КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА 398 BlCan KAE Российский патент 2021 года по МПК C12N5/00 C12N5/09 

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия рака мочевого пузыря 398 BlCan КАЕ обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в активной специфической иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 795Д.

Рак мочевого пузыря (РМП) занимает девятое место среди наиболее часто диагностируемых раковых заболеваний в мире и 13-е место по уровню смертности. В 2018 году в России зарегистрировано 13479 больных с установленным впервые в жизни диагнозом РМП и умерло 4846 пациентов. В период с 2008 по 2018 г. отмечен прирост заболеваемости на 31,46%, среднегодовой прирост при этом составляет 2,68% [Злокачественные новообразования в России в 2018 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2019. - 250 с].

Патология мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря может варьировать от низкой до высокой степени злокачественности с поражениями in situ, поверхностными опухолями или инвазией lamina propria, каждая с различными исходами заболевания. У 50-90% пациентов, как правило, развивается рецидив, и у трети пациентов заболевание прогрессирует, что требует точной стратификации риска [Scarpato K.R., Tyson M.D., Clark Р.Е. Natural biology and management of nonmuscle in vasivebladder cancer // Curr Opin Oncol. - 2016. - Vol. 28(3):210-5. doi: 10.1097/CCO.0000000000000278].

В настоящее время тактика лечения уротелиальной карциномы претерпевает серьезные изменения. Немаловажную роль в этом процессе играют исследования по поиску потенциальных молекулярных биомаркеров, использование которых открывает потенциальные возможности для улучшения понимания биологии РМП, что, в свою очередь, может помочь выявить заболевание на более раннем этапе, стратифицировать риск пациентов, улучшить прогнозирование результатов и помочь при целевой терапии. Здесь важная роль отводится использованию доклинических моделей РМП, базирующихся на применении клеточных линий. Для дальнейшего развития и надлежащего применения терапевтических стратегий необходимо изучение новых молекулярных подтипов и получение соответствующих новых клеточных линий РМП, которые являются полезными инструментами для изучения биологии этой опухоли [Soria F., Krabbe L.M., Todenhofer Т., Dobruch J., Mitra A.P., Inman B.A., Gust K.M., Lotan Y., Shariat S.F. Molecular markers in bladder cancer // World J Urol. - 2019. - Vol. 37(1):31-40. doi: 10.1007/s00345-018-2503-4].

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий опухолей человека, которые возможно использовать для создания клеточных модельных систем, позволяющих проводить доклинические исследования на идентичном биологическом материале, и создание новых противоопухолевых биомедицинских клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия рака мочевого пузыря человека 398 BlCan КАЕ, экспрессирующая специфические опухолеассоциированные антигены, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, которая хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 795Д.

Полученная клеточная линия 398 BlCan КАЕ обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Родословная клеточной линии 398 BlCan КАЕ представлена следующим образом.

Культура клеток рака мочевого пузыря 398 BlCan КАЕ выделена из первичной опухоли - мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря lowgrade больного К.А.Е., 44 г., полученного в результате радикальной цистэктомии, осуществленной в специализированном онкологическом медицинском учреждении.

Получение клеточной линии 398 BlCan КАЕ было осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 25 пассаже. Морфологические признаки клеточной линии 398 BlCan КАЕ характеризуются следующим образом.

Культура представлена мелкими клетками полигональной формы с округлыми ядрами, содержащими 1-2 ядрышка, зернистой цитоплазмой. Клетки формируют ровный монослой с большим количеством митозов. Встречаются крупные многоядерные клетки.

Маркерные признаки клеточной линии 398 BlCan КАЕ следующие.

Методом проточной цитометрии выявлена поверхностная локализация раково-тестикулярных антигенов NY-ESO-1 и семейства GAGE.

Методом ПЦР выявлена гиперэкспрессия раково-тестикулярных генов NY-ESO-1, MAGEA1, SEMG1, PRAME.

Культуральные свойства клеточной линии 398 BlCan КАЕ представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 (80%) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно); 37°С, 5% СO₂, 100% влажность. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Для лучшего прикрепления клеток к субстрату рекомендуется использовать 2% раствор желатина, которым предварительно покрыть культуральную посуду. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1,5×10⁶ клеток. Пересев 1 раз в неделю в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до -70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации 90%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПНР были проведены исследования на наличие Mycoplasma pneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 398 BlCan КАЕ следующая.

Модальный кариотип:

55,XY,t(1;1),del(1)(q23),+del(1)(q21),+del(1)(ql2),+2,+3,del(3)(p),t(1;4),+4,+4,+6,+6,t(5;6),

del(7)(q),-10,t(7;11),+t(11;19(?)),-12,-13,-14,15(p+),+t(15;?),+16,-18,+20,21(q+),

-22,+mar 1,+mar2,+mar3

Использование клеточной линии 398 BlCan КАЕ представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 398 BlCan КАЕ для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточную линию 398 BlCan КАЕ культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.

2. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

3. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия при 1000 об/мин в течение 10 мин.

4. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

5. Для приготовления опухолевого лизата клеток линии 398 BlCan КАЕ проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трепанового синего и светового микроскопа.

6. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

7. Вносили лизат с клеточной линией 398 BlCan КАЕ в культуры незрелых дендритных клеток пациентов (CD14-CD1a+CD83-) на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% СO₂, 100% влажности в СО₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.

8. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом

CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺/CD209⁺/CCR7⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии 398 BlCan КАЕ в экспериментальном исследовании миграции и инвазии клеток РМП.

1. Клеточную линию 398 BlCan КАЕ культивировали как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Высевали клетки линии 398 BlCan КАЕ в инсерты для 24-луночной планшеты с диаметром пор 8 мкм с/без матригеля (BD Bioscience, США) в количестве 5×10⁴ клеток в мл, по 500 мкл бессывороточной среды на инсерт. В лунки 24-луночной планшеты вносили полную питательную среду DMEM/F12 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки в количестве 750 мкл. Компоненты сыворотки выступали в качестве хемоаттрактантов для культивируемых опухолевых клеток.

4. Инкубировали планшету в течение ночи при стандартных условиях культивирования в СO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

5. После инкубации удаляли из инсертов питательную среду с матригелем и неинвазивными клетками с помощью ватной палочки, смоченной в среде. Повторяли процедуру дважды.

6. Фиксировали клетки, располагающиеся на нижней стороне мембраны с помощью забуференного 3,5% формалина, пермобилизировали с помощью 100% метанола и окрашивали красителем по Гимза.

7. Производили подсчет инвазивных клеток в трех полях зрения, используя объективы микроскопа х40 и х100. Процент клеток с инвазивными свойствами рассчитывали как соотношение количества клеток мигрировавших через матригель к количеству клеток, мигрировавших без покрытия, умноженному на 100.

8. Инвазивный потенциал клеток линии 398 BlCan КАЕ составил 42,6%.

Новая клеточная линия рака мочевого пузыря человека 398 BlCan КАЕ расширяет арсенал клеточных линий опухолей человека, которые возможно использовать для создания клеточных модельных систем, позволяющих проводить доклинические исследования на идентичном биологическом материале, позволяет создавать новые противоопухолевых биомедицинские клеточные продукты, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной линии рака мочевого пузыря человека 398 BlCan КАЕ. Указанная линия используется для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, экспрессирует раково-тестикулярные антигены NY-ESO-1, GAGE, MAGEA1, SEMG1, PRAME и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 795Д. Изобретение позволяет расширить арсенал клеточных линий опухолей человека. 2 пр.

Клеточная линия рака мочевого пузыря человека 398 BlCan КАЕ, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, создания экспериментальных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, экспрессирует раково-тестикулярные антигены NY-ESO-1, GAGE, MAGEA1, SEMG1, PRAME и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 795Д.