КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА ПОЧКИ ЧЕЛОВЕКА IBGVAT R 27 Российский патент 2016 года по МПК C12N5/71 

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для клеточных технологий, среди которых создание противоопухолевых вакцин, тестирование активности различных фармацевтических препаратов, разработка диагностических наборов, а также тест-систем для разработки новых лекарственных средств.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В структуре заболеваемости злокачественными заболеваниями в РФ в 2012 году на долю рака почки приходилось около 4% [1]. По статистике приблизительно треть пациентов с раком почки на момент постановки диагноза уже имеют отдаленные метастазы, а среди остальных пациентов приблизительно у половины эти метастазы скорее всего разовьются [2, 3]. К сожалению, метастатический рак почки высоко рефрактерен к традиционным схемам химиотерапии [3], что делает весьма актуальным поиск дополнительных и/или альтернативных методов лечения.

В последние годы много исследований посвящено возможности использования различных иммунологических подходов к терапии онкологических патологий. В основе всех этих подходов лежит идея использования и/или усиления естественных иммунных процессов для борьбы с опухолью. С этой целью исследуются или уже применяются для лечения различные цитокины (например, интерферон-альфа, интерлейкин-6 и др.) [3], моноклональные антитела к опухолевым антигенам для непосредственного блокирования жизнедеятельности опухолевых клеток или направленной доставки к ним противоопухолевых препаратов [4-6]. Кроме того, к иммунотерапевтическим методам лечения относятся аутологичные или аллогенные вакцины [7, 8], принцип действия которых основан на индукции противоопухолевого иммунитета.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-клеточными рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены перед их презентацией, как правило, подвергаются процессингу в контексте молекул гистосовместимости на поверхности клеток [9]. Известно несколько групп антигенов, специфических для опухолевых клеток, например раково/тестикулярные антигены, дифференцировочные антигены и др. Экспрессия таких опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета.

Основная сложность при использовании иммунотерапии для лечения онкологических патологий заключается в ее недостаточной эффективности, часто связанной с существованием механизма ускользания опухоли от иммунологического надзора. Это может быть следствием экспрессии на опухолевых клетках опухолевых антигенов [10, 11] или повышением содержания в организме клеток с ингибиторными свойствами [12]. К последним относятся, в частности, регуляторные клетки (Трег), которые важны для предотвращения чрезмерного активационного ответа на чужеродные воздействия во избежание аутореактивности. Снижение содержания таких клеток часто ассоциировано с аутоиммунными заболеваниями [13, 14], и в таких случаях иммунотерапия может быть направлена на восстановление в организме их количества [15, 16]. В то же время при многих онкологических заболеваниях содержание Трег повышено, они могут формировать толерантность организма к опухолевым клеткам и в таких случаях терапия может быть направлена на снижение их содержания [17, 18].

Вакцинотерапия как способ лечения опухоли направлена на активацию противоопухолевого иммунитета в ответ на дополнительное введение в организм опухолевых антигенов. Особое внимание здесь уделяется цельноклеточным вакцинами, представляющим собой инактивированные облучением аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухольспецифичные антигены, а также снижает риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Показана эффективность такой вакцины в качестве адъювантной терапии для лечения карциномы почки [19].

Разнообразие спектра опухолевых антигенов, включенных в состав противоопухолевой вакцины, позволяет с наибольшей эффективностью индуцировать противоопухолевый иммунитет. Такого разнообразия можно добиться путем правильного подбора клеточных линий для разработки противоопухолевых вакцин. Вакцины, состоящие из нескольких клеточных линий (поливалентные вакцины), содержат широкий спектр опухолевых антигенов и используются как аллогенные. Например, поливалентная вакцина для терапии меланомы [7] состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико-, липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Небольшое количество исследований, связанных с использованием аллогенных вакцин для терапии рака почки, позволяет предполагать их потенциальную эффективность для лечения данной патологии [20, 21].

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии рака почки человека, для которой потенциально возможно использование в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных или генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия IBGVAT R 27 из опухолевого образца рака почки человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Н-152.

Родословная клеточной линии IBGVAT R 27

Линия получена из первичной опухоли пациента с диагнозом рак почки. Материал получен путем удаления первичной опухоли при оперативном вмешательстве (нефроэктомии).

Получение клеточной линии IBGVAT R 27

Опухолевая ткань получена хирургическим путем при нефроэктомии. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 15 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии IBGVAT R 27

IBGVAT R 27 представлена фибробластоподобными клетками, образующими тяжи.

На окрашенных препаратах клеточные элементы веретеновидной формы с обильной слабоэозинофильной гомогенной цитоплазмой. Ядра правильной формы, минимально овоидные, хроматин мелокодисперсный, распределен в ядре равномерно. Немногочисленные клетки содержат два и, реже, более ядра. Фигуры митозов редки. Клетки формируют шториформные пласты без боковых контактов.

Культуральные свойства IBGVAT R 27

Клеточная линия IBGVAT R 27 культивируется в ростовой среде DME/F12 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. В культуральные флаконы объемом 25 см в 7 мл среды засевают 1*10⁵ клеток. Культивирование проводят в CO₂-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. При субкультивировании клетки снимаются с использованием стандартных растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1.

Условия криоконсервапии

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из 80% ростовой среды, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% DMSO. Для хранения замороженного материала используют жидкий азот (температура -196°C). Размораживание быстрое, при 37°C. Клетки разводят в 10 мл ростовой среды и осаждают центрифугированием, осадок ресуспендируют в 5-7 мл ростовой среды и переносят в культуральный флакон 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток IBGVAT R 27 после размораживания составляет 80-90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика IBGVAT R 27

46, Х0, +der(7)t(1;7)(q21; p22), +iso(8q),t(9;10)(p11;p11), -14, -15, der(21)t(15;21),+20 [15]

Примеры использования клеточной линии IBGVAT R 27

Пример 1. Культивирование клеточной линии IBGVAT R27

Фрагмент опухолевой ткани, полученной при нефроэктомии, освобождали от окружающих тканей и помещали в транспортировочный контейнер со стерильной ростовой средой, состоящей из питательной среды DME/F12, содержащей 2,5 мМ L-глутамина, с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС) и антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл и стрептомицин 100 мкг/мл). Опухолевую ткань доставляли в лабораторию в течение одних суток после забора материала.

Образец опухолевой ткани асептически отделяли от соединительной и жировой тканей, а также удаляли некротизированные области. Фрагмент опухоли механически измельчали в ростовой среде на фрагменты величиной 2-3 мм³, после чего ткань диссоциировали смесью ферментов (ДНКаза и коллагеназа I типа) в течение 1-1,5 часов при 37°C. Образовавшуюся клеточную суспензию фильтровали через клеточное сито, центрифугировали в течение 5 мин при 250g, клетки отмывали один раз в бессывороточной среде DME/F12. Осадок клеток ресуспендировали в питательной среде из расчета 2*10⁵ клеток/мл, по 5 мл полученной суспензии помещали в культуральные флаконы 25 см². Клетки культивировали в питательной среде DME/F12, содержащей 2,5 мМ L-глутамина, с добавлением 15% ТЭС, антибиотиков (пенициллин 100 ед./мл и стрептомицин 100 мкг/мл), а также комплекса витаминов и аминокислот. После 15 пассажа была получена стабильно растущая клеточная линия.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность), ed. А.Д. Каприн, В.В. Старинский, and Г.В. Петрова. 2014, Москва: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России.

2. Stewart, S.L., et al., Cancer mortality surveillance-United States, 1990-2000. MMWR Surveill Summ, 2004. 53(3): p. 1-108.

3. Passalacqua, R., et al., Immunotherapy options in metastatic renal cell cancer: where we are arid where we are going. Expert Rev Anticancer Ther, 2006. 6(10): p. 1459-72.

4. Jubb, A.M. and A.L. Harris, Biomarkers to predict the clinical efficacy of bevacizumab in cancer. Lancet Oncol, 2010. 11(12): p. 1172-83.

5. Escudier, В., et al., Bevacizumab plus interferon alfa-2a for treatment of metastatic renal cell carcinoma: a randomised, double-blind phase III trial. Lancet, 2007. 370(9605): p. 2103-11.

6. Тиллиб С.В., et al., Наноантитела для детекции и блокирования биологической активности фактора роста эндотелия сосудов А165 человека. Биохимия, 2012. 77(6): р. 809-817.

7. Morton, D.L., et al., Polyvalent melanoma vaccine improves survival of patients with metastatic melanoma. Ann N Y Acad Sci, 1993. 690: p. 120-34.

8. Larin, S.S., et al., Immunotherapy with autologous tumor cells engineered to secrete Tag7/PGRP, an innate immunity recognition molecule. J Gene Med, 2004. 6(7): p. 798-808.

9. Бережной A.E., et al., Молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы. Вопросы онкологии, 2008. 54(6): р. 669-683.

10. Бережной А.Е., et al., Индукция экспрессии молекулы HLA-E на поверхности опухолевых клеток интерфероном-гамма приводит к защите опухолевых клеток от цитотоксического действия лимфоцитов. Вопросы онкологии, 2009. 55(2): р. 224-229.

11. Бережной А.Е., et al., Анализ экспрессии молекул HLA-E в клетках меланомы человека. Российский биотерапевтический журнал, 2006. 5(3): р. 66-71.

12. Закеева И.Р., et al., Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль в противоопухолевом иммунитете. Вопросы онкологии, 2007. 53(2): р. 140-149.

13. Brusko, T.M., A.L. Putnam, and J.A. Bluestone, Human regulatory T cells: role in autoimmune disease and therapeutic opportunities. Immunol Rev, 2008. 223: p. 371-90.

14. Lyssuk, E.Y., et al., Reduced number and function of CD4+CD25highFoxP3+ regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus. Adv Exp Med Biol, 2007. 601: p. 113-9.

15. Fisson, S., et al., Therapeutic potential of self-antigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells selected in vitro from a polyclonal repertoire. Eur J Immunol, 2006. 36(4): p. 817-27.

16. Быковская C.H. и Е.Ю. Лысюк. Способ обогащения регуляторных CD4+CD25+FOXP3+T-клеток человека ex vivo. Патент на изобретение №2437933, 2011

17. de Rezende, L.C., et al., Regulatory T cell as a target for cancer therapy. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2010. 58(3): p. 179-90.

18. Dannull, J., et al., Enhancement of vaccine-mediated antitumor immunity in cancer patients after depletion of regulatory T cells. J Clin Invest, 2005. 115(12): p. 3623-33.

19. Jocham, D., et al., Adjuvant autologous renal tumour cell vaccine and risk of tumour progression in patients with renal-cell carcinoma after radical nephrectomy: phase III, randomised controlled trial. Lancet, 2004. 363(9409): p. 594-9.

20. Kugler, A., et al., Autologous and allogenic hybrid cell vaccine in patients with metastatic renal cell carcinoma. Br J Urol, 1998. 82(4): p. 487-93.

21. Hu, Z., et al., Anti-tumor effects of fusion vaccine prepared by renal cell carcinoma 786-O cell line and peripheral blood dendritic cells of healthy volunteers in vitro and in human immune reconstituted SCID mice. Cell Immunol, 2010. 262(2): p. 112-9.

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия рака почки человека IBGVAT R 27 обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Линия клеток может использоваться, например, для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных или генноинженерных), тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств. Клеточная линия депонирована во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером Н-152. 1 пр.

Клеточная линия рака почки человека IBGVAT R 27, используемая для тестирования противоопухолевых препаратов, хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Н-152.