТКИ В ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ путем обработки вещества, нанесенного на подложку, газообразным тритием, активированным на раскаленной вольфрамовой нити, отличающийс я тем, что, с целью повьшения производительности процесса и увеличения радиохимического выхода, в качестве подложки используют хроматографическую бумагу.