СПОСОБ И СИСТЕМА ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ ХРОМОСОМ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ МИШЕНЬ-СПЕЦИФИЧНЫХ ДНК-ЗОНДОВ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам и системам для профилирования отдельных хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов в биологических образцах. В частности, способы и системы, раскрытые в настоящем описании, относятся к созданию профилей хромосом либо по отдельности, либо в комбинации (мультиплекс). Более конкретно, способы и системы, раскрытые в настоящем описании, относятся к созданию профилей хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов для различных биологических образцов, таких как внеклеточная ДНК из периферической крови беременной женщины или больного раком; способы и системы дополнительно включают создание профилей хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов для отдельных интактных клеток из периферической крови беременной женщины, больного раком или из эмбриона, полученного с применением искусственных репродуктивных технологий, таких как оплодотворение in vitro.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кариотип идентифицирует статус хромосом эмбриона в диагностическом образце от беременной женщины, полученном из амниотической жидкости или ворсин хориона. Из-за рисков, присущих таким инвазивным процедурам, в последнее время большое внимание уделяется неинвазивным способам скрининга, использующим внеклеточную ДНК эмбриона из материнской крови. Однако указанные способы не позволяют идентифицировать сбалансированные перестройки в кариотипе. Сбалансированные перестройки de novo связаны с повышением риска различных пороков развития плода, врожденных или проявляющихся на более поздней стадии развития. Другой тип сбалансированной перестройки, а именно, Робертсоновские транслокации, которые затрагивают акроцентрические хромосомы, связаны с повышением риска рецидива трисомии.

Кариотип также играет важную роль в диагностике и прогнозировании многих солидных злокачественных новообразований (опухолей). Однако получение хороших кариотипов из солидных опухолей часто является затруднительным из-за неудачных попыток их культивирования. Поэтому, как и в пренатальной диагностике, многие усилия сосредоточены на неинвазивных способах. Применяя внеклеточную циркулирующую ДНК опухоли, различные исследователи разработали целенаправленные стратегии для оценки мутационного статуса определенного гена. Однако на практике первичное происхождение опухоли является неизвестным и, следовательно, целенаправленные исследования дают ограниченную информацию. Это становится критичным для раннего выявления рака. Кроме того, некоторые опухоли характеризуются специфичной сбалансированной транслокацией, которая является диагностической и может быть обнаружена только в интактных клетках.

Как в пренатальной диагностике, так и в диагностике рака, сходные попытки получить генетическую информацию также осуществляют на свободно циркулирующих интактных клетках. Количество свободно циркулирующих эмбриональных или опухолевых клеток чрезвычайно мало, и нередко в нескольких миллилитрах цельной крови присутствуют одна или две клетки. Таким образом, получение полного кариотипа путем профилирования всех 24 хромосом из одной клетки или нескольких клеток будет чрезвычайно эффективным.

Существующие системы не позволяют выявлять сбалансированные транслокации, которые являются диагностическими для всех злокачественных новообразований. Они также не могут выявлять Робертсоновские транслокации, которые имеют решающее значение для генетического консультирования и оценки рисков для беременных женщин.

Основными недостатками существующих систем с применением внеклеточной ДНК и интактных клеток являются: 1) более длительный ТАТ; 2) более высокая стоимость; 3) ограниченное выявление анеуплоидии; 4) варьирование чувствительности способов детекции различных хромосомных анеуплоидий; и 5) высокая стоимость инфраструктуры.

Настоящее изобретение представляет собой усовершенствование существующих технологий, поскольку оно позволяет получать информацию о целом геноме с помощью специально разработанных флуоресцентных кубов с различающимися спектральными характеристиками возбуждения и испускания флуорофоров, прикрепленных к мишень-специфичным ДНК-зондам. Дополнительно, применяя функцию «слои» в стандартных программах, таких как Adobe Photoshop, можно «вытащить» требуемую информацию о мишени. Даже, когда несколько мишеней перекрываются друг с другом в интерфазной клетке, выборочно «вызывая» (отыскивая) заданные конфигурации отдельных мишеней, можно проследить целую хромосому в клетке. Это обеспечит возможность распознавания различных аномалий.

Настоящее изобретение решает проблему необходимости проведения массового параллельного секвенирования и других трудоемких способов тестирования генома для выявления анеуплоидии эмбриона по крови матери и других хромосомных аномалий по периферической крови больного раком, путем профилирования выбранных мишеней на отдельных хромосомах, присутствующих во внеклеточной ДНК.

Следовательно, существует потребность в новом и улучшенном способе и системе для профилирования хромосом по отдельности или в мультиплексном режиме. В этом отношении, настоящее изобретение, по существу, удовлетворяет эту потребность. В этом отношении, способ и система согласно настоящему изобретению существенно отличаются от традиционных концепций и разработок предшествующего уровня техники и при этом предлагают инструмент, разработанный главным образом для целей профилирования хромосом для различных биологических образцов с применением мишень-специфичных ДНК-зондов.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ввиду вышеизложенных недостатков, присущих известным типам генетических методов для выявления различных хромосомных аномалий, существующих в настоящее время в предшествующем уровне техники, настоящее изобретение предлагает улучшенный способ и систему для профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов для различных биологических образцов и преодолевает вышеуказанные проблемы и недостатки предшествующего уровня техники. Таким образом, общей целью настоящего изобретения, которое будет описано далее более подробно, является создание нового и усовершенствованного способа и системы для профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов для различных биологических образцов, имеющего все преимущества предшествующего уровня техники, упомянутые ранее, и много новых характеристик, определяющих способ и систему для профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, который не является очевидным, следует из, предлагается, или даже предполагается на основании источников из уровня техники, взятый как по-отдельности, так и в любой комбинации.

Для достижения этого, настоящее изобретение по существу включает, в одном аспекте, способ для профилирования отдельных хромосом с применением внеклеточной ДНК из биологических образцов. Способ включает стадии:

Забора и транспортировки 10-20 мл периферической крови с применением пробирки для сбора крови с внеклеточной ДНК, например, с применением пробирки для сбора крови, предоставленной компанией Streck Inc.;

Экстракции ДНК плазмы с применением протокола ТНР;

Проведения в течение ночи амплификации целого генома с лигированием тупых концов фрагментов внеклеточной ДНК;

Проведения мечения 5'-концов биотином;

Осаждения фрагментов ДНК этанолом;

Инкубирования гранул Strepavidin Dynabeads и фрагментов ДНК, меченных биотином, в 96-луночном планшете с буфером BHW или без него;

Прикладывания магнита, отмывания несвязанной ДНК;

Удаления магнита, проведения гибридизации с мишень-специфичными ДНК-зондами со специфичными флуорофорами для каждой отдельной хромосомы;

Прикладывания магнита, отмывания избыточного зонда с буфером BHW или без него;

Элюирования с NaOH и с буфером или без него из бумаги Gills;

Прикладывания магнита, переноса элюата в новый 96-луночный планшет;

Добавления отрицательно заряженных частиц серебра и спермина;

Инкубирования при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте;

Снятия показаний для всех флуорофоров для каждой отдельной хромосомы из каждой лунки 96-луночного планшета с помощью флюориметра;

Построения кривых испускания для каждой конкретной мишени на каждой хромосоме; а также

Сравнения значений с построенными нормальными кривыми для соответствующих мишеней на всех хромосомах.

Согласно другому аспекту, способ дополнительно включает профилирование хромосом на интактных клетках, выделенных, извлеченных или экстрагированных из биологических образцов. Способ содержит стадии:

Фиксации интактной клетки (клеток) на многокамерных слайдах;

Генерирования мишень-специфичных ДНК-зондов;

Проведения FISH гибридизаций для всех мишеней в одной реакции;

Проведения FISH гибридизаций для мишеней на шести хромосомах одновременно;

Повторения гибридизации на интактных клетках многократно при необходимости;

Получения изображений гибридизованных мишеней с применением специально разработанных флуоресцентных кубов;

Анализа каждой мишени и назначения ее заранее определенного номера; а также

Завершения профилирования хромосом на основе паттернов гибридизации.

Согласно некоторым вариантам реализации, флуоресцентным красителем, прикрепленным к последовательностям ДНК, который окрашивает мишень-специфичный ДНК-зонд, может быть флуоресцеин 12 dUTP.

Согласно некоторым вариантам реализации, флуоресцентным красителем, прикрепленным к последовательностям ДНК, который окрашивает мишень-специфичный ДНК-зонд, может быть Cyanin 55345 dUTP.

Согласно некоторым вариантам реализации, флуоресцентным красителем, прикрепленным к последовательностям ДНК, который окрашивает мишень-специфичный ДНК-зонд, может быть Cyanin 65455 dUTP.

Согласно некоторым вариантам реализации, флуоресцентным красителем, прикрепленным к последовательностям ДНК, который окрашивает мишень-специфичный ДНК-зонд, может быть 594 dUTP.

Согласно некоторым вариантам реализации, флуоресцентным красителем, прикрепленным к последовательностям ДНК, который окрашивает мишень-специфичный ДНК-зонд, может быть любой флуорофор с характеристиками возбуждения и испускания в диапазоне от 200 до 1000 нм.

Согласно некоторым вариантам реализации, флуоресцентным красителем, прикрепленным к последовательностям ДНК, который окрашивает мишень-специфичный ДНК-зонд, может быть комбинация любого из флуорофоров с характеристиками возбуждения и испускания в диапазоне от 200 до 1000 нм.

Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточная ДНК может происходить из периферической крови беременной женщины.

Согласно некоторым вариантам реализации, внеклеточная ДНК может происходить из периферической крови больного раком.

Согласно некоторым вариантам реализации, интактная клетка (клетки) может происходить из периферической крови больного раком.

Согласно некоторым вариантам реализации, интактная клетка (клетки) может происходить из периферической крови беременной женщины.

Согласно некоторым вариантам реализации, интактная клетка (клетки) может происходить из трофэктодермы эмбриона, полученного с помощью искусственных репродуктивных технологий, таких как оплодотворение in vitro.

Согласно еще одному аспекту, полный кариотип может быть создан путем объединения профилей всех отдельных хромосом, полученных из биологического образца.

Таким образом, в общих чертах были охарактеризованы наиболее важные признаки изобретения, чтобы их подробное описание, которое следует далее, могло быть лучше понято, и чтобы можно было лучше оценить настоящий вклад в область техники.

Многочисленные цели, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники при чтении следующего подробного описания раскрытых в настоящей заявке, но тем не менее иллюстративных вариантов реализации настоящего изобретения, в совокупности с сопровождающими чертежами. В этой связи, перед подробным разъяснением настоящего варианта реализации изобретения, следует указать, что нужно понимать, что изобретение не ограничено его применением для деталей конструкции и расположением компонентов, изложенных в нижеследующем описании или проиллюстрированных на графических материалах. Возможны другие варианты реализации настоящего изобретения, и изобретение может быть реализовано на практике и осуществлено различными путями. Кроме того, следует понимать, что фразеология и терминология, используемые в настоящем описании, предназначены для описания и не должны рассматриваться как ограничивающие.

Таким образом, специалистам в данной области будет понятно, что концепция, на которой основано это изобретение, может быть легко использована в качестве основы для разработки других структур, способов и систем для осуществления нескольких целей настоящего изобретения. Поэтому важно, чтобы формула изобретения рассматривалась как включающая такие эквивалентные конструкции, в той мере, в какой они не отступают от сущности и объема настоящего изобретения.

Поэтому, целью настоящего изобретения является создание нового и усовершенствованного способа и системы для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, которые имеют все преимущества предшествующего уровня техники и ни одного из недостатков.

Другой целью настоящего изобретения является создание нового и усовершенствованного способа и системы для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, которые можно легко и эффективно производить и продавать.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового и усовершенствованного способа и системы для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, который имеет низкую стоимость производства в отношении как материалов, так и рабочей силы, и который соответственно допускает низкую цену продажи потребителю, тем самым делая указанный способ и систему для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, экономически доступными покупателю.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание нового способа и системы для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, который обеспечивает в инструментах и способах предшествующего уровня техники некоторые из его преимуществ, одновременно преодолевая некоторые из недостатков, обычно связанные с ним.

Данные цели вместе с другими целями изобретения, а также вместе с различными признаками новизны, которые характеризуют изобретение, указаны конкретно в формуле изобретения, приложенной к настоящему описанию и составляющей часть настоящего описания. Для лучшего понимания изобретения, его эксплуатационных преимуществ и конкретных целей, достигаемых за счет его применения, следует сослаться на прилагаемые графические материалы и их описание, в которых проиллюстрированы варианты реализации изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Настоящее изобретение будет лучше понято, и цели, отличные от описанных выше, станут очевидными, когда будет рассмотрено следующее подробное описание указанного изобретения. Такое описание ссылается на прилагаемые графические материалы, где:

На Фиг. 1 показаны примерные варианты реализации, демонстрирующие, что мишень-специфичные ДНК-зонды с определенными флуорофорами DEAC, FITC, Су3, CY5, Red могут быть использованы для создания профилей хромосом.

На Фиг. 2 показан профиль нормальной хромосомы 1, показывающий все мишени с их соответствующими флуорофорами и соответствующими интенсивностями.

На Фиг. 3-8 показаны примерные варианты реализации, демонстрирующие аномальные профили хромосомы 1.

На Фиг. 3 показан профиль аномальной хромосомы 1, иллюстрирующий трисомию.

На Фиг. 4 показан профиль аномальной хромосомы 1, иллюстрирующий моносомию.

На Фиг. 5 показан профиль аномальной хромосомы 1, иллюстрирующий несбалансированную транслокацию с «чистой» дупликацией короткого плеча.

На Фиг. 6 изображен профиль аномальной хромосомы 1, иллюстрирующий делецию концевого участка короткого плеча.

На Фиг. 7 изображен профиль аномальной хромосомы 1, иллюстрирующий делецию концевого участка длинного плеча.

На Фиг. 8 показан профиль аномальной хромосомы 1, иллюстрирующий изохромосому по длинному плечу с «чистой» дупликацией длинного плеча и делецией короткого плеча.

На Фиг. 9 изображены карты мишеней основанные на паттернах сигналов гибридизации in situ всех 70 мишеней, иллюстрирующие профилирование всех 24 хромосом в интактной клетке, дополнительно демонстрирующие транслокацию.

На Фиг. 10 показаны примерные варианты реализации, демонстрирующие, что мишень-специфичные ДНК-зонды с определенной комбинацией флуорофоров могут быть применены для генерации профилей хромосом и детекции аномалий, как в данном случае транслокации между хромосомами 12 и 21.

На Фиг. 11 изображена схема цветов флуорофоров а) Мультиплексное Профилирование хромосом 1, Y, 13 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов b) Мультиплексное Профилирование хромосом X, 18, 21 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов с) Мультиплексное Профилирование хромосом 2, 6, 22 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов d) Мультиплексное Профилирование хромосом 3, 7, 20 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов е) Мультиплексное Профилирование хромосом 4, 19, 14 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов f) Мультиплексное Профилирование хромосом 5, 8, 17 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов g) Мультиплексное Профилирование хромосом 9, 16, 12 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов h) Мультиплексное Профилирование хромосом 10, 11, 15 с применением мишень-специфичных ДНК-зондов.

На Фиг. 12А изображено мультиплексное профилирование хромосом 1, Y, 13, иллюстрирующее трисомию 13 и сбалансированную транслокацию, включающую длинное плечо хромосомы 1.

На Фиг. 12В изображено мультиплексное профилирование хромосом X, 18, 21, иллюстрирующее моносомию X и делецию короткого плеча хромосомы 18.

ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обратимся теперь к графическим материалам и, в частности, к Фиг. 1-12, на которых показан вариант реализации способа и системы для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов по настоящему изобретению.

Как указано выше, заявленное изобретение решает проблему необходимости массового параллельного секвенирования генома для выявления анеуплоидии эмбриона по крови матери и других хромосомных перестроек по периферической крови больного раком.

Изобретение использует способ люминесцентной или флуоресцентной детекции для определения количества ДНК, присутствующего в специфичных мишенях по длине хромосомы, путем регистрации общего количества флуоресценции, испускаемой соответствующим флуорофором. Изобретение использует технологии усиления сигнала, применяя наночастицы серебра и спермин, которые будут захватывать фрагменты ДНК, гибридизованные со специфичными флуоресцентными ДНК-зондами. Изобретение также может использовать технологии усиления сигнала, применяя антитела стрептавидин поли-HRP для связывания с биотинилированными ДНК-зондами ВАС, которые разработаны для воздействия на стратегические области генома, такие как теломеры и центромерные/прицентромерные области всех хромосом. Изобретение также использует технологии иммобилизации для связывания модифицированной амином внеклеточной ДНК со специально покрытыми ДНК-связывающими поверхностями микротитрационных планшетов.

Заявленное изобретение отличается от способов, которые существуют в настоящее время. Поскольку все существующие способы основаны на секвенировании, все из них имеют значительные методические недостатки. Настоящее изобретение отличается от существующих способов, основанных на секвенировании, поскольку оно использует платформу гибридизации in situ и способы амплификации сигнала, как в ходе генерации сигнала, так и в ходе усиления для обнаружения флуоресценции. Это является усовершенствованием по сравнению с существующими методологиями и имеет следующие преимущества: 1) быстрый ТАТ; 2) более низкая стоимость; 3) простота использования в условиях практически любой лаборатории без значительных затрат на инфраструктуру; и 4) всеобъемлющий скрининг анеуплоидии всех хромосом.

Как указано выше, кариотип идентифицирует хромосомный статус эмбриона в диагностическом образце от беременной женщины, полученном из амниотической жидкости или ворсин хориона. Из-за рисков, присущих таким инвазивным процедурам, в последнее время большое внимание уделяется неинвазивным способам скрининга, использующим внеклеточную ДНК эмбриона из материнской крови. Однако эти методы не позволяют идентифицировать сбалансированные перестройки в кариотипе. Сбалансированные перестройки de novo связаны с повышением риска различных пороков развития плода, врожденных или проявляющихся на более поздней стадии развития. Другой тип сбалансированной перестройки, а именно, Робертсоновские транслокации, которые затрагивают акроцентрические хромосомы, связаны с повышением риска рецидива трисомии.

Кариотип также играет важную роль в диагностике и прогнозировании многих солидных злокачественных новообразований (опухолей). Однако получение хороших кариотипов из солидных опухолей часто является затруднительным из-за неудачных попыток их культивирования. Поэтому, как и в пренатальной диагностике, многие усилия были сосредоточены на неинвазивных способах. Применяя внеклеточную свободно циркулирующую ДНК опухоли, различные исследователи разработали целенаправленные стратегии для оценки мутационного статуса определенных генов. Однако на практике первичное происхождение опухоли является неизвестным и, следовательно, целенаправленные исследования дают ограниченную информацию. Это становится критичным для раннего выявления рака. Кроме того, некоторые опухоли характеризуются специфичной сбалансированной транслокацией, которая является диагностической и может быть обнаружена только в интактных клетках.

Как в пренатальной диагностике, так и в диагностике рака, сходные попытки получить генетическую информацию также проводят на циркулирующих интактных клетках. Количество циркулирующих эмбриональных или опухолевых клеток чрезвычайно мало и нередко в нескольких миллилитрах цельной крови присутствуют только одна или две клетки. Таким образом, получение полного кариотипа путем профилирования всех 24 хромосом из одной клетки или нескольких клеток будет чрезвычайно эффективным. Заявленное в настоящем описании изобретение решает эту проблему.

Заявленное изобретение решает вышеуказанные проблемы, используя комплексный подход к исследованию целого генома. Воздействуя на конкретные ориентиры на хромосомах, такие как теломеры и центромеры, и делая их молекулярно отличимыми (уникальными), изобретение позволяет идентифицировать все сбалансированные транслокации, а также несбалансированные перестройки на одной или более клетках, полученных из периферической крови беременной женщины, или больного раком или от эмбриона.

Заявленное изобретение является усовершенствованием и отличается от того, что в настоящее время существует. Оно использует технологию флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), и обладает преимуществом, поскольку все мишени на всех хромосомах разработаны так чтобы быть молекулярно отличимыми, целый геном может быть детально исследован на аномалии, как сбалансированные, так и несбалансированные, с использованием одной или более клеток. Данное изобретение выявляет даже особый тип перестройки, то есть Робертсоновскую транслокацию, путем распознавания расположенных рядом центромеров двух затрагиваемых акроцентрических хромосом. Например, это раскрывает механизм синдрома Дауна - обособленно стоящая трисомия в противоположность трисомии, связанной с транслокацией. Поскольку существующие системы нацелены на выявление специфических заболеваний, они не подходят для исследований целого генома. В случае, когда доступный материал настолько ограничен, например, есть одна или несколько клеток, даже амплификация целого генома после экстракции ДНК не может обеспечить возможность всеохватывающего скрининга.

Настоящее изобретение является усовершенствованием существующих технологий, поскольку с применением специально разработанных ДНК-зондов ВАС, оно может получать информацию о целом геноме (кариотипе) применяя специально разработанные флуоресцентные кубы с различимыми спектральными характеристиками возбуждения и испускания. Дополнительно, применяя функцию «слои» в стандартных программах, таких как Adobe Photoshop, можно «вытащить» требуемую информацию о мишени. Даже, когда несколько мишеней перекрываются друг с другом в интерфазной клетке, выборочно «вызывая» (отыскивая) заданные конфигурации отдельных мишеней, можно проследить целую хромосому в клетке. Это обеспечит возможность распознавания различных аномалий.

Варианты реализации настоящего изобретения могут включать, без ограничения:

1) Получение периферической крови и отделение плазмы; если необходимо, применяя стабилизаторы для транспортировки собранной крови в испытательную лабораторию;

2) Очистку внеклеточной (cf, cell free) ДНК с применением либо коммерческих наборов, таких как набор Qiagen amp, либо внутрилабораторных протоколов, таких как протокол Triton/Heat/Phenol (ТНР);

3) Проведение амплификации целого генома (WGA, Whole Genome Amplification) с применением метода лигирования тупых концов с (BLM-PCR) или без (BL-WGA), обогащения фрагментом определенного размера;

4) Проведение мечения 5'-концов биотином;

5) Осаждение фрагментов ДНК этанолом;

6) Инкубирование гранул Strepavidin Dynabeads и фрагментов ДНК, меченных биотином, в 96-луночном планшете с буфером BHW или без него;

7) Прикладывание магнита, отмывание несвязанной ДНК;

8) Удаление магнита, проведение гибридизации с мишень-специфичными ДНК-зондами со специфичными флуорофорами для каждой отдельной хромосомы;

9) Прикладывание магнита, отмывание избыточного зонда с буфером BHW или без него;

10) Элюирование с NaOH и с буфером или без него из бумаги Gills;

11) Прикладывание магнита, перенос элюата в новый 96-луночный планшет;

12) Добавление отрицательно заряженных частиц серебра и спермина;

13) Инкубирование при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте;

14) Обнаружение флуоресценции флуориметром и сравнение с построенными стандартными кривыми для каждой мишени на каждой хромосоме; а также

15) Завершение профилирования хромосом на основе паттернов гибридизации.

Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения могут включать в себя, без ограничения:

16) Мечение ДНК-зондов биотином;

17) Генерацию сигнала с помощью непрямых ферментативных методов, таких как образование комплекса авидин-поли-HRP;

18) Использование усиленного люминола в качестве субстрата для фермента поли-HRP; а также

19) Обнаружение сигнала с помощью люминометра.

Кроме того, дополнительные варианты реализации настоящего изобретения могут включать, без ограничения:

20) Выделение циркулирующих клеток эмбриона или клеток опухоли из периферической крови или клеток трофобласта из эмбриона;

21) Фиксацию интактной клетки (клеток) на многокамерных слайдах;

22) Генерацию мишень-специфичных ДНК-зондов;

23) Проведение FISH гибридизаций для всех мишеней в одной реакции;

24) Проведение FISH гибридизаций для мишеней на шести хромосомах одновременно;

25) Повторение гибридизаций на интактных клетках несколько раз при необходимости;

26) Получение изображений гибридизованных мишеней с применением специально разработанных флуоресцентных кубов;

27) Анализ паттернов гибридизации каждой мишени; а также

28) Завершение профилирования хромосом на основе паттернов гибридизации.

Понятно, что графические материалы могут включать в себя альтернативные изображения мечения зонда и обнаружения сигнала, такие как, без ограничения:

На Фиг. 1 также могут быть показаны примерные варианты реализации, демонстрирующие, что мишень-специфичные ДНК-зонды с оранжевыми флуорофорами, Су3.5, Су5.5, Су7, Су7.5 могут быть использованы для генерации профилей хромосом.

На Фиг. 3-8 также могут быть показаны примерные варианты реализации, демонстрирующие аномальные профили любой из 24 хромосом, иллюстрирующие любую аномалию.

На Фиг. 11 также может быть показана схема цветов флуорофоров мультиплексного профилирования любой комбинации трех из 24 хромосом человека.

На Фиг. 12 также может быть показано мультиплексное профилирование любой комбинации хромосом, иллюстрирующее любые типы аномалий.

Для выявления генетических аномалий посредством профилирования хромосом неинвазивным способом, сначала плазму отделяют от цельной крови, а на следующей стадии выделяют внеклеточную ДНК. Очищенную ДНК амплифицируют на стадии 3. Стадия 4 является интегральной частью третьей стадии, где концы фрагментов геномной ДНК метят биотином. Стадия 4 является необходимым условием для стадии 5, где ДНК осаждают этанолом. На стадии 6, гранулы стрепавидина и меченые биотином фрагменты геномной ДНК инкубируют в 96-луночных планшетах с соответствующим буфером. На следующей стадии, несвязанную ДНК отмывают после разделения гранул в магнитном поле. Это является необходимым условием для FISH гибридизации, которую проводят на стадии 8. После удаления гранул из магнитного поля, мишень-специфичные ДНК-зонды, меченные специфическими комбинациями флуорофоров, гибридизуют с фрагментами генома, связанными с молекулами авидина на магнитных гранулах посредством образования комплексов авидин-биотин на стадии 6. После удаления гранул из магнитного поля, избыток ДНК-зонда отмывают и гибридизованный зонд элюируют NaOH в соответствующем буфере. Отдельные элюаты переносят в новый 96-луночный планшет после разделения гранул в магнитном поле. На стадии 12, флуоресцентные зонды захватывают между отрицательно заряженными наночастицами серебра и положительно заряженным спермином, что способствует формированию агрегатов серебра. Это облегчает амплификацию флуоресцентного сигнала после 10-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте. На следующей стадии, отдельные показания флуоресценции автоматически регистрируют с помощью флуориметра. Наконец, эти показания, которые станут частью хромосомных профилей, будут сравнивать со стандартными профилями нормальных хромосом, для определения генетических аномалий.

Для выявления генетических аномалий с помощью профилирования хромосом неинвазивным способом, кроме использования ДНК плазмы, используют также интактные клетки. Выделение циркулирующих эмбриональных или опухолевых клеток из периферической крови или клеток трофобласта эмбриона является необходимым условием для следующей стадии, когда изолированные клетки будут зафиксированы на слайдах микроскопа. Направленные ВАС-зонды, генерированные на следующей стадии, будут применены для FISH на следующих стадиях, либо нацеливаясь на все хромосомы в одной реакции, либо на шесть хромосом одновременно. На следующей стадии, повторные гибридизации выполняют столько раз, сколько необходимо для завершения гибридизации всех геномных мишеней. На следующей стадии будут записаны изображения гибридизованных мишеней, которые будут применены для анализа на последующей стадии. На последней стадии, применяя заранее установленные критерии, наблюдаемые мишени будут идентифицированы как представляющие собой нормальное или аномальное состояние.

Ниже приведен пример того, как может работать вариант реализации настоящего изобретения. Сохранение внеклеточной ДНК в плазме может быть достигнуто путем применения хорошо известных консервантов, и образец можно транспортировать в лаборатории по всему миру без деградации внеклеточной ДНК. Существует множество методологий для экстракции и очистки высокомолекулярной ДНК. Оптимально отбирая образец и получая внеклеточную ДНК, можно использовать любой из многих методов амплификации целого генома, чтобы получить достаточное количество для оценки анеуплоидии и других аномалий всех хромосом. Другими словами, можно создать молекулярный кариотип, применяя внеклеточную ДНК. Для этого необходимо модифицировать ДНК после стадии амплификации мечением 5'-концов биотином. Существует несколько способов фиксации этих фрагментов ДНК на твердых поверхностях. Наиболее эффективным способом будет инкубация магнитных гранул стрептавидина с биотинилированными фрагментами ДНК. Создание мишень-специфичных ДНК-зондов со специфичными флуорофорами может быть осуществлено с помощью стандартных протоколов ник-трансляции. После создания требуемых зондов, реакции FISH для индивидуальных хромосом могут быть проведены на гранулах в микротитрационных планшетах в соответствующих буферах для гибридизации. Гибридизованные зонды можно элюировать и перенести в новый микротитрационный планшет. Для усиления флуоресценции доступны несколько методов амплификации. Одним из таких методов является применение наночастиц серебра в комбинации со спермином. Конкретные интенсивности флуоресценции можно регистрировать из каждой лунки (хромосомы). Основным применением этого нового подхода будет детекция увеличения или уменьшения уровней геномных мишеней по сравнению с построенными кривыми для количества внеклеточной ДНК у нормальной женщины или не больных раком контрольных индивидуумов. Комбинируя вышеуказанные стадии, может быть проведен анализ хромосомной анеуплоидии и других перестроек, таких как делеции и дупликации. Другими словами, молекулярный кариотип может быть создан этим новым способом с применением внеклеточной ДНК из материнской крови и крови от всех больных раком. Следовательно, хромосомные перестройки, связанные с солидными опухолями, также могут быть выявлены с применением внеклеточной ДНК из периферической крови больных раком, с применением вышеуказанного способа.

Существует несколько способов разделения и обогащения диагностического образца эмбриональными или опухолевыми клетками из периферической крови. Оптимально добывая требуемые клетки, их можно фиксировать на поверхности предметного стекла. Создание мишень-специфичных ДНК-зондов с заданными цветовыми комбинациями (Фиг. 11) может быть осуществлено с помощью стандартных протоколов ник-трансляции. После получения требуемых зондов, гибридизация со всеми геномными мишенями может быть быстро проведена на микропрепарате. Путем повторного проведения гибридизации при необходимости, профили для всех 24 хромосомы могут быть получены менее чем за 24 часа.

С помощью специально разработанных наборов флюоресцентных фильтров и камеры, можно получать изображения. Этот набор данных послужит основой для анализа отдельных мишеней с помощью функции «слои» в Adobe Photoshop. Определение статуса отдельных хромосом возможно путем комбинации указанных выше стадий. Как только отдельные хромосомы идентифицированы, создание полного кариотипа является стандартной процедурой для специалистов в данной области техники.

Ниже приводится пример того, как специалист в данной области техники может использовать вариант реализации настоящего изобретения.

Существуют несколько методов центрифугирования для отделения плазмы от цельной крови, взятой у беременной женщины. Аналогичным образом, многочисленные методы экстракции и очистки ДНК доступны специалисту в данной области техники. Для указанной стадии могут быть применены коммерчески доступные наборы, или внутрилабораторные протоколы, например, протокол ТНР, являются целесообразными. Несколько наборов для амплификации целого генома являются коммерчески доступными. Из них, способ амплификации с лигированием тупых концов с обогащением или без обогащения фрагментами определенного размера оптимально подходит для исследования анеуплоидии эмбриона.

Для мечения концов биотином, имеются несколько коммерчески доступных наборов. Магнитные гранулы стрептавидина легко можно купить у многочисленных поставщиков.

Конкретные библиотеки ВАС и флуорофоры для создания мишень-специфичных ДНК-зондов являются коммерчески доступными. Наночастицы серебра и спермин легко можно купить. Несколько флюориметров коммерчески доступны для применения в этом новом способе.

В литературе описаны несколько стратегий для выделения эмбриональных клеток. Из них, разделение и обогащение образца ядросодержащими эмбриональными эритроцитами дает несколько преимуществ. Простой процедурой было бы использование магнитных гранул, покрытых моноклональными антителами к CD71/Гликофорину А. Применяя магнитное поле, эти клетки можно разделить и обогатить. Из многих систем для выделения опухолевых клеток, система фильтров ScreenCell является самой простой и наиболее экономичной. Эта система также может быть применена для отделения эмбриональных клеток. Затем их можно применять для FISH на микропрепаратах с мишень-специфичными ДНК-зондами, созданными с применением стандартной ник-трансляции и схемы, описанной на Фигуре 11. Флуоресцентные метки, необходимые для окрашивания этих зондов для каждой мишени, являются коммерчески доступными. В целом, четыре спектрально различимых флуорофора применяют в комбинациях, как показано (Фиг. 11). Системы флуоресцентного микроскопа являются коммерчески доступными для применения в настоящем изобретении. Из нескольких поставщиков наборов фильтров возбуждения/испускания, Semrock и Chroma предлагают оптимальные комбинации фильтров для детекции всех цветов. Изображения могут быть записаны либо с применением одного набора фильтров, либо с применением комбинации наборов фильтров. Весь этот процесс также может быть автоматизирован с помощью имеющихся в продаже систем. Подходом по умолчанию всегда является ручной, так как это самый доступный способ для многих лабораторий по всему миру. После записывания соответствующих изображений, их можно загрузить в Adobe Photoshop для дальнейшего анализа. Для этого типа анализа доступны коммерческие программы; однако, как и на предыдущей стадии, использование стандартных программ, таких как Adobe Photoshop, является очень экономичным. Затем можно проанализировать каждую молекулярно отличимую мишень на отдельных хромосомах, применяя ручные или автоматизированные протоколы для создания профилей хромосом.

Чтобы провести скрининг анеуплоидии эмбриона по крови матери, специалист в данной области техники должен выполнить следующие задачи:

Отделить плазму от периферической крови;

Экстрагировать и очистить внеклеточную ДНК;

Лигировать небольшие фрагменты внеклеточной ДНК и провести амплификацию целого генома с применением случайных гексапраймеров;

Пометить концы фрагментов биотином;

Инкубировать со стрептавидиновыми магнитными гранулами;

Создать мишень-специфичные ДНК-зонды со специфичными флуорофорами;

Провести FISH в 96-луночных планшетах;

Инкубировать с наночастицами серебра и спермином; а также

Записать соответствующие интенсивности флуоресценции с использованием флуориметра.

Путем сравнения со стандартными кривыми, построенными для каждого флуорофора, связанного с мишень-специфичными ДНК-зондами, можно определить, существует ли анеуплоидия эмбрионов для различных хромосом. Кроме того, большие делеции и дупликации как терминальные, так и интерстициальные могут быть обнаружены с использованием этого улучшенного флуоресцентного способа (Фиг. 2-8).

Для выявления хромосомных аномалий в первичных солидных опухолях, можно использовать внеклеточную ДНК из периферической крови и сравнить результаты у больных раком с построенными нормальными кривыми.

Даже малые количества образца ДНК эмбриона также можно обработать этим способом. Несмотря на то, что эмбриональная часть внеклеточной ДНК составляет постоянную долю суммарной внеклеточной ДНК, то есть примерно 20%, и разница одной копии хромосомы составляет примерно 10%, абсолютное количество флуоресценции, испускаемой в этой системе, значительно выше, чем 10% разница из-за комплексов наночастиц серебра и спермина. Таким образом, чувствительность этого анализа значительно выше, чем применяемых в настоящее время методов массового параллельного секвенирования. Кроме того, указанный анализ может обеспечить: 1) более быстрый метод выявления анеуплоидии эмбриона по материнской крови; и 2) более практичный подход, который можно применять почти во всех лабораториях, в отличие от существующего метода, предлагаемого только несколькими коммерческими организациями.

Такие же принципы применимы для выявления рака.

Для определения полного кариотипа, особенно для определения сбалансированной транслокации, из одной интактной циркулирующей клетки эмбриона, опухолевой клетки или клетки трофобласта, специалист в данной области должен выполнить следующие задачи:

1. Изолировать/экстрагировать циркулирующую эмбриональную или опухолевую клетку (клетки) или клетки трофобласта;

2. Зафиксировать клетку(и) на предметном стекле;

3. Создать мишень-специфичные ДНК-зонды в соответствии со схемой на Фиг. 11 и в Таблице 1;

4. Провести FISH;

а) Все хромосомы в одной гибридизации; или

б) Шесть хромосом одновременно в соответствии с модифицированной схемой;

5. Получить изображения гибридизованных мишеней, применяя специально разработанные флуоресцентные кубы;

6. Проанализировать каждую мишень и заранее установить ее позицию в соответствии со схемой на Фигуре 11; а также

7. Определить хромосомные аномалии и определить кариотип.

А = Aqua, В = Blue, G = Зеленый, О = оранжевый, Р = Фиолетовый, R = Красный, V = Фиолетовый, Y = Желтый, сеn = центромера, ter = теломера.

Если доступны дополнительные клетки, для аномалии может быть установлена клональность. Дополнительно, можно исследовать эволюцию клона и гетерогенность опухоли. Если дополнительные клетки не доступны, можно использовать другие методы, основанные на ДНК, такие как ПЦР внеклеточной свободно циркулирующей ДНК из образца плазмы того же пациента, чтобы подтвердить транслокацию.

Для обнаружения конкретной сбалансированной транслокации, включающей пять акроцентрических хромосом, а именно, Робертсоновской транслокации, можно будет найти близкое расположение любых двух из пяти центромерных мишеней, если использовали методы, описанные на стадии 3 выше. При необходимости, повторная гибридизация может быть проведена с применением коммерчески доступного набора зондов от InteGen LLC для обнаружения Робертсоновских транслокаций.

Другим применением будет использование мишень-специфичных ДНК-зондов для определения длины и ассоциаций теломер в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками с применением упомянутого выше способа повторной гибридизации.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Установление кариотипа эмбриона по крови матери путем профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов на внеклеточной ДНК плазмы

Согласно одному варианту реализации, кариотип эмбриона может быть установлен путем изучения фрагментов внеклеточной ДНК, которые экстрагируют из плазмы беременной матери, амплифицируют и метят биотином. Фрагменты могут быть связаны с магнитными стрептавидиновыми гранулами посредством образования комплексов авидин-биотин. Фрагменты ДНК могут быть гибридизованы с их комплементарными последовательностями через направленные меченые флуорофором ДНК-зонды. Гибридизованные зонды могут быть элюированы и захвачены комплексами наночастиц серебра и сперминов для усиления их флуоресценции.

Интенсивность каждого флуорофора можно регистрировать флуориметром, и можно создавать отдельные кривые интенсивности, отражающие количество ДНК. Эти кривые можно сравнивать с построенными нормальными кривыми для определения наличия и типа любой аномалии. Следуя приведенным выше стадиям, можно создать профили отдельных хромосом и путем комбинации профилей всех 24 хромосом, можно установить кариотип эмбриона.

ПРИМЕР 2

Установление диагноза солидной опухоли по крови пациентов посредством профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов на внеклеточной ДНК плазмы

Согласно другому варианту реализации, кариотип опухоли может быть определен путем изучения фрагментов внеклеточной ДНК, которые экстрагированы из плазмы крови больного раком, амплифицированы и помечены биотином. Фрагменты могут быть связаны с магнитными стрептавидиновыми гранулами посредством образования комплексов авидин-биотин. Фрагменты ДНК могут быть гибридизованы с их комплементарными последовательностями через меченные флуорофорами мишень-специфичные ДНК-зонды. Гибридизованные зонды можно элюировать и захватить между комплексами наночастиц серебра и сперминов для усиления их флуоресценции.

Интенсивность каждого флуорофора можно регистрировать флуориметром, и можно построить отдельные кривые интенсивности, отражающие количество ДНК. Указанные кривые можно сравнивать с построенными нормальными кривыми для определения наличия и типа любой аномалии. Следуя приведенным выше стадиям, можно создать профили отдельных хромосом и путем объединения профилей всех 24 хромосом можно установить кариотип. На основе данных указанного кариотипа, можно установить диагноз конкретной опухоли.

ПРИМЕР 3

Определение кариотипа эмбриона по материнской крови посредством профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов на интактных циркулирующих клетках эмбриона

Согласно другому варианту реализации, кариотип эмбриона может быть установлен путем гибридизации мишень-специфичных ДНК-зондов на интактных свободно циркулирующих клетках эмбриона. Клетки эмбриона могут быть выделены из материнской крови с помощью различных установленных методов. Гибридизации ДНК могут быть проведены для мишеней всех хромосом в одной реакции, или мишени из шести хромосом могут быть оценены в каждой реакции. За этим может следовать требуемое количество повторных гибридизаций на интактной клетке(ах) для завершения профилирования. Паттерны гибридизации отдельных хромосом можно записывать и сравнивать с ожидаемыми нормальными паттернами для определения наличия и типа любых аномалий. Следуя вышеуказанным стадиям, может быть установлен кариотип эмбриона.

ПРИМЕР 4

Установление диагноза солидной опухоли по крови пациентов путем профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов на интактных свободно циркулирующих опухолевых клетках

Согласно другому варианту реализации, диагноз конкретной опухоли может быть установлен путем гибридизации мишень-специфичных ДНК-зондов на интактных свободно циркулирующих опухолевых клетках. Опухолевые клетки могут быть выделены из крови пациента с помощью различных установленных методов. Гибридизация ДНК может быть выполнена для мишеней всех хромосом в одной реакции, или мишени из шести хромосом могут быть оценены в каждой реакции. За этим может следовать требуемое количество повторных гибридизаций на интактной клетке(ах) для завершения профилирования. Паттерны гибридизации отдельных хромосом можно записать и сравнить с ожидаемыми нормальными паттернами для определения наличия и типа любых аномалий. Следуя вышеуказанным стадиям, можно установить диагноз конкретной опухоли.

ПРИМЕР 5

Определение кариотипа эмбриона посредством профилирования хромосом с применением мишень-специфичных ДНК-зондов на интактных клетках из слоя трофэктодермы

Согласно другому варианту реализации, кариотип эмбриона может быть определен путем гибридизации мишень-специфичных ДНК-зондов на интактных клетках эмбриона. Клетки эмбриона могут быть выделены из трофэктодермального клеточного слоя эмбриона с помощью различных установленных методов. Гибридизации ДНК могут быть проведены для мишеней всех хромосом в одной реакции, или мишени из шести хромосом могут быть оценены в каждой реакции. За этим может следовать требуемое количество повторных гибридизаций на интактной клетке(ах) для завершения профилирования. Паттерны гибридизации отдельных хромосом можно записать и сравнить с ожидаемыми нормальными паттернами для определения наличия и типа любых аномалий. Следуя приведенным выше стадиям, может быть установлен кариотип для любого эмбриона, рассматриваемого для оплодотворения in vitro.

Несмотря на то, что изобретение было раскрыто в контексте определенных вариантов реализации, и примеров, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты реализации изобретения выходят за пределы конкретно раскрытых вариантов реализации на другие альтернативные варианты реализации и/или их применения, а также их модификации и их эквиваленты.

Множество вариантов и альтернативных элементов было раскрыто в вариантах реализации настоящего изобретения. Дальнейшие вариации и альтернативные элементы будут очевидны специалистам в данной области техники. Среди этих вариантов, но не ограничиваясь ими, указаны конкретные числа и/или типы флуорофоров в направленном ДНК-зонде для профилирования отдельных хромосом. Различные варианты реализации изобретения могут включать или исключать любые из этих вариантов или элементов.

Кроме того, в этой спецификации было сделано множество ссылок на патенты и печатные публикации. Каждая из приведенных выше ссылок приведена здесь отдельно в качестве ссылки в полном объеме.

Наконец, следует понимать, что варианты реализации изобретения, раскрытые здесь, являются иллюстрацией принципов настоящего изобретения. Другие модификации, которые могут быть использованы, могут быть в пределах объема изобретения. Следовательно, в качестве примера, но не ограничения, альтернативные конфигурации настоящего изобретения могут быть использованы в соответствии с приведенными в настоящем описании инструкциями. Соответственно, варианты реализации настоящего изобретения не ограничиваются им в точности как показано и описано.

Несмотря на то что варианты реализации способа и системы для профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов были подробно описаны, должно быть очевидно, что возможны модификации и вариации, все из которых относятся к истинному духу и объему изобретения. Что касается вышеприведенного описания, то следует понимать, что оптимальные размерные зависимости для частей изобретения, включающие изменения размеров, материалов, вида, формы, функции и образа действия, сборки и использования, считаются легко понятными и очевидными специалисту в данной области техники, и все зависимости, эквивалентные показанным на чертежах и указанным в описании, предназначены для охвата настоящим изобретением.

Следовательно, вышесказанное рассматривается в качестве только иллюстрации принципов изобретения. Дополнительно, поскольку многочисленные модификации и изменения будут очевидны специалистам в данной области техники, нежелательно ограничивать изобретение точной конструкцией и эксплуатацией, показанной и описанной, и, соответственно, все подходящие модификации и эквиваленты могут быть применены, попадая в объем настоящего изобретения.

ПЕРЕЧЕНЬ ЛИТЕРАТУРЫ

Li J, Harris L and Mamon H et al., Whole Genome Amplification of Plasma-Circulating DNA Enables Expanded Screening for allelic imbalance in plasma, JMD February 2006, Vol 8, No 1 pp 22-30.

Mamon H, Hader С and Li J et al., Preferential amplification of Apoptotic DNA from Plasma: Potential for enhancing detection of minor alterations in circulating DNA, Clinical Chemistry 54:9(2008), pp 1582-1584.

Xue X, Dawn M and Teare В et al., Optimizing the yield and utility of circulating cell- free DNA from plasma and serum, Clinica Chimica Acta 404 (2009) 100-104.

Yahya I. Elshimali YI, Khaddour H and Sarkissyan M et al., The Clinical Utilization of Circulating Cell Free DNA (CCFDNA) in Blood of Cancer Patients, Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 18925-18958; doi: 10.3390/ijmsl40918925.

Epstein L, Sandy DeVries S, and Waldman FM, Reutilization of Previously Hybridized Slides for Fluorescence In Situ Hybridization, Cytometry 21378-381 (1995).

Gill R, Tian L and Somerville WRC et al., Silver Nanoparticle Aggregates as Highly Efficient Plasmonic Antennas for Fluorescence Enhancement, J. Phys. Chem С 2012, 116, 16687-16693.

Lincoln Ph.D., Near-Infrared Surface-Enhanced Fluorescence Using Silver Nanoparticles in Solution, University of Nebraska - Lincoln, DigitalCommons ©University of Nebraska -Thesis 12-1-2013.

Juneau K, Bogard PE and Huang S et al., Microarray-Based Cell-Free DNA Analysis Improves Noninvasive Prenatal Testing, Fetal Diagn Ther, 2014; 36:282-286.

Rubio CI, Bellver J and Rodrigo L et al., Preimplantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials, Fertil Steril, 2013 Apr; 99(5): 1400-7.

Saxena SG, Desai K and Shewale L et al., Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in couples of Indian ethnicity: Is there a scope?, J Hum Reprod Sci. 2014 Jan-Mar; 7(1): 25-29.

Method and apparatus for chromosome profiling, US patent 8,574,836. Method and apparatus for chromosome profiling, US patent 7,943,304.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ мультиплексного профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, включающий следующие стадии: а) выделение, извлечение или экстрагирование ДНК из биологических образцов; b) соединение множества специфичных ДНК-зондов с последовательностями специфичных ДНК-мишеней по меньшей мере на одной определенной хромосоме в интактной интерфазной клетке; c) прикрепление флуоресцентных меток, способных испускать различимые сигналы, к частям множества ДНК-зондов, так что конечный ДНК-зонд генерирует от одного до четырех флуоресцентных сигналов, создавая таким образом уникальный сигнал, характеризующийся тем, что состав уникального сигнала отличается от мишеней на любой данной хромосоме; и d) гибридизация ДНК-зондов с мишенями на хромосоме; f) получение изображений гибридизованных мишеней с применением флуоресцентных кубов для детекции флуоресцентных цветов. Изобретение расширяет арсенал средств для профилирования хромосом. 14 з.п. ф-лы, 5 пр., 1 табл., 13 ил.

1. Способ мультиплексного профилирования хромосом в биологических образцах с применением мишень-специфичных ДНК-зондов, включающий следующие стадии:

а) выделение, извлечение или экстрагирование ДНК из биологических образцов;

b) соединение множества специфичных ДНК-зондов с последовательностями специфичных ДНК-мишеней по меньшей мере на одной определенной хромосоме в интактной интерфазной клетке;

c) прикрепление флуоресцентных меток, способных испускать различимые сигналы, к частям множества ДНК-зондов, так что конечный ДНК-зонд генерирует от одного до четырех флуоресцентных сигналов, создавая таким образом уникальный сигнал, характеризующийся тем, что состав уникального сигнала отличается от мишеней на любой данной хромосоме; и

d) гибридизация ДНК-зондов с мишенями на хромосоме;

f) получение изображений гибридизованных мишеней с применением флуоресцентных кубов для детекции флуоресцентных цветов.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что последовательности специфичной ДНК-мишени находятся на фрагментах ДНК, входящих в состав указанной по меньшей мере одной определенной хромосомы, и тем, что интактная интерфазная клетка представляет собой внеклеточную ДНК плазмы.

3. Способ по п.1 или 2, характеризующийся тем, что гибридизация выбрана из группы, включающей гибридизацию in situ, проводимую один или более раз на интактной интерфазной клетке, и гибридизацию в суспензии, проводимую в одной или более лунках многолуночного планшета.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что гибридизация может быть проведена на одной или более мишенях на по меньшей мере одной из 24 хромосом человека в одной гибридизации.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию регистрации отдельных местоположений флуоресцентных сигналов в интактной интерфазной клетке с применением специальных флуоресцентных кубов возбуждения/испускания, встроенных в флуоресцентный микроскоп, и ПЗС-камеры.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что флуоресцентные метки, прикрепленные к ДНК-зондам, выбраны из группы, состоящей из DEAC dUTP, FITC dUTP, Cyanine 3-dUTP, Cyanine 5-dUTP, Red 594 dUTP , и их аналогов или производных.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что по меньшей мере отдельные флуоресцентные сигналы ДНК-зондов в разных местах внутри интактной интерфазной клетки сгруппированы и классифицированы в соответствующие профили хромосом на основе заданных конфигураций для каждой хромосомы.

8. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно включающий стадию прикрепления нефлуоресцентной метки к частям множества ДНК-зондов, так что конечный ДНК-зонд генерирует хемилюминесцентный сигнал, характеризующийся тем, что нефлуоресцентная метка связывается со специфичным лигандом, конъюгированным с ферментом, и реакция фермент-субстрат генерирует хемилюминесцентный сигнал.

9. Способ по п.8, дополнительно включающий стадию регистрации суммарной интенсивности флуоресценции для каждой из мишеней из каждой реакции в одной лунке с помощью флуориметра, или регистрации суммарной интенсивности хемилюминесценции для каждой из мишеней из каждой реакции в одной лунке с помощью люминометра.

10. Способ по п.8 или 9, характеризующийся тем, что нефлуоресцентная метка, прикрепленная к ДНК-зондам, выбрана из группы, состоящей из биотина и его аналогов или производных.

11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что комплекс лиганд-фермент, который прикреплен к нефлуоресцентной метке биотину, может представлять собой фермент авидин-поли-HRP.

12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что субстрат, который реагирует с ферментом HRP, может представлять собой люминол.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что ДНК-зонды для мишеней выбраны из группы, состоящей из хромосом человека 1-22, X и Y.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что профили отдельных хромосом комбинируют для получения полного кариотипа, и профили отдельных хромосом используют для выявления числовой или структурной хромосомной аномалии.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что происхождение по меньшей мере одного из биологических образцов выбрано из группы, включающей периферическую кровь беременной женщины, периферическую кровь больного раком и клетки трофобласта эмбриона, полученного с использованием искусственных репродуктивных технологий, таких как оплодотворение in vitro.