ИНГИБИТОРЫ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ КАК ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ПРИ ЛИМФОМАХ И ЛЕЙКОЗАХ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/554 A61K31/21 A61K31/201 A61K31/138 A61P35/02 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицине, а также в сельском хозяйстве и в промышленной биотехнологии для разработки принципиально нового подхода в противолейкозной терапии с помощью низкомолекулярных соединений, направленных против специфических молекулярных мишеней, к которым относятся молекулы субъединиц потенциалзависимых калиевых каналов семейства Kv.

Известно использование циклоалкильных соединений в качестве ингибиторов функции калиевых каналов. Патент Российской Федерации №2343143, основные коды МПК: С07С 233/59, С07С 233/60, С07С 279/28, С07С 307/08, С07С 311/16, C07D 261/08, C07D 213/82, C07D 271/06, C07D 409/12, C07D 413/12, А61К 031/155, А61К 031/165, А61К 031/415, А61К 031/4427, А61К 031/4245.

Известно описание АТР-чувствительного калиевого канала человеческого или иного происхождения, его производных, а также перечень диагностических или терапевтических средств против заболеваний, связанных с изменением активности данного канала. Патент Российской Федерации №2190663, коды МПК: C12N 15/12, С07К 14/705, С07Н 21/04.

Таким образом, использование калиевых каналов в качестве терапевтических мишеней достаточно интенсивно исследуется в нашей стране. Однако в российском патентном пространстве в качестве мишеней описаны только сами калиевые каналы, а не их белковые ингибиторы, принадлежащие к семейству KCNRG. Примеров использования калиевых каналов в качестве биомаркеров заболеваний человека в российском патентном пространстве не обнаружено.

Техническим и медицинским результатом изобретения является создание ингибиторов калиевых каналов, использующихся в качестве средства для индукции апоптоза опухолевых клеток В-клеточного хронического лимфолейкоза.

Технический результат достигается тем, что с помощью низкомолекулярных соединений был смоделирован ингибирующий эффект белка KCNRG, который препятствует нормальной сборке белков калиевых каналов, связываясь с областью, отвечающей за их тетрамеризациию, и тем самым подавляя активности каналов, с целью дальнейшего их использования в качестве потенциальных лекарственных средств для больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом, и на модели В-клеточной линии Raji определены диапазоны эффективных действующих концентраций этих соединений.

Хронический лимфолейкоз является практически неизлечимым, однако, медленно прогрессирующим заболеванием. В отличие от острого миелоидного лейкоза и хронического миелобластного лейкоза, радикальных методов терапии хронического лимфолейкоза на сегодняшний день не существует. Из-за системного характера заболевания радиотерапия при ХЛЛ не применяется. Стандартом терапии являются химиотерапевтические режимы с включением нуклеотидных аналогов, алкилирующих препаратов и моноклональных антител.

Сущность изобретения поясняется на фиг.2 и таблице 3.

Белковый продукт гена KCNRG содержит единственный домен Т1, являющийся N-концевым цитоплазматический доменом, ответственным за тетрамеризацию субъединиц калиевых каналов, открывающихся в зависимости от разности потенциалов на мембране клетки. Потенциалзависимые калиевые каналы (Kv) представляют собой чрезвычайно разнообразную группу. Однако при множественном выравнивании аминокислотных последовательностей каналов, Т1-домен показал высокую гомологию и консервативность, что продемонстрировано на фиг.1, где отображено множественное выравнивание последовательностей Т1-домена, выбранных для анализа потенциалзависимых калиевых каналов, полученное с помощью программного обеспечения ClustalX 1.83.

В таблице 1 приведен полный список ингибиторов/блокаторов и активатора калиевых каналов, включенных в настоящее исследование, а также оптимальные теоретические концентрации для ингибирования калиевых каналов для каждого ингибитора.

В качестве рабочих концентраций, помимо теоретических концентраций, на начальном этапе были выбраны также в 10 раз более и в 10 раз менее концентрированные растворы. Предварительные эксперименты по определению эффективных действующих концентраций были проведены на В-клеточной линии Raji. Культуры клеток, выделенных от больных В-ХЛЛ, обрабатывали выбранными концентрациями указанных соединений. В случае ингибирующего действия на калиевые каналы выбранных веществ, был сделан вывод о том, что эти вещества обладают KCNRG-подобным опухоль-супрессорным действием.

Мононуклеары периферической крови больных В-ХЛЛ выделяли с помощью стандартной методики Ficoll-Hipaque. После троекратной промывки стерильным PBS, клетки помещали в культуральный флакон со средой RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 15 мкг/мл гентамицина и 10% бычью эмбриональную сыворотку, в концентрации 1-2 млн клеток/мл. Культура помещалась в СО₂-инкубатор при 37°C с атмосферой, насыщенной водяными парами и не менее чем 5% CO₂. С учетом специфики проводимых экспериментов (определение цитостатического действия низкомолекулярных соединений в отношении клеток В-ХЛЛ по высокочувствительному измерению активности каспаз 3 и 7), культуру считали «живой» в том случае, если количество живых клеток превышало 70% от исходного (оценивалось по окраске трипановым синим).

Все дальнейшие эксперименты проводили в 24-луночных планшетах. В лунку вносили 2 мл первичной культуры, различные концентрации растворов ингибиторов в конечном объеме 8 мкл, после чего планшет помещали в CO₂-инкубатор и инкубировали при 37°C, сильном увлажнении и не менее чем при 7% концентрации CO₂. Цитотоксичность ингибиторов оценивалась в случае, когда в положительном контроле (клетки без ингибиторов) оставалось более 70% живых клеток.

Первоначальную оценку цитотоксичности и выбор оптимального диапазона концентраций проводили при помощи визуального подсчета клеток после окраски трипановым синим на клеточной линии Raji, а затем подтвердили на первичных культурах клеток В-ХЛЛ, полученных от больных. Эти эксперименты позволили выделить группу из 10 соединений, действие которых на первичные культуры является наиболее заметным и стабильным. Для этих веществ был определен рабочий диапазон концентраций (см. табл.2).

Чувствительность лимфоцитов периферической крови к воздействиям ингибиторов определяли с помощью теста с МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) и наборов для определения каспазной активности. Показания считывали через 3 и 24 часа после начала инкубации с цитотоксическими веществами.

Клетки после инкубации с цитотоксическими веществами помещали в 96-луночные планшеты. В качестве контроля использовали интактные клетки. Для учета фоновой оптической плотности в лунки вносили ростовую среду без клеток. В каждую лунку вносили 20 мкл раствора МТТ в стандартном фосфатно-солевом буфере в концентрации 5 мкг/мл. Инкубировали в течение 4 часов (в CO₂-инкубаторе при 37°C с атмосферой, насыщенной водяными парами и не менее чем 7% CO₂), после чего образовавшиеся кристаллы формазана растворяли равным объемом кислого изопропанола, интенсивно перемешивая. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 540 нм на оптическом анализаторе Униплан-Пикон (Россия).

Для оценки воздействия выбранных химических ингибиторов на первичные культуры клеток использовался относительный индекс апоптоза I, рассчитываемый по следующей формуле:

,

где А - показание активности каспаз 3 и 7 в образце, А₀ - фоновое показание активности каспаз 3 и 7 (без клеток), A_culture - показание активности каспаз 3 и 7 в отрицательном контроле (без добавления блокаторов), МТТ - показание теста МТТ в образце, МТТ₀ - фоновое показание теста МТТ (без клеток), MTT_culture - показание теста МТТ в отрицательном контроле (без добавления блокаторов).

Если относительный показатель I>100 (например, 200), это означает, что воздействие вещества в данной концентрации приводит к увеличению апоптоза (в примере в два раза). Если индекс I=100, это значит, что вещество не действует на культуру, и интенсивность ее апоптоза не изменяется. Если I<100, это означает, что вещество приводит к уменьшению интенсивности ее апоптоза.

В исследовании участвовало 8 больных В-ХЛЛ и 4 здоровых доноров в качестве контроля. На фиг.2 представлены характеристики выборок индекса апоптоза I в зависимости от исследуемых ингибиторов при трех различных концентрациях.

Целью настоящего исследования был поиск таких ингибиторов, которые бы действовали на культуру клеток от здоровых доноров в меньшей степени (или не действовали вообще), чем на выборку больных. Для выявления подобной закономерности нами был проведен статистический анализ с использованием непараметрического U критерия Манна - Уитни - Уилкоксона для оценки различий между двумя выборками по уровню относительного индекса апоптоза I. Значения критерия Манна - Уитни приведены в таблице 3.

Нулевой гипотезой при анализе было предположение, что выборки больных и здоровых отвечали на воздействия одинаково. Альтернативной гипотезой служило предположение, что данные выборки отличаются друг от друга. Жирным в таблицах выделены ингибиторы, воздействие которых на культуры подтверждает альтернативную гипотезу с вероятностью р<0,05. Такие ингибиторы можно назвать перспективными, то есть приводящими к апоптозу преимущественно культуры клеток больных. Данные ингибиторы могут быть рекомендованы в качестве основы для разработки новых фармацевтических препаратов для лечения В-клеточного хронического лимфолейкоза. Выделенные курсивом потенциально перспективные ингибиторы удовлетворяют критерию Манна - Уитни не в полной мере (с вероятностью р<0,1), однако их показатели могут быть, вероятно, улучшены при увеличении выборок больных и здоровых.

Приведенный выше анализ был проделан на данных, полученных после культивирования культур клеток в присутствии блокаторов калиевых каналов в течение суток.

Таблица 1 № п/п Название Теоретически рассчитанные концентрации 1 хлорид тетраэтиламмония 560 mM 2 4-аминопиридин 290 µМ 3 ацетат флекаинида 217 µМ 4 нифедипин 96 µМ 5 гидрохлорид дилтиазема 187 µМ 6 дигидрат гидрохлорида налтрексона 2 nM 7 анандамид (арахидонилэтаноламид) 2.7 µМ 8 хинин 14 µМ 9 гидрохлорид верапамила 6 µМ 10 рилузол 70 µМ 11 хинидин 1 mM 12 гидрохлорид никардипина 0.8 µМ 13 гидрохлорид бипувакаина 4.1 µМ 14 гидрохлорид амиодарона 35 µМ 15 кетоконазол 500 nM 16 пимозид 300 nM 17 галотан (2-бром-2-хлор-1,1,1 -трифторэтан) 200 М 18 3-изобутил-1-метилксантин 100 µМ 19 арахидоновая кислота 2 µМ 20 никотин 40 µМ 21 линолевая кислота 280 М 22 капсаицин 45 µМ 23 хлорид бария 5 mM 24 фосфат флудабарина Нет данных 25 орлистат Нет данных

Таблица 2 № п/п Название Экспериментально определенный диапазон рабочих концентраций 4 нифедипин 30-960 µМ 5 гидрохлорид дилтиазема 6-600 µМ 7 анандамид (арахидонилэтаноламид) 0,27-27 µМ 9 гидрохлорид верапамила 6-600 µМ 10 рилузол 70-700 µМ 14 гидрохлорид амиодарона 3,5-35 µМ 17 галотан (2-бром-2-хлор-1,1,1-трифторэтан) 2-20 М 21 линолевая кислота 50-140 М 22 капсаицин 20-200 µМ 25 орлистат 0,5-5 mg/1

Таблица 3 (3.1) Значения критерия Манна-Уитни при концентрации 10х Ингибитор U z p-level nifedipine 15,00 0,17 0,87 diltiazem hydrochloride 5,00 1,87 0,06 anandamide 1,00 2,55 0,01 verapamil hydrochloride 12,00 0,68 0,50 riluzole 14,00 0,34 0,73 amiodarone hydrochloride 12,00 0,68 0,50 linoleic acid 9,00 1,39 0,16 capsaicin 8,00 1,36 0,17 fludarabine phosphate 4,00 1,89 0,06 orlistat 3,00 2,08 0,04 (3.2) 3начения критерия Манна-Уитни при концентрации 1х Ингибитор U Z p-level nifedipine 9,00 1,19 0,23 diltiazem hydrochloride 1,00 2,55 0,01 anandamide 16,00 0,00 1,00 verapamil hydrochloride 2,00 2,38 0,02 riluzole 6,00 1,70 0,09 amiodarone hydrochloride 12,00 0,68 0,50 linoleic acid 10,00 0,76 0,45 capsaicin 14,00 0,00 1,00 fludarabine phosphate 12,00 -0,38 0,71 orlistat 4,00 1,89 0,06 (3.3) Значения критерия Манна-Уитни при концентрации 0,1х Ингибитор и Z p-level nifedipine 5,00 1,87 0,06 diltiazem hydrochloride 4,00 2,04 0,04 anandamide 9,00 1,19 0,23 verapamil hydrochloride 4,00 2,04 0,04 riluzole 13,00 0,51 0,61 amiodarone hydrochloride 6,00 1,70 0,09 linoleic acid 4,00 2,04 0,04 capsaicin 14,00 0,00 1,00 fludarabine phosphate 12,00 0,38 0,71 orlistat 4,00 1,89 0,06

Изобретение относится к области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицине, а также в сельском хозяйстве и в промышленной биотехнологии для разработки принципиально нового подхода в противолейкозной терапии с помощью низкомолекулярных соединений, направленных против специфических молекулярных мишеней, к которым относятся молекулы субъединиц потенциалзависимых калиевых каналов семейства Kv. Предложено применение ингибиторов калиевых каналов, выбранных из гидрохлорида дилтиазема, анандамида (арахидонилэтаноламида), гидрохлорида верапамила, линолевой кислоты в качестве средства для усиления апоптоза опухолевых В-клеток хронического лимфолейкоза. Техническим результатом изобретения является создание ингибиторов калиевых каналов, используемых как средство для индукции апоптоза опухолевых В-клеток хронического лимфолейкоза. Технический результат достигается тем, что с помощью низкомолекулярных соединений смоделирован ингибирующий эффект белка KCNRG, который препятствует нормальной сборке белков калиевых каналов, связываясь с областью, отвечающей за их тетрамеризацию, и тем самым подавляя активности каналов. 2 ил., 3 табл.

Применение ингибиторов калиевых каналов, выбранных из гидрохлорида дилтиазема, анандамида (арахидонилэтаноламида), гидрохлорида верапамила, линолевой кислоты, в качестве средства для усиления апоптоза опухолевых В-клеток хронического лимфолейкоза.