Ассоциация штаммов микроорганизмов Pseudomonas hunanensis и Acinetobacter baumannii для очистки судовых льяльных вод от нефтепродуктов Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии, касается получения ассоциации новых штаммов бактерий, эффективной для очистки судовых льяльных водах от нефтепродуктов.

Интенсивное развитие судоходства на внутренних водных путях России привело к строительству качественно нового флота - с мощными энергетическими установками, высокими грузоподъемностью, пассажировместимостью и скоростью. Массовая эксплуатация таких судов сопровождается ростом негативного воздействия на окружающую среду вследствие непрерывного образования при их работе ряда жидких отходов, в частности, льяльных вод, содержащих нефтепродукты, подлежащих нейтрализации и удалению. Существующие правила (МАРПОЛ 73/78) распространяются, в том числе и на льяльные воды машинных отделений, содержащие нефтепродукты, и предполагают наличие специальных устройств, обеспечивающих их очистку [1].

Известны способы очистки судовых льяльных вод, содержащих нефтепродукты, которые базируются на механических (отстаивание, фильтрация, сепарация), физических (флотация, коалесценция, адсорбция), химических (коагуляция, озонирование) методах [2-4], но они являются высокозатратными.

Наиболее экологически безопасно применение способа очистки судовых льяльных вод от нефтепродуктов, основанного на их разложении микроорганизмами путем включения в естественный обмен веществ и энергии, минимизируя тем самым отрицательное влияние на окружающую среду.

Известны биологически активная композиция, включающая ассоциацию нефтеокисляющих бактериальных культур Pseudoamycolata halophobica ВСБ-753, Kibdelosporangium aridum ВСБ-754, Acinetobacter oleovorum ВСБ-712, Rhodococcus erytropolis HX7 в объемном соотношении 1:1:1:1, торф и комплексное минеральное удобрение [5], консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. ВКМ B-2753D и Ochrobactrum sp. ВКМ B-2754D [6], штамм Rhodotorula sp. ВКМ Y-2993D [7], способные к очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Недостатком указанных микроорганизмов и сообществ микроорганизмов является неспособность к биологическому окислению нефтепродуктов судовых льяльных вод.

Целью изобретения является получение ассоциации штаммов бактерий, способной осуществлять эффективную очистку судовых льяльных вод от нефтепродуктов, расширение области применения биотехнологий для защиты окружающей среды.

Цели достигают применением ассоциации бактерий Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2.

Штаммы бактерий выделены из образцов судовых загрязненных нефтепродуктами жидкостей и шламов, предоставленных ЗАО Судоходная компания «БашВолготанкер» (г.Уфа, Республика Башкортостан, РФ) (Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7) и ПАО «Новороссийский морской торговый порт» (г.Новороссийск, Краснодарский край, РФ) (Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2).

Полученные штаммы ассоциации микроорганизмов депонированы во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационными номерами ВКМ B-3229D и ВКМ B-3231D и характеризуется следующими признаками.

Характеристика штамма Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 (ВКМ В-3229D).

Клетки - прямые палочки размером 0.5-1.0×1.5-1.9 мкм, подвижные, имеют несколько полярных жгутков. Колонии на питательном агаре молочного цвета, округлые, 1.5-2.0 мм в диаметре, непрозрачные, гладкие, слегка выпуклые. Спор не образуют. Грамотрицательные. Растут при температуре 10-40°С, рН 6-9. Оптимальная температура роста 25-37°С, оптимальный диапазон рН 7-8. Не растут при температуре ниже 4°С и выше 42°С. Способны к росту в присутствии 5% NaCl. Образуют флуоресцирующий пигмент при росте на среде Кинг Б. Не гидролизуют крахмал и твин-80. Не образуют лецитиназу. Не восстанавливают нитраты.

Используют D-глюкозу, пропионовую кислоту, уксусную кислоту, L-яблочную кислоту, L-молочную кислоту, D-глюкуроновую кислоту, L-гистидин, D-галактуроновую кислоту. Не используют D-мальтозу, D-трегалозу, 3-метилглюкозу, D-маннит, D-арабитол, D-аспарагиновую кислоту, пектин, D-яблочную кислоту, D-молочную кислоту, D-сорбит, D-раффинозу, α-D-лактозу, α-кето-глутаровую кислоту, α-гидрокси-масляную кислоту.

По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Pseudomonas hunanensis LV (уровень сходства 99.56%). Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.

Характеристика штамма Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 (ВКМ В-3231D).

Клетки - короткие палочки размером 1.0-1.5×1.5-2.5 мкм, неподвижные. Колонии на питательном агаре округлые, 1-3 мм в диаметре, матовые, гладкие, выпуклые. Грамотрицательные, аэробные. Не образуют спор. Растут при температуре 44°С. Каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Не способны к денитрификации. Не гидролизуют желатину. Не образуют сероводород и индол. Растут на среде с ацетатом и солями аммония.

В качестве источника углерода и энергии используют ацетат, β-аланин, L-аргинин, L-аспартат, бензоат, цитрат, глютамат, малат, лактат. Не используют D-глюкозу, D-глюконат, D-рибозу.

По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Acinetobacter baumannii АТСС 19606 (уровень сходства 99.99%).

Непатогенен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.

Приготовление ассоциации штаммов бактерий Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2:

Для получения биомассы культур их выращивают на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO₄⋅7H₂O - 0,02; FeSO₄⋅7H₂O - 0,02; NaH₂PO₄ - 1,5; K₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 2,0; вода водопроводная - 1000 мл. В качестве единственного источника углерода используют дизельное топливо (1%). Процесс культивирования проводят при температуре 25-26°С в аэробных условиях до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости не менее 10⁸ КОЕ/мл. Перед применением смешивают в объемном соотношении между собой 1:1.

Концентрацию нефтепродуктов в пробах очищаемой судовой льяльной воды определяли с использованием анализатора жидкости Флюорат-02 согласно ПНДФ 14.1 2 4.128-98 Методика измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природных, питьевых, сточных вод на анализаторе жидкости Флюорат-02 (М 01-05-2012).

Предлагаемое изобретение поясняется следующими примерами применения ассоциации штаммов бактерий Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 (ВКМ B-3229D) и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 (ВКМ В-323 ID) для очистки судовых льяльных вод (состав исходных судовых льяльных вод представлен в таблице 1) от основных загрязнителей -нефтепродуктов покомпонентно и суммарно:

Пример 1. Использование ассоциации для очистки судовых льяльных вод от судового маловязкого топлива (СМТ).

Ассоциацию углеводородокисляющих культур Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 выращивали в аэробных условиях в качалочных колбах.

Очистка осуществляется в условиях судовой льяльной воды, очищенной от нефтепродуктов физическими способами. В качестве единственного источника углерода использовали СМТ с концентрацией в среде 1 об. %, количество вносимой ассоциации - 2 мл/100 мл воды. Время очистки - 5 суток на качалке при 180 об/мин; температура 25°С. Утилизация нефтепродуктов за это время составила 88.6%.

Пример 2. Использование ассоциации для очистки судовых льяльных вод от дизельного масла М16Г2ЦС.

Ассоциацию углеводородокисляющих культур Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 выращивали в аэробных условиях в качалочных колбах.

Условия очистки как в примере 1. В качестве единственного источника углерода использовали дизельного масла М16Г2ЦС. Утилизация нефтепродуктов за это время составила 62.2%.

Пример 3. Использование ассоциации для очистки судовых льяльных вод от флотского мазута марки IFO 380.

Ассоциацию углеводородокисляющих культур Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 выращивали в аэробных условиях в качалочных колбах.

Условия очистки как в примере 1. В качестве единственного источника углерода использовали флотский мазут марки IFO 3.80. Утилизация нефтепродуктов за это время составила 54.2%.

Пример 4. Использование ассоциации для очистки судовых льяльных вод от нефтепродуктов.

Ассоциацию углеводородокисляющих культур Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 выращивали в аэробных условиях в качалочных колбах.

Очистка осуществляется в условиях судовой льяльной воды, содержащей 840 мг/дм³ нефтепродуктов (таблица 1). Количество вносимой ассоциации - 2 мл/100 мл воды. Время очистки - 5 суток на качалке при 180 об/мин; температура 25°С. Утилизация нефтепродуктов за это время составила 99.1%.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как среди известных микроорганизмов не обнаружено штаммов бактерий, либо их ассоциаций, которым присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемая ассоциация имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены микроорганизмы, либо их ассоциации, характеризующиеся одинаковой способностью к очистке судовых льяльных вод от нефтепродуктов.

Таким образом, ассоциация штаммов бактерий Pseudomonas hunanensis BCHR-IB-C7 и Acinetobacter baumannii BCHR-IB-P2 может быть использована для очистки судовых льяльных вод от нефтепродуктов с большой эффективностью и служить основой для получения биопрепаратов при разработке биологических технологий очистки судовых сточных вод, загрязненных углеводородами, для защиты окружающей среды.

Список литературы

1. Международная Конвенция по предотвращению загрязнения с судов 1973 г., измененная протоколом 1978 г. к ней (МАРПОЛ-73/78). Кн. I и II. СПб: ЗАО "ЦНИИМФ", 2008.

2. Судовой механик. Справочник. Т. 2. Под ред. Фока А.А. Одесса: Феникс, 2010. 1032 с.

3. Зуев В.А., Калинина Н.В. Обеспечение экологической безопасности при плавании судов. Метод, указания. Н. Новгород: изд-во НГТУ, 2008. 40 с.

4. Ермошкин Н.Г., Калугин В.Н., Корнилов Э.В., Кулешов И.Н. Судовые установки очистки нефтесодержащих вод. Методы и схемы очистки, устройство и эксплуатация: справочное пособие. Одесса: Феникс, 2004. 44 с.

5. Патент РФ №2270808, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, 2006.

6. Патент РФ №2553540, кл. C02F 3/34, C12N 1/20, В09С 1/10, 2015.

7. Патент РФ №2553540, кл. C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, 2013.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена ассоциация штаммов бактерий Pseudomonas hunanensis ВКМ B-3229D и Acinetobacter baumannii ВКМ B-3231D, смешанных в объемном соотношении между собой 1:1. Изобретение позволяет повысить эффективность очистки судовых льяльных вод от нефтепродуктов. 1 табл., 4 пр.

Ассоциация штаммов бактерий Pseudomonas hunanensis и Acinetobacter baumannii, депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской Академии Наук под регистрационными номерами ВКМ B-3229D и ВКМ В-3231D, в объемном соотношении между собой 1:1, используемая для очистки судовых льяльных вод от нефтепродуктов.