ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к технологиям доставки матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) и к способам применения этих технологий доставки мРНК в различных терапевтических, диагностических и профилактических целях. Такие системы доставки могут применяться как отдельные вмешательства или в комбинации с другими терапевтическими компонентами.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Генная терапия представляет собой процесс введения кодирующих полинуклеотидов в клетки пациента для лечения заболевания. Например, мутированный и/или нефункциональный ген может быть заменен в клетках-мишенях интактной копией. Для введения кодирующих полинуклеотидов в клетки-мишени в генной терапии часто используются вирусные векторы, но существуют и другие методы доставки полинуклеотидов в клетки без использования вирусов. Преимущества вирусов включают относительно высокие возможные уровни трансфекции, а также способность нацеливать вирус на определенные типы клеток путем контроля связывающих белков, посредством которых вирусы проникают в клетку-мишень. Напротив, в случае невирусных способов введения кодирующих полинуклеотидов в клетки могут возникать проблемы с низкими уровнями трансфекции, а также с ограниченными возможностями нацеливания экспрессии на определенные органы и типы клеток. Однако природа вирусного вмешательства несет в себе риски токсичности и воспаления, а также характеризуется ограниченным контролем над продолжительностью и степенью экспрессии введенного фактора.
Виды противоопухолевой терапии, основанные на биологических подходах, имеют преимущества по сравнению с традиционными химиотерапевтическими лекарственными средствами, поскольку в них могут быть задействовано множество разнообразных механизмов для более точного нацеливания на раковые опухоли и их уничтожения - например, посредством прямого лизиса клеток, цитотоксических иммунных эффекторных механизмов и сосудистого коллапса, среди прочего. В результате число клинических исследований потенциала таких подходов значительно возросло. Однако из-за широкого спектра терапевтических действий доклинические и клинические исследования являются сложными, поскольку на их терапевтический потенциал может влиять множество параметров и, следовательно, определение причин неэффективности лечения или методов, которые могли бы повысить терапевтическую активность, может представлять трудности. Поддержание активности нацеливания на мишень, специфичности к опухоли и уменьшение побочных действий также является серьезной проблемой для таких экспериментальных и высокоактивных видов терапии.
В неклинических условиях также часто желательна способность вызывать экспрессию определенного продукта гена, такого как полипептид, в определенной ткани- или органе-мишени. Во многих ситуациях ткань- или орган-мишень будет содержать более одного типа клеток, и в таких случаях также часто желательно экспрессировать продукт гена в различной степени в разных типах клеток, то есть, обеспечивать дифференциальную экспрессию в разных типах клеток. Хотя существуют способы введения полинуклеотидов in vitro и in vivo, они имеют те же ограничения, что и обсуждаемые выше.
В WO-2017/132552-А1 описан рекомбинантный онколитический вирус со сконструированным геномом, включающим сайты связывания микроРНК.
US-2013/156849-A1 относится к способам экспрессии представляющего интерес полипептида в клетке или ткани млекопитающего, причем способ включает приведение указанной клетки или ткани млекопитающего в контакт с препаратом, содержащим модифицированную мРНК, кодирующую представляющий интерес полипептид. В WO-2016/011306-А2 описана разработка, получение, изготовление и/или препарат нуклеиновых кислот, содержащих по меньшей мере одну терминальную модификацию, которая может содержать сайт связывания микроРНК. В вышеупомянутых документах уровня техники не решаются проблемы обеспечения эффективной защиты одного или нескольких типов органов в организме субъекта, проходящего лечение совместно вводимым терапевтическим агентом или фактором.
Следовательно, существует необходимость в дальнейшей разработке способов и композиций для доставки полинуклеотидных последовательностей, таких как мРНК, в конкретные органы и/или ткани, и способов модуляции экспрессии доставленных полинуклеотидных последовательностей в конкретных клетках.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте предложена выделенная последовательность мРНК для экспрессии одного или более полипептидов в одном или более органах-мишенях. Последовательность содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид; по меньшей мере первую последовательность нетранслируемой области (UTR); и множество последовательностей сайтов связывания микроРНК (мкРНК). Каждая из последовательностей сайтов связывания мкРНК находится внутри первой последовательности UTR, непосредственно примыкает к ней с 5'-конца или непосредственно примыкает к ней с 3'-конца. Последовательности сайтов связывания мкРНК обеспечивают дифференциальную экспрессию кодирующей последовательности по меньшей мере в первом и во втором типах клеток в органе- или органах-мишенях.
Последовательность мРНК может содержать более двух, в соответствующих случаях более трех, обычно более четырех последовательностей сайтов связывания. Множество последовательностей сайтов связывания мкРНК может содержать по меньшей мере две по существу схожие последовательности, и/или множество последовательностей сайтов связывания мкРНК может содержать по меньшей мере две по существу разные последовательности.
В некоторых вариантах осуществления множество последовательностей сайтов связывания мкРНК по существу комплементарны последовательностям мкРНК, выбранным из по меньшей мере одной или более из группы, состоящей из: мкРНК-122; мкРНК-125а; мкРНК-125b; мкРНК-199, мкРНК-124а; Let-7; мкРНК-148а; мкРНК-148b; мкРНК-375; мкРНК-143; мкРНК-145; мкРНК192; мкРНК194; мкРНК-204; мкРНК215; мкРНК-30b и мкРНК-30 с. По меньшей мере одна из множества последовательностей сайтов связывания мкРНК может содержать одну или более из SEQ ID NO: 1-7, в соответствующих случаях SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления последовательности сайтов связывания содержат каждую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5; или содержат каждую из SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 и 7.
В некоторых вариантах осуществления первый и второй типы клеток представляют собой разных представителей группы, состоящей из ненеопластических клеток, трансформированного клеточного фенотипа, предракового фенотипа; и неопластического фенотипа. Орган- или органы-мишени могут быть выбраны из группы, состоящей из: печени; головного мозга; легкого; молочной железы; поджелудочной железы; толстой кишки и почки.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более полипептидов содержит терапевтический усиливающий фактор. Терапевтический усиливающий фактор может быть выбран из группы, состоящей из:
(i) цитокинов (или их лигандов), участвующих в иммунном ответе и воспалении, выбранных из одного или более из: TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-гамма, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 CXCL 9 и CXCL10;
(ii) активаторов дендритных клеток, выбранных из одного или более из: GM-CSF, TLR7 и TLR9;
(iii) молекул, нацеленных на следующие клеточные рецепторы и их лиганды, выбранные из одного или более из: CD40, CD40L, CD160, 2 В4, Tim-3, GP-2, В7Н3 и В7Н4;
(iv) ингибиторов TGF-β;
(v) ингибиторов белка 3 Т-клеточной мембраны;
(vi) ингибиторов белка программируемой клеточной смерти 1 (PD1), лиганда 1 рецептора программируемой клеточной смерти (PDL1), лиганда 2 рецептора программируемой клеточной смерти (PDL2), цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4 (CTLA4) и гена активации лимфоцитов 3 (LAG3); и
(vii) ингибиторов NF-κВ.
мРНК может содержать более одной открытой рамки считывания (ORF).
В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит последовательность, выбранную из одной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18-29.
В еще одном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая выделенную последовательность мРНК, как описано в настоящем документе, и частицу для доставки, причем указанная последовательность содержится в частице для доставки, и фармацевтически приемлемый носитель. Частица для доставки может быть выбрана из по меньшей мере одной из группы, состоящей из частицы аминоспиртового липидоида; липосомы; экзосомы; клеточной везикулы; и полимерной частицы.
В некоторых вариантах осуществления частица для доставки нацелена на один или более органов-мишеней. В таких случаях частица для доставки может содержать нацеливающий агент, выбранный из белков, пептидов, углеводов, гликопротеинов, липидов, малых молекул и нуклеиновых кислот; где указанные нацеливающие агенты избирательно связываются с клетками в органе- или органах-мишенях.
В еще одном дополнительном аспекте предложена полинуклеотидная экспрессирующая векторная конструкция, кодирующая последовательность мРНК, как описано в настоящем документе.
В еще одном аспекте предложен вирусный вектор, содержащий последовательность мРНК или полинуклеотидную экспрессирующую векторную конструкцию, как описано в настоящем документе.
В еще одном аспекте предложен способ лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей выделенную последовательность мРНК, композицию, векторную конструкцию или вирусный вектор, как описано в настоящем документе.
Способ может дополнительно включать введение субъекту терапии или терапевтического агента. Терапия или терапевтический агент могут быть выбраны из химиотерапии, радиационной терапии, биологического агента, онколитического вируса, низкомолекулярного лекарственного средства, CAR-T или адоптивной клеточной терапии и их комбинаций. В вариантах осуществления способа субъект представляет собой человека или животное, не являющееся человеком.
В отдельных вариантах осуществления рак выбран из по меньшей мере одного из группы, состоящей из рака печени, рака головного мозга, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака и рака почки, в соответствующих случаях рака печени. Рак печени может включать первичный рак печени или вторичный рак печени. Первичный рак печени может быть выбран из группы, состоящей из гепатокарциномы, гепатобластомы, холангиокарциномы и ангиосаркомы. Вторичный рак печени может представлять собой метастатический рак печени из известной или неизвестной первичной солидной опухоли.
Способ может дополнительно включать введение субъекту онколитического вируса. В таких вариантах осуществления выделенная последовательность мРНК может кодировать терапевтический агент, повышающий эффективность онколитического вируса. Онколитический вирус может быть ослаблен путем мутации одного или более генов вирулентности, и в таких вариантах осуществления последовательность мРНК может кодировать один или более генов вирулентности или их эквивалент или гомолог. В некоторых вариантах осуществления онколитический вирус выбран из любой из групп I-VII классификации вирусов по Балтимору. Онколитический вирус может быть выбран из группы, содержащей один или более из следующих: вирус везикулярного стоматита, вирус Мараба, вирус полиомиелита, реовирус, вирус кори, вирус болезни Ньюкасла, вирус Коксаки А21, парвовирус, вирус простого герпеса 1 типа, вирус осповакцины и аденовирус. Как правило, онколитический вирус представляет собой вирус простого герпеса.
Описанный способ может в некоторых вариантах осуществления дополнительно включать введение субъекту CAR-T или адоптивной клеточной терапии. В таких вариантах осуществления выделенная последовательность мРНК, композиция, векторная конструкция или вирусный вектор могут кодировать одну или более иммуномодулирующих молекул, выбранных из группы, состоящей из:
(i) цитокинов (или их лигандов), участвующих в иммунном ответе и воспалении, выбранных из одного или более из: TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-гамма, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 CXCL 9 и CXCL10;
(ii) активаторов дендритных клеток, выбранных из одного или более из: GM-CSF, TLR7 и TLR9;
(iii) молекул, нацеленных на следующие клеточные рецепторы и их лиганды, выбранные из одного или более из: CD40, CD40L, CD160, 2 В4, Tim-3, GP-2, В7Н3 и В7Н4;
(iv) ингибиторов TGF-β;
(v) ингибиторов белка 3 Т-клеточной мембраны;
(vi) ингибиторов белка программируемой клеточной смерти 1 (PD1), лиганда 1 рецептора программируемой клеточной смерти (PDL1), лиганда 2 рецептора программируемой клеточной смерти (PDL2), цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4 (CTLA4) и гена активации лимфоцитов 3 (LAG3); и
(vii) ингибиторов NF-κB.
Способ может в других вариантах осуществления дополнительно включать введение субъекту ингибитора клеточных контрольных точек. Аналогично, в таких вариантах осуществления выделенная последовательность мРНК, композиция, векторная конструкция или вирусный вектор могут кодировать одну или более иммуномодулирующих молекул, выбранных из группы, состоящей из:
(i) цитокинов (или их лигандов), участвующих в иммунном ответе и воспалении, выбранных из одного или более из: TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-гамма, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 CXCL 9 и CXCL10;
(ii) активаторов дендритных клеток, выбранных из одного или более из: GM-CSF, TLR7 и TLR9;
(iii) молекул, нацеленных на следующие клеточные рецепторы и их лиганды, выбранные из одного или более из: CD40, CD40L, CD160, 2 В4, Tim-3, GP-2, В7Н3 и В7Н4;
(iv) ингибиторов TGF-β;
(v) ингибиторов белка 3 Т-клеточной мембраны;
(vi) ингибиторов белка программируемой клеточной смерти 1 (PD1), лиганда 1 рецептора программируемой клеточной смерти (PDL1), лиганда 2 рецептора программируемой клеточной смерти (PDL2), цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4 (CTLA4) и гена активации лимфоцитов 3 (LAG3); и
(vii) ингибиторов NF-κB.
В дополнительном аспекте композиция, содержащая выделенную последовательность мРНК, векторную конструкцию или вирус, как описано в настоящем документе, или композицию, описанную в настоящем документе, предложена для применения в медицине.
В еще одном аспекте композиция, содержащая выделенную последовательность мРНК, векторную конструкцию или вирус, как описано в настоящем документе, или композицию, описанную в настоящем документе, предложена для применения для лечения рака, где рак в соответствующих случаях выбран из группы, состоящей из рака печени, рака головного мозга, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака и рака почки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Изобретение дополнительно проиллюстрировано ссылкой на прилагаемые графические материалы, где:
На фиг. 1 показана схема способа введения композиции мРНК, инкапсулированной в липидоид, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения.
На фиг. 2 показан пример способа клонирования для получения векторов для синтеза ДНК, которые были использованы для получения конструкций мРНК в соответствии с вариантами осуществления изобретения.
На фиг. 3 показаны три варианта конструкций мРНК, использованных в вариантах осуществления изобретения и проиллюстрированных на фиг. 4, и возможные варианты точки вставки пары последовательностей связывания мкРНК (в данном случае это последовательности, связывающиеся с miR-122), внутри или рядом с последовательностью UTR, которая является 3'-концевой относительно кодирующей последовательности.
На фиг. 4 показаны примеры ДНК-плазмид, матричных плазмид, а также векторов для синтеза для получения конструкций мРНК, изображенных на фиг. 3.
На фиг. 5, 6 и 7 показаны примеры способов, которые могут применяться для получения вектора для синтеза для получения вариантов конструкции мРНК, изображенных на фиг.3.
На фиг. 8 показаны химические формулы примеров соединений, которые могут быть использованы в качестве составляющих при получении частиц для доставки в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения.
На фиг. 9А показан способ получения нанопрепарата частиц для доставки, содержащих мРНК, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения.
На фиг. 9В показана структура поперечного сечения частицы для доставки, содержащей мРНК, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, и дополнительно содержащей инкапсулирующие составляющие соединения, изображенные на фиг. 8.
На фиг. 10А приведены изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, показывающие результаты эксперимента, в котором клетки из культуры здоровых человеческих гепатоцитов (высеваемые человеческие гепатоциты, НМСРР5), клеток гепатокарциномы человека (Нер3В) и гепатобластомы человека (HepG2) трансфицировали in vitro композициями в соответствии с вариантами осуществления изобретения. Вводили две частицы для доставки: одну, содержащую мРНК, кодирующую флуоресцентный белок mcherry (мРНК-mCh-DMPCTx), и одну, содержащую мРНК, кодирующую флуоресцентный белок mcherry, но в которой дифференциальная экспрессия контролируется содержанием мкРНК-122 в клетках-мишенях (мРНК-MCH-122-DMPCTx).
На фиг. 10В показано количественное определение интенсивности флуоресценции через 48 часов после трансфекции клеток в соответствии с экспериментом, показанным на фиг. 10А. Результаты показаны как средние значения ±СКО (среднеквадратическое отклонение). Статистическая значимость была определена с использованием t-критерия. Звездочки обозначают статистически значимое различие между экспрессией мРНК-mCherry и мРНК-mCherry-122 в трансфицированных клетках (****р<0,0001, ***р<0,001).
На фиг. 11 показан график результатов эксперимента, в котором человеческие гепатоциты (НМСРР5) трансфицировали либо многократно (МРТ), либо однократно (ST) частицами для доставки, использованными на фиг. 10A. Экспрессию mCherry определяли по уровню интенсивности флуоресценции, измеренному через 24, 28, 72, 96 и 144 часа после трансфекции. Результаты показаны как средние значения ±СКО. Статистическая значимость была определена с использованием t-критерия. Звездочки обозначают статистически значимое различие между экспрессией мРНК-mCherry и мРНК-mCherry-122 втрансфицированных клетках (*р<0,01, **р<0,05).
На фиг. 12А показаны изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, показывающие результаты эксперимента, в котором здоровые гепатоциты мышей (линия клеток AML12) трансфицировали in vitro с частицами для доставки, использованными на фиг. 10А, где относительные уровни экспрессии mCherry показаны через 24 часа после трансфекции.
На фиг. 12В показан график, демонстрирующий количественную оценку интенсивности флуоресценции в виде % пикселей, подсчитанных для результатов с фиг. 12А, а также для дополнительного момента времени после трансфекции, равного 72 часам.
На фиг. 13 показаны результаты вестерн-блоттинга в двух экспериментах (обозначенных как анализ 1 и анализ 2), в которых человеческие гепатоциты (НМСРР5), клетки гепатобластомы человека (HepG2) и гепатокарциномы человека (Нер3В) трансфицировали композицией в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, содержащей мРНК, кодирующую иллюстративный человеческий полипептид с молекулярной массой 25 кДа, при контроле дифференциальной экспрессии мкРНК.
На фиг. 14 показано влияние варианта вируса простого герпеса R7041 на жизнеспособность человеческих клеток из модели гепатокарциномы (Нер3В) и гепатобластомы (HepG2). Показано влияние применения вируса на относительную жизнеспособность клеток.
На фиг. 15 показан временной график эксперимента in vitro, в котором человеческие клетки из модели гепатокарциномы обрабатывали композицией и способом в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, а затем тестировали с помощью колориметрического МТТ-теста.
На фиг. 16А и 16В показаны результаты экспериментов in vitro, в которых человеческие клетки из модели гепатобластомы (фиг. 16А) и гепатокарциномы (фиг. 16В) обрабатывали вирусом по отдельности или в комбинации с композицией в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, согласно временному графику, показанному на фиг. 15. Композиция представляет собой частицу для доставки, содержащую мРНК, кодирующую US3 (мРНК US3 DMPCTx). Показано влияние обработок на жизнеспособность клеток.
На фиг. 17А и 17В показаны результаты экспериментов in vivo с использованием мышиной модели гепатокарциномы человека. На фиг. 17А показан рост опухоли (клетки Нер3В помечены люциферазой). На фиг. 17В показаны полученные с помощью флуоресцентной микроскопии изображения здоровой печени мыши с использованием мРНК, кодирующей mCherry-флуоресценция не была обнаружена при использовании композиции mCherry-DMPCTx-мкРНК122.
На фиг. 18 показаны микроснимки результатов иммуногистохимии эксперимента in vivo с использованием той же мышиной модели, что и на фиг.17А. Частица для доставки, содержащая мРНК, кодирующую US3 (мРНК US3 DMPCTx мкРНК-122), вводится через хвостовую вену и обеспечивает дифференциальную экспрессию в не пораженных заболеванием гепатоцитах и опухолевой тканью печени, о чем свидетельствует более темное окрашивание на белок US3 в опухолевой ткани. Граница между опухолевой тканью и не пораженной заболеванием тканью показана пунктирной линией.
На фиг. 19А показаны примеры последовательностей сайтов связывания мкРНК, которые могут быть использованы в конструкциях мРНК согласно настоящему изобретению.
На фиг. 19В показаны общие схемы для примеров конструкций мРНК согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, в которые включено до пяти сайтов связывания.
На фиг. 19С и 19D показаны примеры комбинаций последовательностей сайтов связывания, которые могут быть использованы в конструкциях мРНК согласно изобретению.
На фиг. 19Е показаны некоторые конкретные комбинации кодирующих последовательностей, включая кодирующие последовательности для нескольких полипептидов, и сайтов связывания согласно некоторым вариантам осуществления.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, при осуществлении настоящего изобретения используются обычные методы химии, молекулярной биологии, микробиологии, технологии рекомбинантных ДНК и химические способы, которые находятся в пределах возможностей специалиста в данной области техники. Такие методы также поясняются в литературе, например, M.R. Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (1995 и периодические дополнения; Current Protocols in Molecular Biology, гл. 9, 13 и 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; и D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Каждый из этих общих источников включен в настоящий документ посредством ссылки.
Перед изложением изобретения приводится ряд определений, которые помогут в понимании изобретения. Все источники, цитируемые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такие же значения, которые обычно подразумеваются специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
В контексте настоящего документа термин «содержащий» означает, что любой из перечисленных элементов обязательно включен, а также могут быть необязательно включены другие элементы. «По существу состоящий из» означает, что любые перечисленные элементы обязательно включены, элементы, которые могли бы существенно повлиять на основные и новые характеристики перечисленных элементов, исключены, и другие элементы могут быть необязательно включены. «Состоящий из» означает, что все элементы, кроме перечисленных, исключены. Варианты осуществления, определенные каждым из этих терминов, входят в объем данного изобретения.
Термин «выделенный» применительно к полинуклеотидной последовательности означает, что последовательность была удалена из организма, из которого она естественным образом происходит, и, таким образом, не содержит лишних или нежелательных кодирующих или регуляторных последовательностей. Выделенная последовательность подходит для применения в процессах рекомбинантных ДНК и в системах синтеза генетически модифицированных белков. Такие выделенные последовательности включают кДНК, мРНК и геномные клоны. Выделенные последовательности могут быть ограничены только кодирующей белок последовательностью или могут также включать 5'- и 3'-концевые регуляторные последовательности, такие как промоторы и терминаторы транскрипции. Перед дальнейшим изложением изобретения приводится ряд определений, которые помогут в понимании изобретения.
«Полинуклеотид» представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную ковалентно связанную последовательность нуклеотидов, в которой 3'- и 5'-концы на каждом нуклеотиде соединены фосфодиэфирными связями. Полинуклеотид может состоять из дезоксирибонуклеотидных оснований или рибонуклеотидных оснований. Полинуклеотиды включают ДНК и РНК и могут быть получены синтетическим путем in vitro или выделены из природных источников. Размеры полинуклеотидов обычно выражают в виде количества пар нуклеотидов (п.н.) для двухцепочечных полинуклеотидов или в случае одноцепочечных полинуклеотидов в виде количества нуклеотидов (нт). Одна тысяча п. н. или нт равна килобазе (кб). Полинуклеотиды длиной менее приблизительно 40 нуклеотидов обычно называют «олигонуклеотидами». В контексте настоящего документа термин «последовательность нуклеиновой кислоты» означает одноцепочечную или двухцепочечную ковалентно связанную последовательность нуклеотидов, в которой 3'- и 5'-концы на каждом нуклеотиде соединены фосфодиэфирными связями. Полинуклеотид может состоять из дезоксирибонуклеотидных оснований или рибонуклеотидных оснований. Последовательности нуклеиновых кислот могут включать ДНК и РНК и могут быть получены синтетическим путем in vitro или выделены из природных источников. Размеры последовательностей нуклеиновых кислот, также называемых в настоящем документе «полинуклеотидами», обычно выражают в виде количества пар нуклеотидов (п.н.) для двухцепочечных полинуклеотидов или в случае одноцепочечных полинуклеотидов в виде количества нуклеотидов (нт). Одна тысяча п. н. или нт равна килобазе (кб). Полинуклеотиды длиной менее приблизительно 40 нуклеотидов обычно называют «олигонуклеотидами», и они могут содержать праймеры для применения при манипуляциях с ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В контексте настоящего документа термин «нуклеиновая кислота» означает одноцепочечную или двухцепочечную ковалентно связанную последовательность нуклеотидов, в которой 3'- и 5'-концы на каждом нуклеотиде соединены фосфодиэфирными связями. Полинуклеотид может состоять из дезоксирибонуклеотидных оснований или рибонуклеотидных оснований. Нуклеиновые кислоты могут включать ДНК и РНК и могут быть получены синтетическим путем in vitro или выделены из природных источников. Нуклеиновые кислоты могут дополнительно включать модифицированную ДНК или РНК, например, ДНК или РНК, которая была метилирована, или РНК, которая была подвергнута посттрансляционной модификации, например, 5'-кэпированию 7-метилгуанозином, 3'-процессингу, такому как расщепление и полиаденилирование, и сплайсингу. Нуклеиновые кислоты могут также включать синтетические нуклеиновые кислоты (XNA), такие как гекситолнуклеиновая кислота (HNA), циклогексеннуклеиновая кислота (CeNA), треозо-нуклеиновая кислота (TNA), глицериннуклеиновая кислота (GNA), закрытая нуклеиновая кислота (LNA) и пептидо-нуклеиновая кислота (PNA). Размеры нуклеиновых кислот, также называемых в настоящем документе «полинуклеотидами», обычно выражают в виде количества пар нуклеотидов (п.н.) для двухцепочечных полинуклеотидов или в случае одноцепочечных полинуклеотидов в виде количества нуклеотидов (нт). Одна тысяча п. н. или нт равна килобазе (кб). Полинуклеотиды длиной менее приблизительно 100 нуклеотидов обычно называют «олигонуклеотидами», и они могут содержать праймеры для применения при манипуляциях с ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты содержит матричную РНК (мРНК).
Согласно настоящему изобретению гомология последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе, не ограничивается только лишь 100% идентичностью последовательностей. Многие последовательности нуклеиновых кислот могут демонстрировать биохимическую или функциональную эквивалентность друг другу, несмотря на кажущуюся низкой идентичность их последовательностей. В настоящем изобретении в качестве гомологичных последовательностей нуклеиновых кислот рассматриваются такие, которые будут гибридизоваться друг с другом в условиях низкой жесткости (Sambrook J. et al., см. выше). В этом отношении термин «по существу схожий», относящийся к двум последовательностям, означает, что эти последовательности обладают по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 100% сходством. Аналогично, термин «по существу комплементарный», относящийся к двум последовательностям, означает, что эти последовательности являются полностью комплементарными или что комплементарными являются по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% оснований. То есть между основаниями последовательностей, предназначенных для гибридизации, могут иметь место несоответствия, которые могут иметь место у по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20% или до 30% оснований.
Термин «функционально связанный» применительно к последовательностям нуклеиновых кислот, например, в экспрессирующей конструкции, указывает на то, что последовательности расположены так, что они функционируют совместно для осуществления своего предназначения. Например, в ДНК-векторе последовательность промотора позволяет инициировать транскрипцию, которая проходит через связанную кодирующую последовательность вплоть до последовательности терминации. В случае последовательностей РНК одна или более нетранслируемых областей (UTR) могут быть расположены во взаимосвязи со связанной последовательностью, кодирующей белок, называемой открытой рамкой считывания (ORF). Отдельно взятая мРНК может содержать более одной ORF - так называемая полицистронная РНК. UTR может являться 5'-концевой или 3'-концевой относительно функционально связанной кодирующей последовательности ORF. UTR могут содержать последовательности, обычно встречающиеся в последовательностях мРНК, встречающихся в природе, такие как консенсусные последовательности Козак, инициирующие кодоны, цис-действующие регуляторные элементы, поли-А-хвосты, участки внутренней посадки рибосомы (IRES), структуры, регулирующие продолжительность жизни мРНК, последовательности, направляющую локализацию мРНК, и т.д. мРНК может содержать несколько UTR, которые являются одинаковыми или разными.
Термин «экспрессия полипептида» в контексте настоящего изобретения относится к продукции полипептида, который кодируются полинуклеотидными последовательностями, описанными в настоящем документе. Как правило, она включает трансляцию предоставленной последовательности мРНК с помощью рибосомного механизма клетки, в которую доставляется последовательность.
Термин «частица для доставки» в контексте настоящего документа относится к частицам, которые могут содержать терапевтические компоненты путем инкапсуляции, удерживания в матрице, образования комплекса или другими способами, и доставлять терапевтический компонент, такой как кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты, в клетку-мишень. Частицы для доставки могут иметь микроразмеры, но в конкретных вариантах осуществления, как правило, они могут иметь наноразмеры, т.е. представлять собой наночастицы. Наночастицы обычно имеют размер по меньшей мере 50 нм (нанометров), в соответствующих случаях по меньшей мере приблизительно 100 нм и как правило не более 150 нм, 200 нм, хотя необязательно могут иметь диаметр вплоть до 300 нм. В одном из вариантов осуществления изобретения наночастицы имеют средний диаметр, равный приблизительно по меньшей мере 60 нм. Преимущество этих размеров состоит в том, что это означает, что частицы находятся ниже порогового значения для клиренса ретикулоэндотелиальной системой (мононуклеарной фагоцитарной системой), то есть частица является достаточно маленькой, чтобы не подвергаться уничтожению фагоцитарными клетками при функционировании защитного механизма организма. Это облегчает использование внутривенных путей доставки для композиций согласно изобретению.
Альтернативные возможности для композиции наночастиц включают полимолочную кислоту (PLA), поли(молочную-ко-гликолевую кислоту) (PLGA), частицы на основе липидов или фосфолипидов, такие как липосомы; частицы на основе белков и/или гликопротеинов, таких как коллаген, альбумин, желатин, эластин, глиадин, кератин, легумин, зеин, соевые белки, молочные белки, такие как казеин, и другие (Lohcharoenkal et al. BioMed Research International; Volume 2014 (2014)); и частицы на основе металлов или соединений металлов, таких как золото, серебро, алюминий, оксиды меди и так далее.
В частности, была исследована возможность доставки нуклеиновых кислот с помощью полимеров, содержащих полиэтиленимин (PEI). Также было показано, что векторы на основе наночастиц, состоящие из поли(β-аминоэфиров) (РВАЕ), пригодны для доставки нуклеиновых кислот, особенно в комбинированном препарате с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (Kaczmarek JC et al Angew Chem Int Ed Engl. 2016; 55(44): 13808-13812). Частицы на основе таких комбинированных препаратов были использованы для доставки мРНК в легкие.
Также рассматриваются частицы на основе полисахаридов и их производных, таких как целлюлоза, хитин и хитозан. Хитозан представляет собой катионный линейный полисахарид, получаемый путем частичного деацетилирования хитина, причем наночастицы, содержащие это вещество, обладают многообещающими свойствами для доставки лекарственных средств, такими как биосовместимость, низкая токсичность и небольшой размер (Felt et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 24, 1998 - Issue 11). Предполагается, что могут быть использованы комбинации вышеуказанных составляющих.
В US2010/0331234, US2011/0293703 и US2015/0203439 - включенных в настоящий документ посредством ссылки - описано получение аминоспиртовых липидоидов путем взаимодействия амина с соединением с эпоксидными концевыми группами. С этими липидоидами могут быть получены комплексы, мицеллы, липосомы и частицы, включая наночастицы, и их химическая структура делает их особенно подходящими для доставки «груза» - например, нуклеиновых кислот, таких как кодирующие мРНК, - для нацеливания на типы клеток в организме человека или животного. Платформы для доставки, содержащие аминоспиртовые липидоидные соединения, особенно подходят для применения при доставке молекул груза с отрицательным суммарным зарядом с учетом третичных аминов, доступных для протонирования, тем самым образующих катионный фрагмент. Например, аминоспиртовые липидоидные соединения могут применяться при получении композиций в форме частиц для доставки ДНК, РНК или других полинуклеотидных грузов в организм субъекта или в клетку- или ткань-мишень. Подходящие частицы могут быть в форме микрочастиц, наночастиц, липосом, экзосом или мицелл.
Частицы для доставки на основе аминоспиртовых липидоидов содержат третичные амины, доступные для взаимодействия с полинуклеотидным грузом, таким как кодирующая мРНК. Полинуклеотиды или их производные приводят в контакт с аминоспиртовыми липидоидными соединениями в условиях, подходящих для образования комплексов полинуклеотид/липидоид. Липидоид предпочтительно является по меньшей мере частично протонированным, чтобы образовывать комплекс с отрицательно заряженным полинуклеотидом. Таким образом комплексы полинуклеотид/липидоид образуют частицы, пригодные для доставки груза полинуклеотидов в клетки и ткани. В отдельных вариантах осуществления с молекулой полинуклеотида может быть связано множество молекул аминоспиртовых липидоидов. Комплекс может включать по меньшей мере 1, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или, в соответствующих случаях, по меньшей мере 100 молекул аминоспиртовых липидоидов. Комплекс может включать не более 10000, не более 5000, не более 2000, не более 1000, не более 500 или, как правило, не более 100 молекул аминоспиртовых липидоидов.
Специалистам в данной области техники должно быть ясно, что совокупность частиц следует принципам распределения частиц по размерам. Широко используемые, признанные в данной области техники способы описания распределений частиц по размерам включают, например, средние диаметры и значения D, такие как значение D50, которое обычно используется для обозначения среднего диаметра диапазона размеров частиц отдельно взятого образца. В отдельных вариантах осуществления диаметр частиц наночастиц находится в диапазоне 10-500 нм, более подходящим является диаметр частиц в диапазоне 10-1200 нм, в частности, 50-150 нм. В некоторых вариантах осуществления наночастицы имеют средние диаметры, составляющие по меньшей мере приблизительно 10 нм, в соответствующих случаях по меньшей мере приблизительно 30 нм. В некоторых вариантах осуществления наночастицы имеют средние диаметры в среднем менее приблизительно 150 нм и в среднем более 50 нм.
Частицы могут быть дополнительно связаны с нацеливающим агентом, который облегчает связывание частицы для доставки с целевым типом клеток. Термин «нацеленный» в контексте настоящего документа относится к объекту или композиции, такой как содержащая частицу для доставки, предназначенным для связывания с клетками в конкретном органе, ткани или типе клеток в организме, и облегчения их трансфекции. В частном варианте осуществления частица для доставки, такая как наночастица для доставки, может быть нацелена для доставки своего груза только в определенный орган, ткань или клетку. Нацеливание может быть территориальным, например, путем доставки нацеленного объекта непосредственно в конкретную ткань, или может быть опосредовано химически, посредством нацеливающих агентов или связывающих фрагментов, которые избирательно связываются с клетками- или тканями-мишенями.
В данной области известны различные нацеливающие агенты, направляющие фармацевтические композиции к конкретным клеткам (см., например, Cotten et al. Methods Enzym. 217:618,1993; Wagner et al. Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 14, Issue 1, April-May 1994, 113-135; Fiume et al. Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 14, Issue 1, April-May 1994, 51-65). Нацеливающие агенты могут быть включены по всей частице или могут быть локализованы только на поверхности. Нацеливающий агент может представлять собой белок, пептид, углевод, гликопротеин, липид, малую молекулу, нуклеиновые кислоты и т.д. Нацеливающий агент может применяться для нацеливания на конкретные клетки или ткани, или может применяться для стимуляции эндоцитоза или фагоцитоза частицы. Примеры нацеливающих агентов включают, не ограничиваясь перечисленным, антитела, фрагменты антител, липопротеины низкой плотности (ЛПНП), трансферрин, асиалогликопротеины, оболочечный белок qp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), углеводы, лиганды рецепторов, сиаловую кислоту, аптамеры и т.д. Если нацеливающий агент распределен по всей частице, он может быть включен в смесь или композит, используемые для образования частиц. Если нацеливающий агент расположен только на поверхности, он может быть связан с образованными частицами с использованием стандартных химических методов, например, путем ковалентного связывания, гидрофобного связывания, водородного связывания, вандерваальсовых сил, биотин-авидиновой связи или других взаимодействий.
Композиции в форме частиц согласно отдельным вариантам осуществления изобретения могут в соответствующих случаях доставлять инкапсулированный груз мРНК в течение периода времени, который может контролироваться конкретным выбором или составом инкапсулирующего биоразлагаемого нетоксичного полимера или биосовместимого материала. Например, композиции в форме частиц могут высвобождать инкапсулированный груз мРНК в течение по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 12 часов или по меньшей мере 1 дня. Композиции в форме частиц могут высвобождать инкапсулированный груз мРНК в течение не более 2 дней, не более 3 дней или не более 7 дней.
Термин «пораженный заболеванием» в контексте настоящего документа, как в «пораженных заболеванием клетках» и/или «пораженной заболеванием ткани», обозначает ткани и органы (или их части) и клетки, которые демонстрируют аберрантную, отличную от здоровой или связанную с заболеванием патологию. Например, пораженные заболеванием клетки могут быть заражены вирусом, бактерией, прионом или эукариотическим паразитом; может содержать вредные мутации; и/или могут быть раковыми, предраковыми, опухолевыми или неопластическими. Пораженные заболеванием клетки могут содержать измененную внутриклеточную среду мкРНК по сравнению с в остальном нормальными или так называемыми здоровыми клетками. В отдельных случаях пораженные заболеванием клетки могут быть патологически нормальными, но содержать измененную внутриклеточную среду мкРНК, которая представляет собой состояние, предшествующее заболеванию. Пораженные заболеванием ткани могут содержать здоровые ткани, которые были инфильтрированы пораженными заболеванием клетками из другого органа или системы органов. Например, многие воспалительные заболевания включают патологии, при которых в остальном здоровые органы подвергаются инфильтрации иммунными клетками, такими как Т-клетки и нейтрофилы. В качестве еще одного примера, органы и ткани, подвергшиеся стенотическим или цирротическим поражениям, могут содержать как здоровые, так и пораженные заболеванием клетки в непосредственной близости друг от друга.
Термин «рак» в контексте настоящего документа относится к новообразованиям в ткани, включая злокачественные опухоли, которые могут представлять собой первичный рак, начинающийся в определенной ткани, или вторичный рак, распространившийся путем метастазирования из других мест. Термины «рак», «новообразование» и «злокачественные опухоли» используются в настоящем документ взаимозаменяемо. Рак может обозначать ткань или клетку, расположенную в новообразовании, или обладающую свойствами, связанными с новообразованием. Новообразования обычно обладают характеристиками, отличающими их от нормальной ткани и нормальных клеток. К таким характеристикам относятся, не ограничиваясь перечисленным, степень анаплазии, изменения морфологии, неправильная форма, снижение адгезивной способности клеток, способность метастазировать и усиление пролиферации клеток. Термины, относящиеся к «раку» и часто синонимичные с ним, включают саркому, карциному, злокачественную опухоль, эпителиому, лейкоз, лимфому, перерождение, новообразование и тому подобное. В контексте настоящего документа термин «рак» включает предзлокачественные и/или предраковые опухоли, а также злокачественные опухоли.
В контексте настоящего документа термин «здоровый», как в «здоровых клетках» и/или «здоровой ткани», обозначает ткани и органы (или их части) и клетки, которые сами не поражены заболеванием и приблизительно соответствуют в основном нормально функционирующему фенотипу. Понятно, что в контексте изобретения термин «здоровый» является относительным, поскольку, например, не являющиеся неопластическими клетки в ткани, пораженной опухолями, вполне могут быть не совсем здоровыми в абсолютном смысле. Поэтому под «не являющимися здоровыми клетками» подразумеваются клетки, которые сами по себе не являются неопластическими, раковыми или предраковыми, но могут, например, быть цирротическими, воспаленными или инфицированными, или иным образом пораженными заболеванием. Аналогичным образом под «здоровой или не являющейся здоровой тканью» подразумевается ткань или ее части без опухолей, неопластических, раковых или предраковых клеток; или других заболеваний, указанных выше; независимо от общего состояния здоровья. Например, в контексте органа, содержащего раковую и фиброзную ткань, клетки, содержащиеся в фиброзной ткани, могут считаться относительно «здоровыми» по сравнению с раковой тканью.
В альтернативном варианте осуществления состояние здоровья клетки, типа клеток, ткани и/или органа определяется количественным определением экспрессии мкРНК. При определенных типах заболеваний, таких как рак, нарушается экспрессия определенных видов мкРНК, и она может активироваться или подавляться по сравнению с непораженными клетками. Это различие в транскриптоме мкРНК может быть использовано для определения относительного состояния здоровья и/или для отслеживания развития здоровых клеток, типов клеток, тканей и/или органов в направлении патологического состояния. Патологическое состояние может включать различные стадии перерождения в неопластическую клетку. В вариантах осуществления настоящего изобретения характерные различия в транскриптоме мкРНК для типов клеток, содержащихся в отдельно взятом органе или системе органов, используются для контроля экспрессии белка в разных типах клеток.
В контексте настоящего документа термин «орган» является синонимом «системы органов» и относится к комбинации тканей и/или типов клеток, которые могут быть разделены внутри организма субъекта для обеспечения биологической функции, такой как физиологическая, анатомическая, гомеостатическая или эндокринная функция. Соответственно, органы или системы органов могут означать васкуляризированный внутренний орган, такой как печень или поджелудочная железа. Обычно органы содержат по меньшей мере два типа тканей и/или множество типов клеток, проявляющих фенотипическую характеристику органа.
Термин «терапевтический вирус» в контексте настоящего документа относится к вирусу, способному инфицировать и уничтожать раковые клетки, иногда путем прямого вирусного лизиса (онколизиса), но также включая опосредованное уничтожение путем стимуляции противоопухолевых ответов хозяина. Онколитические вирусы часто характеризуются повышенной активностью в пораженных заболеванием клетках, включая раковые, по сравнению со здоровыми клетками.
Примеры онколитических вирусов включают приведенные в таблице 1 и их подтипы.
В вариантах осуществления изобретения вирусы могут быть выбраны из любой из групп I-VII классификации вирусов по Балтимору (Baltimore D (1971). "Expression of animal virus genomes". Bacteriol Rev. 35 (3): 235-41). В конкретных вариантах осуществления изобретения подходящие вирусы могут быть выбраны из группы I по Балтимору, вирусный геном которых содержит двухцепочечную ДНК; группы IV, которые имеют одноцепочечную геномную РНК позитивной полярности; и группы V, которые имеют одноцепочечную геномную РНК негативной полярности.
Термин «ген вирулентности» или «фактор вирулентности» в контексте настоящего документа относится к гену или продукту гена, способствующему репликации терапевтического вируса, такого как онколитический вирус, в клетках, или лизису клеток, которые он заражает.Термин «фактор репликации» используется в настоящем документе как синоним. Факторами вирулентности обычно могут быть вирусные гены, кодируемые вирусным геномом. Факторы вирулентности могут быть вовлечены в такие функции, как подавление внутриклеточной иммунной системы и уклонение от нее, репликация вирусного генома, распространение или передача вирионов, продукция или сборка структурных белков оболочки, активация вирусов в латентном состоянии, предупреждение вирусной латентности и захват процессов клетки-хозяина. Некоторые факторы вирулентности имеют клеточные или другие эквиваленты, которые могут компенсировать функцию этих генов, если они отсутствуют в вирусном геноме. Некоторые вирусы могут быть модифицированы экзогенными генами вирулентности, которые увеличивают их способность к репликации, лизису клеток и распространению.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательности мРНК усиливают или поддерживают онколитическую активность совместно вводимого вируса в опухоли, расположенной в органе, посредством дифференциальной экспрессии одного или более белков или полипептидов, которые избирательно усиливают репликацию вириона в указанной опухоли. Таким образом, мРНК может кодировать один или более факторов, усиливающих биологическую активность онколитического вируса посредством: повышения репликации, и/или повышения прямого онколитического эффекта, и/или повышения вирусного потомства, и/или адаптивного противоопухолевого иммунного ответа. В дополнительных вариантах осуществления изобретения композиции могут кодировать продукт гена, контролирующий взаимодействие между иммунными клетками хозяина и онколитическим вирусом в опухоли. В еще одном дополнительном варианте осуществления композиции согласно изобретению могут применяться для получения продуктов генов, модулирующих различные профили активности онколитического вируса, а также экспрессию иммунных костимулирующих молекул, вводимых посредством вириона, экзогенно или посредством частицы для доставки согласно изобретению.
Термин «полипептид» в контексте настоящего документа означает полимер из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, который может быть получен природным путем или путем синтеза in vitro. Полипептиды длиной менее чем приблизительно 12 аминокислотных остатков обычно называют «пептидами», а полипептиды длиной от приблизительно 12 до приблизительно 30 аминокислотных остатков могут называться «олигопептидами». Термин «полипептид» в контексте настоящего документа обозначает продукт встречающегося в природе полипептида, предшественника или пропротеина. Полипептиды также могут претерпевать процессы созревания или посттрансляционной модификации, которые могут включать, не ограничиваясь перечисленным: гликозилирование, протеолитическое расщепление, липидизацию, расщепление сигнального пептида, расщепление пропептида, фосфорилирование и тому подобное. Термин «белок» используется в настоящем документе для обозначения макромолекулы, содержащей одну или более полипептидных цепей.
Термин «продукт гена» в контексте настоящего документа относится к продукту по меньшей мере одной кодирующей последовательности или ORF, содержащейся в конструкции мРНК согласно изобретению, как описано в настоящем документе. Продукт(ы) гена может включать полипептид или белок. Конструкция на основе полицистронной мРНК может быть использована для продукции нескольких продуктов генов. Понятно, что несколько ORF могут приводить к образованию in situ множества продуктов, которые могут функционально взаимодействовать или могут образовывать комплексы и/или мультимерные белки с различными биологическими и потенциально терапевтическими эффектами.
Доставка мРНК непосредственно в клетки позволяет осуществлять прямую и контролируемую трансляцию желаемых продуктов генов, таких как полипептиды и/или белки, в клетках. Обеспечение мРНК, в частности, позволяет не только использовать клеточные механизмы модуляции экспрессии, такие как контроль, опосредованный мкРНК (как подробно описано в конкретных вариантах осуществления ниже), но также представляет собой ограниченный и исчерпываемый запас продукта, а не потенциально постоянное изменение транскриптома клетки-мишени, которое может обеспечить эписомально или геномно встраиваемый ДНК-вектор.
В вариантах осуществления настоящего изобретения предложена последовательность мРНК, содержащая последовательность, кодирующую по меньшей мере один полипептид в функциональной комбинации с одной или более нетранслируемыми областями (UTR), которые могут придавать тканеспецифичность и стабильность последовательности нуклеиновой кислоты в целом. Под «тканеспецифичностью» подразумевается, что трансляция белкового продукта, кодируемого мРНК, модулируется в зависимости от наличия UTR. Модуляция может включать разрешение, снижение или даже блокирование обнаружимой трансляции мРНК в белковый продукт.UTR могут быть связаны непосредственно с мРНК в цис-положении, то есть на одной и той же цепи полинуклеотида. В альтернативном варианте осуществления предложена первая последовательность, кодирующая продукт гена, и предложена дополнительная вторая последовательность, которая гибридизуется с частью первой последовательности, где указанная вторая последовательность содержит одну или более UTR, придающих тканеспецифичность последовательности нуклеиновой кислоты в целом. В этом последнем варианте осуществления UTR функционально связана с последовательностью, кодирующей продукт гена в транс-положении.
В соответствии с конкретными вариантами осуществления изобретения предложена мРНК, содержащая такие связанные последовательности нуклеиновой кислоты, которые функционально с ней связаны и необходимы для предотвращения или снижения экспрессии продукта гена в не пораженной заболеванием ткани печени, например, в здоровых гепатоцитах. Таким образом, предложена конструкция или транскрипт мРНК, содержащий кэп на 5'-конце и UTR, необходимые для рекрутинга рибосом и ткане- и/или орган-специфической экспрессии (обычно, но не исключительно, являющиеся 3'-концевыми относительно ORF), а также старт- и стоп-кодоны, соответственно определяющие одну или более ORF. При введении конструкции в не пораженную заболеванием печень, легкое, поджелудочную железу, молочную железу, головной мозг, почку и/или толстую кишку-желудочно-кишечный тракт экспрессия продукта гена предотвращается или снижается. Напротив, неопластические клетки или пораженные иным заболеванием клетки, содержащиеся в вышеупомянутых органах, обычно не соответствуют профилям экспрессии нормальных не пораженных заболеванием клеток, так как обладают совершенно другим транскриптомом мкРНК. Продукт(ы) гена, содержащийся в мРНК, специфически транслируется в этих аберрантных клетках, но не в соседних здоровых клетках. Доставка конструкции мРНК в упомянутые выше органы может быть осуществлена с помощью платформы для доставки частиц, как описано в настоящем документе, или любым подходящим способом, известным из уровня техники. Специфичная к типу клетки экспрессия может быть опосредована посредством механизмов модуляции микроРНК, таких как механизмы, более подробно описанные ниже.
«Терапевтический компонент» или «терапевтический агент», как определено в настоящем документе, относится к молекуле, веществу, клетке или организму, которые при введении человеку или другому животному в качестве части терапевтического вмешательства способствуют оказанию терапевтического эффекта на этого человека или другое животное. Терапевтический эффект может быть вызван самим терапевтическим компонентом или другим компонентом терапевтического вмешательства. Терапевтический компонент может представлять собой кодирующий компонент нуклеиновой кислоты, в частности, мРНК. Компонент(ы) кодирующей нуклеиновой кислоты может кодировать терапевтические усиливающие факторы, как определено ниже. Терапевтический компонент может также содержать лекарственное средство, необязательно химиотерапевтическое лекарственное средство, такое как малая молекула или моноклональное антитело (или его фрагмент). В некоторых вариантах осуществления терапевтический компонент может содержать клетку, такую как рекомбинантно модифицированная иммунная эффекторная клетка, например, CAR-T-клетка. В других вариантах осуществления изобретения терапевтический агент содержит терапевтический вирус, такой как онколитический вирус или вирусный вектор.
Термин «терапевтический эффект» относится к локальному или системному эффекту у животного, обычно человека, вызываемому фармакологически или терапевтически активным агентом, содержащим вещество, молекулу, композицию, клетку или организм, которые были введены субъекту, и термин «терапевтическое вмешательство» относится к введению такого вещества, молекулы, композиции, клетки или организма. Таким образом, термин означает любой агент, предназначенный для применения в диагностике, излечении, смягчении, лечении или профилактике заболевания или в усилении желаемого физического или умственного развития и состояний у животного или человека. Фраза «терапевтически эффективное количество» означает такое количество такого агента, которое вызывает желаемый местный или системный эффект при разумном соотношении польза/риск, применимом к любому виду лечения. В отдельных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество агента будет зависеть от широты его терапевтического действия, растворимости и тому подобного. Например, некоторые терапевтические агенты согласно настоящему изобретению могут быть введены в количестве, достаточном для достижения разумного соотношения польза/риск, применимого к такому виду лечения. В конкретном контексте лечения рака «терапевтический эффект» может проявляться различным образом, включая, не ограничиваясь перечисленным, уменьшение объема солидной опухоли, уменьшение количества раковых клеток, уменьшение наблюдаемого количества метастазов, увеличение ожидаемой продолжительности жизни, уменьшение пролиферации раковых клеток, уменьшение выживаемости раковых клеток, уменьшение экспрессии маркеров опухолевых клеток и/или облегчение различных физиологических симптомов, связанных с раковым заболеванием.
В одном из вариантов осуществления субъект, которому вводят терапию, представляет собой млекопитающее (например, мышь, крысу, примата, млекопитающее, не являющееся человеком, домашнее животное или домашний скот, такой как собака, кошка, кролик, корова, лошадь, овца, коза и тому подобное), и, в соответствующих случаях, человека. В дополнительном варианте осуществления субъект представляет собой животную модель рака. Например, животная модель может представлять собой ортотопическую ксенотрансплантатную животную модель рака, происходящего от человека, в соответствующих случаях рака печени, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака головного мозга, рака почки и/или толстой кишки-желудочно-кишечного тракта.
В конкретном варианте осуществления способов согласно настоящему изобретению субъект еще не прошел терапевтическое лечение, такое как терапевтическая вирусная терапия, химиотерапия, радиационная терапия, таргетная терапия и/или терапия иммунных контрольных точек. В еще одном варианте осуществления субъект подвергся терапевтическому лечению, такому как вышеупомянутые виды терапии.
В дополнительных вариантах осуществления субъекту была сделана операция по удалению раковой или предраковой ткани. В других вариантах осуществления раковая ткань не была удалена, например, раковая ткань может быть расположена в неоперабельной области тела, такой как ткань или орган, которая, будучи подвергнутой хирургическому вмешательству, может поставить под угрозу жизнь субъекта, или в области, где хирургическое вмешательство может вызвать значительный риск необратимого вреда или даже смерти.
В некоторых вариантах осуществления предложенная мРНК может кодировать «терапевтический усиливающий фактор». Согласно настоящему изобретению терапевтические усиливающие факторы представляют собой продукты генов или полипептиды, которые могут усиливать или способствовать способности другого совместно вводимого терапевтического агента оказывать терапевтический эффект на данную клетку, в соответствующих случаях на клетку-мишень. При введении в клетку-мишень или вблизи нее экспрессия терапевтического усиливающего фактора может взаимодействовать с совместно вводимым терапевтическим агентом, тем самым обеспечивая или усиливая терапевтическую активность агента. В некоторых вариантах осуществления терапевтический усиливающий фактор может усиливать способность совместно вводимого онколитического вируса осуществлять лизис раковых клеток. В других вариантах осуществления изобретения терапевтический усиливающий фактор может влиять на изменение микроокружения опухоли, чтобы способствовать собственному иммунному ответу субъекта или рекрутировать его. В этом последнем варианте осуществления изменению микроокружения опухоли может способствовать совместное введению онколитического вируса, или CAR-T, или другой адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления терапевтический усиливающий фактор может обеспечить превращение пролекарства в активную форму.
Несколько терапевтических усиливающих факторов могут быть объединены в композициях в соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения. В таких вариантах осуществления кодирующие последовательности для каждого терапевтического усиливающего фактора могут присутствовать в отдельных молекулах мРНК. В некоторых вариантах осуществления последовательности для более чем одного терапевтического усиливающего фактора могут присутствовать на одной и той же молекуле мРНК. В таких случаях молекула полицистронной мРНК дополнительно содержит последовательности, необходимые для экспрессии всех кодируемых последовательностей, такие как участки внутренней посадки рибосомы (IRES).
В вариантах осуществления, где в одной или более системах доставки содержится несколько разных молекул мРНК, предполагается, что каждая система доставки - например, частица, липосома, вирусная векторная система, - может содержать один или более чем один тип молекулы мРНК в качестве «нагрузки»; то есть, не каждая доставляемая нагрузка в конкретном варианте осуществления обязательно будет содержать все молекулы мРНК, предложенные в указанном варианте осуществления. Таким образом, также считается возможным направлять разные системы доставки и связанные с ними последовательности в разные клетки-мишени с помощью нацеливающих агентов, описанных в настоящем документе.
Конструкции мРНК отдельных вариантов осуществления изобретения могут быть синтезированы из полинуклеотидной экспрессирующей конструкции, которая может представлять собой, например, ДНК-плазмиду. Эта экспрессирующая конструкция может содержать любую последовательность промотора, необходимую для инициации транскрипции, и соответствующую последовательность терминации транскрипции, так что может осуществляться транскрипция конструкции мРНК. Предполагается, что такие полинуклеотидные экспрессирующие конструкции включают варианты осуществления изобретения сами по себе.
Продукт гена, кодируемый мРНК, обычно представляет собой пептид, полипептид или белок. Если конкретный белок состоит из более чем одной субъединицы, мРНК может кодировать одну или более субъединиц в одной или более ORF. В альтернативных вариантах осуществления первая мРНК может кодировать первую субъединицу, тогда как вторая совместно вводимая мРНК может кодировать вторую субъединицу, которая при трансляции in situ приводит к сборке продукта гена, представляющего собой белок из нескольких субъединиц.
Продукт гена, кодируемый мРНК, может быть любого типа, подходящего для получения терапевтического эффекта. В контексте лечения рака продукт гена, кодируемый мРНК, может в соответствующих случаях включать гены, которые при экспрессии раковой клеткой вызывают или способствуют разрушению раковой клетки.
Конструкции согласно изобретению могут обеспечивать гены-супрессоры опухолей, такие как р53. р53 играет роль в клеточных процессах, включая апоптоз и геномную стабильность. Он участвует в активации процесса репарации ДНК в ответ на повреждение генома и может останавливать рост и размножение клеток.
Гены, которые способствуют гибели клеток в результате апоптоза - так называемые суицидальные гены - которые при экспрессии заставляют клетку активировать процесс апоптоза, также могут быть обеспечены композициями и конструкциями согласно изобретению. Раковые клетки часто несут мутированные и/или нефункциональные версии этих связанных с апоптозом генов, и поэтому не могут претерпевать апоптоз в ответ на внешние сигналы. Терапия суицидальными генами может также относиться к введению генов, обеспечивающих превращение нетоксичного соединения или пролекарства в смертельное лекарственное средство (Duarte et al. Cancer Letters, 2012). В соответствии с вариантами осуществления изобретения такие продукты генов могут быть селективно введены в пораженные заболеванием клетки, такие как опухолевые клетки, помечая их для разрушения индуцированным апоптозом или доставкой в других случаях нетоксичного соединения или пролекарства.
В конкретных вариантах осуществления изобретения мРНК может кодировать ингибиторы сигнального пути программируемой клеточной смерти, такие как ингибиторы рецептора PD-1 (CD279) или его лигандов PD-L1 (В7-Н1; CD274) и PD-L2 (B7-DC; CD273). Следовательно, мРНК может кодировать белок или полипептид, который связывается или иным образом нарушает функцию оси PD-1/PDL-1 или PD-1/PDL-2 в пораженных заболеванием или опухолевых клетках в органе-мишени. Подходящие белки или полипептиды могут включать антитела, которые могут быть моноклональными или поликлональными, или их антигенсвязывающие фрагменты, или другие антигенсвязывающие микробелки, которые связываются с рецептором PD-1, PDL-1, PDL-2 или комплексами лиганда и рецептора. Этот эффект может также наблюдаться при использовании белковых или полипептидных ингибиторов пути цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4 (CTLA4), другой так называемой иммунной контрольной точки. Известно, что ингибирование одного или обоих путей приводит к изменению иммунного ответа в микроокружении опухоли, которое может положительно влиять на состояние здоровья пациента. Кроме того, модулируя иммунный ответ у субъекта, композиции согласно настоящему изобретению могут быть особенно эффективны в комбинаторной терапии с другими противораковыми терапевтическими подходами, такими как радиационная терапия или химиотерапия. Одобренные FDA (Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) ингибиторы пути анти-PD1 включают пембролизумаб и ниволумаб. Известные ингибиторы анти-PDL-1 включают MPDL-3280A, BMS-936559 и атезолизумаб. Терапевтические ингибиторы анти-CTLA4 включают ипилимумаб и тремелимумаб. Композиции согласно изобретению могут применяться для избирательной доставки таких ингибиторов сигнального пути программируемой клеточной смерти или их функциональных миметиков к пораженным заболеванием клеткам внутри органа-мишени у субъекта путем использования отличающейся среды мкРНК в этих клетках.
Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-T-клетки) представляют собой иммунные клетки, обычно Т-лимфоциты, которые были модифицированы для экспрессии рецепторов, нацеленных на раковые клетки.
Адоптивная иммунотерапия, которая включает перенос аутологичных антигенспецифических Т-клеток, генерируемых ex vivo, является многообещающей стратегией лечения вирусных инфекций и рака. Т-клетки, используемые для адоптивной иммунотерапии, могут быть генерированы либо путем размножения антигенспецифических Т-клеток, либо путем перенаправления Т-клеток с помощью генной инженерии (см., например, Park, Т. S., S. A. Rosenberg, et al. (2011). "Treating cancer with genetically engineered T cells." Trends Biotechnol 29(11): 550-7).
Новые специфичности в Т-клетках, также известных как иммунные эффекторные клетки, были успешно созданы посредством генетического переноса трансгенных Т-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (CAR) (см., например, Jena, В., G. Dotti, et al. (2010). "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor." Blood 116(7): 1035-44). CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие по меньшей мере из трех частей: внеклеточного антигенраспознающего домена (также известного как эктодомен), трансмембранного домена и внутриклеточного домена активации Т-клеток (также известного как эндодомен). В некоторых вариантах осуществления сконструированные Т-клетки включают в себя определенный класс Т-клеток, такой как, например, гамма-дельта-Т-клетки, подтип Т-клеток, которые избирательно нацеливаются на опухолевые клетки, не затрагивая здоровые. CAR успешно позволили перенаправить Т-клетки против антигенов, экспрессируемых на поверхности опухолевых клеток различных злокачественных новообразований, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti et al., см. выше). В некоторых вариантах осуществления сконструированные Т-клетки содержат по меньшей мере популяцию аутологичных Т-клеток, в которой CAR-T-клетки сконструированы для устранения экспрессии эндогенного αβ Т-клеточного рецептора (TCR), чтобы предотвратить реакцию "трансплантат против хозяина", не нарушая CAR-зависимых эффекторных функций. В некоторых вариантах осуществления сконструированные Т-клетки содержат по меньшей мере популяцию аллогенных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления сконструированные Т-клетки содержат по меньшей мере популяцию аутологичных Т-клеток и популяцию аллогенных Т-клеток.
Обычно внеклеточный антигенраспознающий домен представляет собой нацеливающий фрагмент, связанный с одним или более сигнальными доменами в одной слитой молекуле из домена антитела, рецептора или лиганда, который связывает конкретную мишень, обычно мишень, ассоциированную с опухолью. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен представляет собой или происходит от одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), содержащего вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен связан с трансмембранным доменом с помощью линкера, такого как, например, гибкий линкер, такой как линкер шарнира lgG1. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой или происходит от трансмембранного домена CD28. В некоторых вариантах осуществления эндодомен включает костимулирующий домен, предназначенный для усиления иммунного ответа, например, путем повышения выживаемости и увеличения пролиферации CAR-модифицированных Т-клеток, и внутренний домен активации Т-клеток, предназначенный для активации Т-клеток при связывании с желаемой мишенью. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий домен представляет собой или происходит от костимулирующего домена CD28, костимулирующего домена ОХ-40 (CD134), костимулирующего домена ICOS, костимулирующего домена 4-1ВВ (CD137) или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен активации Т-клеток содержит домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ) или его биологически активную часть. В некоторых вариантах осуществления активация Т-клеток приводит к активации иммунных клеток, при которой Т-клетками высвобождаются воспалительные цитокины, способствующие воспалению и/или иммунному ответу. В некоторых вариантах осуществления активация Т-клеток приводит к цитотоксической активности, при которой Т-клетками высвобождаются цитотоксины, способствующие апоптозу раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления активация Т-клеток приводит к пролиферации, при которой Т-клетками высвобождаются интерлейкины, способствующие развитию и делению клеток. В некоторых вариантах осуществления активация Т-клеток приводит к комбинации по меньшей мере двух из активации иммунных клеток, цитотоксической активности и/или пролиферации.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен специфически связывается c CD19. CD19 является привлекательной мишенью для иммунотерапии, поскольку подавляющее большинство В-острых лимфобластных лейкозов (B-ALL) однотипно экспрессируют CD19, тогда как его экспрессия отсутствует на негемопоэтических клетках, а также на миелоидных, эритроидных и Т-клетках и стволовых клетках костного мозга. Продолжается проведение клинических исследований, направленных на изучение CD19 при В-клеточных злокачественных новообразованиях, с получением воодушевляющих противоопухолевых ответов. Во многих современных CAR-T-терапиях, оцениваемых в клинических исследованиях, используются Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) со специфичностью, получаемой из области scFv С019-специфического мышиного моноклонального антитела FMC63 (см., например, Nicholson, Lenton et al. (1997);. "Construction and characterisation of a functional CD19 specific single chain Fv fragment for immunotherapy of В lineage leukaemia and lymphoma." Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17):1157-65; Cooper, Topp et al. (2003). "T-cell clones can be rendered specific for CD19: toward the selective augmentation of the graft-versus-B-lineage leukemia effect." Blood. 2003 Feb 15; 101 (4):1637-44; Cooper, Jena et al. (2012) (международная заявка WO2013/126712).
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен специфически связывается с CD22. CD22 представляет собой трансмембранный фосфогликопротеин, принадлежащий к семейству лектинов Siglec и специфически связывающий сиаловую кислоту своими семью N-концевыми внеклеточными доменами иммуноглобулина. Он главным образом выполняет функцию ингибирующего рецептора для активации и передачи сигналов В-клетками и регулирует взаимодействие В-клеток с Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками (АРС). Подобно CD19, CD22 представляет собой ограниченный линией В-клеток маркер, явным образом экспрессируемый В-лимфоидными клетками от стадии пре-В до стадии зрелой В-клетки. Однако он утрачивается при дифференцировке в плазматические клетки. CD22 повсеместно экспрессируется при большинстве В-клеточных злокачественных новообразований, включая острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и различные подтипы неходжкинской лимфомы (NHL), такие как диффузная В-крупноклеточная лимфома. То, что CD22 является привлекательной терапевтической мишенью при В-клеточных злокачественных новообразованиях было подтверждено положительными результатами в клинических исследованиях моноклональных антител к CD22 (например, эпратузумаба) и иммунотоксинов (например, BL22, НА22). Было показано, что CD22 экспрессируется на клетках ALL, утративших CD19 после обработки анти-СР19 CAR-T-клетками, что делает анти-СР22 CAR-T-клетки подходящими для комбинированной и/или последующей терапии анти-CD19 CAR-T клетками.
Тем не менее, хотя в многочисленных клинических исследованиях был продемонстрирован потенциал адоптивного переноса CAR-T-клеток для противораковой терапии, они также повысили риски, связанные с синдромом выброса цитокинов (CRS) и эффектом «on-target off-tumour».
Композиции для доставки мРНК, предложенные в некоторых вариантах осуществления в настоящем документе, пригодны для повышения безопасности и эффективности CAR-T-клеток. Например, системы наночастиц для доставки мРНК согласно вариантам осуществления, описанным в настоящем документе, могут применяться для рекрутинга специфических иммунных клеток или модифицированных субпопуляций иммунных клеток, таких как CAR-T-клетки, в микроокружение опухоли. Кроме того, системы наночастиц для доставки мРНК могут применяться для ингибирования эндогенных Т-клеточных рецепторов (TCR), чтобы избежать заболевания «трансплантат против хозяина» и/или для избирательной делеции генов иммунных контрольных точек в этих клетках, чтобы усилить их противораковую активность в супрессивном микроокружении опухоли, (см., например, Moffett, Coon, et al. (2017) "Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers." Nature Communications. 8:389.)
В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК применяется для привлечения CAR-T-клеток в конкретный сайт у субъекта. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК применяется для преодоления недостаточной миграции иммунной клетки в микроокружение опухоли. В ответ на специфические хемокины различные субпопуляции иммунных клеток мигрируют в микроокружение опухоли и регулируют противоопухолевые иммунные ответы пространственно-временным образом. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК применяется для усиления активации CAR-T-клеток. Кроме того, хемокины могут непосредственно воздействовать на неиммунные клетки, включая опухолевые клетки и эндотелиальные клетки сосудов, в микроокружении опухоли, и было показано, что они регулируют пролиферацию опухолевых клеток, свойства раковых стволовых клеток, инвазивность и метастазирование рака. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку, естественную киллерную (NK) клетку, В-клетку, антигенпрезентирующую клетку (АРС), такую как макрофаг или дендритная клетка, или любую их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК может применяться для преодоления недостаточной миграции CAR-T-клеток в микроокружение опухоли и предотвращения нецелевой активности CAR-T. В некоторых вариантах осуществления мРНК доставляют в микроокружение опухоли, а кодирующая мРНК кодирует продукт гена, привлекающий или иным образом рекрутирующий CAR-T-клетки в микроокружение опухоли. В некоторых вариантах кодирующая мРНК экспрессирует хемокин. В качестве неограничивающего примера одна или более кодирующих мРНК могут кодировать один или более хемокинов, привлекающих Т-клетки, таких как CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL20, CCL22, CCL28, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 и любую их комбинацию. В ситуациях, когда требуется обратный эффект, например при аутоиммунном заболевании, кодирующая мРНК может экспрессировать блокаторы, антагонисты и/или ингибиторы вышеупомянутых факторов.
В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК временно экспрессируется в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК кодирует цитокин или другой продукт гена, участвующий в регуляции выживания, пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток в противоопухолевом ответе, таких как, например, активированные Т-клетки и NK-клетки. В качестве неограничивающего примера кодирующая мРНК может кодировать цитокин, такой как IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, IL-33, IL-35, TGF-бета и любую их комбинацию. Аналогичным образом, в ситуациях, когда требуется обратный эффект, например, при аутоиммунном заболевании, кодирующая мРНК может экспрессировать блокаторы, антагонисты и/или ингибиторы вышеупомянутых факторов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения кодирующую мРНК доставляют в комбинации с CAR-T или другой адоптивной клеточной терапией для обеспечения временной экспрессии кодирующей мРНК.
В некоторых вариантах осуществления система для доставки мРНК, как описано в настоящем документе, доставляет мРНК, кодирующую агент для редактирования генома, в популяцию клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует сиквенс-специфическую нуклеазу, нацеленную на локус гена и нарушающую экспрессию одного или более эндогенных генов, продуцируемых в популяции клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует сиквенс-специфическую нуклеазу, нацеленную на локус гена, связанный с Т-клеточным рецептором (TCR), тем самым нарушая экспрессию одного или более доменов TCR.
В некоторых вариантах осуществления описанные системы для доставки мРНК могут применяться для доставки мРНК, кодирующей один или более агентов, программирующих сконструированные Т-клетки в направлении желаемого фенотипа. В некоторых вариантах осуществления мРНК может применяться для индукции маркеров и профилей транскрипции, характерных для желаемого фенотипа Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления мРНК может применяться для стимуляции развития CD26L+центральных Т-клеток памяти (Tcm), которые, как было показано, улучшают эффективность лечения CAR-T-клетками. (см., например, Moffett, Coon, выше).
МикроРНК (мкРНК) представляют собой класс некодирующих РНК, каждая из которых содержит приблизительно от 20 до 25 нуклеотидов, некоторые из которых, как полагают, участвуют в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов путем связывания с комплементарными последовательностями в 3'-концевых нетранслируемых областях (3'-концевых UTR) мРНК-мишеней, что приводит к их сайленсингу. Эти последовательности также называются в настоящем документе сайтами связывания мкРНК или последовательностями сайтов связывания мкРНК. Некоторые мкРНК обладают высокой тканеспецифичностью в своей экспрессии; например, miR-122 и ее варианты широко распространены в печени и редко экспрессируются в других тканях (Lagos-Quintana (2002), Current Biology, Vol.12, Apr).
Таким образом, система мкРНК обеспечивает надежную платформу, с помощью которой нуклеиновые кислоты, вводимые в клетки, могут быть подвергнуты сайленсингу в выбранных типах клеток в ткани-мишени, и экспрессированы в других. Путем включения сайта связывания для конкретной данной последовательности мкРНК в конструкцию мРНК, подлежащую введению в клетки-мишени, особенно в UTR или непосредственно с 5'- или 3'-конца от нее, экспрессия определенных введенных генов может быть снижена или по существу устранена в некоторых типах клеток, сохраняясь в других (Brown and Naldini, Nature Reviews Genetics volume 10, pages 578-585 (2009)). Подразумевается, что термин «непосредственно» является синонимом терминов «в высокой близости к» или «очень близко к». При упоминании 5'-концевого или 3'-концевого положения относительно последовательности UTR оно охватывает варианты, в которых между последовательностью связывания мкРНК и соседней UTR могут быть расположены обычно до приблизительно двадцати, в соответствующих случаях не более пятидесяти, промежуточных нуклеотидных оснований. Предполагается, что одна или множество таких последовательностей сайтов связывания мкРНК могут быть включены в конструкцию мРНК. Когда присутствует множество последовательностей сайтов связывания мкРНК, это множество может включать, например, более двух, более трех, обычно более четырех последовательностей сайтов связывания мкРНК. Эти последовательности сайтов связывания мкРНК в конструкциях мРНК могут быть расположены последовательно, совместно или в заранее определенных местах внутри определенной UTR или непосредственно с 3'- или 5'-конца от нее. Несколько последовательностей сайтов связывания могут быть разделены линкерной последовательностью, которая может варьироваться, или могут содержать конкретную последовательность, например, «uuuaaa». В некоторых вариантах осуществления между последовательностями сайтов связывания может отсутствовать линкерная последовательность. Другие части последовательности мРНК могут включать линкерные последовательности, например, между стоп-кодоном ORF и UTR или сайтами связывания.
мкРНК-122, несмотря на ее широкую распространенность в здоровой не пораженной заболеванием ткани печени, снижается при большинстве раковых заболеваний печени, а также в пораженных заболеванием клетках (Braconi et al. 2011, Semin Oncol; 38(6): 752-763, Brown and Naldini Nature 2009;10 578). Вышеупомянутым способом было обнаружено, что, когда тканью-мишенью является печень, трансляция введенных последовательностей мРНК может быть облегчена в раковых клетках печени и снижена или по существу устранена в трансфицированных здоровых клетках путем включения сайтов связывания мкРНК-122 (например, SEQ ID NO: 1) в их UTR или непосредственно с 3'-конца от них.
Аналогичным образом, возможна также дифференциальная трансляция такой мРНК между раковыми клетками и здоровыми клетками в других органах с использованием других последовательностей сайтов связывания мкРНК. Подходящие кандидаты включают (не ограничиваясь перечисленным) сайты связывания для мкРНК-125, мкРНК-124а, MKPHK-Let7, мкРНК-375, мкРНК-143, мкРНК-145, мкРНК-192, мкРНК-194, мкРНК-204, мкРНК-215 и мкРНК-30b,с. В таблице 2 приведены дополнительные (неограничивающие) примеры последовательностей мкРНК, где была продемонстрирована дифференциальная экспрессия.
мкРНК-125 подавлена в нескольких солидных опухолях, таких как гепатоклеточная карцинома (Coppola et al. Oncotarget 2017;8); рак молочной железы (Mattie et al. Mol Cancer 2006;5), рак легкого (Wang ewt al. FEBS J 2009), рак яичника (Lee et al. Oncotarget 2016;7), рак желудка (Xu et al. Mol Med Rep2014;10, рактолстой кишки (Tong et al. Biomed Pharmacother2015;75) и рак шейки матки (Fan et al Oncotarget 2015;6); нейробластома, медуллобластома (Ferretti et al. Int J Cancer 2009;124), глиобластома (Cortez et al. Genes Chromosomes Cancer 2010;49) и ретинобластома (Zhang et al; Cell signal 2016;28).
Несколько видов мкРНК также дифференциально экспрессируются в клетках мультиформной глиобластомы (Zhangh et al. J Miol Med 2009;87 / Shi et al. Brain Res 2008;1236) по сравнению с не пораженными заболеванием клетками головного мозга (например, нейронами), причем мкРНК-124а является одной из наиболее разрегулированных (Karsy et al. Gene Cancer 2012;3; Riddick et al. Nat Rev Neurol 2011;7; Gaur et al. Cancer Res 2007;67 / Silber et al. BMC Med 2008;6).
В отношении рака легкого недавний мета-анализ подтвердил подавление Let-7 (а также мкРНК-148а и мкРНК-148b) при немелкоклеточном раке легкого (Lamichhane et al. Disease Markers 2018).
Аналогично, было обнаружено, что экспрессия мкРНК-375 подавлена в клетках рака поджелудочной железы по сравнению со здоровыми клетками поджелудочной железы (Shiduo et al. Biomedical Reports 2013;1).
В еще одном варианте осуществления использование секретирующих IL-12 клеток может усиливать активность CAR-T-клеток. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что индуцированное IL-12 накопление IFNγ в опухолях способствует проникновению CAR-T или других иммунных клеток хозяина (например, NK-клеток) в опухоли, что приводит к усилению терапевтического эффекта (Chinnasamy D. et al. Clin Cancer Res 2012:18/Chmielewski M. et al. Cancer Res 2011; 71 / Kerkar SP. Et al. J Clin Invest 2011; 121 / Jackson HJ. Et al. Nat Rev Clin Oncol 2016; 13). Следовательно, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения мРНК может применяться для стимулирования экзогенной экспрессии IL-12 в микроокружении опухоли путем кодирования IL-12 или его функционального эквивалента или производного.
В контексте специфической для заболевания экспрессии введенных полинуклеотидов связывающие последовательности для любой последовательности мкРНК, которая нарушается при конкретном заболевании, то есть, ее экспрессия активируется или подавляется в пораженных заболеванием клетках (таких как опухолевые клетки) по сравнению с не пораженными заболеванием клетками, считаются подходящими для использования в изобретении. В таблице 2 обсуждаются дополнительные неограничивающие примеры опухолеассоциированных последовательностей связывания мкРНК такого типа, которые могут быть использованы в вариантах осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается только случаями, когда экспрессия данной мкРНК или класса мкРНК подавляется в первом типе клеток по сравнению со вторым типом клеток в данном органе или системе органов. Напротив, просто требуется наличие дифференциального профиля экспрессии регуляторной мкРНК в первом и втором типах клеток, содержащихся в органе или системе органов. Дифференциальная экспрессия мкРНК может быть использована с применением композиций и способов, описанных в настоящем документе, для обеспечения соответствующей дифференциальной трансляции белковых продуктов в этих клетках.
Примеры раковых заболеваний, при которых были обнаружены свидетельства схожей дифференциальной экспрессии мкРНК в здоровых и раковых клетках, включают рак молочной железы (Nygaard et al, ВМС Med Genomics, 2009 Jun 9;2:35), рак яичника (Wyman et al, PloS One, 2009;4(4):e5311), рак предстательной железы (Watahiki et al, PloS One, 2011; 6(9):e24950) и рак шейки матки (Lui et al. Cancer Research, 2007 Jul 1; 67(13):6031-43). В WO 2017/132552 A1 описан широкий спектр мкРНК с различными уровнями экспрессии в различных раковых клетках.
Было показано, что в поджелудочной железе экспрессия мкРНК-375 является высокой в нормальных клетках поджелудочной железы, но значительно ниже в пораженных заболеванием и/или раковых тканях (Song, Zhou et al. 2013). Было показано, что эта экспрессия зависит от стадии рака, причем экспрессия еще более снижается при более поздней стадии рака. Полагают, что мкРНК-375 участвует в регуляции индуцированных глюкозой биологических реакций в β-клетках поджелудочной железы путем нацеливания на мРНК 3-фосфоинозитид-зависимой протеинкиназы-1 (PDK1) и, таким образом, влияет на каскад PI 3-киназы/РКВ (El Ouaamari et al. Diabetes 57:2708-2717, 2008). Антипролиферативный эффект мкРНК-375 связан с этим предполагаемым механизмом действия, что может объяснить ее подавление в раковых клетках.
Известно, что могут быть найдены варианты и полиморфизмы последовательностей мкРНК, и что существуют семейства мкРНК со схожими свойствами. В настоящем изобретении предполагается, что в соответствующих случаях могут применяться все подходящие варианты и члены семейства конкретных последовательностей мкРНК и связанных сайтов связывания. С другой стороны, предположительно близкородственные последовательности мкРНК могут иметь разные профили экспрессии (Sun et al, World J Gastroenterol. 2017 Nov 28), поэтому в некоторых ситуациях необходимо будет определить, подходит ли конкретная замена, со ссылкой на литературные данные. Например, Let-7 является частью более широкого семейства с рядом родственных вариантов, которые можно обозначить как Let-7a - Let-7k и т.д.
Лечение пациентов с помощью иммунотерапии, такой как онколитические вирусы или терапия CAR-T, может создавать угрозу безопасности из-за возможности нецелевых эффектов. Даже экспрессия определенных полипептидов путем предоставления кодирующих последовательностей мРНК может оказывать отрицательное влияние на определенные органы. Защита здоровых тканей, например, печени, головного мозга, молочной железы, легкого, поджелудочной железы, толстой кишки/желудочно-кишечного тракта и почек, таким образом, имеет первостепенное значение для успешного клинического применения. Следовательно, настоящие композиции могут представлять собой благоприятную технологическую платформу для облегчения и содействия успешному внедрению до сих пор «экспериментальных» клеточных или вирусных методов лечения.
Присутствие множества последовательностей сайтов связывания мкРНК в конструкции мРНК обеспечивает улучшенную эффективность дифференциальной экспрессии предоставляемого полипептида или полипептидов. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что с увеличением числа сайтов связывания вероятность связывания мкРНК и последующей деградации увеличивается. Несколько сайтов связывания мкРНК могут содержать несколько копий по существу одной и той же последовательности сайта связывания, тем самым внося избыточность. В качестве альтернативы или дополнительно, несколько последовательностей сайтов связывания могут содержать по существу разные последовательности, что позволяет нацеливать конструкцию мРНК более чем одним видом мкРНК. Таким образом, дифференциальная экспрессия предоставляемой конструкции мРНК может быть достигнута для более чем одного типа клеток и/или в более чем одном органе, как очевидно из приведенного выше обсуждения органов и связанных с ними последовательностей мкРНК. Оба подхода считаются возможными в пределах одной и той же последовательности или нескольких последовательностей. Предусматривается также промежуточный подход, при котором включено несколько последовательностей связывания, предназначенных в качестве мишеней для одной и той же последовательности мкРНК, но имеющих различия, чтобы связывать разные варианты одной и той же последовательности мкРНК.
Некоторые преимущества, связанные с использованием нескольких сайтов связывания, включают увеличение эффективности дифференциальной экспрессии полипептидов, предоставляемых последовательностями мРНК согласно настоящему изобретению, в пределах одного органа. Использование разных последовательностей сайтов связывания или последовательностей, которые применимы к более чем одному типу ткани или органа, может обеспечить возможность достижения дифференциальной экспрессии в различных типах клеток в более чем одном органе или ткани. Это может быть желательным, когда используется системное введение композиций согласно изобретению, и необходимо избегать нецелевых эффектов более чем в одном органе.
Даже при локальном или целевом введении предоставляемые конструкции мРНК могут попадать или накапливаться в органах, тканях и/или клетках, для которых они не предназначены. В частности, ткани печени и почек могут накапливать введенные композиции из-за физиологической функции этих органов. В этих случаях, чтобы избежать нецелевых эффектов, может быть желательно, чтобы предоставляемые конструкции содержали последовательности сайтов связывания мкРНК, которые позволили бы снизить экспрессию в этих тканях. И наоборот, может быть желательно стимулировать экспрессию в некоторых органах, тканях и/или типах клеток, но не в других, что может быть достигнуто путем соответствующего выбора последовательностей сайтов связывания мкРНК.
В некоторых вариантах осуществления в одной композиции может быть предусмотрено несколько разных последовательностей мРНК. Эти разные последовательности могут кодировать разные полипептиды и/или разные последовательности связывания мкРНК. Таким образом, одна композиция может обеспечивать экспрессию множества разных полипептидов. При использовании различных комбинаций последовательностей связывания мкРНК в отдельных последовательностях мРНК различные типы клеток или органов-мишеней могут экспрессировать или быть защищены от экспрессии определенных полипептидов в соответствии с желаемой целью. Например, если здоровые клетки в печени и головном мозге должны быть защищены от экспрессии полипептида «А», но желательно экспрессировать полипептид «В» в здоровом головном мозге, но не в печени, первая последовательность мРНК может содержать последовательность «А», с сайтами связывания для мкРНК-122, мкРНК-125а и мкРНК-124а, тогда как вторая последовательность мРНК может содержать последовательность «В», с сайтами связывания для мкРНК-122 и мкРНК-125а.
Понятно, что специалист в данной области техники сможет разработать комбинации сайтов связывания, полипептидных последовательностей и множества последовательностей мРНК для достижения любой комбинации экспрессии в заданном наборе органов и типов клеток. Некоторые примеры приведены на фиг. 19А, 19В, 19С, 19D и 19Е и в SEQ ID NO: 1-29. На фиг. 19А показаны последовательности возможных сайтов связывания мкРНК-122, мкРНК-125а, мкРНК-124а, Let-7, мкРНК-375, мкРНК-192 и мкРНК-143 (относящиеся к SEQ ID NO: 1-7, соответственно). Соответствующие органы и типы тканей, относящиеся к этим последовательностям, обсуждаются выше и в таблице 2. На фиг. 19В показаны схематические изображения конструкций мРНК согласно некоторым вариантам осуществления изобретения. ORF предшествует старт-кодон и она оканчивается стоп-кодоном, после чего следует последующая серия из вплоть до пяти последовательностей сайтов связывания. Как показано на этой фигуре, последовательности сайтов связывания могут быть разделены линкерами или не иметь линкеров. ORF может кодировать, например, US3, или может представлять собой любую ORF. Вариабельность в стоп-кодоне предусмотрена в любом из вариантов осуществления, и во всех вариантах осуществления может отсутствовать стоп-кодон между ORF и последовательностями сайтов связывания.
Конкретные комбинации последовательностей сайтов связывания мкРНК приведены на фиг. 19С и 19D вместе с органами, которые имеют улучшенную защиту в результате этой выборки. Это можно увидеть на примерах SEQ ID NO: 8-16. Ясно, что защита является относительной, а не абсолютной, и что уровни экспрессии микроРНК будут варьироваться в пределах органа между различными тканями и между органами. Вариации также будут иметь место в популяции, в зависимости от этнической принадлежности, возраста, пола, состояния здоровья и патологии, а также генетических вариаций и полиморфизмов между индивидуумами.
В одном из вариантов осуществления последовательность мРНК может содержать SEQ ID NO: 11. Эта последовательность содержит последовательности связывания для последовательностей микроРНК мкРНК-122, мкРНК-125, мкРНК-124а, Let-7 и мкРНК-375. Эти последовательности обеспечивают защиту от нежелательной экспрессии предоставляемого полипептида в здоровой ткани органов, таких как (не ограничиваясь перечисленным) печень, головной мозг, легкие, поджелудочная железа и молочная железа. Аналогичным образом последовательность, содержащая последовательности связывания для последовательностей мкРНК мкРНК-122, мкРНК-124а, Let-7, мкРНК-375, мкРНК-192, обеспечит улучшенную защиту печени, головного мозга, легких, поджелудочной железы, молочной железы и почек. Для лечения желудочно-кишечных опухолей, таких как колоректальный рак, защита медицинских тканей печени, легкого, молочной железы, поджелудочной железы, почки и толстой кишки будет иметь важное значение для медицинского применения.
На фиг. 19Е показаны конкретные комбинации кодирующих последовательностей полипептидов и сайтов связывания. А именно, кодирующая последовательность US3 указана в комбинации с любой из комбинаций последовательностей сайтов связывания, приведенных на фиг. 19В и 19С (например, с SEQ ID NO: 8-16), как проиллюстрировано SEQ ID NO: 18-26, а кодирующая последовательность RR1 указана в комбинации с последовательностями сайтов связывания, например, с SEQ ID NO: 11 и 16, как проиллюстрировано SEQ ID NO: 27 и 28. Кодирующая последовательность IL-12 указана в комбинации с последовательностями сайтов связывания, включенными, например, в SEQ ID NO: 11, как проиллюстрировано SEQ ID NO: 29. ORF, содержащая кодирующие последовательности как для US3, так и для RR1, как для US3, так и для анти-PDLI, как для US3, так и для анти-PDLI, и как для RR1, так и для IL12, указана в комбинации с последовательностями сайтов связывания, например, с SEQ ID NO: 11. Однако в настоящем документе рассматриваются все комбинации кодирующих последовательностей и множества последовательностей сайтов связывания. В частности, кодирующие последовательности для US3, RR1, анти-PDLI и IL12 можно комбинировать с любыми последовательностями сайтов связывания.
В некоторых вариантах осуществления может быть желательно, чтобы последовательности сайтов связывания имели несоответствия с нацеленными на них последовательностями мкРНК. Например, несоответствия могут иметь место в отношении до 5%, до 10%, до 20% или до 30% оснований последовательностей сайтов связывания по сравнению с полноразмерными последовательностями мкРНК-мишени. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что чрезмерное поглощение последовательностей мкРНК в клетках может в некоторых типах клеток приводить к нарушению регуляции системы эндогенной мкРНК. Такое нарушение регуляции профилей мкРНК связано с различными заболеваниями печени (Szabo G et al. Gastroenterol Hepatol 2013; 10 / Schueller F. et al. Int J Mol Sci 2018; 19). Снижение комплементарности между предоставляемыми последовательностями сайтов связывания и последовательностями мкРНК может ослабить это потенциальное побочное действие.
UTR последовательностей мРНК, обеспечиваемых в соответствии с настоящим изобретением, может быть выбрана так, чтобы она имела сходство, например, сходство более чем на 90%, с частью или всей последовательностью UTR, экспрессируемой в одном из типов клеток в органе-мишени. У определенных типов клеток могут быть гены, которые экспрессия которых активируется или подавляется, и последовательность UTR может опосредовать эту регуляцию, например, путем стимулирования стабильности или деградации соответствующих последовательностей мРНК.
Например, UTR, связанные с генами, которые, как известно, активируются в раковых клетках, могут иметь одну или более особенностей, таких как последовательности сайтов связывания мкРНК, которые стимулируют их стабильность и трансляцию в этих раковых клетках. Путем включения аналогичных последовательностей в обеспечиваемые последовательности мРНК можно улучшить стабильность и трансляцию в раковых клетках, но не в нераковых или здоровых клетках.
Также считается, что рак, подлежащий лечению согласно изобретению, может представлять собой вторичный рак в ткани-мишени, то есть, метастаз от рака в другом месте, отличном от ткани-мишени. Например, метастаз в печени может происходить от пищевода, желудка, толстой кишки, прямой кишки, молочной железы, почек, кожи, поджелудочной железы или легкого и может представлять собой аденокарциному или другой тип рака. В этих случаях может потребоваться выбор альтернативных последовательностей мкРНК для обеспечения дифференциальной экспрессии в здоровых, нераковых и/или раковых клетках. Действительно, в таких случаях может быть увеличен выбор последовательностей-кандидатов мкРНК из-за различного тканевого происхождения метастазировавших клеток.
В определенных ситуациях возможно существование более одного кандидата на последовательность мкРНК, которая демонстрирует дифференциальную экспрессию в различных типах клеток в ткани-мишени. В таких случаях может быть желательным включение множества последовательностей сайтов связывания мкРНК в конструкцию мРНК, и чтобы эти последовательности могли быть по существу разными последовательностями. Однако также предусмотрено, что все из множества последовательностей сайтов связывания мкРНК может быть по существу одинаковой последовательностью.
КОМБИНИРОВАННЫЕ ВИДЫ ТЕРАПИИ
Онколитические вирусы
Как упоминалось выше, онколитическая вирусная терапия представляет собой процесс использования вирусов для заражения и уничтожения раковых клеток, иногда путем прямого лизиса вируса, но также включая опосредованное уничтожение путем стимуляции противоопухолевых ответов хозяина. Хотя онколитические вирусы часто характеризуются повышенной активностью в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками, были зарегистрированы нецелевые эффекты, вызванные повреждением здоровых клеток (Russell et al. Nature Biotechnology, 2012).
Для повышения безопасности и снижения нецелевых эффектов онколитические вирусы могут быть модифицированы или отобраны для снижения их вирулентности, например, путем делеции факторов или генов вирулентности, участвующих в таких функциях, как подавление внутриклеточной иммунной системы и уклонение от нее, репликация вирусного генома и захват процессов клетки-хозяина. Исторически производимые безопасные формы живых вирусов для применения в вакцинации являются еще одним источником ослабленных вирусов. В других случаях отмечалось, что определенные мутации или даже дополнительные гены усиливают онколитическую активность, в частности, онколитических вирусов. Неисчерпывающие примеры генов вирулентности, обычно добавляемых, мутируемых или подвергаемых делеции в онколитических вирусах, приведены в таблице 3.
Таким образом, ослабление или модификация онколитических вирусов может играть роль в селективности онколитических вирусов к раковым клеткам: поскольку процесс канцерогенеза часто включает инактивацию генов, которые играют защитную роль против как рака (например, путем регуляции деления клеток или апоптоза), так и вирусной инфекции, онколитические вирусы, ослабленные, как описано выше, могут сохранять свою вирулентность в раковых клетках из-за отсутствия в этих клетках обычных противовирусных генов. Следовательно, в здоровых клетках ослабленный вирус не может защищаться от нормальных противовирусных ответов и устраняется, тогда как в раковых клетках этот ответ отсутствует, и вирус может осуществлять лизис клеток. Однако этот подход редко бывает полностью эффективным, поскольку, во-первых, частичная инактивация противовирусных ответов в раковых клетках встречается чаще, чем полное отсутствие противовирусной активности (Haralambieva et al, Mol. Then, 2007), что означает, что вирулентность в этих клетках все еще может быть снижена, и, во-вторых, все еще может происходить инфицирование здоровых клеток.
Точно так же, поскольку вирусы обычно используют клеточный механизм клетки-хозяина для репликации своих геномов, но этот механизм обычно подавляется в здоровых, покоящихся, не реплицирующихся клетках, которые не реплицируют свои собственные геномы, многие вирусы обладают генами, которые реактивируют или компенсируют механизм хозяина. Например, ферменты рибонуклеотидредуктазы необходимы для продукции дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеотидов; экспрессия этих ферментов обычно подавляется в покоящихся клетках-хозяевах, и некоторые вирусы обладают генами своих собственных ферментов этого типа, чтобы иметь источник дезоксирибонуклеотидов. Поскольку в реплицирующихся раковых клетках эти ферменты могут быть реактивированы, ослабленный онколитический вирус, ген собственного фермента рибонуклеотидредуктазы которого был подвергнут делеции, по-прежнему может реплицироваться в раковых клетках. Однако по причинам, аналогичным описанным выше, этот подход может не может быть полностью эффективным либо в отношении защиты здоровых клеток от инфицирования, либо в отношении восстановления вирулентности в раковых клетках. Например, не все клетки в опухоли реплицируются в любой отдельно взятый момент времени, и соответственно для репликации вируса в большей части раковых клеток может быть недоступно достаточное количество дезоксирибонуклеотидов.
В соответствии с вышеизложенным, при применении композиции или способа согласно настоящему изобретению в комбинации с онколитической вирусной терапией, терапевтический усиливающий фактор, обеспечиваемый конструкциями согласно изобретению, может быть фактором, повышающим эффективность онколитического вируса в раковых клетках, например, усиливающим репликацию вируса или способность вируса осуществлять лизис клеток, в которых он находится. В частности, если онколитический вирус был модифицирован для ослабления его функции, например, путем делеции одного или более генов факторов вирулентности, терапевтический фактор может заменить подвергнутый делеции ген мРНК для продукта гена, который является копией продукта гена вируса, или продукта гена, по существу гомологичного подвергнутому делеции гену, или иным образом компенсирующего делецию гена. В таких вариантах осуществления посредством дифференциальной экспрессии в здоровых и раковых клетках, возможной благодаря изобретению, заменяющий продукт гена может экспрессироваться только в раковых клетках, усиливая вирусную активность и лизис в этих клетках, а не в здоровых клетках, где экспрессия обеспечиваемой мРНК ингибируется вследствие наличия сайтов связывания мкРНК.
Аналогичным образом, мРНК, кодирующая факторы, повышающие устойчивость клеток к онколитическим вирусам, может избирательно экспрессироваться в здоровых клетках, что, опять же, способствует вирусной активности в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками.
Преимущество этого подхода заключается в том, что, в отличие от ранее известных видов терапии с использованием онколитических вирусов, он не зависит ни от того, какие клеточные антивирусные гены и процессы могут быть инактивированы вследствие канцерогенеза, ни от процессов репликации клеток, которые могут активироваться в некоторых раковых клетках и быть неактивны в других. В результате возможна делеция большего объема генов вирулентности из онколитических вирусов. Таким образом, онколитические вирусы могут быть модифицированы так, чтобы полностью лишиться способности к репликации в здоровых клетках, а в раковых клетках, где функция подвергшихся делеции генов вирулентности заменяется с помощью изобретения, вирус может быть восстановлен до полной активности. В результате побочные действия могут быть снижены, а эффективность увеличена. Аналогичным образом, поскольку дифференциальная экспрессия обеспечиваемой мРНК зависит от различий в экспрессии мкРНК в раковых и здоровых клетках, вирулентность может быть восстановлена во всех трансфицированных раковых клетках, а не только в тех, которые, например, претерпевают репликацию во время введения.
В частном варианте осуществления онколитический вирус представляет собой HSV-1 - часть семейства герпесвирусов. Ослабленные версии HSV могут быть сконструированы или отобраны так, чтобы быть дефицитными по ICP6, который кодирует вирусную рибонуклеотидредуктазу (Aghi et al, Oncogene. 2008), и/или по US3, который кодирует серин/треонин-протеинкиназу и играет несколько ролей в жизненном цикле вируса, включая блокирование апоптоза клеток-хозяев (Kasuya et al, Cancer Gene Therapy, 2007).
В еще одном варианте осуществления онколитический вирус является частью семейства поксвирусов, в частности, он может представлять собой вирус осповакцины. Ослабленные версии вируса осповакцины смогут быть сконструированы или отобраны так, чтобы быть дефицитными по одной или более субъединицам рибонуклеотидредуктазы (RR1 и RR2) и/или по тимидинкиназе (ТК) (Buller et al. Nature (London) 1985;317. Puhlamm M et al. Cancer Gene Ther 2000;7 Slabaugh MB et al. J Virol 1984;52).
Примеры последовательностей, содержащих кодирующие последовательности, специфичные для конкретных полипептидов, связанных с онколитическими вирусами, а также множество последовательностей сайтов связывания мкРНК, приведены, например, в SEQ ID NO: 18-28, а также на фиг. 19B-19D.
Цитокины
Предполагается, что композиции и способы, описанные в настоящем документе, могут индуцировать иммунный ответ против заболевания. В частности, иммунные ответы могут быть индуцированы против раковых клеток. Процесс канцерогенеза часто включает в себя пути, посредством которых раковые клетки пытаются уклониться от иммунной системы, включая изменения в антигенах, продуцируемых и экспонируемых этими клетками.
В некоторых вариантах осуществления мРНК, обеспечиваемая изобретением, содержит по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий белок, который является биспецифическим рекрутером Т-клеток (BiTE), антииммуносупрессивным белком или иммуногенным антигеном. Термин «антииммуносупрессивный белок» в контексте настоящего документа относится к белку, ингибирующему иммуносупрессивный сигнальный путь.
Изобретение охватывает композиции, обеспечивающие мРНК, кодирующую антииммуносупрессивный белок, представляющий собой белок против регуляторных Т-клеток (Treg) или белок против супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). В некоторых вариантах осуществления антииммуносупрессивный белок представляет собой блокатор, полученный из VHH, или BiTE, полученный из VHH.
Термин «иммуногенный антиген» в контексте настоящего документа относится к белку, усиливающему воспалительный или иммуногенный иммунный ответ.В частных вариантах осуществления антииммуносупрессивные и иммуногенные антигены индуцируют противоопухолевый иммунный ответ.Примеры таких белков включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с рецепторами иммунных контрольных точек (например, CTLA4, LAG3, PD1, PDL1 и другие) и ингибируют их, провоспалительные цитокины (например, IFNγ, IFNα, IPNβ, TNFα, IL-12, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF и другие) или белки, которые связываются с активирующим рецептором (например, FcγRI, FcγIIa, FcγIIIa, костимулирующие рецепторы и другие) и активируют его. В частных вариантах осуществления белок выбран из ЕрСАМ, IFNβ, анти-CTLA-4, анти-PD1, анти-PDL1, А2А, анти-FGF2, анти-FGFR/FGFR2b, анти-SEMA4D, CCL5, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, CXCL10, CXCL13, рецептора эндотелина В, IL-12, IL-15, IL-2, IL-21, IL-35, ISRE7, LFA-1, NG2 (также известного как SPEG4), SMADs, STING, TGFβ и VCAM1.
Изобретение охватывает композиции, обеспечивающие мРНК, кодирующие функциональные макромолекулы для популяций клеток-мишеней, используемых в клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток-мишеней представляет собой популяцию генетически модифицированных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток-мишеней представляет собой популяцию Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T-клеток).
Кодирующая мРНК может применяться для привлечения популяции иммунных клеток или комбинации популяций иммунных клеток в конкретный сайт в организме субъекта. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК и частицы для доставки применяются для привлечения иммунных клеток в микроокружение опухоли. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК и частицы для доставки применяются для преодоления недостаточной миграции иммунной клетки в микроокружение опухоли. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку, естественную киллерную (NK) клетку, В-клетку, антигенпрезентирующую клетку (АРС), такую как макрофаг или дендритная клетка, или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК и частицы для доставки применяются для привлечения CAR-T-клеток в микроокружение опухоли.
Кодирующая мРНК может применяться для преодоления недостаточной миграции CAR-T-клеток в микроокружение опухоли. В некоторых вариантах осуществления частицы для доставки специфически нацелены на микроокружение опухоли, а кодирующая мРНК кодирует продукт гена, привлекающий или иным образом рекрутирующий CAR-T-клетки в микроокружение опухоли. В некоторых вариантах кодирующая мРНК экспрессирует хемокин. В качестве неограничивающего примера кодирующая мРНК может кодировать хемокин, привлекающий Т-клетки, такой как CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL20, CCL22, CCL28, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 и любые их комбинации. В ситуациях, когда требуется обратный эффект, например при аутоиммунном заболевании, кодирующая мРНК может экспрессировать блокаторы, антагонисты и/или ингибиторы вышеупомянутых факторов.
Кодирующая мРНК может быть доставлена в микроокружение опухоли и временно экспрессирована в нем. В некоторых вариантах осуществления кодирующая мРНК кодирует цитокин или другой продукт гена, участвующий в регуляции выживания, пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток в противоопухолевом ответе, таких как, например, активированные Т-клетки и NK-клетки. В качестве неограничивающего примера кодирующая мРНК может кодировать цитокин, такой как IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, IL-33, IL-35, TGF-бета и любую их комбинацию. Аналогичным образом, в ситуациях, когда требуется обратный эффект, например, при аутоиммунном заболевании, кодирующая мРНК может экспрессировать блокаторы, антагонисты и/или ингибиторы вышеупомянутых факторов.
Композиции, обеспечивающие мРНК, могут быть предназначены для нацеливания на конкретные подтипы клеток и, после связывания с ними, стимуляции рецептор-опосредованного эндоцитоза, тем самым вводя синтетическую мРНК, которую они переносят, в клетки, которые после этого могут экспрессировать синтетическую мРНК. Поскольку ядерный транспорт и транскрипция трансгена не требуются, этот процесс является быстрым и эффективным.
В некоторых вариантах осуществления система для доставки мРНК доставляет мРНК, кодирующую агент для редактирования генома, в популяцию клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует сиквенс-специфическую нуклеазу, нацеленную на локус гена и нарушающую экспрессию одного или более эндогенных генов, продуцируемых в популяции клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления мРНК кодирует сиквенс-специфическую нуклеазу, нацеленную на локус гена, связанный с Т-клеточным рецептором (TCR), тем самым нарушая экспрессию одного или более доменов TCR.
В некоторых вариантах осуществления системы для доставки мРНК могут применяться для доставки мРНК, кодирующей один или более агентов, программирующих сконструированные Т-клетки в направлении желаемого фенотипа. В некоторых вариантах осуществления композиции наночастиц для доставки мРНК могут применяться для индукции маркеров и профилей транскрипции, характерных для желаемого фенотипа Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции наночастиц для доставки мРНК могут применяться для стимуляции развития CD26L+центральных Т-клеток памяти (Tcm), которые, как было показано, улучшают эффективность лечения CAR-T-клетками. (см., например, Moffett, Coon, выше). В некоторых вариантах осуществления композиции обеспечивают мРНК, кодирующую один или более факторов транскрипции, для контроля дифференцировки клеток в популяции клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления фактор транскрипции представляет собой Foxo1, контролирующий развитие перехода CD8 Т-клеток из эффекторных клеток в клетки памяти.
В некоторых вариантах осуществления композиции для доставки мРНК включают закрепленный на поверхности нацеливающий домен, специфичный к маркеру Т-клеток, такому как, например, поверхностный антиген, находящийся на Т-клетках. В некоторых вариантах осуществления закрепленный на поверхности нацеливающий домен специфичен к антигену, который избирательно связывает наночастицу с Т-клетками и инициирует индуцируемый рецептором эндоцитоз для интернализации композиций наночастиц для доставки мРНК. В некоторых вариантах осуществления закрепленный на поверхности нацеливающий домен селективно связывает CD3, CD8 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления закрепленный на поверхности нацеливающий домен представляет собой или происходит от антитела, которое селективно связывает CD3, CD8 или их комбинацию.
С помощью изобретения может быть достигнута дифференциальная экспрессия вышеупомянутых продуктов генов в различных типах клеток, например, в здоровых клетках, не пораженных заболеванием, пораженных заболеванием клетках и раковых клетках. Посредством этого способа можно инициировать иммунный ответ, направленный на пораженные заболеванием клетки, не воздействуя при этом на не пораженные заболеванием или здоровые клетки.
Введение кодирующих нуклеотидных последовательностей в клетку-мишень часто требует использования агента доставки для переноса желаемого вещества из внеклеточного пространства во внутриклеточную среду. Часто такие агенты для доставки имеют форму частиц для доставки, которые могут подвергаться фагоцитозу и/или сливаться с клеткой-мишенью. Частицы для доставки могут содержать желаемое вещество путем инкапсуляции или путем включения вещества в матрицу или структуру.
Частицы для доставки могут быть нацелены на клетки ткани-мишени. Это нацеливание может быть опосредовано нацеливающим агентом на поверхности частиц для доставки, который может представлять собой белок, пептид, углевод, гликопротеин, липид, малую молекулу, нуклеиновую кислоту и т.д. Нацеливающий агент может применяться для нацеливания на конкретные клетки или ткани, или может применяться для стимуляции эндоцитоза или фагоцитоза частицы. Примеры нацеливающих агентов включают, не ограничиваясь перечисленным, антитела, фрагменты антител, липопротеины низкой плотности (ЛПНП), трансферрин, асиалогликопротеины, оболочечный белок qp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), углеводы, лиганды рецепторов, сиаловую кислоту, аптамеры и т.д.
Частицы для доставки могут содержать аминоспиртовые липидоиды. Эти соединения могут быть использованы при образовании частиц, включая наночастицы, липосомы и мицеллы, которые особенно подходят для доставки нуклеиновых кислот.Иллюстративный пример получения нанопрепаратов, содержащих частицы в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, содержится в разделе примеров.
При введении субъекту терапевтический компонент соответствующим образом вводится как часть композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Приемлемые фармацевтические носители могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Фармацевтические носители могут представлять собой физиологический раствор, аравийскую камедь, желатин, крахмальную пасту, тальк, кератин, коллоидный диоксид кремния, мочевину и тому подобное. Кроме того, могут быть использованы вспомогательные, стабилизирующие, загущающие, смазывающие агенты и красители. При введении субъекту фармацевтически приемлемые носители предпочтительно являются стерильными. Вода является подходящим носителем при внутривенном введении соединения согласно изобретению. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические носители также включают вспомогательные вещества, такие как крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Фармацевтические композиции, при желании, могут также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов.
Лекарственные средства и фармацевтические композиции согласно изобретению могут принимать форму жидкостей, растворов, суспензий, гелей, составов с модифицированным высвобождением (таким как медленное или замедленное высвобождение), эмульсий, капсул (например, капсул, содержащих жидкости или гели), липосом, микрочастиц, наночастиц или любые другие подходящие составы, известные в данной области техники. Другие примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19th ed., 1995, см., например, стр. 1447-1676.
Для любого соединения или композиции, описанных в настоящем документе, терапевтически эффективное количество может быть первоначально определено из анализов клеточных культур in vitro. Целевые концентрации будут представлять собой такие концентрации активного компонента(ов), которые способны обеспечить осуществление способов, описанных в настоящем документе, при измерении с использованием способов, описанных в настоящем документе или известных в данной области техники.
Как хорошо известно в данной области техники, терапевтически эффективные количества для применения у людей также могут быть определены на животных моделях. Например, доза для людей может быть приготовлена в концентрации, которая, как было установлено, является эффективной для животных. Дозировка у людей может быть скорректирована путем мониторинга эффективности соединений и корректировки дозировки в сторону повышения или понижения, как описано выше. Корректировка дозы для достижения максимальной эффективности у людей на основе способов, описанных выше, и других способов находится в пределах компетентности специалиста в данной области техники.
Предполагается, что варианты осуществления изобретения могут включать композиции, приготовленные для медицинского применения. В этой связи композиция согласно изобретению может быть суспендирована в биосовместимом растворе с образованием композиции, которая может быть нацелена на определенное место в клетке, в ткани или в организме пациента или животного (то есть, композиция может применяться in vitro, ex vivo или in vivo). В соответствующих случаях биосовместимый раствор может представлять собой натрий-фосфатный буфер или любой другой фармацевтически приемлемый раствор-основа. Композиция согласно изобретению может быть объединена с одной или более дополнительными фармацевтически приемлемыми основами (такими как разбавители, адъюванты, наполнители или носители) в составе фармацевтической композиции. Подходящие фармацевтические основы описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» Е. W. Martin. Фармацевтические препараты и композиции согласно изобретению приготовлены в соответствии с регулирующими стандартами и могут быть введены перорально, внутривенно, местно, интратуморально или подкожно, или другими стандартными способами. Введение может быть системным или местным, или интраназальным, или интратекальным.
Также предполагаются варианты осуществления, в которых композицию согласно некоторым из вариантов осуществления изобретения вводят по отдельности или в комбинации с альтернативными противоопухолевыми терапевтическими компонентами или противораковыми терапевтическими компонентами иного рода. Эти компоненты могут включать онколитические вирусы, низкомолекулярные лекарственные средства, химиотерапевтические, радиотерапевтические или биологические препараты. Компоненты могут быть введены одновременно с композицией согласно изобретению и могут содержаться в частицах для доставки, или могут быть введены по отдельности, до или после введения композиции согласно изобретению, любым подходящим способом.
Также предполагается, что композиция согласно некоторым из вариантов осуществления изобретения может применяться в способах in vitro и/или ex vivo, например, в лабораторных условиях. Примером способа in vivo является способ, в котором композицию, включающую систему доставки, содержащую последовательность мРНК, как описано в настоящем документе, вводят в клетки-мишени in vitro, а последовательности сайтов связывания мкРНК, содержащиеся в последовательности мРНК, обеспечивают дифференциальную экспрессию кодирующей последовательности мРНК в разных типах клеток в клетках-мишенях in vitro. Аналогичным образом рассматривается способ, в котором композицию, содержащую систему доставки и последовательность мРНК, как описано в настоящем документе, вводят в образец-мишень, взятый у животного, ex vivo, и последовательности сайтов связывания мкРНК, содержащиеся в последовательности мРНК, обеспечивают дифференциальную экспрессию кодирующей последовательности мРНК в разных типах клеток в образце-мишени.
Устройство согласно изобретению иллюстрируется, но никоим образом не ограничивается, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Общие протоколы Линии клеток
Клетки гепатокарциномы печени человека (НСС) HepG2 (АТСС® НВ-8065™) и Нер3В (АТСС® НВ-8064™) были приобретены у АТСС. Клетки культивировали в минимальной питательной среде Игла (ЕМЕМ) (Cellgro, США), 10% FBS (HyClone, США), стрептомицине (100 мкг/мл) и пенициллине (100 Ед/мл-1) (Cellgro) в виде монослоев при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки HepG2 выращивали на планшетах, покрытых коллагеном (Gibco, США), при концентрации коллагена 5 мкг/см2.
НМСРР5 (объединенные высеваемые человеческие гепатоциты; смесь высеваемых первичных гепатоцитов, полученная путем объединения клеток от 5 отдельных доноров) были приобретены у ThermoFisher Scientific, США. Клетки высевали в среду Williams Е (WEM) с добавками 5% FBS, 1 мкМ дексаметазона и коктейля А (пенициллин/стрептомицин, человеческий рекомбинантный инсулин, GlutaMax и HEPES, рН 7,4). Через 24 часа после высевания среду WEM/коктейль А заменяли на среду для поддержания/инкубации WEM с добавками 0,1 мкМ дексаметазона и коктейля В (пенициллин/стрептомицин, ITS (человеческий рекомбинантный инсулин, человеческий трансферрин, селеновая кислота, BSA, линолевая кислота), GlutaMax и HEPES, рН 7,4) в виде монослоев при 37°С в атмосфере 5% СО2. В ходе всех экспериментов клетки культивировали в среде WEM/коктейль В, за исключением периодов трансфекции нанопрепаратом мРНК. Среду WEM/коктейль В меняли на свежую каждые 3 дня. Рост клеток НМСРР5 на планшетах, покрытых коллагеном (Gibco), при концентрации белка 5 мкг/см2.
Aml12 (здоровые мышиные гепатоциты) были приобретены у АТСС, США. Клетки высевали в 12-луночный планшет с плотностью 1×105/лунку.
Векторные конструкции
Конструирование матрицы pMRNA-CTx-мРНК
Матрицы для формирования матрицы плазмиды pMRNA-CTx-мРНК для синтеза in vitro всех мРНК, использованных в экспериментах, конструировали в соответствии с коммерчески доступным набором для синтеза мРНК mRNAExpress™ (SBI, США). Все плазмиды размножали в E.coli (Invitrogen, США) и очищали с использованием набора Qiagen Mini или Maxi (Qiagen, США). Рестрикционные карты всех плазмид создавали с использованием программного обеспечения pDRAW32 (www.acaclone.com).
Способ клонирования 1 - эндонуклеаза рестрикции
Как показано на фиг.2, последовательность одного или более генов, фланкированную последовательностью Козака для оптимальной трансляции непосредственно перед кодоном ATG на 5'-конце или стоп-кодоном (ТАА, TAG, TGA) на 3'-конце гена, была синтезирована компанией GeneArt (без оптимизации кодонов) и доставлена в виде плазмидной ДНК (называемой ДНК-плазмидами или векторами), показанной на фиг. 2 как рМА-Т-СТх-Ген. Предложенные 5'- и 3'-концевые области UTR, фланкирующие кодирующую последовательность, были включены во все синтезированные последовательности (не показаны в прилагаемых последовательностях). 5'-концевая UTR является синтетической и содержит последовательность Козака, а 3'-концевая UTR основана на UTR альфа-глобина мыши и также содержит поли-А-хвост из 120 оснований. Для получения вектора для синтеза, показанного на фиг. 2 как pMRNA-CTx-мРНК, нуклеотидный фрагмент, содержащий ген или гены, вырезали из ДНК-плазмиды с использованием эндонуклеаз рестрикции, в данном случае EcoRI и NheI, и субклонировали в сайты рестрикции EcoRI/NheI в матричной плазмиде pMRNA, содержащей промотор Т7, распознаваемый РНК-полимеразой Т7, 5'-и 3'-концевые UTR и последовательность полиА.
Способ клонирования 2 - cold fusion (холодное слияние)
Последовательность одного или более генов, фланкированных, как в способе клонирования 1, последовательностью Козака и стоп-кодоном (ТАА, TAG, TGA), была синтезирована компанией GeneArt (без оптимизации кодонов) и доставлена в виде плазмидной ДНК рМАТ-СТх-Ген, основа которой была такой же, как описано выше. Для конструирования матричного вектора pMRNA-CTx-мРНК использовали набор для клонирования Cold Fusion (SBI, США). Вкратце, последовательность гена из ДНК-плазмиды амплифицировали с помощью ПЦР со специфическими праймерами, причем праймеры добавляли удлинение из 14 гомологичных оснований к каждому концу последовательности гена. Эти 14 оснований были сконструированы так, чтобы они были гомологичны концам линеаризованного вектора, полученного путем расщепления матричной плазмиды с помощью разреза эндонуклеазой рестрикции в сайте множественного клонирования, расположенном между 5'- и 3'-концевыми UTR. Для получения вектора для синтеза предсказанный продукт ПЦР очищали с помощью набора для очистки продуктов ПЦР (Qiagen, США) и включали в матричную плазмиду pMRNA после реакции Cold Fusion (гомологичная рекомбинация) в соответствии с протоколом производителя.
Конструирование матрицы, содержащей последовательности сайтов связывания мкРНК Для получения последовательностей мРНК, содержащих последовательности сайтов связывания мкРНК, примеры которых с использованием miR-122 показаны на фиг. 3, иллюстративные способы создания трех вариантов обсуждаются ниже. В варианте 1 две копии последовательности сайта связывания мкРНК включены между стоп-кодоном и положением +1 3'-концевой UTR. В варианте 2 две копии последовательности сайта связывания мкРНК включены в начале или на 5'-конце 3'-концевой UTR, а в варианте 3 две копии последовательности сайта связывания мкРНК включены на конце или 3'-конце 3'-концевой UTR.
На фиг. 4 показаны примеры векторов для синтеза, содержащих эти три варианта, с использованием в качестве примера белка В, гена из приблизительно 1400 п.н.
Вариант 1
Как показано на фиг.5, последовательность одного или более генов, фланкированная, как в описанных выше способах, последовательностью Козака и стоп-кодоном (ТАА, TAG, TGA), и дополнительно содержащая две копии последовательности сайта связывания мкРНК после стоп-кодона, была синтезирована компанией GeneArt (без оптимизации кодонов) и доставлена в виде плазмидной ДНК (в данном примере вновь проиллюстрированной с помощью белка А) рМАТ-СТх-Ген, основа которой была такой же, как описано выше. Затем эту последовательность клонировали в матричную плазмиду для создания вектора для синтеза любым из способов, описанных выше.
Варианты 2 и 3
Последовательность одного или более генов, фланкированная, как в описанных выше способах, последовательностью Козака и стоп-кодоном (ТАА, TAG, TGA), и дополнительно содержащую 3'-концевую UTR, включая две копии последовательности сайта связывания мкРНК либо в начале/на 5'-конце этой области (вариант 2, как показано на фиг. 6), либо на конце/3'-конце этой области (вариант 3, как показано на фиг. 7), была синтезирована компанией GeneArt (без оптимизации кодонов) и доставлена в виде плазмидной ДНК рМАТ-СТх-Ген, основа которой была такой же, как описано выше. Эту последовательность затем клонировали в матричную плазмиду для создания вектора для синтеза любым из способов, описанных выше, с тем отличием, что были выбраны ферменты рестрикции (здесь EcoRI и NotI) для удаления 3'-концевой UTR из матричного вектора, так чтобы 3'-концевая UTR из предоставленной последовательности ДНК присутствовала в конечном векторе для синтеза, так как она содержит последовательности сайтов связывания мкРНК.
In vitro транскрипция (IVT) мРНК с синтезом мРНК in vitro
Для проведения IVT мРНК с 3'-концевыми UTR, модифицированными мкРНК, или без них, использовали коммерчески доступный набор для синтеза мРНК mRNAExpress™. Матрицы ДНК для векторов IVT конструировали, как описано в протоколах, изложенных выше. Процедуру синтеза мРНК in vitro проводили в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, к последовательности ДНК добавляли поли-А-хвост, используя реакцию ПЦР со специфическими 5'-и 3'-праймерами (поставляются в составе набора). В ходе транскрипции in vitro синтезированная мРНК на матрице ДНК была кэпирована нуклеотидами, модифицированными аналогом кэп-структуры с правильной ориентацией (anti-reverse cap analog, ARCA) (5-метилцитидин-5'-трифосфатом). Аналог кэп-структуры, псевдоуридин-5'-трифосфат, и поли-А-хвост были включены в транскрибируемые in vitro мРНК для повышения стабильности и снижения иммунного ответа клеток-хозяев.
Синтез DMPCTx и приготовление препарата мРНК
Препарат платформы для доставки и модуляции от Combined Therapeutics (DMPCTx) представляет собой многокомпонентную наночастицу из смеси ионизируемого липидоподобного материала С12-200, фосфолипида DOPE, холестерина и закрепленного на липиде полиэтиленгликоля C14-ПЭГ-DSPE2000. Этот конкретный состав DMPCTx и конкретное массовое соотношение (10:1) С12-200:мРНК, а также молярный [%] состав липидоподобного материала, фосфолипида, холестерина и ПЭГ (таблица 4) были оптимизированы и показали высокую эффективность препарата in vivo (Kauffman K.J., Nano Letter. 2015, 15, 7300-7306). Химическая структура этих иллюстративных компонентов показана на фиг.8.
Для синтеза DMPCTx готовили этанольный раствор (смесь А) из С12-200 (WuXi, Китай), как показано на фиг.9А, фосфолипида DOPE (1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина) (Avanti Polar Lipids, Алабастер, Алабама, США), холестерина (Sigma, США) и C14-ПЭГ-DSPE2000 (Avanti Polar Lipids, Алабастер, Алабама, США) и водный забуференный раствор мРНК (смесь В) (в 10 мМ цитрате, рН 4,5). Этанольную смесь А и водную смесь В в соотношении 3:1 смешивали/объединяли с использованием шприцевых насосов и устройства с микрожидкостным чипом (Chen D, at al J. Am. Chem. Soc. 2012,134 (16), 6948-6951). Спиртовой раствор нанопрепарата мРНК с микрожидкостного чипа собирали в пробирки объемом 1,5 мл.
Для удаления спирта после приготовления смесь DMPCTx-мРНК переносили на кассету для диализа G2 Slide-A-Lyzer® и подвергали диализу в PBS при комнатной температуре на магнитной мешалке в течение 4 часов. Затем препарат мРНК с использованием шприца с иглами 18 калибра длиной 1 дюйм со скошенным острием переносили в новые пробирки объемом 1,5 мл, после чего он был готов для определения характеристик.
Для расчета эффективности инкапсуляции мРНК использовали анализ на РНК RiboGreen (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Полидисперсность (PDI) и размер липидных наночастиц измеряли с использованием динамического рассеяния света (ZetaPALS, Brookhaven, Instruments). Поверхностный заряд DMPCTx (дзета-потенциал) измеряли с использованием того же прибора. Растворы последовательностей мРНК с двумя копиями последовательности miR-122, связанных линкером (SEQ ID NO: 30) и вставленных после стоп-кодона кодирующей последовательности мРНК, и без них, готовили из исходного материала концентрацией 1,05 и 1 мг/мл, соответственно. Примеры параметров после инкапсуляции последовательностей мРНК, содержащих последовательность mCherry (mCh), последовательность белка А, человеческого белка размером приблизительно 25 кДа, показаны в таблице 5, включая размер, эффективность инкапсуляции и полидисперсность платформы для доставки и модуляции от Combined Therapeutics (DMPCTx). Иллюстративная схема частицы для доставки в соответствии с DMPCTx приведена на фиг. 9В.
Дифференциальная экспрессия доставленных конструкций мРНК in vitro
Для исследования потенциала настоящего изобретения в отношении успешной трансфекции клеток-мишеней конструкцией мРНК и последующего управления дифференциальной экспрессией в разных типах клеток использовали платформу мРНК DMPCTx, модифицированную сайтами связывания мкРНК-122, на модели гепатокарциномы печени.
Трансфекция линий клеток
Флуоресцентная визуализация и количественная оценка
Однократные трансфекции линий клеток гепатокарциномы печени человека HepG2 и Нер3В проводили следующим образом: за один день до трансфекции клетки HepG2 и Нер3В по отдельности высевали в 12-луночный планшет с плотностью 2,7×105/лунку и 2×105/лунку (ЕМЕМ/10% FCS), соответственно. На следующий день клетки трансфицировали либо контрольным носителем, содержащим только PBS, либо 0,5 мкг/лунку мРНК-mCherry-DMPCTx, либо 0,5 мкг/лунку мРНК-mCherry-122-DMPCTx (последовательность, содержащая SEQ ID NO: 31). Трансфекцию осуществляли непосредственным добавлением мРНК-DMPCTx к культуральной среде в лунке, при необходимости осторожно перемешивая культивируемые клетки.
Однократные трансфекции НМСРР5 (объединенные высеваемые человеческие гепатоциты) проводили следующим образом: за один день до трансфекции клетки НМСРР5 высевали в 12-луночный планшет с плотностью 2,5×105/лунку (WEM/коктейль В). На следующий день клетки трансфицировали либо контрольным носителем DMPCTx (PBS), либо 0,5 мкг/лунку мРНК-mCherry-DMPCTx, либо 0,5 мкг/лунку мРНК-mCherry-122-DMPCTx. Трансфекцию осуществляли непосредственным добавлением мРНК-DMPCTx к культуральной среде в лунке, при необходимости осторожно перемешивая культивируемые клетки. Во время трансфекции НМСРР5 в среду WEM/коктейль В добавляли 5% FBS. Трансфекцию осуществляли способом, описанным выше для клеток рака печени. Через 24 часа после трансфекции среду снова меняли на WEM/коктейль В.
Для оценки конститутивной активности и экспрессии мкРНК-122 в здоровых человеческих гепатоцитах проводили многократную трансфекцию клеток НМСРР5 следующим образом: клетки НМСРР5 высевали и культивировали, как указано выше, и трансфицировали мРНК-mCherry-DMPCTx или мРНК-mCherry-122-DMPCTx, в общей сложности три раза (МРТ) с интервалом 48 часов между каждой трансфекцией. Трансфекцию осуществляли так же, как описано для однократных трансфекций НМСРР5, как описано выше.
Однократные трансфекции здоровых мышиных гепатоцитов (Aml12, АТСС, США) проводили следующим образом: за один день до трансфекции клетки Aml12 высевали в 12-луночный планшет с плотностью 1×105/лунку. На следующий день клетки трансфицировали либо контрольным носителем DMPCTx (PBS), либо 0,5 мкг/лунку мРНК-mCherry-DMPCTx, либо 0,5 мкг/лунку мРНК-mCherry-122-DMPCTx. Трансфекцию осуществляли непосредственным добавлением мРНК-DMPCTx к культуральной среде в лунке, при необходимости осторожно перемешивая культивируемые клетки.
После трансфекции осуществляли обнаружение экспрессии mCherry в вышеуказанных линиях клеток с использованием системы флуоресцентной визуализации (приложение от EVOS® FL Imaging Systems). Фотографии, показывающие флуоресценцию mCherry, были сделаны через 16, 24, 48, 72, 96 и 144 часа после трансфекции.
Количественную оценку флуоресцентного сигнала mCherry проводили с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, США) из 3 случайно выбранных полей на культуральных планшетах (мРНК-mCherry, мРНК-mCherry-122). На фиг. 10В, 11 и 12В показаны результаты такой количественной оценки. Количество пикселей в лунках, трансфицированных mCherry, было установлено равным 100% (флуоресценция mCherry). Статистическую значимость определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты показаны как средние значения ±СКО. Разницу считали значимой при значении р<0,05. Звездочки обозначают статистически значимую разницу между флуоресценцией mCherry в клетках, трансфицированных мРНК-mCherry, по сравнению с клетками, трансфицированными мРНК-mCherry-122 (****, р<0,0001, ***р<0,001, **р<0,01, *р<0,05).
Пример 1. Экспрессия опухолеспецифического гена с помощью регуляции мкРНК-122 мкРНК-122 является широко распространенной, специфичной для печени мкРНК, экспрессия которой значительно снижена в линиях клеток первичной гепатокарциномы человека (НСС) и производных от НСС, таких как Нер3В и HepG2. Цель этого исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать, что модификация 3'-концевой нетранслируемой области (UTR) последовательности мРНК путем вставки последовательностей-мишеней для мкРНК-122 (например, SEQ ID NO: 30, как показано в варианте 1, вверху на фиг. 3) может привести к подавлению трансляции и/или деаденилированию с последующим декэпированием экзогенной мРНК в нормальных гепатоцитах, но не в тестируемых линиях клеток НСС.
Для исследования эндогенной активности мкРНК-122 в здоровых гепатоцитах клетки НМСРР5 (объединенные высеваемые человеческие гепатоциты, представляющие собой смесь высеваемых первичных гепатоцитов, полученных путем объединения клеток от 5 отдельных доноров), трансфицировали мРНК-mCherry или мРНК-mCherry-122, полученными в соответствии с вышеупомянутыми общими протоколами, используя mCherry (красный флуоресцентный белок) в качестве введенного представляющего интерес гена, и наблюдали за экспрессией mCherry (красный флуоресцентный белок) стечением времени. Как показано на фиг. 10А, экспрессию mCherry (mCh) анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии через 48 часов после трансфекции. В течение всего времени после трансфекции экспрессия mCherry наблюдалась в клетках НМСРР5, трансфицированных мРНК-mCherry (то есть без модификации 3'-концевой UTR путем введения последовательности miR-122), что свидетельствует об успешной трансфекции и трансляции. Напротив, в здоровых гепатоцитах, которые, как известно, являются мкРНК-122-положительными, экспрессия MPHK-mCherry-122 была подавлена до практически необнаружимых уровней, сопоставимых с уровнями, наблюдаемыми в контрольных нетрансфицированных клетках, даже спустя 3 дня после трансфекции. Это свидетельствовало о том, что присутствие в мРНК-mCherry-122 последовательности-мишени для мкРНК-122, вставленной в 3'-концевую UTR (вариант 1), предотвращает трансляцию мРНК, скорее всего из-за подавления трансляции в клетках-реципиентах.
Количественная оценка флуоресцентного сигнала, наблюдаемого для этих клеток, подтвердила вышесказанное. Как показано на фиг. 10В, интенсивность флуоресценции была резко снижена в здоровых клетках, трансфицированных мРНК-mCherry-122, по сравнению с клетками, трансфицированными мРНК-mCherry.
Результат, полученный в приведенном выше эксперименте, показал, что нативная экспрессия мкРНК-122 и совместная локализация с последовательностью-мишенью для мкРНК-122 (вариант 1) могут эффективно регулировать экспрессию белка в здоровых гепатоцитах, тем самым значительно увеличивая опухолеспецифическую экспрессию генов. В следующем эксперименте была оценена конститутивная экспрессия и активность мкРНК-122 в клетках НМСРР5. Клетки НМСРР5 трансфицировали мРНК-mCherry или мРНК-mCherry-122 в общей сложности три раза с интервалом в 48 часов после каждого. Через шесть дней после первой трансфекции (то есть, через 48 часов после последней трансфекции) определяли экспрессию mCherry с помощью флуоресцентной микроскопии. Как и раньше, в то время как клетки, трансфицированные конструкцией мРНК-mCherry, демонстрировали отчетливую красную флуоресценцию, клетки, трансфицированные конструкцией мРНК-mCherry-122, ее не демонстрировали. На фиг. 11 показаны сравнения клеток, трансфицированных мРНК-mCherry-122, и клеток, трансфицированных мРНК-mCherry, в течение пятидневного периода после последней трансфекции как для однократно (ST), так и для многократно трансфицированных клеток (МРТ). Можно видеть, что многократно трансфицированные клетки демонстрируют такое же резкое снижение интенсивности флуоресценции при трансфекции мРНК-mCherry-122, что и однократно трансфицированные клетки, причем эффект сохраняется дольше после многократных трансфекций. Как и следовало ожидать, это свидетельствует о том, что эффект дифференциальной экспрессии, управляемой механизмом контроля мкРНК, устойчив к повторным событиям трансфекции, и что количество мкРНК-122, доступное в клетках для управления этим механизмом, не исчерпывается в этом временном интервале.
Для изучения влияния эндогенной активности мкРНК-122 с использованием линий клеток гепатокарциномы Нер3В и гепатобластомы HepG2 печени человека проводили эксперимент, аналогичный описанному выше. Клетки трансфицировали последовательностью мРНК мРНК-mCherry, мРНК-mCherry-122 (вариант 1) или подвергали контрольной трансфекции. Как и ранее, через 48 часов определяли экспрессию mCherry в трансфицированных клетках Нер3В и HepG2 с использованием флуоресцентной микроскопии, как показано на фиг. 10А. В клетках Нер3В (фиг. 10А, средний столбец) флуоресценция mCherry была отчетливо видна в линиях, трансфицированных как мРНК-mCherry, так и мРНК-mCherry-122, что свидетельствует о том, что опосредуемое мкРНК-122 подавление трансляции не активно в этих клетках. В клетках HepG2 флуоресценция mCherry была отчетливо видна в линии, трансфицированной мРНК-mCherry, но хотя некоторая флуоресценция наблюдалась в клетках, трансфицированных мРНК-mCherry-122, она, по-видимому, была лишь частично снижена и значительно превышала таковую, наблюдаемую в нормальных гепатоцитах. Дополнительные свидетельства этого приведены на фиг. 10В, где количественное определение флуоресценции mCherry в линиях, трансфицированных мРНК-mCherry-122, свидетельствует о том, что снижение уровня флуоресценции в клетках Нер3В не наблюдается, но в клетках HepG2 наблюдается снижение приблизительно на 50%.
Частичное подавление, наблюдаемое в клетках HepG2, также свидетельствует о влиянии на трансляцию, опосредованном мкРНК-122, поскольку было показано, что клетки этой линии сохраняют остаточную активность мкРНК-122 (Demonstration of the Presence of the "Deleted" MIR122 Gene in HepG2 Cells, PLoS One. 2015; 10(3)).
мкРНК-122 строго консервативна для видов позвоночных, и, как и у человека, сниженный уровень мкРНК-122 у мышей связан с гепатоклеточной карциномой (Kutay et al, 2006). Поэтому эндогенный эффект активности мкРНК-122 исследовали с использованием линии клеток здоровых мышиных гепатоцитов Aml12.
Здоровые мышиные гепатоциты также трансфицировали описанными ранее последовательностями мРНК-Cherry, т.е. мРНК-mCherry или мРНК-mCherry-122, инкапсулированными в DMPCTx. Аналогичное влияние вставки последовательности сайта связывания мкРНК-122 на флуоресценцию mCherry наблюдалось через 24 и 72 часа после трансфекции.
Как показано на фиг. 12А, флуоресценция наблюдалась после трансфекции мРНК-mCherry. После трансфекции мРНК-mCherry-122 наблюдалось заметное снижение флуоресценции, хотя некоторый сигнал по-прежнему наблюдался.
Количественное определение флуоресценции mCherry через 24 и 72 часа после трансфекции, проведенное для 3 случайно выбранных полей на культуральных планшетах для каждой обработанной группы (фиг. 12В), показало, что при трансфекции мРНК-mCherry-122 наблюдалось подавление трансляции более чем на 70%.
В качестве предварительного вывода приведенный выше пример показывает, что свойств двойного нацеливания системы доставки на основе наночастиц и включения последовательности-мишени для мкРНК-122 в конструкцию мРНК достаточно для достижения довольно значимой дифференциальной экспрессии белкового продукта в клетках гепатокарциномы и гепатобластомы по сравнению со здоровыми гепатоцитами. Наблюдаемая дифференциальная экспрессия была очевидной как в человеческих, так и в мышиных линиях клеток.
Пример 2. Уровень экспрессии белка после опухолеспецифической экспрессии гена
В другом эксперименте использовали вестерн-блоттинг для определения уровня экспрессии белка, который в конечном итоге проявлялся после трансфекции, следующим образом.
Трансфекция линий клеток и иммуноблот - белок А
Для оценки уровня опухолеспецифической экспрессии иллюстративного человеческого белка размером 25 кДа (обозначен как «белок А») клетки рака печени (HepG2 и Нер3В) и здоровые гепатоциты (НМСРР5) высевали в 12-луночные планшеты и трансфицировали 0,5 мкг/лунку нанопрепарата мРНК, экспрессирующей человеческий белок А размером 25 кДа (мРНК-A-DMPCTx), или мРНК, экспрессирующей человеческий белок А (человеческий белок размером приблизительно 25 кДа), содержащей две последовательности связывания мкРНК122 в 3'-концевой UTR (SEQ ID NO: 30), вариант 1 (мРНК-A-мкРНК122-DMPCTx), как описано выше в примере 1 для трансфекции mCherry. Через 24 часа после трансфекции проводили иммуноблот после полной экстракции белка.
Для иммуноблота культуральную среду удаляли, клетки промывали холодным PBS (Cellgro) и клеточные осадки лизировали в буфере RIPA (радиоиммунопреципитационный анализ) (Boston Byproducts) с помощью смеси ингибиторов протеазы (Sigma). Концентрацию белка определяли колориметрическим анализом по методу Брэдфорда. В общей сложности 10 мг белка отделяли 4-12% минигелями Novex™ (ThermoFisher Scientific) и переносили на мембраны из PVDF (поливинилидендифторида) с помощью электроблоттинга (устройства для переноса с геля iBIot® 2, Invitrogen). После блокирования 5% обезжиренным сухим молоком в TBS-Tween 20 (Boston Bioproducts) мембраны инкубировали при 4°С в течение ночи с антителами против белка А (1:2000, Abeam) или р-актином (Cell Signaling), а затем инкубировали с соответствующими конъюгированными с HRP (пероксидазой хрена) козьими анти-кроличьими вторичными антителами (1:10000; Abeam) в течение 1 часа при комнатной температуре. Комплексы белок-антитело визуализировали и получали изображение с использованием субстрата Clarity™ Western ECL (Bio Rad) и системы LI-COR® (LI-COR), соответственно.
Результаты вышеуказанной процедуры приведены на фиг. 13, где показаны следующие конструкции трансфекции, инкапсулированные в DMPCTx:
Дорожки 1, 4 и 7 на фиг. 13: носитель (имитация обработки, только PBS),
Дорожки 2, 5 и 8 на фиг. 13: мРНК-А (мРНК, содержащая последовательность для белка А), и
Дорожки 3, 6 и 9 на фиг. 13: конструкции мРНК-А-122 (содержащие последовательность для белка А и мкРНК122, вставленную в положение варианта 1, как показано на фиг. 3).
Трансфекцию осуществляли в здоровых гепатоцитах (НМСРР5) на дорожках 1-3, на модели гепатокарциномы Нер3В на дорожках с 7 по 9 и в клетках модели гепатобластомы HepG2 на дорожках с 4 по 6, как описано выше, с использованием 0,5 мкг мРНК-DMPCTx на лунку. Из каждой линии клеток через 24 часа после трансфекции выделяли белок. 10 мкг белка загружали в каждую дорожку и получали данные из двух независимых экспериментов. Белок А был обнаружен во всех протестированных линиях клеток при трансфекции мРНК-А, что свидетельствует об успешной трансфекции. При трансфекции мРНК-А-122 подавление трансляции наблюдалось только в здоровых гепатоцитах, но не в клетках Нер3В и HepG2 (дорожки 3, 6 и 9), что свидетельствует о том, что мкРНК-122 не выполняет свою функцию в протестированных клетках рака печени. Однако для клеток HepG2, трансфицированных мРНК-А-122, экспрессия белка А была слегка подавлена по сравнению с клетками, трансфицированными мРНК-А, аналогично картине, ранее наблюдаемой для экспрессии mCherry в примере 1. Это хорошо видно на фотографиях с повышенной экспозицией (внизу), которые показывают неполное подавление в клетках HepG2. Частичное подавление, наблюдаемое в клетках HepG2, также свидетельствует о влиянии на трансляцию, опосредованном мкРНК-122, поскольку было показано, что клетки этой линии сохраняют остаточную активность мкРНК-122 (Demonstration of the Presence of the "Deleted" MIR122 Gene in HepG2 Cells, PLoS One. 2015; 10(3)).
Таким образом, модификация мРНК 3'-концевой UTR путем вставки последовательности-мишени специфичной для печени мкРНК-122 может существенно ограничивать трансляцию мРНК в гепатокарциноме Нер3В и гепатобластоме HepG2, но не в нормальных человеческих гепатоцитах.
Пример 3. Онколитическая вирусная комбинированная терапия in vitro
В настоящем примере описано, что дифференциальная экспрессия предложенных конструкций мРНК, обеспечиваемая способом согласно изобретению и показанная в приведенных выше примерах, может применяться в комбинации с онколитической вирусной терапией. В частности, если онколитические вирусы были модифицированы для удаления генов вирулентности, что привело к ослаблению их способности к репликации в здоровых клетках, изобретение может быть использовано для восстановления функции этих генов или их эквивалентов в пораженных заболеванием клетках, таких как раковые клетки. Чтобы исследовать эту возможность, в модели гепатокарциномы печени (SEQ ID NO: 32) использовали комбинацию онколитического вируса HSV-1 (R7041), дефицитного по US3 (см. Leopardi et al, 1997, PNAS 94; 7891-7896), и платформы DMPCTx, обеспечивающей конструкцию мРНК, кодирующую US3, и модифицированную сайтами связывания мкРНК-122.
Общие протоколы: Культура клеток
Клетки гепатокарциномы печени человека (НСС) HepG2 и Нер3В культивировали в минимальной питательной среде Игла (ЕМЕМ, Cellgro, США), 10% FBS, стрептомицине (100 мкг/мл) и пенициллине (100 Ед/мл-1) в виде монослоев при 37°С и в атмосфере 5% CO2. Клетки HepG2 выращивали на покрытых коллагеном планшетах при концентрации коллагена 5 мкг/см2.
Подготовка вируса
Замороженный вирус R7041 размораживали на водяной бане при 37°С и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с, используя ультразвуковую ванну (ультразвуковой аппарат Q500, Qsonica, США), после чего переносили на лед готовым к использованию.
Токсичность R7041 по отдельности в отношении человеческих НСС
Считается, что мутантный по US3 вирус R7041 практически апатоген для здоровых клеток (Leopardi et al. 1997) и даже показал хорошую безопасность у иммунодефицитных, бестимусных мышей (Liu et al. 2007, Clin Cancer Res 2007;13(19)). Чтобы установить базовый уровень эффективности вируса R7041 против клеток гепатокарциномы печени, модельные линии клеток обрабатывали онколитическим вирусом по отдельности. Клетки из линий Нер3В и HepG2 в трех экземплярах высевали в 96-луночные планшеты в количестве 15000 и 17000 на лунку, соответственно.
Через 24 часа клетки инфицировали 3-кратными серийными разведениями вируса, от MOI (множественность заражения) 0,37 до 0,0001694. Через 96 часов после инфицирования измеряли жизнеспособность тестируемых линий клеток с помощью МТТ-теста в соответствии с инструкциями поставщика (анализ пролиферации клеток CellTiter 96® AQueous One Solution, Promega, США). Поглощение измеряли при 490 нм с помощью считывателя для 96-луночного планшета (BioTek, Cytation 3, США). Кривые доза-ответ и значения 50% эффективной дозы (ED50) получали с использованием GraphPad Prism, 7.03.
Как показано на фиг. 14, линии клеток как Нер3В, так и HepG2 проявляли схожую восприимчивость к R7041 с ED50=0,01 и 0,02 MOI, соответственно. Однако было обнаружено, что линии клеток Нер3В были несколько более восприимчивы к R7041, чем клетки HepG2.
Сочетательный эффект R7041 и мРНК-DMPCTx на жизнеспособность НСС человека
До оценки сочетательного эффекта вируса R7041 и мРНК-US3-DMPCTx на клетки гепатокарциномы человека авторы убедились, что трансфекция клеток Нер3В и HepG2 мРНК-US3-DMPCTx в концентрации 0,04 мкг/мл мРНК-US3 не оказывает существенного влияния на жизнеспособность клеток по результатам МТТ-теста.
Клетки линий Нер3В и HepG2 в трех экземплярах высевали в 96-луночные планшеты в количестве 15000 и 17000 на лунку, соответственно. Через 24 часа клетки инфицировали 3-кратными серийными разведениями вируса, начиная с MOI 0,37 до 0,0001694. Обе протестированные линии клеток дважды трансфицировали фиксированной дозой 0,04 мкг/мл мРНК-US3-DMPCTx, через 24 и 48 часов после инфицирования R7041, согласно временному графику, показанному на фиг. 15. Через три дня после трансфекции жизнеспособность протестированных линий клеток измеряли с помощью МТТ-теста, как описано выше. Для обоих протестированных НСС человека комбинация двух разных соединений: онколитического R7041 и нетоксичной дозы мРНК-US3-DMPCTx (0,04 мкг/мл) значительно усиливала разрушение опухоли при более низких вирусных титрах, как показано на фиг. 16. На этой фигуре влияние на жизнеспособность показано для мРНК-US3-DMPCTx по отдельности при 0,04 мкг/мл (пересечение с осью у), для R7041 по отдельности в различных разведениях (серые треугольники/ромбы) и для комбинации (черные кружки).
Приведенные выше примеры свидетельствуют о том, что комбинация ослабленного онколитического вируса с подвергнутыми делеции генами вирулентности и обеспечение дифференциально экспрессируемых замен для повергнутых делеции генов может значительно повысить эффективность онколитической вирусной терапии in vitro. В частности, более высокие эффекты наблюдались при более низких вирусных титрах в комбинации с композицией согласно изобретению.
Пример 4. Экспрессия доставленного флуоресцентного белка mCherry конструкциями мРНК in vivo
Чтобы определить применимость изобретения для подходов in vivo, использовали мышиную модель ортотопической гепатоклеточной карциномы человека. Выше (см. пример 1) было показано, что дифференциальная экспрессия, управляемая сайтами связывания мкРНК-122, применима в здоровых клетках печени мыши Aml12 in vitro.
Ортотопическая модель гепатоклеточной карциномы (НСС) человека Животные
Самки мышей (CB17/lcs-PrkdcSCID/lcrlcoCrl) Fox Chase SCID в возрасте 6-8 недель были приобретены у Charles River, Великобритания. Все процедуры in vivo были одобрены Подкомитетом по уходу за экспериментальными животными в CrownBio в Великобритании.
Клетки
Для создания ортотопической модели НСС использовали биолюминесцентный вариант линии человеческих клеток Нер3В, экспрессирующей люциферазу светлячка (Нер3В-cLuX). Клетки культивировали в среде ЕМЕМ (Sigma, Великобритания) с добавками 10% инактивированной нагреванием FBS, 2 мМ L-глутамина, 1% NEAA; клетки еженедельно обрабатывали 2 мкг/мл пуромицина (Sigma).
Внутрипеченочная инъекция и контроль роста опухолей
Под наркозом человеческие клетки НерВ-cLuX (2×106), суспендированные в 20 мкл 1:1 PBS:Matrigel™, инъецировали в верхнюю часть левой доли печени с помощью иглы 29G. Место инъекции накрывали с помощью рассасывающейся желатиновой губки (AGS), печень помещали обратно в брюшную полость, не нарушая целостность AGS, и зашивали кожу. Рост опухоли проверяли два раза в неделю с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI).
Вкратце, мышей анестезировали и подкожно инъецировали им 150 мг/кг D-люциферина за 15 минут до визуализации. Изображение BLI получали и обрабатывали с использованием программного обеспечения Living Image 4.3.1 (Caliper LS, US). Мышей взвешивали три раза в неделю или один раз в неделю до введения дозы. В указанные дни мышей умерщвляли и печени фиксировали 2 или 4% раствором параформальдегида (PFA) перед замораживанием в ОСТ (соединение для замораживания - среда для заливки) для дальнейшего гистопатологического анализа.
Приготовление препарата мРНК и оценка эффективности нацеливания на опухоль
Последовательности мРНК, содержащие последовательность mCherry, и последовательность mCherry, содержащую мкРНК-122 (SEQ ID NO: 31), вводили в состав препарата, как описано выше в разделе «Синтез DMPCTx и приготовление препарата мРНК» и в таблице 4. Для оценки селективного нацеливания на опухоль и отсутствия воздействия на не пораженные заболеванием клетки полученный препарат мРНК инъецировали в хвостовую вену мышей с ортотопическим раком печени. Вкратце, 2×106 человеческих клеток Нер3В-cLuX, суспендированных в 20 мкл 1:1 PBS:Matrigel™, инъецировали в верхнюю часть левой доли печени, как описано выше. Затем рост опухоли контролировали с помощью визуализации BLI, также как описано выше. Восемь дней спустя, когда опухоль сформировалась (BLI ≥6×106), через хвостовую вену инъецировали 20 мкг препарата мРНК-mCherry-DMPCTx, мРНК-mCherry-122-DMPCTx или мРНК-A-122-DMPCTx на мышь, что привело к попаданию частиц для доставки в печень возвращающимся током крови. Через двадцать четыре часа после проведения последней BLI мышей умерщвляли и печени вырезали и визуализировали с помощью BLI ex vivo в местах локализованных поражений печени.
Гистология
Вкратце, после визуализации ex vivo левые доли печени с опухолью удаляли, фиксировали 2% PFA, погружали в 30% раствор сахарозы (в PBS; рН 7,4) при 4°С, заливали ОСТ и замораживали в предварительно охлажденном изопентане с помощью бани с сухим льдом, а затем хранили при -80°С. Замороженные срезы толщиной 5 мкм (Leica СМ300, США) подвергали контрастному окрашиванию ядер с помощью DAPI (VECTASHIELD, Vector Laboratories, США) или Н&Е (гематоксилин и эозин). Нацеливание на опухоль оценивали путем определения уровня экспрессии mCherry по сравнению mCherry-122 в опухоли и здоровой печени с использованием флуоресцентной микроскопии и/или программного обеспечения. Опухолевую и здоровую ткань определяли окрашиванием с помощью Н&Е.
Пример роста опухоли, контролируемого с помощью BLI визуализации, у мышей, получивших имитацию обработки, и мышей, обработанных мРНК-mCherry-DMPCTx и мРНК-mCherry-122-DMPCTx. Животным подкожно инъецировали D-люциферин и проводили визуализацию через 15 минут.Сигнал присутствовал в средней части туловища животных только как показано на фиг. 17 (А) (верхняя секция), показаны животные до обработки композициями. Все животные с одинаковой интенсивностью в средней части туловища были вскрыты, и печени были визуализированы ex vivo, фиг. 17 (А) (нижняя секция). Левая доля печени с опухолью была разрезана на срезы и подвергнута контрастному окрашиванию с помощью DAPI. Для определения экспрессии mCherry в здоровых клетках печени и в опухолевых клетках печени через 24 часа после введения препарата мРНК использовали флуоресцентную микроскопию, как показано на фиг. 17 (В). Флуоресценция mCherry была обнаружена в здоровых гепатоцитах, когда мышей обрабатывали мРНК-mCherry-DMPCTx (фиг. 17В, средняя секция). При обработке мРНК-mCherry-122-DMPCTx (вариант 1) наблюдалось подавление трансляции (фиг. 17В, левая секция). На фиг. 17В показаны здоровые клетки печени, взятые у (слева направо) мышей, получивших имитацию обработки, обработанных mRNA-mCherry-DMPCTx и мРНК-mCherry-122-DMPCTx.
Таким образом, композиции согласно изобретению могут быть введены in vivo и могут успешно трансфицировать клетки печени-мишени. При модификации сайтами связывания мкРНК дифференциальная экспрессия может быть достигнута в не пораженных заболеванием и опухолевых клетках.
Пример 5. Дифференциальная экспрессия доставленной конструкции мРНК US3 in vivo в не пораженной заболеванием и пораженной заболеванием ткани в печени
Модель на мышах in vivo, описанную в примере 4, применяли для введения композиции частиц для доставки, содержащей конструкцию мРНК US3 DMPCTx мкРНК-122. Дифференциальную экспрессию US3 в печени мышей, содержащих рак Нер3В человека, анализировали с использованием иммуногистохимии с поликлональным антителом к US3. Результаты показаны на фиг. 18, где можно видеть, что существует заметная разница в уровнях белка US3 между опухолью (более темное окрашивание) и не пораженными заболеванием клетками (более светлое окрашивание). Дифференциальная экспрессия повторяет границу опухоли, что было независимо подтверждено специалистом по лабораторной диагностике. Следовательно, можно сделать вывод, что композиции согласно изобретению могут успешно управлять дифференциальной экспрессией потенциального терапевтического усиливающего фактора in vivo у субъекта-млекопитающего.
Иммуногистохимия
Свежезамороженные срезы разрезали на толщину 5 мкм (микрон) и сушили на воздухе в течение приблизительно одного часа перед фиксацией 4% параформальдегидом при комнатной температуре (комн. темп.) в течение 15 минут. Срезы промывали проточной водопроводной водой и переносили в PBS-0,1% Tween. Срезы инкубировали с 2,5% нормальной лошадиной сывороткой (готовой к использованию, набор для определения ImmPRESS HRP anti-rabbit IgG peroxidase polymer, Vector MP-7401) в течение 20 минут. Предметные стекла осушали и инкубировали с первичным антителом к US3, разведенным в соотношении 1:400 (Acris AP55266SU-N). Антитела разбавляли PBS-0,1% Tween и включали отрицательные контроли, в которых отсутствовало первичное антитело, и инкубировали предметные стекла с разбавителем антител PBS-0,1% Tween в течение одного часа при комнатной температуре. Предметные стекла промывали PBS-0,1% Tween и блокировали эндогенную пероксидазу 0,3% перекисью водорода, разбавленной водой от elga, в течение 10 минут. Предметные стекла промывали PBS-0,1% Tween и инкубировали с реагентом против кроличьего IgG ImmPress (готовый к использованию, набор для определения ImmPRESS HRP anti-rabbit IgG peroxidase polymer, Vector MP-7401) в течение 30 минут при комнатной температуре. Предметные стекла промывали PBS-0,1% Tween и инкубировали в течение 5 минут с хромогеном ImmPACT DAB (субстрат пероксидазы (HRP) ImmPACT DAB, Vector SK-4105), затем промывали водой от elga и при необходимости проводили контрастное окрашивание гематоксилином Майера. Проводили еще одну кратковременную промывку в воде от elga и окрашивали в синий цвет в проточной водопроводной воде в течение 5 минут. Предметные стекла высушивали, очищали и устанавливали (95% IMS, 99% IMS ×2 и ксилол ×2), затем покрывали покровным стеклом.
Хотя конкретные варианты осуществления изобретения были подробно раскрыты в настоящем документе, это было сделано в качестве примера и только в целях иллюстрации. Подразумевается, что вышеупомянутые варианты осуществления не носят ограничительного характера в отношении объема прилагаемой формулы изобретения. Авторы подразумевают, что в изобретение могут быть внесены различные замены, изменения и модификации без отклонения его от сущности и объема, как определено формулой изобретения. Любые последовательности нуклеиновых кислот и/или полипептидов нечеловеческого происхождения, которые были включены в конструкции и векторы согласно вариантам осуществления изобретения, были получены из источников в Великобритании, США и Европейском союзе. Насколько известно автору, при создании настоящего изобретения не использовались никакие генетические ресурсы, на которые распространялись бы соглашения о доступе и совместном использовании выгод, или связанные с ними традиционные знания.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Комбайнд Терапевтикс
Миколь Ромен
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ, ЭКСПРЕССИИ И
МОДУЛИРОВАНИЯ КОДИРУЮЩИХ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ТКАНИ
<130> P44379WO
<150> PCT/US18/49772
<151> 2018-09-06
<150> US62632056
<151> 2018-02-19
<160> 33
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miR122
<400> 1
aacgccauua ucacacuaaa ua 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miR125a
<400> 2
acaggugagg uucuugggag cc 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miRNA 124a
<400> 3
uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miRNA Let-7b
<400> 4
cuauacaacc uacugccuuc cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miRNA-375
<400> 5
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miRNA-192
<400> 6
cugccaauuc cauaggucac ag 22
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> один сайт связывания miRNA-143
<400> 7
ugagaugaag cacuguagcu c 21
<210> 8
<211> 131
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для
miRNAmiRNA122-miRNA125a-miRNA122-miRNA125a-miRNA122
<400> 8
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaac aggugagguu cuugggagcc uuuaaaaacg 60
ccauuaucac acuaaauauu uaaaggugag guucuuggga gccuuuaaaa acgccauuau 120
cacacuaaau a 131
<210> 9
<211> 134
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для
miRNA122-miRNA124a-miRNA122-miRNA124a-miRNA122
<400> 9
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaua aggcacgcgg ugaaugccaa uuuaaaaacg 60
ccauuaucac acuaaauauu uaaauaaggc acgcggugaa ugccaauuua aaaacgccau 120
uaucacacua aaua 134
<210> 10
<211> 134
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для
miRNA122-Let-7-miRNA122-Let-7-miRNA122
<400> 10
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaacu auacaaccua cugccuuccc uuuaaaaacg 60
ccauuaucac acuaaauauu uaaacuauac aaccuacugc cuucccuuua aaaacgccau 120
uaucacacua aaua 134
<210> 11
<211> 134
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для
miRNA-122-miRNA125a-miRNA124a-let-7-miRNA375
<400> 11
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaac aggugagguu cuugggagcc uuuaaauaag 60
gcacgcggug aaugccaauu uaaacuauac aaccuacugc cuucccuuua aauuuguucg 120
uucggcucgc guga 134
<210> 12
<211> 78
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для miRNA122-miRNA124a-Let7
<400> 12
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaua aggcacgcgg ugaaugccaa uuuaaacuau 60
acaaccuacu gccuuccc 78
<210> 13
<211> 106
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для miRNA122-miRNA125a-miRNA124a-Let7
<400> 13
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaac aggugagguu cuugggagcc uuuaaauaag 60
gcacgcggug aaugccaauu uaaacuauac aaccuacugc cuuccc 106
<210> 14
<211> 106
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные сайты связывания для miRNA122-miRNA125a-miRNA375-Let7
<400> 14
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaac aggugagguu cuugggagcc uuuaaauuug 60
uucguucggc ucgcgugauu uaaacuauac aaccuacugc cuuccc 106
<210> 15
<211> 134
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные последовательности связывания для
miRNA122-miRNA124a-Let7-miRNA375-miRNA192
<400> 15
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaua aggcacgcgg ugaaugccaa uuuaaacuau 60
acaaccuacu gccuucccuu uaaauuuguu cguucggcuc gcgugauuua aacugccaau 120
uccauagguc acag 134
<210> 16
<211> 133
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> соединенные последовательности связывания для
miRNA122-miRNA125a-miRNA375-miRNA192-miRNA143
<400> 16
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaac aggugagguu cuugggagcc uuuaaauuug 60
uucguucggc ucgcgugauu uaaacugcca auuccauagg ucacaguuua aaugagauga 120
agcacuguag cuc 133
<210> 17
<211> 1445
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3
<400> 17
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accaggccaa gcuggugacu ggcaugggcu uuacgaucca cggagcgcuc accccaggau 600
cggaggggug ugucuuugac agcagccacc cagauuaccc ccaacgggua aucgugaagg 660
cgggguggua cacgagcacg agccacgagg cgcgacugcu gaggcgacug gaccaccccg 720
cgauccugcc ccuccuggac cugcaugucg ucuccggggu cacgugucug guccucccca 780
aguaccaggc cgaccuguau accuaucuga guaggcgccu gaacccgcug ggacgcccgc 840
agaucgcagc ggucucccgg cagcuccuaa gcgccguuga cuacauucac cgccagggca 900
uuauccaccg cgacauuaag accgaaaaua uuuuuauuaa cacccccgag gacauuugcc 960
ugggggacuu uggugccgcg ugcuucgugc aggguucccg aucaagcccc uuccccuacg 1020
gaaucgccgg aaccaucgac accaacgccc ccgagguccu gaccggggau ccguauacca 1080
ccaccgucga cauuuggagc gccggucugg ugaucuucga gacugccguc cacaacgcgu 1140
ccuuguucuc ggccccccgc ggccccaaaa ggggcccgug cgacagucag aucacccgca 1200
ucauccgaca ggcccagguc cacguugacg aguuuucccc gcauccagaa ucgcgccuca 1260
ccucgcgcua ccgcucccgc gcggccggga acaaucgccc gccguacacc cgaccggccu 1320
ggacccgcua cuacaagaug gacauagacg ucgaauaucu gguuugcaaa gcccucaccu 1380
ucgacggcgc gcuucgcccc agcgccgcag agcugcuuug uuugccgcug uuucaacaga 1440
aauga 1445
<210> 18
<211> 1577
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNAmiRNA122-miRNA125a-miRNA122-miRNA125a-miRNA122
<400> 18
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaaacaggu gagguucuug ggagccuuua 1500
aaaacgccau uaucacacua aauauuuaaa ggugagguuc uugggagccu uuaaaaacgc 1560
cauuaucaca cuaaaua 1577
<210> 19
<211> 1580
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNA122-miRNA124a-miRNA122-miRNA124a-miRNA122
<400> 19
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaauaaggc acgcggugaa ugccaauuua 1500
aaaacgccau uaucacacua aauauuuaaa uaaggcacgc ggugaaugcc aauuuaaaaa 1560
cgccauuauc acacuaaaua 1580
<210> 20
<211> 1580
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNA122-Let-7-miRNA122-Let-7-miRNA122
<400> 20
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaacuauac aaccuacugc cuucccuuua 1500
aaaacgccau uaucacacua aauauuuaaa cuauacaacc uacugccuuc ccuuuaaaaa 1560
cgccauuauc acacuaaaua 1580
<210> 21
<211> 1606
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNA-122-miRNA125a-miRNA124a-let-7-miRNA375
<400> 21
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuacgaucca cggagcgcuc accccaggau 600
cggaggggug ugucuuugac agcagccacc cagauuaccc ccaacgggua aucgugaagg 660
cgggguggua cacgagcacg agccacgagg cgcgacugcu gaggcgacug gaccaccccg 720
cgauccugcc ccuccuggac cugcaugucg ucuccggggu cacgugucug guccucccca 780
aguaccagcc gaccuguaua ccuaucugag uaggcgccug aacccgcugg gacgcccgca 840
gaucgcagcg gucucccggc agcuccuaag cgccguugac uacauucacc gccagggcau 900
uauccaccgc gacauuaaga ccgaaaauau uuuuauuaac acccccgagg acauuugccu 960
gggggacuuu ggugccgcgu gcuucgugca ggguucccga ucaagccccu uccccuacgg 1020
aaucgccgga accaucgaca ccaacgcccc cgagguccug accggggauc cguauaccac 1080
caccgucgac auuuggagcg ccggucuggu gaucuucgag acugccgucc acaacgcguc 1140
cuuguucucg gccccccgcg gccccaaaag gggcccgugc gacagucaga ucacccgcau 1200
cauccgacag gcccaggucc acguugacga guuuuccccg cauccagaau cgcgccucac 1260
cucgcgcuac cgcucccgcg cggccgggaa caaucgcccg ccguacaccc gaccggccug 1320
gacccgcuac uacaagaugg acauagacgu cgaauaucug guuugcaaag cccucaccuu 1380
cgacggcgcg cuucgcccca gcgccgcaga gcugcuuugu uugccgcugu uucaacagaa 1440
augaaacgcc auuaucacac uaaauauuua aaacagguga gguucuuggg agccuuuaaa 1500
uaaggcacgc ggugaaugcc aauuuaaacu auacaaccua cugccuuccc uuuaaauuug 1560
uucguucggc ucgcgugauu uaaauuuguu cguucggcuc gcguga 1606
<210> 22
<211> 1524
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNA122-miRNA124a-Let7
<400> 22
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaauaaggc acgcggugaa ugccaauuua 1500
aacuauacaa ccuacugccu uccc 1524
<210> 23
<211> 1552
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNA122-miRNA125a-miRNA124a-Let7
<400> 23
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaaacaggu gagguucuug ggagccuuua 1500
aauaaggcac gcggugaaug ccaauuuaaa cuauacaacc uacugccuuc cc 1552
<210> 24
<211> 1551
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными сайтами связывания
для miRNA122-miRNA125a-miRNA375-Let7
<400> 24
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaaacaggu gagguucuug ggagccuuua 1500
aauuuguucg uucggcucgc gugauuuaaa cuauacaacc uacugccuuc c 1551
<210> 25
<211> 1580
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными
последовательностями связывания для
miRNA122-miRNA124a-Let7-miRNA375-miRNA192
<400> 25
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaauaaggc acgcggugaa ugccaauuua 1500
aacuauacaa ccuacugccu ucccuuuaaa uuuguucguu cggcucgcgu gauuuaaacu 1560
gccaauucca uaggucacag 1580
<210> 26
<211> 1578
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность US3 с соединенными
последовательностями связывания для
miRNA122-miRNA125a-miRNA375-miRNA192-miRNA143
<400> 26
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcaa gcuggugacu ggcaugggcu uuacgaucca cggagcgcuc accccaggau 600
cggaggggug ugucuuugac agcagccacc cagauuaccc ccaacgggua aucgugaagg 660
cgggguggua cacgagcacg agccacgagg cgcgacugcu gaggcgacug gaccaccccg 720
cgauccugcc ccuccuggac cugcaugucg ucuccggggu cacgugucug guccucccca 780
aguaccaggc cgaccuguau accuaucuga guaggcgccu gaacccgcug ggacgcccgc 840
agaucgcagc ggucucccgg cagcuccuaa gcgccguuga cuacauucac cgccagggca 900
uuauccaccg cgacauuaag accgaaaaua uuuuuauuaa cacccccgag gacauuugcc 960
ugggggacuu uggugccgcg ugcuucgugc aggguucccg aucaagcccc uuccccuacg 1020
gaaucgccgg aaccaucgac accaacgccc ccgagguccu gaccggggau ccguauacca 1080
ccaccgucga cauuuggagc gccggucugg ugaucuucga gacugccguc cacaacgcgu 1140
ccuuguucuc ggccccccgc ggccccaaaa ggggcccgug cgacagucag aucacccgca 1200
ucauccgaca ggcccagguc cacguugacg aguuuucccc gcauccagaa ucgcgccuca 1260
ccucgcgcua ccgcucccgc gcggccggga acaaucgccc gccguacacc cgaccggccu 1320
ggacccgcua cuacaagaug gacauagacg ucgaauaucu gguuugcaaa gcccucaccu 1380
ucgacggcgc gcuucgcccc agcgccgcag agcugcuuug uuugccgcug uuucaacaga 1440
aaugaaacgc cauuaucaca cuaaauauuu aaaacaggug agguucuugg gagccuuuaa 1500
auuuguucgu ucggcucgcg ugauuuaaac ugccaauucc auaggucaca guuuaaauga 1560
gaugaagcac uguagcuc 1578
<210> 27
<211> 2513
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность RR1 с последовательностями связывания
для miRNA-122, miRNA-125a, miRNA-124a, let-7, miRNA-375
<400> 27
augcauguga ucaagcgaga uggccgccaa gagcgaguua uguuugacaa aauuacauca 60
cgaauccaga aacucuguua uggacucaac auggacuuug uugauccugc ucagaucacc 120
augaaaguaa uccaaggccu auauaguggg gucaccacag uggaacugga cacccuggcu 180
gcugagacag ccgcgaccuu gaccacgaag cacccugacu augccauccu ggcagcaagg 240
auagccgucu cuaacuugca caaagaaaca aagaaagugu ucagugaugu gauggaggau 300
cucuacaacu acauaaaucc gcacaacggc agacacucuc ccaugguggc cagcucaaca 360
cucgacauug uuauggccaa uaaggaucgc cugaauucug ccauuaucua ugaccgagau 420
uucucuuaua acuacuuugg cuuuaagaca cuggaacggu cauauuuguu gaagaucaau 480
gguaaagugg cugaaagacc acagcauaug uugaugaggg uuucuguggg gauucacaaa 540
gaagauauug augcugcaau ugaaaccuac aaccuacuuu cugagaagug guucacucau 600
gccucuccua cucucuucaa ugcugggacc aaccgcccac agcugucuag cuguuuccuc 660
uugaguauga aagaugacag cauugaagga auuuaugaua cucugaagca gugugccuug 720
auuucuaagu ccgcuggggg aauugguguu gcugugaguu guauucgggc cacugguagc 780
uacaucgcug ggacuaaugg caauucuaau ggccuugugc caaugcugag aguauauaac 840
aacacagcuc gcuaugugga ucaaggugga aacaagcgcc caggcgcguu ugcuauuuac 900
cuggagccuu ggcacuuaga caucuuugag uuccuugacu ugaagaagaa cacaggcaag 960
gaagaacagc gagcacgcga ucucuucuuu gcacuuugga ucccagaucu cuucaugaag 1020
cgaguggaga cuaaccagga cuggucauug auguguccca augagugucc uggucuggac 1080
gaggucuggg gagaggaguu ugagaaguua uaugaaaguu acgagaagca gggucguguc 1140
cgaaaaguug uaaaagcuca gcagcuuugg uaugccauca uugaguccca gacggagacc 1200
gguaccccau acaugcucua caaagauucc uguaaccgga agagcaacca gcagaaccug 1260
ggaaccauca aaugcagcaa ccuguguaca gaaauaguag aguacaccag uaaagaugag 1320
guugcaguuu guaacuuggc uucucuggcu cugaauaugu augucacacc ggaacauacg 1380
uaugacuuug agaaacuggc agaagucacu aaagucauug uccgaaaucu gaauaaaaua 1440
auugauauaa acuacuaccc uauuccagag gcacacuuau caaauaaacg ccaucggccc 1500
auuggaauug ggguacaagg uuuagaagau gcuuucaucc ugaugagaua ccccuuugag 1560
agcccagaag cccaguuauu aaauaagcag aucuuugaaa ccauuuacua uggagcccug 1620
gaagccagcu gugaacuagc caaggaguau ggccccuaug aaacguauga gggaucucca 1680
gucagcaagg guauucuuca guaugacaug uggaauguug cuccuacaga ccugugggac 1740
uggaagccuc ucaaggagaa gauugcaaag uaugguauaa ggaacaguuu acuuauugcc 1800
ccaaugccua cugcuucaac ugcccagauu cuggggaaua augaguccau ugagccuuau 1860
accaguaaca ucuacacucg aagagucuug ucaggggaau uucagauugu gaauccucac 1920
uuacugaaag aucuuacuga gcggggcuug uggaaugaag agaugaaaaa ucagauuauu 1980
gcaugcaaug gcuccauuca gagcauacca gaaauuccug augaccugaa gcaacucuau 2040
aagaccgugu gggaaaucuc ucagaagacu guucucaaga uggcagccga gagaggugcu 2100
uucaucgauc agagccaguc uuuaaacauc cauauugcug agcccaacua uggcaaacuc 2160
acuaguaugc acuucuacgg uuggaagcag gguuuaaaga cuggaaugua uuacuuaagg 2220
acgaggccug ccgcuaaucc aauccaguuc acucugaaca aggaaaaacu gaaagauaag 2280
gaaaaggcac ugaaggagga ggaggagaag gagaggaaca cagcagccau ggugugcucu 2340
uuggagaaca gagaggagug ucugaugugu ggauccugaa acgccauuau cacacuaaau 2400
auuuaaaaca ggugagguuc uugggagccu uuaaauaagg cacgcgguga augccaauuu 2460
aaacuauaca accuacugcc uucccuuuaa auuuguucgu ucggcucgcg uga 2513
<210> 28
<211> 2512
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мРНК RR1 с последовательностями связывания для miRNA-122,
miRNA-125, miRNA-375, miRNA-192, miRNA-143
<400> 28
augcauguga ucaagcgaga uggccgccaa gagcgaguua uguuugacaa aauuacauca 60
cgaauccaga aacucuguua uggacucaac auggacuuug uugauccugc ucagaucacc 120
augaaaguaa uccaaggccu auauaguggg gucaccacag uggaacugga cacccuggcu 180
gcugagacag ccgcgaccuu gaccacgaag cacccugacu augccauccu ggcagcaagg 240
auagccgucu cuaacuugca caaagaaaca aagaaagugu ucagugaugu gauggaggau 300
cucuacaacu acauaaaucc gcacaacggc agacacucuc ccaugguggc cagcucaaca 360
cucgacauug uuauggccaa uaaggaucgc cugaauucug ccauuaucua ugaccgagau 420
uucucuuaua acuacuuugg cuuuaagaca cuggaacggu cauauuuguu gaagaucaau 480
gguaaagugg cugaaagacc acagcauaug uugaugaggg uuucuguggg gauucacaaa 540
gaagauauug augcugcaau ugaaaccuac aaccuacuuu cugagaagug guucacucau 600
gccucuccua cucucuucaa ugcugggacc aaccgcccac agcugucuag cuguuuccuc 660
uugaguauga aagaugacag cauugaagga auuuaugaua cucugaagca gugugccuug 720
auuucuaagu ccgcuggggg aauugguguu gcugugaguu guauucgggc cacugguagc 780
uacaucgcug ggacuaaugg caauucuaau ggccuugugc caaugcugag aguauauaac 840
aacacagcuc gcuaugugga ucaaggugga aacaagcgcc caggcgcguu ugcuauuuac 900
cuggagccuu ggcacuuaga caucuuugag uuccuugacu ugaagaagaa cacaggcaag 960
gaagaacagc gagcacgcga ucucuucuuu gcacuuugga ucccagaucu cuucaugaag 1020
cgaguggaga cuaaccagga cuggucauug auguguccca augagugucc uggucuggac 1080
gaggucuggg gagaggaguu ugagaaguua uaugaaaguu acgagaagca gggucguguc 1140
cgaaaaguug uaaaagcuca gcagcuuugg uaugccauca uugaguccca gacggagacc 1200
gguaccccau acaugcucua caaagauucc uguaaccgga agagcaacca gcagaaccug 1260
ggaaccauca aaugcagcaa ccuguguaca gaaauaguag aguacaccag uaaagaugag 1320
guugcaguuu guaacuuggc uucucuggcu cugaauaugu augucacacc ggaacauacg 1380
uaugacuuug agaaacuggc agaagucacu aaagucauug uccgaaaucu gaauaaaaua 1440
auugauauaa acuacuaccc uauuccagag gcacacuuau caaauaaacg ccaucggccc 1500
auuggaauug ggguacaagg uuuagaagau gcuuucaucc ugaugagaua ccccuuugag 1560
agcccagaag cccaguuauu aaauaagcag aucuuugaaa ccauuuacua uggagcccug 1620
gaagccagcu gugaacuagc caaggaguau ggccccuaug aaacguauga gggaucucca 1680
gucagcaagg guauucuuca guaugacaug uggaauguug cuccuacaga ccugugggac 1740
uggaagccuc ucaaggagaa gauugcaaag uaugguauaa ggaacaguuu acuuauugcc 1800
ccaaugccua cugcuucaac ugcccagauu cuggggaaua augaguccau ugagccuuau 1860
accaguaaca ucuacacucg aagagucuug ucaggggaau uucagauugu gaauccucac 1920
uuacugaaag aucuuacuga gcggggcuug uggaaugaag agaugaaaaa ucagauuauu 1980
gcaugcaaug gcuccauuca gagcauacca gaaauuccug augaccugaa gcaacucuau 2040
aagaccgugu gggaaaucuc ucagaagacu guucucaaga uggcagccga gagaggugcu 2100
uucaucgauc agagccaguc uuuaaacauc cauauugcug agcccaacua uggcaaacuc 2160
acuaguaugc acuucuacgg uuggaagcag gguuuaaaga cuggaaugua uuacuuaagg 2220
acgaggccug ccgcuaaucc aauccaguuc acucugaaca aggaaaaacu gaaagauaag 2280
gaaaaggcac ugaaggagga ggaggagaag gagaggaaca cagcagccau ggugugcucu 2340
uuggagaaca gagaggagug ucugaugugu ggauccugaa acgccauuau cacacuaaau 2400
auuuaaaaca ggugagguuc uugggagccu uuaaauuugu ucguucggcu cgcgugauuu 2460
aaacugccaa uuccauaggu cacaguuuaa augagaugaa gcacuguagc uc 2512
<210> 29
<211> 2454
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кодирующая последовательность IL-12 с соединенными сайтами
связывания для miRNA-122-miRNA125a-miRNA124a-let-7-miRNA375
<400> 29
gcccagagca agauguguca ccagcaguug gucaucucuu gguuuucccu gguuuuucug 60
gcaucucccc ucguggccau augggaacug aagaaagaug uuuaugucgu agaauuggau 120
ugguauccgg augccccugg agaaauggug guccucaccu gugacacccc ugaagaagau 180
gguaucaccu ggaccuugga ccagagcagu gaggucuuag gcucuggcaa aacccugacc 240
auccaaguca aagaguuugg agaugcuggc caguacaccu gucacaaagg aggcgagguu 300
cuaagccauu cgcuccugcu gcuucacaaa aaggaagaug gaauuugguc cacugauauu 360
uuaaaggacc agaaagaacc caaaaauaag accuuucuaa gaugcgaggc caagaauuau 420
ucuggacguu ucaccugcug guggcugacg acaaucagua cugauuugac auucaguguc 480
aaaagcagca gaggcucuuc ugacccccaa ggggugacgu gcggagcugc uacacucucu 540
gcagagagag ucagagggga caacaaggag uaugaguacu caguggagug ccaggaggac 600
agugccugcc cagcugcuga ggagagucug cccauugagg ucauggugga ugccguucac 660
aagcucaagu augaaaacua caccagcagc uucuucauca gggacaucau caaaccugac 720
ccacccaaga acuugcagcu gaagccauua aagaauucuc ggcaggugga ggucagcugg 780
gaguacccug acaccuggag uacuccacau uccuacuucu cccugacauu cugcguucag 840
guccagggca agagcaagag agaaaagaaa gauagagucu ucacggacaa gaccucagcc 900
acggucaucu gccgcaaaaa ugccagcauu agcgugcggg cccaggaccg cuacuauagc 960
ucaucuugga gcgaaugggc aucugugccc ugcaguuagg uucugaucca ggaugaaaau 1020
uuggaggaaa aguggaagau auuaagcaaa auguuuaaag acacaacgga auagacccaa 1080
aaagauaauu ucuaucugau uugcuuuaaa acguuuuuuu aggaucacaa ugauaucuuu 1140
gcuguauuug uauaguuaga ugcuaaaugc ucauugaaac aaucagcuaa uuuauguaua 1200
gauuuuccag cucucaaguu gccaugggcc uucaugcuau uuaaauauuu aaguaauuua 1260
uguauuuauu aguauauuac uguuauuuaa cguuugucug ccaggaugua uggaauguuu 1320
cauacucuua ugaccugauc caucaggauc agucccuauu augcaaaaug ugaauuuaau 1380
uuuauuugua cugacaacuu uucaagcaag gcugcaagua caucaguuuu augacaauca 1440
ggaagaaugc aguguucuga uaccagugcc aucauacacu ugugauggau gggaacgcaa 1500
gagauacuua cauggaaacc ugacaaugca aaccuguuga gaagauccag gagaacaaga 1560
ugcuaguucc caugucugug aagacuuccu ggagauggug uugauaaagc aauuuagggc 1620
cacuuacacu ucuaagcaag uuuaaucuuu ggaugccuga auuuuaaaag ggcuagaaaa 1680
aaaugauuga ccagccuggg aaacauaaca agaccccguc ucuacaaaaa aaauuuaaaa 1740
uuagccaggc gugguggcuc augcuugugg ucccagcugu ucaggaggau gaggcaggag 1800
gaucucuuga gcccaggagg ucaaggcuau ggugagccgu gauugugcca cugcauacca 1860
gccuagguga cagaaugaga cccugucuca aaaaaaaaaa ugauugaaau uaaaauucag 1920
cuuuagcuuc cauggcaguc cucaccccca ccucucuaaa agacacagga ggaugacaca 1980
gaaacaccgu aagugucugg aaggcaaaaa gaucuuaaga uucaagagag aggacaagua 2040
guuauggcua aggacaugaa auugucagaa uggcaggugg cuucuuaaca gcccugugag 2100
aagcagacag augcaaagaa aaucuggaau cccuuucuca uuagcaugaa ugaaccugau 2160
acacaauuau gaccagaaaa uauggcucca ugaaggugcu acuuuuaagu aauguaugug 2220
cgcucuguaa agugauuaca uuuguuuccu guuuguuuau uuauuuauuu auuuuugcau 2280
ucugaggcug aacuaauaaa aacucuucuu uguaaucuga aacgccauua ucacacuaaa 2340
uauuuaaaac aggugagguu cuugggagcc uuuaaauaag gcacgcggug aaugccaauu 2400
uaaacuauac aaccuacugc cuucccuuua aauuuguucg uucggcucgc guga 2454
<210> 30
<211> 50
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 2x сайта связывания miR-122 с линкером
<400> 30
aacgccauua ucacacuaaa uauuuaaaaa cgccauuauc acacuaaaua 50
<210> 31
<211> 761
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность mCherry с 2x последовательностями связывания
miR-122 и линкером
<400> 31
auggugagca agggcgagga ggauaacaug gccaucauca aggaguucau gcgcuucaag 60
gugcacaugg agggcuccgu gaacggccac gaguucgaga ucgagggcga gggcgagggc 120
cgccccuacg agggcaccca gaccgccaag cugaagguga ccaagggugg cccccugccc 180
uucgccuggg acauccuguc cccucaguuc auguacggcu ccaaggccua cgugaagcac 240
cccgccgaca uccccgacua cuugaagcug uccuuccccg agggcuucaa gugggagcgc 300
gugaugaacu ucgaggacgg cggcguggug accgugaccc aggacuccuc ccugcaggac 360
ggcgaguuca ucuacaaggu gaagcugcgc ggcaccaacu uccccuccga cggccccgua 420
augcagaaga agaccauggg cugggaggcc uccuccgagc ggauguaccc cgaggacggc 480
gcccugaagg gcgagaucaa gcagaggcug aagcugaagg acggcggcca cuacgacgcu 540
gaggucaaga ccaccuacaa ggccaagaag cccgugcagc ugcccggcgc cuacaacguc 600
aacaucaagu uggacaucac cucccacaac gaggacuaca ccaucgugga acaguacgaa 660
cgcgccgagg gccgccacuc caccggcggc auggacgagc uguacaagua aaacgccauu 720
aucacacuaa auauuuaaaa acgccauuau cacacuaaau a 761
<210> 32
<211> 1496
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> US3 с 2x сайтами связывания miR-122 и линкером
<400> 32
auggccuguc guaaguuuug ucgcguuuac gggggacagg gcaggaggaa ggaggaggcc 60
gucccgccgg agacaaagcc gucccgggug uuuccucaug gccccuuuua uaccccagcc 120
gaggacgcgu gccuggacuc cccgcccccg gagaccccca aaccuuccca caccacacca 180
cccggcgaug ccgagcgccu gugucaucug caggagaucc uggcccagau guacggaaac 240
caggacuacc ccauagagga cgaccccagc gcggaugccg cggacgaugu cgacgaggac 300
gccccggacg acguggccua uccggaggaa uacgcagagg agcuuuuucu gcccggggac 360
gcgcccgguc cccuuaucgg ggccaacgac cacaucccuc ccccgugugg cgcaucuccc 420
cccgguauac gacgacgcag ccgggaugag auuggggcca cgggauuuac cgcggaagaa 480
cuggacgcca uggacaggga ggcggcucga gccaucagcc gcggcggcaa gccccccucg 540
accauggcca agcuggugac uggcaugggc uuuacgaucc acggagcgcu caccccagga 600
ucggaggggu gugucuuuga cagcagccac ccagauuacc cccaacgggu aaucgugaag 660
gcgggguggu acacgagcac gagccacgag gcgcgacugc ugaggcgacu ggaccacccc 720
gcgauccugc cccuccugga ccugcauguc gucuccgggg ucacgugucu gguccucccc 780
aaguaccagg ccgaccugua uaccuaucug aguaggcgcc ugaacccgcu gggacgcccg 840
cagaucgcag cggucucccg gcagcuccua agcgccguug acuacauuca ccgccagggc 900
auuauccacc gcgacauuaa gaccgaaaau auuuuuauua acacccccga ggacauuugc 960
cugggggacu uuggugccgc gugcuucgug caggguuccc gaucaagccc cuuccccuac 1020
ggaaucgccg gaaccaucga caccaacgcc cccgaggucc ugaccgggga uccguauacc 1080
accaccgucg acauuuggag cgccggucug gugaucuucg agacugccgu ccacaacgcg 1140
uccuuguucu cggccccccg cggccccaaa aggggcccgu gcgacaguca gaucacccgc 1200
aucauccgac aggcccaggu ccacguugac gaguuuuccc cgcauccaga aucgcgccuc 1260
accucgcgcu accgcucccg cgcggccggg aacaaucgcc cgccguacac ccgaccggcc 1320
uggacccgcu acuacaagau ggacauagac gucgaauauc ugguuugcaa agcccucacc 1380
uucgacggcg cgcuucgccc cagcgccgca gagcugcuuu guuugccgcu guuucaacag 1440
aaaugaaacg ccauuaucac acuaaauauu uaaaaacgcc auuaucacac uaaaua 1496
<210> 33
<211> 3466
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ICP6 с 2x последовательностями сайта связывания miRNA-122
<400> 33
augauggcca gccgcccagc cgcauccucu cccgucgaag cgcgggcccc gguuggggga 60
caggaggccg gcggccccag cgcagccacc cagggggagg ccgccggggc cccucucgcc 120
cacggccacc acguguacug ccagcgaguc aauggcguga uggugcuuuc cgacaagacg 180
cccggguccg cguccuaccg caucagcgau agcaacuuug uccaaugugg uuccaacugc 240
accaugauua ucgacggaga cguggugcgc gggcgccccc aggacccggg ggccgcggca 300
ucccccgcuc ccuucguugc ggugacaaac aucggagccg gcagcgacgg cgggaccgcc 360
gucguugcau ucgggggaac cccacgucgc ucggcgggga cgucuaccgg uacccagacg 420
gccgacgucc cagccgaggc ccuugggggc cccccuccuc cuccccgcuu cacccugggu 480
ggcggcuguu gcuccugucg cgacacacgg cgccgcucug cgguauucgg gggggagggg 540
gaucccgucg gccccgcgga guucgucucg gacgaccggu cguccgauuc cgacucggau 600
gacucggagg acaccgacuc ggagacgcug ucacacgccu ccucggacgu guccggcggg 660
gccacguacg acgacgcccu ugacuccgau ucgucaucgg augacucccu gcagauagau 720
ggccccgugu gucgcccgug gagcaaugac accgcgcccc uggauguuug ccccgggacc 780
cccggcccgg gcgccgacgc cggugguccc ucagcgguag acccacacgc gccgacgaca 840
ggggccggcg cuggucuugc ggccgauccc gccguggccc gggacgacgc ggaggggcuu 900
ucggaccccc ggccacgucu gggaacgggc acggccuacc ccgucccccu ggaacucacg 960
cccgagaacg cggaggccgu ggcgcgcuuu cugggagaug ccgugaaccg cgaacccgcg 1020
cucaugcugg aguacuuuug ccggugcgcc cgcgaggaaa ccaagcgugu cccccccagg 1080
acauucugca gccccccucg ccucacggag gacgacuuug ggcuucucaa cuacgcgcuc 1140
guggagaugc agcgccugug ucuggacguu ccuccggucc cgccgaacgc auacaugccc 1200
uauuaucuca gggaguaugu gacgcggcug gucaacgggu ucaagccgcu ggugagccgg 1260
uccguucgcc uuuaccgcau ccuggggguu cuggugcacc ugcggauccg gacccgggag 1320
gccuccuuug aggaguggcu gcgauccaag gaaguggccc uggacuuugg ccugacggaa 1380
aggcuucgcg agcacgaagc ccagcuggug auccuggccc aggcucugga ccauuacgac 1440
ugucugaucc acagcacacc gcacacgcug gucgagcggg ggcugcaauc ggcccugaag 1500
uaugaggagu uuuaccuaaa gcgcuuuggc gggcacuaca uggaguccgu cuuccagaug 1560
uacacccgca ucgccggcuu uuuggccugc cgggccacgc gcggcaugcg ccacaucgcc 1620
cuggggcgag aggggucgug gugggaaaug uucaaguucu uuuuccaccg ccucuacgac 1680
caccagaucg uaccgucgac ccccgccaug cugaaccugg ggacccgcaa cuacuacacc 1740
uccagcugcu accugguaaa cccccaggcc accacaaaca aggcgacccu gcgggccauc 1800
accagcaacg ucagugccau ccucgcccgc aacgggggca ucgggcuaug cgugcaggcg 1860
uuuaacgacu ccggccccgg gaccgccagc gucaugcccg cccucaaggu ccucgacucg 1920
cugguggcgg cgcacaacaa agagagcgcg cguccgaccg gcgcgugcgu guaccuggag 1980
ccguggcaca ccgacgugcg ggccgugcuc cggaugaagg ggguccucgc cggcgaagag 2040
gcccagcgcu gcgacaauau cuucagcgcc cucuggaugc cagaccuguu uuucaagcgc 2100
cugauucgcc accuggacgg cgagaagaac gucacaugga cccuguucga ccgggacacc 2160
agcaugucgc ucgccgacuu ucacggggag gaguucgaga agcucuacca gcaccucgag 2220
gucauggggu ucggcgagca gauacccauc caggagcugg ccuauggcau ugugcgcagu 2280
gcggccacga ccgggagccc cuucgucaug uucaaagacg cggugaaccg ccacuacauc 2340
uacgacaccc agggggcggc caucgccggc uccaaccucu gcaccgagau cguccauccg 2400
gccuccaagc gauccagugg ggucugcaau cugggaagcg ugaaucuggc ccgaugcguc 2460
uccaggcaga cguuugacuu ugggcggcuc cgcgacgccg ugcaggcgug cgugcugaug 2520
gugaacauca ugaucgacag cacgcuacaa cccacgcccc agugcacccg cggcaacgac 2580
aaccugcggu ccaugggaau cggcaugcag ggccugcaca cggccugccu gaagcugggg 2640
cuggaucugg agucugccga auuucaggac cugaacaaac acaucgccga ggugaugcug 2700
cugucggcga ugaagaccag caacgcgcug ugcguucgcg gggcccgucc cuucaaccac 2760
uuuaagcgca gcauguaucg cgccggccgc uuucacuggg agcgcuuucc ggacgcccgg 2820
ccgcgguacg agggcgagug ggagaugcua cgccagagca ugaugaaaca cggccugcgc 2880
aacagccagu uugucgcgcu gaugcccacc gccgccucgg cgcagaucuc ggacgucagc 2940
gagggcuuug ccccccuguu caccaaccug uuuagcaagg ugacccggga cggcgagacg 3000
cugcgcccca acacgcuccu gcuaaaggaa cuggaacgca cguuuagcgg gaagcgccuc 3060
cuggagguga uggacaguuc gacgccaagc agugguccgu ggcgcaggcg cucccgugcc 3120
uggagcccac ccacccccuc cggcgauuca agaccgcguu ugacuacgac cagaaguugc 3180
ugaucgaccu gugugcggac cgcgcccccu acgucgacca uagccaaucc augacccugu 3240
augucacgga gaaggcggac gggacccucc cagccuccac ccugguccgc cuucuggucc 3300
acgcauauaa gcgcggacua aaaacaggga uguacuacug caagguucgc aaggcgacca 3360
acagcggggu cuuuggcggc gacgacaaca uugucugcac gagcugcgcg cuguagaacg 3420
ccauuaucac acuaaauauu uaaaaacgcc auuaucacac uaaaua 3466
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| РЕКОМБИНАНТНЫЙ ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ ВИРУС, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ | 2020 |
|
RU2795230C1 |
| ОНКОЛИТИЧЕСКИЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2018 |
|
RU2771110C2 |
| КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТА ОНКОЛИТИЧЕСКОГО АДЕНОВИРУСА, СПЕЦИФИЧЕСКИ ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО ИММУНОМОДУЛЯТОРНЫЙ ФАКТОР GM-CSF В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2004 |
|
RU2361611C2 |
| ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИНТЕРЛЕЙКИН-12 (IL12), И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2017 |
|
RU2769316C2 |
| ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА | 2016 |
|
RU2720984C2 |
| НАЦЕЛИВАНИЕ НА КЛЕТКИ, ОПОСРЕДУЕМОЕ ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ | 2018 |
|
RU2783316C2 |
| СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ РНК В КЛЕТКЕ | 2018 |
|
RU2784654C2 |
| АГЕНТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ КЛАУДИН РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2013 |
|
RU2678127C2 |
| СПОСОБ АКТИВАЦИИ/ПРОЛИФЕРАЦИИ T-КЛЕТОК | 2019 |
|
RU2806549C2 |
| НЕТОКСИЧНЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ ВПГ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЙ В ЭФФЕКТИВНОЙ ДОСТАВКЕ ГЕНОВ И КОМПЛЕМЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ ДЛЯ ИХ ПРОДУЦИРОВАНИЯ | 2014 |
|
RU2714259C2 |
Настоящее изобретение относится к области генной инженерии. Описана выделенная последовательность мРНК для экспрессии одного или более полипептидов в одном или более органах-мишенях, содержащая по меньшей мере одну кодирующую последовательность, которая кодирует по меньшей мере один полипептид, по меньшей мере первую последовательность нетранслируемой области (UTR) и множество последовательностей сайтов связывания микроРНК (мкРНК). Каждая из последовательностей сайтов связывания мкРНК находится внутри первой последовательности UTR, непосредственно примыкает к ней с 5'-конца или непосредственно примыкает к ней с 3'-конца; и последовательности сайтов связывания мкРНК обеспечивают дифференциальную экспрессию кодирующей последовательности по меньшей мере в первом и во втором типах клеток в органе- или органах-мишенях. Технический результат заключается в создании композиции для улучшенной направленной цитокиновой терапии с гибкой защитой от нецелевых эффектов. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 28 ил., 5 табл., 5 пр.
1. Выделенная последовательность мРНК для экспрессии одного или более цитокинов в одном или более органах-мишенях, содержащая:
по меньшей мере одну кодирующую последовательность, которая кодирует воспалительный или иммуномодулирующий цитокин, причем цитокин участвует в иммунном ответе и воспалении и выбран из: TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-гамма, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL 9 и CXCL10 и GM-CSF;
по меньшей мере первую последовательность нетранслируемой области (UTR);
по меньшей мере три различные последовательности сайтов связывания микроРНК (мкРНК);
где каждая из последовательностей сайтов связывания мкРНК находится внутри первой последовательности UTR, непосредственно примыкает к ней с 5'-конца или непосредственно примыкает к ней с 3'-конца; и
где последовательности сайтов связывания мкРНК обеспечивают дифференциальную экспрессию кодирующей последовательности по меньшей мере в первом и во втором типах клеток в органе- или органах-мишенях.
2. Выделенная последовательность мРНК по п.1, содержащая по меньшей мере четыре, обычно по меньшей мере пять последовательностей сайтов связывания мкРНК.
3. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1 или 2, где множество последовательностей сайтов связывания мкРНК по существу комплементарны последовательностям мкРНК, выбранным из по меньшей мере одной или более из группы, состоящей из: мкРНК-122; мкРНК-125a; мкРНК-125b; мкРНК-199, мкРНК-124a; Let-7; мкРНК-148a; мкРНК-148b; мкРНК-375; мкРНК-143; мкРНК-145; мкРНК192; мкРНК194; мкРНК-204; мкРНК215 и мкРНК-30.
4. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1-3, где по меньшей мере одна из по меньшей мере трех последовательностей сайтов связывания мкРНК содержит одну или более из SEQ ID NO: 1-7.
5. Выделенная последовательность мРНК по п.4, где по меньшей мере одна из по меньшей мере трех последовательностей сайтов связывания мкРНК содержит SEQ ID NO: 1.
6. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1-5, где последовательности сайтов связывания содержат каждую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 и 5; или где последовательности сайтов связывания содержат каждую из SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 и 7.
7. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1-6, где первый и второй типы клеток представляют собой разных представителей группы, состоящей из ненеопластических клеток, трансформированного клеточного фенотипа, предракового фенотипа, типа иммунных клеток и неопластического фенотипа.
8. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1-7, где орган- или органы-мишени выбраны из группы, состоящей из печени; головного мозга; легкого; молочной железы; поджелудочной железы; толстой кишки и почки.
9. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1-8, где мРНК содержит более чем одну открытую рамку считывания (ORF).
10. Выделенная последовательность мРНК по п.9, где дополнительная/ые ORF кодируют один или более цитокинов или их лигандов, участвующих в иммунном ответе и воспалении, выбранных из одного или более из: TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-гамма, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10 или одного или более активаторов дендритных клеток, выбранных из одного или более из: GM-CSF, TLR7 и TLR9.
11. Выделенная последовательность мРНК по любому из пп.1-10, где мРНК содержит SEQ ID NO: 29.
12. Композиция для лечения рака, в соответствующих случаях, где рак выбран из группы, состоящей из рака печени, рака головного мозга, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака и рака почки, причем композиция содержит выделенную последовательность мРНК по любому из пп.1-10, и дополнительную последовательность мРНК, содержащую:
по меньшей мере одну кодирующую последовательность, которая кодирует один или более цитокинов или их лигандов, участвующих в иммунном ответе и воспалении, выбранных из одного или более из: TNF-α, TNF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-гамма, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 и CXCL10;
по меньшей мере первую последовательность нетранслируемой области (UTR);
по меньшей мере три различные последовательности сайтов связывания микроРНК (мкРНК);
где каждая из последовательностей сайтов связывания мкРНК находится внутри первой последовательности UTR, непосредственно примыкает к ней с 5'-конца или непосредственно примыкает к ней с 3'-конца.
13. Композиция для лечения рака, в соответствующих случаях, где рак выбран из группы, состоящей из рака печени, рака головного мозга, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака и рака почки, причем композиция содержит последовательность мРНК по любому из пп.1-11, и дополнительную последовательность мРНК, содержащую:
по меньшей мере одну кодирующую последовательность, которая кодирует один или более активаторов дендритных клеток, выбранных из одного или более из GM-CSF, TLR7 и TLR9;
по меньшей мере первую последовательность нетранслируемой области (UTR);
по меньшей мере три различные последовательности сайтов связывания микроРНК (мкРНК);
где каждая из последовательностей сайтов связывания мкРНК находится внутри первой последовательности UTR, непосредственно примыкает к ней с 5'-конца или непосредственно примыкает к ней с 3'-конца.
14. Фармацевтическая композиция для лечения рака, в соответствующих случаях, где рак выбран из группы, состоящей из рака печени, рака головного мозга, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака и рака почки, причем композиция содержит выделенную последовательность мРНК по любому из пп.1-11 или композицию по п.12 или 13, и частицу для доставки, причем указанная последовательность содержится в частице для доставки, и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Композиция по п.14, где частица для доставки выбрана из по меньшей мере одной частицы из группы, состоящей из частицы аминоспиртового липидоида; липосомы; экзосомы; клеточной везикулы; и полимерной частицы.
16. Композиция по п.14 или 15, где частица для доставки нацелена на один или более орган или органы-мишени.
17. Композиция по п.16, где частица для доставки содержит нацеливающий агент, выбранный из белков, пептидов, углеводов, гликопротеинов, липидов, малых молекул и нуклеиновых кислот; и
где указанные нацеливающие агенты избирательно связываются с клетками в органе- или органах-мишенях.
18. Экспрессирующая векторная ДНК-конструкция, кодирующая последовательность мРНК по любому из пп.1-11.
19. Вирусный вектор для лечения рака, в соответствующих случаях, где рак выбран из группы, состоящей из рака печени, рака головного мозга, рака легкого, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака и рака почки, причем вектор содержит последовательность мРНК по любому из пп.1-11 или экспрессирующую векторную ДНК-конструкцию по п.18.
| US2013156849 20.0.2013 | |||
| WO2017132552 03.08.2017 | |||
| WO2016011306 21.02.2016 | |||
| ВЕЗИКУЛЫ С РЕГУЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ АКТИВНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ | 1994 |
|
RU2160093C2 |
