КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА 198 BlCan RLA Российский патент 2020 года по МПК A61K35/00 C12N5/09 

Изобретение относится к области биотехнологии и может использоваться в активной специфической иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодно для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия 198 BlCan RLA депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 794Д.

Согласно мировой статистике, рак мочевого пузыря (РМП) занимает четвертое место среди наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин и одиннадцатое место у женщин. Ежегодно по всему миру диагностируется около 400 000 новых случаев этого заболевания [Kamat A.M., М, Huri Е. What is new in non-muscle-invasive bladder cancer in 2016? Turkish Journal of Urology. 2017; 43(1):9-13. doi: 10.5152/tud.2017.60376]. По данным Siegel et al. в США на 79030 новых эпизодов РМП приходится 16870 случаев летального исхода, в структуре онкологических заболеваний в России опухоли мочевого пузыря составляют 2,8% [Siegel R.L., Miller K.D., Jemal A. Cancer Statistics. CA Cancer J Clin. 2017; 67 (1):7-30. doi: 10.3322/саас.21387]. Приблизительно в 75% случаев РМП выявляют поверхностный, неинвазивный гистологический тип опухоли, однако, у половины пациентов с неинвазивным РМП, которым была проведена трансуретральная резекция, регистрируют впоследствии рецидив заболевания, и у 5-25% из этих больных наблюдается прогрессирование до мышечно-инвазивной стадии после повторных рецидивов [Ильницкая А.С., Данилова А.Б., Балдуева И.А. Иммунотерапия на основе дендритных клеток в лечении рака мочевого пузыря. Успехи молекулярной онкологии. - 2018; 5(2): С. 16-23].

РМП можно отнести к одной из наиболее агрессивных форм злокачественных новообразований. Хирургические методы, химиотерапия и лучевая терапия являются стандартом лечения данного вида злокачественных опухолей, однако, их высокая способность к метастазированию и формирование лекарственной устойчивости создают предпосылки для поиска и создания новых терапевтических подходов, тем более что иммуногенность РМП не вызывает сомнений, так как характерной его особенностью является высокий уровень мутационной нагрузки [Zabolotneva А.А., Zhavoronkov A., Garazha A.V., Roumiantsev S.A., Buzdin A.A. Characteristic patterns of microRNA expression in human bladder cancer. Front. Genet. 2013; 3:31.doi: 10.3389/fgene.2012.00310].

Одним из инновационных методов, актуальных в настоящее время для лечения РМП, является иммунотерапия на основе дендритных клеток (ДК). Успешное применение ДК-вакцин для лечения РМП зависит от использования в качестве мишеней соответствующих целевых антигенов и эффективных стратегий иммунизации. Выбор антигенного материала как точки приложения для активации специфического противоопухолевого иммунного ответа в контексте создания ДК-вакцины для лечения РМП, является очень важным моментом [Boegemann М., Aydin A.M., Bagrodia А., Krabbe L.-M. Prospects and progress of immunotherapy for bladder cancer. Expert Opinion on Biological Therapy. 2017, 1-15. doi:10.1080/14712598.2017.1366445]. Несмотря на огромные преимущества использования аутологичного опухолевого материала в качестве антигенов при производстве ДК-вакцин, этот подход технически весьма ограничен, поскольку является трудоемким, дорогостоящим и непригодным для пациентов с низким статусом опухолевой нагрузки. Чтобы преодолеть эти ограничения, в качестве альтернативного источника опухолеассоциированных антигенов (ОАА) могут быть использованы аллогенные опухолевые клетки или опухолевые клеточные линии, полученные из опухолей различных локализаций [Palucka А.K., Ueno Н., Connolly J., Kerneis-Norvell F., Blanck J.P., Johnston D.A., Fay J., Banchereau J. Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells can induce objective clinical responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity. J Immunother. 2006; 29:545-557. DOI: 10.1097/01.cji.0000211309.90621.8b].

Необходимым условием является расширение арсенала хорошо охарактеризованных аллогенных линий малигнизированных клеток, имеющих высокую пролиферативную активность invitro и способных экспрессировать достаточное количество ОАА для нагрузки и активации ДК, так как их возможно стандартизировать и использовать в крупномасштабном производстве противоопухолевых вакцин. Исследования последних лет убедительно показали, что такие ОАА, как раково-тестикулярные антигены присутствуют в клетках многих опухолей и потенцируют противоопухолевый иммунный ответ, что дает основание к разработке универсальных подходов в клеточной иммунотерапии злокачественных новообразований [Taherian-Esfahani Z., Dashti S. Cancer-testis antigens: An update on their roles in cancer immunotherapy. Hum Antibodies. 2019; 27(3): 171-183. doi: 10.3233/НАВ-190366].

Благодаря культивированию опухолевых клеток создаются возможности получать неограниченное количество клеточного материала для любых исследований, это способствует оптимизации количества используемых экспериментальных животных. Существование банков постоянных линий опухолевых клеток дает возможность проводить исследования на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине. Каждая полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума. Происхождение, история и чистота культуры клеток могут быть легко проверены на аутентичность и документированы. Банкирование клеточных линий, предназначенных для целей клинического применения, - это важная стратегическая задача, без решения которой невозможно на сегодняшний день дальнейшее развитие медицинских технологий [Рачинская О.А., Чапленко А.А., Мельников Е.В., Семенова И.С., Олефир Ю.В. Мировая практика хранения клеточных линий, предназначенных для применения в клинических целях. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018; 18(4): 216-224].

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, которые возможно использовать для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, тест-систем и экспериментальных моделей для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия рака мочевого пузыря человека 198 BlCan RLA, экспрессирующая специфические опухолеассоциированные антигены, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 794Д. Полученная клеточная линия 198 BlCan RLA обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Родословная клеточной линии 198 BlCan RLA представлена следующим образом.

Культура клеток рака мочевого пузыря 198 BlCan RLA приготовлена из рецидива мышечно инвазивного рака мочевого пузыря больного Р.Л.А., 53 г., полученного в результате радикальной цистэктомии, осуществленной в специализированном онкологическом медицинском учреждении.

Получение клеточной линии 198 BlCan RLA было осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 40 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 198 BlCan RLA характеризуются следующим образом.

Культура представлена крупными клетками полигональной формы с округлыми ядрами, содержащими 1-2 ядрышка, зернистой цитоплазмой. Клетки формируют ровный монослой с большим количеством митозов.

Маркерные признаки клеточной линии 198 BlCan RLA следующие.

Методом проточной цитометрии выявлена поверхностная локализация раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и семейств MAGE, BAGE, GAGE.

Методом ПЦР выявлена гиперэкспрессия раково-тестикулярных генов NY-ESO-1, MAGEA1, SCP1, PRAME.

Культуральные свойства клеточной линии 198 BlCan RLA представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 (80%) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно); 37°С, 5% CO2, 100% влажность. Для лучшего прикрепления клеток к субстрату рекомендуется использовать 2% раствор желатина, которым предварительно покрыть культуральную посуду. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1,5×10⁶ клеток. Пересев 1 раз в неделю в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации 90%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasma pneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 198 BlCan RLA следующая.

Культура распадается на три основных субклона:

53-55,X,-Y,

t(1;7?),t(1;?),+del(1)(q22)x2,+del(1)(q21),+del(1)(p22),+del(2)(p13),+del(3)(p),-4,+5,del(7)(q11.2),t(7;12)(p;q),+t(9;12),+del(11)(q?),12q+,+t(12;17),t(13;17)(q;p),15p+,+16,+der(16),-17,-18,+19,-21,-22 - 40%

43-46,X,-Y,+del(1)(q)x2,+del(3)(q),-4,-9, del(7)(q),-+t(7:12),-17 - 30%

50,X,-Y,+del(1)(q)x2,+del(3)(q),+5,+t(7;12),del(7)(q),+16, -17,-18,+19 - 20%

Использование клеточной линии 198 BlCan RLA представлено следующими примерами.

Пример 1 Использование клеточной линии 198 BlCan RLA для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточную линию 198 BlCan RLA культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора Версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в CO₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

4. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

5. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 198 BlCan RLA проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до минус 196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

6. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

7. Вносили лизат с клеточной линией 198 BlCan RLA в культуры незрелых дендритных клеток пациентов с раком мочевого пузыря на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии 198 BlCan RLA для оценки пролиферативного и инвазивного потенциала опухолевых клеток.

1. Культивировали клеточную линию 198 BlCan RLA как описано выше. Для оценки пролиферативной активности клетки собирали после пересева, осуществляли подсчет их количества и оценку жизнеспособности и высевали в количестве 5×10⁴ в мл в объеме 200 мкл полной питательной среды DMEM/F12 в планшету Е-16 (ACEA Bioscience Inc., США).

2. Оставляли планшеты на 30 мин. в условиях C_O2-инкубатора для минимизации турбулентных потоков жидкостей. Далее устанавливали планшеты в ячейки прибора xCelligence (ACEA Bioscience Inc., США) и начинали регистрацию электрических сигналов.

3. Для определения инвазивного потенциала опухолевых клеток клеточную линию 198 BlCan RLA высевали в количестве 4×10⁵ в мл в объеме 100 мкл бессывороточной среды DMEM/F12 в верхнюю камеру планшеты CIM-16 (ACEA Bioscience Inc., США), где предварительно был нанесен и заполимеризован слой матригеля (BD Bioscience, США). В нижнюю камеру добавляли полную питательную среду DMEM/F12. Камеры разделены мембраной с диаметром пор 8 мкм.

4. Через 30 мин. после минимизации турбулентных потоков жидкостей устанавливали планшету в ячейки прибора xCelligence (ACEA Bioscience Inc., США) и начинали регистрацию электрических сигналов. Вели наблюдение в течение 72 часов.

5. Получили результаты по пролиферативной активности в виде кривых изменения клеточного индекса (CI), представляющего собой соотношение импеданса в «нулевой» точке к импедансу в данной временной точке.

6. Качество процессов миграции и инвазии с течением времени оценивали по изменению трех параметров: CI, DT (промежуток времени, необходимый для увеличения CI в два раза) и Slope (тангенс угла касательной к точкам кривой CI) в цифровом и графическом выражении.

Изобретение расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов, тест-систем и экспериментальных моделей для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной линии рака мочевого пузыря человека 198 BlCan RLA. Указанная клеточная линия используется для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей, тестирования противоопухолевых препаратов и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 794Д. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 3 н.п. ф-лы, 2 пр.

1. Клеточная линия рака мочевого пузыря человека 198 BlCan RLA, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК(П) 794Д.

2. Применение клеточной линии рака мочевого пузыря человека 198 BlCan RLA для создания экспериментальных моделей.

3. Применение клеточной линии рака мочевого пузыря человека 198 BlCan RLA для тестирования противоопухолевых препаратов.