КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА 587 BlCan TVV Российский патент 2021 года по МПК C12N5/00 C12N5/09 

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия рака мочевого пузыря 587 BlCan TVV обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в активной специфической иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 792Д.

Несмотря на колоссальные успехи, достигнутые в последние десятилетия в области хирургического лечения и лекарственной терапии злокачественных новообразований, по-прежнему остается проблема высокой смертности среди больных метастатическими формами рака. Применение принципиально новых методов лечения, основанных на клеточных технологиях, расширяют арсенал приемов воздействия на опухолевый процесс. Одним из таких подходов является противоопухолевая вакцинотерапия, в том числе основанная на использовании аутологичных и/или аллогенных опухолевых клеток [Seledtsov V.I., Goncharov A.G., Seledtsova G.V. Clinically feasible approaches to potentiating cancer cell-based immunotherapies // Hum Vaccin Immunother. - 2015. - Vol. 11(4). - P. 851-869. doi: 10.1080/21645515.2015.1009814].

Объектами биомедицинских исследований являются живые организмы, но работа с ними чрезвычайно затруднена, а изучение молекулярных взаимодействий практически невозможно, так как очень сложно выделить конкретные процессы от миллионов других событий, одновременно происходящих в организме. Кроме того, результаты всех исследований, проведенных на животных модельных системах, не могут быть прямо экстраполированы на человека, а эксперименты на людях запрещены. Поэтому получение и культивирование клеток, выделенных из организма человека, является в настоящее время весьма перспективным подходом, позволяющим получать неограниченное количество клеточного материала для любых исследований и проводить их на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине [Мензоров А.Г., Серов О.Л. Зачем нужны коллекции линий клеток // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2016. - Т.20(6). - С. 945-948. doi10.18699/VJ16.215].

Банкирование клеточных линий, предназначенных для целей клинического применения, - это важная стратегическая задача, без решения которой невозможно на сегодняшний день дальнейшее развитие медицинских технологий [Рачинская О.А., Чапленко А.А., Мельников Е.В., Семенова И.С., Олефир Ю.В. Мировая практика хранения клеточных линий, предназначенных для применения в клинических целях // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2018; 18(4): 216-224].

В структуре онкологической заболеваемости опухоли мочевого пузыря составляют от 2 до 5% всех новообразований, занимая среди онкоурологических заболеваний в России второе место и третье - по смертности от них [Григорьев Е.Г., Фролова И.Г., Усынин Е.А., Величко С.А., Окунев В.В. Рак мочевого пузыря: возможности лучевых методов диагностики (обзор литературы) // Сибирский онкологический журнал. - 2013. - №3(57). - С. 75-81].

Рак мочевого пузыря можно отнести к одной из наиболее агрессивных форм злокачественных новообразований. Хирургические методы, химиотерапия и лучевая терапия являются стандартом лечения данного вида злокачественных опухолей, однако, их высокая способность к метастазированию и формирование лекарственной устойчивости создают предпосылки для поиска и создания новых терапевтических подходов, тем более что иммуногенность РМП не вызывает сомнений, так как характерной его особенностью является высокий уровень мутационной нагрузки [Zabolotneva А.А., Zhavoronkov A., Garazha A.V., Roumiantsev S.A., Buzdin A.A. Characteristic patterns of microRNA expression in human bladder cancer // Front. Genet. 2013; 3:31. doi: 10.3389/fgene.2012.00310].

Разработка новых методов лечения этого вида злокачественных новообразований требует необходимости вовлечения клеточных технологий, основанных на получении и применении хорошо охарактеризованных клеточных линий рака мочевого пузыря.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала опухолевых клеточных линий, которые возможно использовать для экспериментальных и клинических целей, а именно для создания противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, применение которых дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, тест-систем и экспериментальных моделей для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия рака мочевого пузыря человека 587 BlCan TVV, экспрессирующая специфические опухолеассоциированные антигены, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 792Д.

Полученная клеточная линия 587 BlCan TVV обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Родословная клеточной линии 587 BlCan TVV представлена следующим образом.

Культура клеток рака мочевого пузыря 587 BlCan TVV приготовлена из образца первичной опухоли - мышечно неинвазивного рака мочевого пузыря больного Т.В.В., 63 г., полученного в результате цистэктомии, осуществленной в специализированном онкологическом медицинском учреждении.

Получение клеточной линии 587 BlCan TVV было осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Для лучшего прикрепления клеток к субстрату использовали 2% раствор желатина, которым предварительно покрывали культуральную посуду. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 40 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 587 BlCan TVV характеризуются следующим образом.

Культура представлена клетками преимущественно полигональной формы с округлыми светлыми ядрами, содержащими 1-2 ядрышка. Цитоплазма имеет ярко выраженную зернистость, концентрирующуюся вокруг ядра. Клетки легко образуют симпласты с характерным рисунком «булыжной мостовой».

Маркерные признаки клеточной линии 587 BlCan TVV следующие.

Методом проточной цитометрии выявлена поверхностная локализация раково-тестикулярного антигена NY-ESO-1 и антигенов семейств MAGE, BAGE, GAGE.

Методом иммуноцитохимии выявлена гиперэксперссия антигена HER-2new.

Методом ПЦР выявлена гиперэксперссия раково-тестикулярного гена MAGEA1.

Культуральные свойства клеточной линии 587 BlCan TVV представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 (80%) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно); 37°С, 5% СO₂, 100% влажность. Для лучшего прикрепления клеток к субстрату используют 2% раствор желатина, которым предварительно покрывают культуральную посуду. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 2×10⁶ клеток. Пересев 1 раз в неделю в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до -70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации 85%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasma pneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 587 BlCan TVV следующая.

46, XY,-9,21p (del(9)(p21) - 67,5% клеток.

42,XY, -9, -15, -16,-17,-19,+mar -29,5% клеток.

Использование клеточной линии 587 BlCan TVV представлено следующими примерами.

Пример 1. Создание клеточных 3D-моделей на основе клеточной линии 587 BlCan TVV.

1. Клеточную линию 587 BlCan TVV культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Клетки 587 BlCan TVV в количестве 500, 1000, 3000 помещали в каплю полной питательной среды (DMEM/F12, 20% FCS, глутамин) объемом 25 мкл, локализующуюся на крышке чашки Петри 35 мм. В саму чашку Петри вносили 0,9% раствор NaCl.

4. Чашки Петри помещали в СO₂ инкубатор (37°С, 100% влажности) на 7 суток. В процессе культивирования на 3-е сутки проводили смену питательной среды в каплях.

5. По окончании культивирования изъятые из капель сфероиды отмывали в однократном растворе PBS, после чего высаживали в ячейки 48-луночного планшета, предварительно покрытого полимеризованным матригелем (100 мкл на лунку), и добавляли 500 мкл питательной среды.

6. Помещали планшеты в автоматическую систему для наблюдения за живыми клетками Cell-IQ (Chip-Man Technologies Ltd, Финляндия) и определяли эффективность образования сфероидов путем подсчета диаметра сфероида и его площади.

7. Произвели следующие измерения: сфероиды, полученные из 500 клеток 587 BlCan TW, имели средний диаметр 302,5±1,63 мкм, среднюю площадь 71734,4±115,66 мкм²; 1000 клеток - средний диаметр 623,4±4,43 мкм, среднюю площадь 266120,0±52,32 мкм²; 3000 клеток - средний диаметр 795,8±12,71 мкм, среднюю площадь 497138,6±55,92 мкм².

Пример 2. Использование клеточной линии 587 BlCan TVV в экспериментальном исследовании миграции и инвазии клеток солидных опухолей.

1. Клеточную линию 587 BlCan TVV культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Высевали клетки линии 587 BlCan TVV в инсерты для 24-луночной планшеты с диаметром пор 8 мкм с/без матригеля (BD Bioscience, США) в количестве 5×10⁴ клеток в мл, по 500 мкл бессывороточной среды на инсерт. В лунки 24-луночной планшеты вносили полную питательную среду DMEM/F12 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки в количестве 750 мкл. Компоненты сыворотки выступали в качестве хемоаттрактантов для культивируемых опухолевых клеток.

4. Инкубировали планшету в течение ночи при стандартных условиях культивирования в СO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

5. После инкубации удаляли из инсертов питательную среду с матригелем и неинвазивными клетками с помощью ватной палочки, смоченной в среде. Повторяли процедуру дважды.

6. Фиксировали клетки, располагающиеся на нижней стороне мембраны с помощью забуференного 3,5% формалина, пермобилизировали с помощью 100% метанола и окрашивали красителем по Гимза.

7. Производили подсчет инвазивных клеток в трех полях зрения, используя объективы микроскопа х40 и х100. Процент клеток с инвазивными свойствами рассчитывали как соотношение количества клеток, мигрировавших через матригель к количеству клеток, мигрировавших без покрытия.

8. Инвазивный потенциал клеток линии 587 BlCan TVV составил 10,5%.

Пример 3. Использование клеточной линии 587 BlCan TVV для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточную линию 587 BlCan TVV культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% СO₂, 100% влажности в СO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СO₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 587 BlCan TVV проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией 587 BlCan TVV в культуры незрелых дендритных клеток пациентов с раком мочевого пузыря на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Икубировали в условиях 37°С, 5% СO₂, 100% влажности в СО₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом.

CD14^-/CD1a^-/7CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺/CD209⁺/CCR7⁺.

Клеточная линия рака мочевого пузыря человека 587 BlCan TVV расширяет арсенал опухолевых клеточных линий, которые возможно использовать для экспериментальных и клинических целей, а именно для создания противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, применение которых дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, тест-систем и экспериментальных моделей для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной линии рака мочевого пузыря человека 587 BlCan TVV. Указанная линия используется для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, экспрессирует опухолеассоциированные антигены NY-ESO-1, MAGEA1, BAGE, GAGE, HER-2new и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 792Д. Изобретение позволяет расширить арсенал клеточных линий опухолей человека. 3 пр.

Клеточная линия рака мочевого пузыря человека 587 BlCan TVV, экспрессирующая опухолеассоциированные антигены NY-ESO-1, MAGEA1, BAGE, GAGE, HER-2new, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 792Д.