СОСТАВ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ Российский патент 2023 года по МПК B09C1/10 C12N1/00 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды и биотехнологии и представляет собой ассоциацию микроорганизмов для очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен биопрепарат «Родер» для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2174496, опубл.: 10.10.2001) на основе бактерий рода Rhodococcus, дополнительно содержит R-формы родококков штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, полученные путем селекции R-форм на обедненной питательной среде с концентрацией NaCl 10,0 г/л для биорекультивации загрязненных углеводородами объектов в условиях низкой минерализации или с концентрацией морской соли 30,0-50,0 г/л для биорекультивации в условиях высокой минерализации.

Недостатками данного изобретения являются низкая эффективность разложения нефти за один летний сезон до 65%, необходимость трехкратной обработки загрязненных участков в течение периода очистки, а также многоступенчатая технология получения указанных штаммов.

Известен биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2191752, опубл.: 27.10.2002), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии и воду, дополнительно содержит нефть, сахарозу и полиэтиленгликоль при следующем соотношении компонентов: нефть – 0,5-1 мас.%, сахароза – 1-5 мас.%, полиэтиленгликоль – 1-5 мас.%, вода – остальное, Mycobacterium flavescens ВКПМ В-6000 в конечной концентрации не менее 1,2*10⁷ кл/мл препарата, Mycobacterium sp. ИЖ 4 в конечной концентрации не менее 2,5*10⁷ кл/мл препарата, Rhodococcus sp. 56д в конечной концентрации не менее 2*10⁷ кл/мл препарата, Acinetobacter sp. НВ-1 в конечной концентрации не менее 5*10⁷ кл/мл препарата.

Недостатками данного изобретения являются многокомпонентный состав препарата, необходимость культивирования штаммов в ферментере, а также отсутствие доказательной информации об эффективности очистки почв от нефти и нефтепродуктов.

Известен препарат для биодеградации нефтепродуктов и способ его получения (Патент РФ № 2681831, опубл.: 12.03.2019), известный как биопрепарат «БИОМ», включающий ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269, иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в количестве 10⁷-10¹⁰ кл/г. Для получения препарата осуществляют раздельное культивирование штаммов бактерий, приготовление микробной ассоциации смешиванием культуральных жидкостей штаммов бактерий в соотношении 2:1:1:1, аэрозольное напыление смеси культуральных жидкостей на глауконитсодержащий носитель при подаче подогретого до 40 °С воздуха до достижения влажности в конечном биопрепарате 4%, причем используют фракцию носителя со средним диаметром частиц 600 мкм, подвергнутую термообработке при температуре 190 °С до остаточной влажности 4%.

Недостатками данного препарата является использование разных питательных сред для культивирования штаммов, а также многостадийная технология подготовки товарной формы биопрепарата, включающая термообработку.

Известен биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2361686, опубл.: 20.07.2009), включающий аэробные нефтеокисляющие микроорганизмы, минеральный питательный субстрат, нормальные парафины от С₁₂ до C₁₈ и твердый субстрат-носитель, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов он содержит ассоциацию представителей 4-х родов и 8 видов: Bacillus cereus, В. subtilis, Actinomyces griseus, Act. glaucus, Pseudomonas fluorescens, Ps. mesentericus, Ps. denitrificans, Arthrobacter globiformis, выделенных из нефти Советского месторождения Западной Сибири в концентрации 2,5*10⁹ кл/г, в качестве субстрата-носителя содержит сферозолу и дополнительно содержит глюкозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: минеральный питательный субстрат – 0,85-0,95; нормальные парафины C₁₂-C₁₈ – 0,6-0,7; глюкоза – 0,9-1,0; ассоциация аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов – 0,06-0,08; сферозола – до 100.

Недостатком данного изобретения является многокомпонентный состав биопрепарата, включающий 8 различных видов бактерий и большое количество вспомогательных веществ.

Известен микробный препарат для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами (Патент РФ № 2705290, опубл.: 06.11.2019), принятый за прототип, в качестве нефтеразрушающих микроорганизмов он содержит ассоциацию трех штаммов: Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в виде смеси их равных объемов с содержанием каждого компонента не менее 1*10⁷ КОЕ/мл, предварительно высушенных до влажности не более 10%.

Недостатком предложенного препарата является ограниченность его использования ввиду необходимости поддержания повышенной температуры 25 °С, не характерной для большинства нефтезагрязненных территорий России, для снижения концентрации нефти на 70% в течение 60 суток. Также недостатком изобретения является применение трудоемкой операции по высушиванию в технологии получения препарата.

Техническим результатом является разработка состава для биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с высокой степенью очистки.

Технический результат достигается тем, что в качестве штаммов используют Acinetobacter sp. ВКМ B-3202, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T, Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 в виде смеси бактериальных суспензий при следующих соотношениях, % по объему:

штамм Acinetobacter sp. ВКМ B-3202 25  штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T 25-50  штамм Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 50-25 

Заявляемый состав для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, включают в себя следующие штаммы в виде бактериальных суспензий, % по объему:

- Штамм Acinetobacter sp. депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ г. Пущино под регистрационным номером ВКМ B-3202 – 25.

- Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ г. Пущино под регистрационным номером ВКМ Ac-858^T – 25-50.

- Штамм Pseudomonas alcaligenes депонирован в коллекции ФБГУН ВКМ г. Пущино под регистрационным номером ВКМ B-1295 – 25-50.

Культивирование штаммов осуществлялось на твердой питательной среде ГМФ-агар при температуре от 26 до 30 °C в течение не менее 48 часов. Бактериальные суспензии получали методом смыва с поверхности питательных сред.

Концентрация клеток в полученных суспензиях определялась спектрофотометрическим методом по калибровочным зависимостям количества клеток от оптической плотности для использованных штаммов и составляла не менее 10⁷ КОЕ/мл суспензии.

Состав поясняется следующими примерами, а результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Пример 1. Суспензии трех штаммов вносили в нефтезагрязненную почву, отобранную в районе ж/д станции Таммисуо, Ленинградская обл., г. Выборг. В контейнеры помещали по 200 г почвы, инокулировали бактериальными суспензиями с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл в пропорциях, согласно таблице 1, и тщательно перемешивали стерильным шпателем. В качестве контроля использовалась загрязненная почва без внесения бактериальных суспензий.

Пример 2. Суспензии трех штаммов вносили в почву, загрязненную в лабораторных условиях посредством внесения сырой нефти (5 мас. %). В контейнеры помещали по 200 г почвы, инокулировали бактериальными суспензиями с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл в пропорциях, согласно таблице 1, и тщательно перемешивали стерильным шпателем. В качестве контроля использовалась загрязненная почва без внесения бактериальных суспензий.

Пример 3. Суспензии трех штаммов вносили в почву, загрязненную в лабораторных условиях посредством внесения дизельного топлива (5 мас. %). В контейнеры помещали по 200 г почвы, инокулировали бактериальными суспензиями с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл в пропорциях, согласно таблице 1, и тщательно перемешивали стерильным шпателем. В качестве контроля использовалась загрязненная почва без внесения бактериальных суспензий.

Пример 4. Суспензии трех штаммов вносили в почву, загрязненную в лабораторных условиях посредством внесения бензина (5 мас. %). В контейнеры помещали по 200 г почвы, инокулировали бактериальными суспензиями с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл в пропорциях, согласно таблице 1, и тщательно перемешивали стерильным шпателем. В качестве контроля использовалась загрязненная почва без внесения бактериальных суспензий.

Инкубирование почвы проводили в течение 60 суток при температуре от 18 до 22°C, осуществляли поддержание естественной влажности почв от 40 до 60%.

Концентрация нефтепродуктов и нефти в образцах почвы определялась флуориметрическим методом перед внесением составов, а также на протяжении 60 суток с временным интервалом не менее 14 суток.

Таблица 1 – Динамика концентрации нефтепродуктов и нефти в образцах почвы

Загрязнитель Соотношение ВКМ B-3202/
ВКМ Ac-858^T/
ВКМ B-1295 Временной интервал от начала опыта, сут. 14 28 42 60 Снижение концентрации, % Нефтепродукт с разлива 25%/25%/50% 13,28 30,39 50,89 71,97 25%/50%/25% 11,40 24,26 38,10 61,45 20%/40%/40% 0,00 0,00 20,68 47,01 20%/20%/60% 12,42 25,17 46,28 65,25 20%/60%/20% 10,12 21,42 35,25 58,30 30%/30%/40% 7,53 17,32 32,72 45,27 30%/40%/30% 5,08 11,33 28,73 42,26 10%/10%/80% 11,52 22,77 43,37 58,34 10%/80%/10% 9,05 18,67 33,48 55,57 Нефть 25%/25%/50% 14,77 21,81 32,95 54,17 25%/50%/25% 35,49 48,92 67,72 75,59 20%/40%/40% 8,18 40,97 54,52 68,60 20%/20%/60% 12,36 18,82 28,75 50,33 20%/60%/20% 30,25 44,64 61,23 70,53 30%/30%/40% 8,73 13,42 26,25 42,83 30%/40%/30% 15,37 34,92 49,52 60,44 10%/10%/80% 10,40 15,22 24,70 46,45 10%/80%/10% 18,55 38,27 54,12 65,56 Дизельное топливо 25%/25%/50% 23,32 79,37 84,01 86,43 25%/50%/25% 37,26 88,42 88,79 90,53 20%/40%/40% 13,50 74,11 80,16 85,07 20%/20%/60% 20,64 69,35 78,07 83,53 20%/60%/20% 30,36 65,54 81,13 87,56 30%/30%/40% 15,93 48,73 60,45 71,33 30%/40%/30% 20,65 52,05 69,40 75,47 10%/10%/80% 18,15 55,35 68,45 73,03 10%/80%/10% 22,04 51,32 65,35 76,66 Бензин 25%/25%/50% 26,16 48,53 0,00 0,00 25%/50%/25% 39,40 59,35 0,00 0,00 20%/40%/40% 12,24 65,81 0,00 0,00 20%/20%/60% 23,63 44,57 51,25 0,00 20%/60%/20% 28,45 40,17 47,09 0,00 30%/30%/40% 18,27 45,63 0,00 0,00 30%/40%/30% 15,08 56,15 0,00 0,00 10%/10%/80% 18,03 39,77 42,13 0,00 10%/80%/10% 19,35 39,43 46,38 0,00

Было установлено, что наибольшей эффективностью в отношении очистки почв, отобранных с разлива, от нефтепродукта обладает состав с внесением бактериальных суспензий Acinetobacter sp. ВКМ B-3202, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T, Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 в соотношении 25%:25%:50% по объему – концентрация нефтепродукта в образцах снизилась на 71,97% за 60 суток.

Наибольшей эффективностью в отношении очистки почв, загрязненных сырой нефтью и дизельным топливом, обладает состав с внесением бактериальных суспензий Acinetobacter sp. ВКМ B-3202, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T, Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 в соотношении 25%:50%:25% по объему – концентрация нефти в образцах снизилась, соответственно, на 75,59% и 90,53% за 60 суток эксперимента.

Низкая эффективность состава в отношении очистки почв от бензина и отсутствие динамики концентрации спустя 28 дней опыта связано с быстрой испаряемостью данного загрязнителя.

Данный состав может быть использован при проведении биологического этапа рекультивации нефтезагрязненных земель с высокой степенью очистки, за счет совместного действия бактериальных суспензий.

Изобретение относится к биотехнологии. Состав для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, содержит ассоциацию трех штаммов в виде смеси с содержанием каждого компонента не менее 1*10⁷ КОЕ/мл, причем в качестве штаммов используют Acinetobacter sp. ВКМ B-3202, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T, Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 в виде смеси бактериальных суспензий при следующих соотношениях, % по объему: штамм Acinetobacter sp. ВКМ B-3202 25%, штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T 25-50%, штамм Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 50-25%. Изобретение позволяет разработать состав для биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с высокой степенью очистки. 1 табл., 4 пр.

Состав для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, содержащий ассоциацию трех штаммов в виде смеси с содержанием каждого компонента не менее 1*10⁷ КОЕ/мл, отличающийся тем, что в качестве штаммов используют Acinetobacter sp. ВКМ B-3202, Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T, Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 в виде смеси бактериальных суспензий при следующих соотношениях, % по объему:

штамм Acinetobacter sp. ВКМ B-3202 25 штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-858^T 25-50 штамм Pseudomonas alcaligenes ВКМ B-1295 50-25