КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ СИНОВИАЛЬНОЙ САРКОМЫ ЧЕЛОВЕКА 716 SS MNV Российский патент 2021 года по МПК C12N15/07 

Изобретение относится к области биотехнологии. Полученная новая клеточная линия синовиальной саркомы человека 716 SS MNV обладает стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в клеточной иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 790Д.

Среди сарком мягких тканей (СМТ) синовиальная саркома (СС) составляет 5-10% случаев и вместе со злокачественной фиброзной гистиоцитомой (28%), липосаркомой (15%) и лейомиосаркомой (12%) образует группу наиболее распространенных СМТ среди взрослого населения. По частоте заболеваемости среди детей и подростков СС уступает лишь рабдомиосаркоме и составляет 10-20% [Hoang N.T., Acevedo L.A., Mann M.J., Tolani В. Areviewofsoft-tissuesarcomas: translation of biological advances into treatmen tmeasures // Cancer Manag Res. - 2018. - May 10; 10: 1089-1114. doi: 10.2147/CMAR.S 159641].

Локализация СС в мягких тканях конечностей достигает 80%, в меньшей степени эти опухоли встречаются в области головы и шеи, туловища, забрюшинном пространстве. Точные причины развития синовиальной саркомы на сегодняшний день не установлены. Предполагают, что существуют определенные факторы риска, способные приводить к возникновению патологии, среди которых выделяют изменения на генетическом уровне, радиационное воздействие и канцерогенное влияние на организм человека. В 50% случаев у пациентов наблюдается метастатическое заболевание, при этом у 74%-81% больных обнаруживают метастазы в легких [Sultan I., Rodriguez-Galindo С., Saab R., Yasir S., Casanova M., Ferrari A. Comparing children and adults with synovial sarcoma in the Surveillance, Epidemiology, and End Results program, 1983 to 2005: an analysis of 1268 patients // Cancer. - 2009. - Vol. 115: 3537-3547. doi: 10.1002/cncr.24424].

Учитывая гистологическое разнообразие СМТ, их редкость и генетическую неоднородность, лечение этих злокачественных новообразований довольно сложное. Тем не менее в настоящее время уже есть много протоколов успешного применения инновационных лекарств для лечения СМТ, в том числе СС. Этот недавний прогресс в разработке новых противораковых препаратов предполагает улучшение клинической эффективности терапии пациентов с саркомами в ближайшем будущем. Но в тоже время, поскольку уровень успешности разработки лекарств в онкологии в целом остается низким, а количество больных СМТ, которые могут быть включены в клинические испытания, ограничено низкой частотой встречаемости этих заболеваний, важно проводить доклинические исследования для оценки пригодности потенциальных противораковых препаратов, особенно для таких редких злокачественных новообразований, как саркомы [Hattori Е., Oyama R., Kondo Т. Systematic review of the current status of human sarcoma cell lines // Cells. - 2019. - Feb 13; 8(2). pii: E157. doi: 10.3390/cells8020157].

Преимущества клеточных линий перед другими моделями для доклинических исследований очевидны. Использование стабильно пролиферирующих клеточных линий позволяет наращивать значительное количество идентичного клеточного материала, что дает возможность проводить изучение механизмов функционирования генов или эффективности действия лекарственных препаратов со значительной воспроизводимостью, при этом возможна интеграция результатов исследований, выполняемых в разных лабораториях. Использование клеточных линий позволяет также проводить скрининг библиотек химических соединений и прогнозировать результат лечения. Кроме того, клеточные линии необходимы для выявления биомаркеров, где необходимой частью работы является функциональная оценка кандидатов в биомаркеры для последующего проведения многоцентровых валидационных исследований и изучение биологических свойств потенциальных биомаркеров. [Teicher В.А., Polley Е., Kunkel М., Evans D., Silvers Т., Delosh R., Laudeman J., Ogle C., Reinhart R., Selby M., et al. Sarcoma Cell Line Screen of Oncology Drugs and Investigational Agents Identifies Patterns Associated with Gene and microRNA Expression // Mol. Cancer Ther. - 2015. - Vol. 14:2452-2462. doi: 10.1158/1535-7163.МСТ-15-0074].

Получение клеточных линий сарком человека представляет значительные трудности, и количество подобных клеточных линий ограничено в мировом научном сообществе. Отсутствие соответствующих клеточных линий затрудняет проведение фундаментальных исследований и разработку эффективных методов лечения СМТ [Barretina J., Caponigro G., Stransky N., Venkatesan K. et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity // Nature. - 2012. - Mar 28; 483(7391): 603-607. doi: 10.1038/naturel 1003]. Из 844 клеточных линий сарком, зарегистрированных в базе данных Cellosaurus, только 148 доступны как объект исследования, многие гистологические подтипы сарком вообще не представлены. Поэтому перед мировым научным сообществом стоит задача получения и характеристики новых клеточных линий сарком мягких тканей различных гистологических подтипов, которые можно было бы использовать в клеточных модельных системах для исследования.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии монофазной синовиальной саркомы человека, которую потенциально возможно использовать как клеточную модель для изучения молекулярных основ канцерогенеза и разработки новых инновационных методов лечения этого вида злокачественного новообразования.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении синовиальной саркомы. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия 716 SS MNV из опухолевого образца метастатической монофазной синовиальной саркомы человека, экспрессирующая специфические антигены. Полученная клеточная линия 716 SS MNV обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками и хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 790Д. Клеточная линия выделена из метастаза монофазной синовиальной саркомы в толстой кишке больной М.Н.В., 48 л., проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования.

Получение клеточной линии 716 SS MNV осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм²) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30 с - 1 мин. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 32 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 716 SS MNV характеризуются следующим образом.

Культура представлена клетками вытянутой или полигональной формы, содержащими крупные овальные вытянутые ядра, насчитывающие до 4-5 ядрышек. В цитоплазме наблюдаются волокнистые структуры, дающие положительную иммунохимическую реакцию на кальпонин. В 38,1% клеток выявляется маркер пролиферации Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии 716 SS MNV следующие.

Методом проточной цитометрии определена слабая поверхностная экспрессия антигена HLA А/В/С - 38,0%; экспрессия HLA DQ/DP/DR отсутствует.

Методом проточной цитометрии выявлено присутствие раково-тестикулярных антигенов MAGE, BAGE, GAGE и NY-ESO-1.

Методом ПЦР выявлена гиперэкспрессия раково-тестикулярного гена PRAME.

Культуральные свойства клеточной линии 716 SS MNV представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% CO₂, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 2×10⁶ клеток. Пересев 1 раз в неделю в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до -70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 87%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasma pneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 716 SS MNV следующая.

Культура распадается на четыре основных субклона:

46,X,t(X;18)(р11;q11) - 72,2%

46,X,t(X;18)(p11;q11),del(6)(q23) - 16,6%

Использование клеточной линии 716 SS MNV представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 716 SS MNV для приготовления клеточного лизата, используемого для активации in vitro дендритных клеток больного синовиальной саркомой.

1. Клеточную линию 716 SS MNV культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в CO₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 716 SS MNV проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трепанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией 716 SS MNV в культуры незрелых дендритных клеток пациента с синовиальной саркомой на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺/CD209⁺/CCR7⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии 716 SS MNV для создания модельной системы, позволяющей оценить специфическую противоопухолевую активность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ).

1. Клеточную линию 716 SS MNV культивировали, как описано выше. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с субстрата с помощью равновесной смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена.

2. Клетки отмывали дважды в полной культуральной среде, производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

3. Заблаговременно получали культуру специфически активированных ЦТЛ. Для этого мононуклеарные клетки периферической крови пациентов выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности «Ficoll-Paque Premium» «GE Healthcare» (Великобритания) методом Boyum. Производили разделение моноцитов (CD14⁺) и лимфоцитов (CD3⁺) методом адгезии на пластике. Моноциты культивировали в питательной среде CellGro DC в присутствии GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (15 нг/мл) (Cell Genix, ФРГ), которые добавляли в 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования. На 7-е сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены, исходя из соотношения 1 ДК / 3 лизированные клетки меланомы кожи, ростовые факторы - GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (15 нг/мл) (CellGenix, ФРГ) и TNF-α (20 нг/мл) (BD Bioscience, США). Через 48 часов ДК собирали, осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10% альбумина человека, производили подсчет и оценку жизнеспособности с помощью 0,4% трепанового синего в автоматическом счетчике клеток «Countess».

4. Фракцию лимфоцитов кокультивировали со зрелыми ДК в присутствии цитокинов GM-CSF (72 нг/мл), IL-4 (15 нг/мл), (Cell Genix, ФРГ), IL-2 (50 МЕ/мл), IL-7 (10 нг/мл), TNF-α (20 нг/мл) (BD Bioscience, США) в течение 7 дней, добавляя цитокины каждые 48 часов. Процедуру повторяли дважды.

5. Полученную суспензию лимфоцитов анализировали методом проточной цитофлуорометрии. Выделение антиген-специфических CD8⁺ЦТЛ производили методом негативной магнитной сепарации с использованием прибора EasySep™ Magnet. CD8⁺ЦТЛ выделяли из клеточной суспензии с помощью набора EasySep™ Human CD8⁺ Т Cell Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc., Канада).

6. Для оценки эффективности взаимодействия активированных ЦТЛ с клетками линии 716 SS MNV в клеточном анализаторе xCelligence клетки опухолевой линии 716 SS MNV высевали предварительно в количестве 2×10⁴ на лунку в Е-16 Plate (ACEA Bioscience., USA).

7. Оставляли планшеты в условиях CO₂-инкубатора на 30 мин. для минимизации турбулентных потоков жидкости, затем вносили в систему активированные ЦТЛ в соотношении 1 опух. кл./50 лимфоцитов и помещали планшеты в ячейки прибора, где осуществляли регистрацию электрических сигналов в течение 48 часов.

8. Вычисляли процент клеточного лизиса в процессе взаимодействия Т-лимфоцитов и клеток линии 716 SS MNV следующим образом:

(CI_{опух кл}-CI_{опух кл+ЦТЛ})/CI_{опух кл}×100, где:

CI - клеточный индекс, представляющий собой изменение электрического импеданса относительно контрольных лунок, не содержащих клеток.

9. Процент лизиса клеток линии 716 SS MNV через 10 часов наблюдения составил 52%, через 25 ч - 91% и через 40 ч достиг 100%.

Новая клеточная линия 716 SS MNV позволяет расширить арсенал клеточных линий, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении синовиальной саркомы, может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно к получению клеточных линий, используемых для клеточных технологий в медицине. Полученная новая клеточная линия синовиальной саркомы человека 716 SS MNV обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 790Д. Клеточная линия характеризуется экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса, экспрессией раково-тестикулярных антигенов MAGE, BAGE, GAGE, NY-ESO-1, PRAME, используемых для создания биомедицинских противоопухолевых клеточных продуктов, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении синовиальной саркомы. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств. Может использоваться для создания биомедицинских клеточных продуктов, клеточных моделей, для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем с целью разработки новых терапевтических подходов и лекарственных средств.

Клеточная линия синовиальной саркомы человека 716 SS MNV, используемая для создания биомедицинских клеточных продуктов, клеточных моделей и тестирования противоопухолевых препаратов, депонированная в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 790Д.