Способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro с помощью кофеина Российский патент 2019 года по МПК A01H4/00 

Использование: Биотехнология и сельское хозяйство

Сущность изобретения: стерильные микропобеги растений базальной частью помещают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга [1], содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина. Заявляемое изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для укоренения стерильных микрочеренков в культуре in vitro.

Получение корнесобственных плодовых и ягодных растений путем вегетативного размножения черенками является важным компонентом в интенсификации сельскохозяйственного производства. Для решения этой задачи эффективным подходом служит применение метода клонального микроразмножения, который позволяет получать большие объемы генетически однородного высококачественного посадочного материала в сжатые сроки.

Однако не все виды растений одинаково успешно размножаются и укореняются в условиях культуры in vitro. В зависимости от генотипа могут проявляться сложности на этапе размножения и укоренения растений на питательных средах. Это влечет за собой необходимость модификации отдельных элементов методики, а так же привлечения различных стимулирующих факторов для прохождения критических этапов культивирования.

В связи с этим, при культивировании растений in vitro используют различные факторы физической и химической природы, стимулирующие ризогенез. В качестве физических факторов применяют лазерное излучение [2], ультразвук [3], инкубацию в полной темноте в течение 5-6 суток [4].

Для активизации индукции корневых зачатков химическими способами, в основном, используют ауксины и фенольные соединения. Фенольные соединения в зависимости от химического строения, рН, концентрации и других факторов действуют как ингибиторы или как стимуляторы ризогенеза. Свои регуляторные функции эти соединения осуществляют через ферментную систему окисления ИУК [5]. К таким веществам относятся фенолкарбоновые кислоты. Для стимуляции морфогенетических процессов наиболее часто используют салициловую кислоту [6, 7, 8], галловую, сиреневую, n-кумаровую, феруловую, хлорогеновую кислоты [9, 10, 11].

Наиболее близким по своей сущности к заявленному изобретению является способ укоренения микрочеренков in vitro, с добавлением в питательную среду в качестве индуктора ризогенеза салициловой кислоты

Недостатком прототипа является то, что салициловая кислота используется в широком спектре концентраций 0,7-41,4 мг/л и требует тщательного их подбора для конкретного вида растения. В случае не удачного выбора концентрации или экспозиции воздействия салициловая кислота оказывает негативное влияние на микрочеренки [6]. Процесс образования корней значительно замедляется, в некоторых вариантах уменьшается число корней на укорененное растение и в ряде случаев их длина. Итоговая частота укоренения через 2 месяца культивирования практически одинакова во всех вариантах и незначительно превышает или находится в пределах контроля [6].

Целью изобретения является повышение эффективности ризогенеза генетически однородных микропобегов растений, полученных в культуре in vitro.

Цель достигается за счет того, что стерильные микропобеги высаживают на питательную среду укоренения на основе среды Мурасиге-Скуга [1], содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина.

Кофеин - соединение из группы метилксантинов. Это алкалоид, содержащийся в листьях чая (Thea sinensis), в семенах кофе (Coffea arabicd), в семенах какао (Theobroma cacao), в семенах кола (Cola acuminata) и в других растениях. Человеком используется как психостимулятор, поскольку сочетает психостимулирующие и аналептические свойства. Нет данных о применении данного соединения в качестве регулятора роста растений.

Пример 1.

Микропобеги ежевики сорта Логан Торнлесс длиной 1,5-2,5 см, полученные на питательной среде размножения из апикальных и латеральных почек материнского растения, помещали на среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга [1], с уменьшенным вдвое количеством макросолей и хелата железа, содержащую сахарозу - 20 г/л, пиридоксин HCl - 0,5 мг/л, никотиновую кислоту - 0,5 мг/л, тиамин HCl - 0,4, инозитол - 50 мг/л и 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты (ИМК) с добавлением 1-5000 мг/л кофеина. рН питательной среды - 5,7-5,8. Среды стерилизовали автоклавированием (1 атм., 20 мин.). Витамины, индолилмасляную кислоту и кофеин стерилизовали фильтрованием и добавляли после автоклавирования ("Millipore" 0,22 μт, France).

Контролем служила среда без кофеина.

Субкультивирование побегов осуществляли в широкогорлых конических колбах емкостью 250 мл со 100 мл среды. Колбы закрывали тонкой алюминиевой фольгой и герметизировали липкой лентой.

Культивирование растений осуществляли в специально оборудованной культуральной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 2400 люкс (люминесцентные лампы Osram L36W Cool Daylight), температуре воздуха 24±2°С и влажности воздуха 55-60%.

Эффективность обработки оценивали через месяц культивирования по числу укоренившихся микропобегов и количеству образовавшихся корней на одно укорененное микрорастение.

Применение кофеина на этапе ризогенеза позволило существенно повысить эффективность укоренения ежевики Логан Торнлесс (фиг. 1). Частота укоренения микрочеренков ежевики на среде, содержащей 1-50 мг/л кофеина, возросла от 46,7% при концентрации кофеина в питательной среде 1 мг/л до 82,6% при концентрации кофеина 10 мг/л по сравнению с 40,3% в контроле.

Среднее число корней на укорененный микрочеренок возросло от 4,2 шт. /побег при концентрации кофеина 1 мг/л до 6,2 шт. /побег при концентрации кофеина 10 мг/л по сравнению с 3,7 шт. в контроле (фиг. 2). Даже минимальная концентрация кофеина в питательной среде (1 мг/л) производила стимулирующий эффект, корни начинали образовываться быстрее, корневые зачатки закладывались дружно и одновременно (фиг. 3).

Наиболее эффективным определен диапазон концентраций кофеина от 5 до 50 мг/л. Дальнейшее повышение концентрации кофеина до 100 мг/л не способствовало повышению эффективности ризогенеза ежевики Логан Торнлесс, показатели упали до уровня контроля или несколько ниже (фиг. 1, 2, 3).

Концентрации кофеина в питательной среде свыше 100 мг/л оказывали негативное действие на растительные ткани, замедляя и останавливая процесс образования корней, останавливая рост побегов и вызывая пожелтения листьев.

Таким образом, при культивировании растительных тканей применение кофеина в концентрации выше 100 мг/л не рекомендуется

Пример 2.

Микропобеги ежемалинового гибрида Бойзенберри, достигшие на среде размножения длины 1,5-2,5 см, срезали и поместили на питательные среды и в те же условия, которые описаны в примере 1. Опытные среды содержали от 1 до 5000 мг/л кофеина и 1 мг/л ИМК. Контроль - среда MS_УК с ИМК 1 мг/л без кофеина.

Эффективность обработки оценивали через месяц культивирования по числу укоренившихся микропобегов и количеству образовавшихся корней на одно укорененное микрорастение.

Как следует из полученных результатов, рабочими концентрациями кофеина для этой культуры были концентрации от 1 до 100 мг/л.

Применение кофеина на этапе ризогенеза позволило в 1,6-1,7 раза повысить эффективность укоренения ежемалинового гибрида Бойзенберри, частота укоренения возросла до 91,7% при концентрации кофеина 10 мг/л и до 93,7% при концентрации кофеина 50 мг/л по сравнению с 56,7% в контроле (фиг. 4).

Среднее число корней на укорененный микрочеренок возросло от 4,9 шт. в контроле до 7,2 и 7,8 шт. при концентрации кофеина 10 и 50 мг/л соответственно (фиг. 5).

На контрольной среде без кофеина лишь отдельные микрочеренки укоренились быстро и образовали значительное число корней на укорененное микрорастение, тогда как на средах с кофеином образование корней происходило одновременно в массовом порядке (фиг. 6). Это вело к сокращению продолжительности этапа ризогенеза и повышению экономической эффективности метода клонального микроразмножения.

Концентрации кофеина свыше 500 мг/л были губительны для растительных тканей, вызывая некрозы оснований побегов, погруженных в питательную среду и пожелтение листьев с последующим частичным некрозом тканей побегов.

Пример 3.

Микропобеги клонового подвоя яблони 54-545, достигшие на среде размножения длины 1,5-2,5 см, срезали и поместили на питательную среду укоренения, приготовленную по прописи Мурасиге-Скуга и в те же условия, которые описаны в примере 1. Опытные среды содержали от 1 до 5000 мг/л кофеина и 1 мг/л ИМК. Контроль - среда MS_УК с ИМК 1 мг/л без кофеина.

Применение кофеина на этапе ризогенеза клонового подвоя яблони 54-118 производило положительный эффект. Частота укоренения микрочеренков возросла почти в 2 раза (фиг. 7), более чем в два раза увеличилось число корней на укорененный микрочеренок (фиг. 8).

Наиболее эффективны были концентрации кофеина 5 и 10 мг/л. Содержания кофеина в питательной среде от 1 до 10 мг/л было достаточно, чтобы у полученных микрорастений сформировалась хорошо развитая корневая система (фиг. 9). Развитая корневая система чрезвычайно важна для этапа адаптации, поскольку такие растения хорошо переносят высадку в грунт и хорошо развиваются в дальнейшем.

Литература

1. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 5, №95. - P. 473-497.

2. Будаговский A.B. Теория и практика лазерной обработки растений монография / А.В. Будаговский. - Мичуринск, 2008. - 548 с.

3. Плаксина Т.В. Влияние ультразвукового облучения на корнеобразование у земляники и вишни / Т.В. Плаксина, О.В. Мочалова, А.Л. Верещагин, В.Н. Хмелев // Ползуновский вестник. - 2011. - №4-1. - С. 250-254.

4. Шорников Д.Г. Оптимизация условий культивирования in vitro ягодных и декоративных культур / Д.Г. Шорников, С.А. Брюхина, С.А. Муратова, М.Б. Янковская, Р.В. Папихин // Вестник Тамбовского государственного университета им. Г.Р. Державина. Серия: естественные и технические науки. - 2010. - Т. 15, Вып. 2. - С. 640-645.

5. Harborne J.B. Secondary plant products. - N.Y., 1980. - 363 p.

6. Шорников Д.Г. Действие салициловой кислоты на процессы размножения и укоренения растений in vitro / Д.Г. Шорников, М.Б. Янковская, С.А. Муратова // Биология будущего: традиции и инновации. Материалы Всероссийской конференции, посвященной 90-летию Уральского Государственного Университета им. A.M. Горького. Екатеринбург, 25-28 октября 2010 г. - Екатеринбург, 2010. - С. 82-83.

7. Поротикова О.В. Действие салициловой кислоты и ИМК на этапе укоренения ежевики Whitford Tornless in vitro / О.В. Поротикова, М.Б. Янковская, М.В. Романов // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. 2013. - №5. - С. 19-21.

8. Упадышев М.Т. Салициловая кислота как регулятор ризогенеза у плодовых и ягодных культур in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Сельскохозяйственная биология. - 1998. - №5. - С. 63-68.

9. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов // Биосинтез, превращение и практическое использование. - М.: Наука, 1995. - 270 с.

10. Петрова А.Д. Хемотерапия и размножение садовых культур на питательных средах с фенокарбоновыми кислотами / А.Д. Петрова, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России. - 2000. - Т. VII. -С. 67-72.

11. Упадышев М.Т. Ауксины и фенолкарбоновые кислоты как регуляторы ризогенеза растений рода Rubus in vitro / М.Т. Упадышев, А.В. Гуськов // Сельскохозяйственная биология. - 1996. - №1. - С. 92-98.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности ризогенеза растений in vitro, заключающийся в том, что экспланты базальной частью высаживают на питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина. Изобретение позволяет повысить эффективность ризогенеза in vitro микрочеренков растений, культивируемых на питательных средах. 9 ил., 3 пр.

Способ укоренения микропобегов, включающий культивирование побегов in vitro, отличающийся тем, что побеги помещают базальной частью в питательную среду укоренения по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 1 мг/л β-индолилмасляной кислоты, с добавлением 1-50 мг/л кофеина.