ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОГО РАКА ПОЧКИ ЧЕЛОВЕКА RC291C Российский патент 2018 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности, к получению и применению клеточных линий, используемых для клеточных технологий в медицине, среди которых создание биомедицинских клеточных продуктов - противоопухолевых вакцин, диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов, тестирование активности различных фармацевтических препаратов.

Прогресс современной биомедицинской науки и биотехнологии в значительной степени обусловлен применением культивируемых in vitro клеток различного происхождения. Метод культур клеток является уникальным и вместе с тем широко применяется в настоящее время, как в практических, так и в научных исследованиях. Появилась возможность использования клеток животных для получения генно-инженерных препаратов, заместительной терапии, производство препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения в значительной мере зависит от стабильности и воспроизводимости свойств используемых клеток. Основой получения любого безопасного биопродукта должна быть стандартизованная и аттестованная культура клеток. В настоящее время использование подобных клеточных линий является неотъемлемым условием при проведении исследований или разработке новых технологий, а также для обеспечения стабильного и безопасного производства биотехнологических препаратов (Мензоров А.Г., Серов О.Л. Зачем нужны коллекции линий клеток // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2016. - Т. 20(6). - С. 945-948. DOI 10.18699/VJ16.215).

Рак почки занимает одно из ведущих мест по темпам прироста среди онкоурологических заболеваний. По данным статистики, в 2016 г. в России было зарегистрировано 108,9 случаев злокачественных новообразований почки на 100000 тыс. населения по сравнению с 78,5 в 2011 г. (Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. - илл. - 236 с. ISBN 978-5-85502-231-5). Течение этого заболевания таково, что у 25-50% больных на момент установления диагноза уже определяются метастазы, приблизительно у половины пациентов болезнь приобретет системный характер в разные сроки после оперативного лечения. Биологической особенностью почечноклеточного рака является способность к метастазированию в любые органы и ткани организма. Традиционные виды системного лечения, назначаемые при распространенных формах опухолей, оказываются неэффективными у больных почечноклеточным раком. Однако рак почки относится к группе новообразований, чувствительных к иммунотерапевтическому воздействию (Cho Y.H., Kim M.S., Chung H.S., Chang E.Novel immunotherapy in metastatic renal cell carcinoma // Investig Clin Urol. - 2017 - Vol. 58(4). - P. 220-227. doi: 10.411 l/icu.2017.58.4.220).

Активная иммунотерапия включает в себя: 1) неспецифическую иммунотерапию (индуцирование активного воспалительного процесса, неспецифическая вакцинация, местное и системное использование БЦЖ, применение левамизола, интерферонов α и γ, фактора некроза опухолей, интерлейкинов, колониестимулирующих факторов, высоких доз антиэстрогенов), 2) специфическую иммунотерапию с иммунизацией опухолевыми антигенами (вакцинотерапию), 3) генную терапию. В настоящее время ведется поиск опухолеассоциированных антигенов (ОАА), использование которых в качестве мишеней для иммунотерапии позволило бы вывести эти методы на качественно новый уровень (Schumacher T.N., Schreiber R.D. Neoantigens in cancer immunotherapy // Science. - 2015. - Vol. 348, Issue 6230. - P. 69-74. DOI: 10.1126/science. 4971). Процесс создания и отбора опухолевых клеточных линий, способных стабильно продуцировать высокий уровень ОАА, является базой для производства противоопухолевых клеточных вакцин, в том числе вакцин на основе дендритных клеток (ДК). Создание противоопухолевых вакцин с использованием ДК является перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний, так как позволяет активировать защитные системы организма больного, используя естественные пути распознавания опухолевых антигенов и их последующую элиминацию. Опухолевые антигены, полученные из разрушенных клеток опухоли, в большей степени подходят для нагрузки ДК, так как в этом случае в клетку попадает весь набор опухолеассоциированных и опухолеспецифических антигенов (Балдуева И.А. Иммунотерапия злокачественных новообразований: взгляд в будущее. Аллергология и иммунология - 2014. - №4. - С. 266-268). В качестве носителей ОАА используют аутологичные и аллогенные цельные или лизированные опухолевые клетки, причем каждая опухолевая клеточная линия обладает специфическим уникальным набором ОАА, и расширение спектра клеточных линий позволяет создать более широкий пул данных антигенов, которые могут стать доступны для таких антигенпрезентирующих клеток? как ДК в процессе манипуляций in vitro при создании противоопухолевых вакцин, что позволяет с наибольшей эффективностью индуцировать противоопухолевый иммунитет (Monjazeb A.M., Hsiao Н.Н., Sckisel G.D., Murphy W.J. The role of antigen-specific and non-specific immunotherapy in the treatment of cancer // J Immunotoxicol. - 2012. - Jul-Sep; 9(3). - P. 248-58. - doi: 10.3109/1547691X.2012.685527). ДК-вакцины успешно применяют для лечения пациентов с раком почки как в виде монотерапии, так и в составе комбинированной противоопухолевой терапии (Amin A., Dudek A.Z., Logan T.F. et al. Survival with AGS-003, an autologous dendritic cell-based immunotherapy, in combination with sunitinib in unfavorable risk patients with advanced renal cell carcinoma (RCC): Phase 2 study results // J Immunother Cancer. 2015 Apr 21; 3:14. doi: 10.1186/s40425-015-0055-3).

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований.

Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, тест-систем и экспериментальных моделей для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.

Указанный технический результат достигается применением клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов.

Полученная клеточная линия RC291C обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Родословная клеточной линии RC291C представлена следующим образом.

Клеточная линия получена из метастаза опухоли в легкое больной Ц., 65 л., проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении/. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования. Получение клеточной линии RC291C осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм³) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме Медимашины (DAKO, Дания) в течение 30-60 сек, помещая их на стерильные ножи медиконы. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной питательной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 22 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии RC291C характеризуются следующим образом.

Культура представлена клетками полигональной или округлой формы, содержащими крупные ядра с одним или двумя ядрышками. Встречаются многоядерные клетки. Ядра 78% клеток окрашиваются в ходе иммуноцитохимической реакции с моноклональными антителами против маркера пролиферации Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии RC291C следующие.

Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов HLAA/B/C, раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и семейств MAGE, GAGE. Методом иммуноцитохимии определена экспрессия антигена RCC (renal cell carcinoma antigen).

Культуральные свойства клеточной линии RC291C представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% CO₂, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. При субкультивировании клетки снимают 2 раза в неделю в соотношении 1:2 с использованием стандартного раствора 0,25% трипсина.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 92%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Иммунофлуоресцентный тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии RC291C следующая:

47,X,-X,+t(1;7)(q21;p22),+t(1:7)(q21;p22),+del(4)(q),+t(7:?)(p22;?),-8,del(9)(p22),-14,-15,+del(17)(q),+20,-21.

При этом del (4)(q) встречается в 62% клеток в виде del (4)(q23) и в 38% клеток в виде del (4)(q31). Делеция del(17)(q) встречается в 77% клеток в виде del(17)(q11.2) и в 23% клеток в виде del(17)(q22). Наиболее часто встречаемые маркеры, характеризующие культуру RC291C:

1. Нереципрокная (невзаимная) транслокация между 1 и 7 хромосомами [t(l;7)(q21;p22)]. Выявлена в 95% случаев, при этом в количестве 2 в 75% клеток, в количестве 1 - в 16% клеток, в количестве 3 - в 4 клетках из 100.

2. Дериват хромосомы 7, или транслокация 7 в локусе р22 [t(7;?)(p22;?)]. Выявлена в 56% клеток, при этом в основном в количестве 1 и только в 4%>клеток в количестве 2.

3. Изохромосома 9q выявлена в 35% клеток, в основном в количестве 1.

4. Делеция хромосомы 4 в локусе q23 встречается в 72% клеток, при этом в основном в количестве 1.

5. Делеция 4q13 встречается в 29% клеток, при этом в 6% клеток в количестве 2.

6. Делеция 7 хромосомы в локусе q11.2 встречается в 55% клеток, при этом в 12% клеток в количестве 2 и в 3% клеток в количестве 3.

7. Делеция 6 хромосомы в локусе q23 отмечена в 5% клеток.

8. Делеция 9 хромосомы в локусе р22 отмечена в 61% клеток, в основном в количестве 1.

9. Маркер в виде 10(р) отмечен в 9% клеток.

Использование клеточной линии RC291C представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии RC291C для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточную линию RC291C культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% CO₂, 100%) влажности в СО₂-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:2.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в CO₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клеток линии RC291C проводили шесть последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией RC291C в культуры незрелых дендритных клеток пациентов на 5-й день культивирования (иммунофенотип CD14^-CD1a⁺CD83^-) в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки на 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин - 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺/CD209⁺/CCR7⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии RC291C для создания экспериментальной системы in vitro, позволяющей оценить активность цитотоксических Т-лимфоцитов.

1. Клеточную линию RC291C культивировали, как описывается выше. После пересева клетки собирали, осуществляли подсчет их количества, оценку жизнеспособности и высевали в планшету Е-16 (ACEA Bioscience Inc., США) в количестве 10 тыс. кл/лунка.

2. Два часа инкубировали планшету с клетками RC291C в условиях 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (TermoElectron LTD GmbH, Германия).

3. Вносили в каждую лунку планшеты специфически активированные CD3⁺CD8⁺ лимфоциты больного раком почки в соотношении 1 оп. кл. /5 лимфоцитов, 1/10 и 1/50, соответственно.

4. Инкубировали в условиях CO₂-инкубатора 30 минут, после чего устанавливали планшету в автоматический клеточный анализатор xCELLigence (ACEA Bioscience Inc., США). Программировали систему регистрации параметров жизнеспособности и пролиферации прикрепившихся культивируемых опухолевых клеток RC291C на 48 ч.

5. Оценили изменения жизнеспособности и скорости роста культуры RC291C по изменению значений электрического импеданса, которые автоматически контролировались системой xCELLigence и были выражены в виде клеточного индекса (CI).

6. Наблюдали прогрессивное уменьшение CI культуры RC291C при кокультивировании в течение 48 ч. с активированными CD3⁺CD8⁺ лимфоцитами: 1,049 в контроле и 0,0027 при соотношении опухолевая клетка/лимфоцит 1/50.

Заявляемый способ расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, способствуе тповышению эффективности лечения и увеличению продолжительность жизни пациентов при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия RC291C может использоваться для создания противоопухолевых вакцин, диагностических наборов, тест-систем с целью разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов, для тестирования эффективности различных фармацевтических препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой применение клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. 1 пр.

Применение клеточной линии светлоклеточного рака почки человека RC291C, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 724Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов.