Способ клонального микроразмножения княженики арктической (Rubus arcticus L.) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения ягодных культур, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала княженики арктической (Rubus arcticus L.) являющейся ценной пищевой и лекарственной и декоративной культурой. Полученные микроклоны княженики арктической могут быть использованы для создания постоянных маточных плантаций, реинтродукции в естественные места произрастания, увеличения числа регионов промышленного выращивания культуры и расширения коллекций ботанических садов.

Княженика арктическая - ценная ягодная культура, отличающаяся необычным вкусом ягод, содержанием высокого количества вторичных метаболитов, которые оказывают благоприятное действие на иммунную систему человека. Однако данная культура имеет ограниченный ареал распространения, а созданные культурные сорта размножаются в небольшом количестве и не могут обеспечить высокую потребность в посадочном материале. Перспективным направлением быстрого размножения ценных сортов и гибридов растений является способ клонального микроразмножения, позволяющий получать за короткое время генетически стабильный, высококачественный посадочный материал, с высоким коэффициентом размножения.

В мире проводятся исследования по размножению в культуре in vitro княженики арктической. Однако предлагаемые технологии мало эффективны из-за низкого коэффициента размножения и низкой адаптации микроклонов к условиям ex vitro.

Известен способ размножения in vitro и адаптации микроклонов княженики арктической (сорта Astra и Sofia) к условиям ex vitro [Макаров С.С., Тяк Г.В., Кузнецова И.Б., Чудецкий А.И., Цареградская С.Ю. Получение посадочного материала Rubus arcticus L. методом клонального микроразмножения // Изв. вузов. Лесн. журн. 2021. No 6. с. 89-99. DOI: 10.37482/0536- 1036-2021-6-89-99]. Способ заключается в размножении растений in vitro на питательной среде Мурасига и Скуга (МС), содержащей 0,5 мг/л 6-бензиламинопурин (БАЛ). Для лучшей стимуляции корнеобразования на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro предлагается добавлять в состав питательной среды ауксин индолил-3-масляную кислоту (ИМК) в концентрации 1,0 мг/л с одновременным добавлением препарата Экогель в концентрации 0,5 мг/л. Для получения максимальной приживамости растений княженики арктической при их адаптации к нестерильным условиям рекомендуется использовать кокосовый субстрат, а также верховой торф. Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения (2,9) и низкая приживаемость микроклонов в нестерильных условиях выращивания (90%).

Известен другой способ получения посадочного материала княженики арктической in vitro [Макаров С.С., Чудецкий А.И. Использование витаминно-минерального комплекса и биопрепаратов при культивировании княженики арктической (Rubus arcticus L.) // Сборник материалов юбилейной Международной научной конференции, ВИЛАР, 2021, с. 301-306. DOI: 10.52101/9785 870191003_2021_301]. Способ предусматривает культивирование микропобегов княженики арктической на питательной среде МС, содержащей 0,5 мг/л БАП и витаминно-минеральный комплекс, а при укоренении микропобегов предусматривается добавление в состав питательно среды МС 1,0 мг/л ИМК в сочетании с препаратом Экогель в концентрации 0,5 мг/л. При адаптации микроклонов в почвенный субстрат добавляли препарат Микориза. Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения (3,2) и низкая приживаемость микроклонов в нестерильных условиях выращивания (94%). Кроме того, авторами не указывается состав витаминно-минерального комплекса и концентрация препарата Микориза. Следует отметить, что состав питательной среды МС состоит из определенного минерально-витаминного комплекса, который оказывает положительное влияние на рост и развитие микроклонов растений разных таксономических групп в культуре in vitro и включение в состав питательной среды дополнительно минеральные вещества и витамины, как правило, приводит к гиперотравлению клеточных культур, что способствует образованию морфологически аномальных растений, образованию некротических тканей и гибели растительного материала.

Известен другой способ размножения княженики арктической (финские сорта Anna, Еlрее, Astra) in vitro [Петрова И.И., Сивцев В.В. Размножение садовых сортов княженики in vitro// International agricultural journal. 2022 №6, 1253-1265] включающий культивирование побегов с почками на питательной среде МС, содержащей 0,5 мг/л БАП в сочетании с 0,2 мг/л индолилуксусной кислотой (ИУК). Недостатком предлагаемого способа является разработка технологии только на этапе введения эксплантов в культуру in vitro и установление сортовых особенностей на этапе собственно микроразмножения. Полной технологии клонального микроразмножения не приводится.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится способ клонального микроразмножения княженики арктической [Макаров С.С., Упадышев М.Т., Родин С.А., Макарова Т.А., Самойленко А., Кузнецова И.Б. Адаптация растений-регенерантов княженики арктической к условиям ex vitro с применением гидропоники // Сибирский лесной журнал, 2023, №4, с. 75-82. DOI: 10.15372/SJFS20230408] предусматривающий использование в качестве эксплантов пазушных почек растений. Растения культивировали на питательной среде МС. В качестве регулятора роста на этапе пролиферации использовали БАП в концентрации 0,5 мг/л и препарат Эпин в концентрации 0,1 мг/л. На этапе укоренения микропобегов использовали ИМК в концентрации 0,5-1,0 мл/л с добавлением препарата Экогель в концентрации 0,5 мл/л. Адаптацию микроклонов проводили на гидропонной установке в режиме периодического затопления в контейнерах диаметром 6 см, заполненных на 1/3 объема стерильным керамзитом фракцией 0,5-1,0 см. Выращивание княженики арктической проводили в питательном растворе на основе полностью растворимых комплексных удобрений с микроэлементами Yara Ferticare Hydro (NPK 6:14:30) (Yara International, Норвегия) и кальциевой селитры (CaN₂O₆). Изначально все растения были высажены в контейнеры конгломератами, через 30 суток их разделяли и пересаживали по одному в каждый контейнер еще в течение 15 суток.

Недостатком способа размножения и адаптации княженики арктической является использование на этапе адаптации конгломератов микропобегов и культивирование их на гидропонной установке в течение 30 суток с последующим разделением их на одиночные побеги и вновь культивированием на гидропонике, что усложняет процесс адаптации. Кроме того, при переводе растений из условий гидропоники в почвенный субстрат приживаемость микроклонов была невысокой и составила всего 69%.

Из анализа аналогичных технических решений выявлено, что основной проблемой в данной технологии размножения княженики арктической является низкий коэффициент размножения и не высокий выход адаптированных микроклонов к условиям ex vitro. Поэтому необходимо расширить арсенал питательных сред и условий культивирования, обеспечивающих высокий коэффициент размножения, быстрое формирование побегов без морфологических изменений и 100%-ную адаптацию микроклонов к условиям ex vitro. Это позволит получать в массовом количестве высококачественный посадочный материал княженики арктической in vitro для создания постоянных маточных плантаций, реинтродукции в естественные места произрастания, увеличения числа регионов промышленного выращивания культуры, а также для расширения коллекций ботанических садов.

Техническим результатом изобретения является ускорение процесса массового получения генетически однородного, высококачественного посадочного материала княженики арктической.

Поставленная задача достигается за счет того, что в качестве первичного экспланта используют сегменты побегов с одной или двумя пазушными почками и культивируют на питательной среде, содержащей минеральные соли МС, а также БАП совместно с тидиазуроном (ТДЗ) в концентрациях 1,0 мг/л и препарат Аминовен в концентрации 1 мл/л. После трех-четырех циклов выращивания микропобеги переносят на питательную среду для укоренения, содержащую минеральные соли 1/2МС, содержащую 0,55 мг/л идолилуксусной кислоты (ИУК). Сформировавшиеся в условиях in vitro микроклоны в дальнейшем переносят для адаптации в условия аэропоники., адаптируют микроклоны к условиям ex vitro, орошая корневую систему питательным раствором, в состав которого входит 1/3 нормы минеральных солей МС с добавлением ИМК в концентрации 1 мг/л, используя при этом аэропонную систему GrowPlant X-Stream 120 (Netherlands) и светодиодную подсветку лампами красного (Δλ_0,5=646÷674 nm, λ_max=660 nm) и синего (Δλ_0,5=452÷477 nm, λ_max=465 nm) спектра и 16-часового фотопериода.

Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением питательной среды для размножения и укоренения in vitro и аэропонной установки для адаптации ex vitro княженики арктической не достигался в известных решениях.

Конкретный пример осуществления предполагаемого способа.

В качестве первичного экспланта используют сегменты побегов с одной или двумя пазушными почками, изолированных с маточных донорных растений. Перед введением в культуру in vitro экспланты последовательно обрабатывают фунгицидом в течении 20 минут, затем этанолом 70% 1 минуту и раствором CaClO₂ 5% в течение 7 минут, после чего промывают стерильной дистиллированной водой и помещают на питательную среду МС с добавлением БАП совместно с ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л и препарата Аминовен в концентрации 1 мг/л. рН питательной среды МС доводят до 5,8 перед автоклавированием. В этих условиях микрочеренки культивируют 30-40 суток до формирования из боковых почек побегов, которые в дальнейшем отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на питательной среде МС с добавлением БАП совместно с ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л и препарата Аминовен в концентрации 1 мл/л. Сформировавшиеся микропобеги в дальнейшем переносят на питательную среду для укоренения. Для этого используют питательную среду, содержащую ½ нормы минеральных солей по МС в сочетании с 0,55 мг/л ИУК. Сформированные в условиях in vitro микроклоны в дальнейшем переносят для адаптации на аэропонную установку. Для этого используют аэропонную систему GrowPlant Х-Stream 120 (Netherlands) - аэропонный клонер на 120 посадочных мест с системой орошения корневой системы питательным раствором. В качестве раствора используют 1/3 минеральных солей по прописи МС с добавлением индолилмасляной кислоты (ИМК) в концентрации 1 мг/л. При выращивании мироклонов в условиях аэропоники используют светодиодную подсветку, которая располагается равномерно от ряда к ряду с регулируемым спектром освещения и интенсивностью до 300 μmol/m^-2 s^-1. В качестве подсветки используют светодиодные лампы красного (Δλ_0,5=646÷674 nm, λ_max=660 nm) и синего (Δλ_0,5=452÷477 nm, λ_max=465 nm) спектра и 16-часовой фотопериод. Выращивание микроклонов в условиях аэропонной установки осуществляют в течение 30 суток. В этих условиях образуется мощная мочковатая корневая система, а также наблюдается интенсивный рост надземной массы. Следует отметить, что в течение 30 суток культивирования микроклонов на аэропонной установке наблюдается формирование корней длиной 23-27 см, с одновременным образованием на корнях множественного числа почек возобновления (10-15 шт. на один микроклон), которые самостоятельно в дальнейшем развиваются в полноценные растения. Адаптированные микроклоны и вновь образовавшиеся побеги переносят в почвенный субстрат для дальнейшего роста. Приживаемость микроклонов в почвенном субстрате составила 100%.

Изобретение проиллюстрировано на рисунках.

На фиг. 1 Микроклоны княженики арктической на этапе адаптации (3 сутки)

На фиг. 2 Микроклоны княженики арктической на этапе адаптации (7 сутки)

На фиг. 3. Микроклоны княженики арктической на этапе адаптации (15 сутки)

На фиг. 4 Микроклоны княженики арктической на этапе адаптации (21 сутки)

На фиг. 5 Формирование побегов из почек возобновления на корнях на этапе адаптации (25-30 сутки)

На фиг. 6 Микроклоны княженики на этапе адаптации на 8, 20 и 30 сутки (фотография из прототипа)

По учитываемым показателям исследований (коэффициент размножения, высота микропобегов, процент адаптированных к условиям ех vitro микроклонов и их морфофизиологические характеристики) заявленная технология превышает аналогичные показатели способа-прототипа (Таблица).

Таким образом, на основании проведенных исследований следует заключить, что предлагаемый способ размножения in vitro и адаптации микроклонов к условиям ex vitro позволит получать с высокой эффективностью высококачественный посадочный материал княженики арктической с хорошо развитой корневой системой и надземной частью.

Предлагаемый способ получения посадочного материала княженики арктической сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической работе для массового получения ценного посадочного материала:

1. Предлагаемый способ позволяет получать посадочный материал высокого качества, так как снижается процент гибели растений на этапе адаптации, увеличивается рост и развитие надземной массы, а также корневой системы.

2. Предлагаемый способ позволяет увеличить коэффициент размножения за счет массового образования почек возобновления на корнях микроклонов при адаптации их в условиях аэропоники.

3. Предлагаемая технология позволит снизить экономические затраты на получение посадочного материала за счет высокого коэффициента размножения и сокращения временных затрат на адаптацию микроклонов.

4. Технология предполагает проведение работ по размножению и получению ценного посадочного материала в лабораторных условиях не зависимо от сезона и негативных факторов окружающей среды.

5. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогого оборудования и дорогостоящих компонентов питательной среды.

Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам размножения и адаптации микрорастений разных таксономических групп. Использование изобретения позволит получать посадочный материал княженики арктической высокого качества с наименьшими экономическими и временными затратами за счет увеличения коэффициента размножения, формирования адаптированных микроклонов с хорошо развитой корневой системой и надземной массой растений, а также формированием дополнительных почек возобновления. Известных в научно-технической и патентной литературе способов размножения княженики арктической in vitro с использованием аналогичного состава питательной среды и технологии адаптации микроклонов к условиям ex vitro не обнаружено.

По сравнению с прототипом изобретение обеспечит ускорение получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала.

Полученный посадочный материал княженики арктической может быть использован для создания постоянных маточных плантаций, реинтродукции в естественные места произрастания и увеличения ареала выращивания, а также для расширения коллекции ботанических садов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального размножения княженики арктической (Rubus arcticus L.). Микрорастения получают из сегментов побегов, содержащих одну или две пазушных почки, которые после поверхностной стерилизации культивируют на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно включают на этапе размножения БАП и ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л и препарат Аминовен в концентрации 1 мл/л, а на этапе укоренения - ½ минеральных солей по МС и 0,55 мг/л ИУК. Адаптируют микроклоны к условиям ex vitro, используя аэропонную систему GrowPlant X-Stream 120 (Netherlands) с системой орошения корневой системы питательным раствором, в состав которого входит 1/3 нормы минеральных солей МС с добавлением ИМК в концентрации 1 мг/л и применением светодиодных ламп красного (Δλ_0,5=646÷674 nm, λ_max=660 nm) и синего (Δλ_0,5=452÷477 nm, λ_max=465 nm) спектров и 16-часового фотопериода. Изобретение позволяет получить высококачественный посадочный материал княженики арктической с хорошо развитой корневой системой и надземной частью. 6 ил., 1 табл.

Способ клонального микроразмножения княженики арктической (Rubus arcticus L.), характеризующийся тем, что полученные микрорастения в условиях in vitro из простерилизованных сегментов побегов с одной или двумя пазушными почками княженики арктической культивируют на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно включают на этапе размножения БАП и ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л и препарат Аминовен в концентрации 1 мл/л, а на этапе укоренения включают ½ минеральных солей по МС и 0,55 мг/л ИУК, адаптируют микроклоны к условиям ex vitro, орошая корневую систему питательным раствором, в состав которого входит ₁/³ нормы минеральных солей МС с добавлением ИМК в концентрации 1 мг/л, используя при этом аэропонную систему GrowPlant X-Stream 120 и светодиодную подсветку лампами красного (Δλ_0,5=646÷674 nm, λ_max=660 nm) и синего (Δλ_0,5=452÷477 nm, λ_max=465 nm) спектров и 16-часового фотопериода.