Способ выращивания морошки приземистой (Rubus chamaemorus L.) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, лесного хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного биологического получения оздоровленного посадочного материала путем микроклонального размножения с целью последующей закладки ягодных плантаций.

Известны классические способы получения посадочного материала морошки приземистой (Rubus chamaemorus L.): ее размножают семенами, так и вегетативно (делением куста, стеблевыми и корневыми черенками). Недостатками этих способов являются: маленький выход посадочного материала, грибные и вирусные болезни передаются от родительских растений, сезонность в работе (ограниченные сроки заготовки материала), необходимость поддержания в течение 4 недель высокой влажности для адаптации черенков, что приводит к увеличению затрат на получение большого объема посадочного материала и удорожанию технологии (Тяк Г.В., Макеева Г.Ю. К вопросу о семенном размножении морошки приземистой (Rubus chamaemorus L.) // Перспективы инновационного развития лесного хозяйства: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. (г. Кострома, 25-26 августа 2011 г.). Кострома: Изд-во Костром, гос. технол. ун-та, 2011. С. 82-86; Тяк Г.В., Макеева Г.Ю. Первый опыт культивирования морошки приземистой в Костромской области // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: мат-лы X Междунар. симп. (г. Пущино, 17-21 июня 2013 г.). Т. I. М.: Изд-во РУДН, 2013. С. 40-43).

Однако для получения чистосортного и здорового посадочного материала, освобожденного от вирусной и грибной инфекции используется метод клонального микроразмножения растений в культуре in vitro, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество жизнеспособных растений, предназначенных как для садоводов, так и для промышленного выращивания (Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 232 с.; Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М: ФБК-Пресс, 1999. 160 с.; Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология и биоинженерия: учеб. М.: URSS, 2015. 715 с.).

Известны питательные среды для клонального микроразмножения ягодных растений рода Rubus L., в состав которых в качестве стимуляторов для образования побегов и корней входят регуляторы роста цитокининовой, ауксиновой и фенольной природы (а/с N 1706481, кл. А01Н 4/00, 15.05.1990. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Питательная среда для укоренения побегов ежевики. Бюл. N 3 от 23.01.1992; патент RU 2080059 C1, А01Н 4/00, 27.05.1997. Высоцкий В.А., Соломонова Ф.Н. Способ получения растений-регенерантов малины in vitro; патент RU (11) 2063682 (13) C1, А01Н 4/00, 20.07.1996. Упадышев М.Т. Питательная среда для размножения ягодных и плодовых культур; патент RU 2095972 C1, А01Н 4/00, 20.11.1997. Упадышев М.Т., Гуськов А.В., Ракитин В.Ю. Питательная среда для микроразмножения растений; патент RU 2111653 C1, А01Н 4/00, 27.05.1998. Упадышев М.Т., Гуськов А.В. Питательная среда для укоренения растений in vitro). Однако во многих случаях наблюдается сильное каллусообразование, торможение процессов формирования и роста побегов и корней, а иногда и отмирание надземной системы. Также часто имеет место специфическая реакция растения на введение в состав среды тех или иных регуляторов роста в зависимости от сорта, что приводит к наличию положительного эффекта только на какой-либо одной культуре или сорте. В свою очередь это способствует снижению ценности разработки и приводит к потере ее универсальности для других культур.

Наиболее близким, к изобретению по совокупности существенных признаков относятся способы клонального микроразмножения морошки приземистой с использованием модифицированной питательной среды Мурасиге и Скуга (1962) с добавлением 6-БАП и ИМК (Thiem В. Micropropagation of Cloudberry (Rubus chamaemorus L.) by Initiation of Axillary Shoots // Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 2001. Vol. 70. No. 1. P. 11-16; Martinussen I., Nilsen G., Svenson L., et al. In Vitro Propagation of Cloudberry (Rubus chamaemorus) // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2004. Vol. 78. P. 43-49; Зонтиков Д.H., Зонтикова С.А., Малахова К.В. Влияние состава питательных сред и регуляторов роста при клональном микроразмножении некоторых хозяйственно ценных представителей рода Rubus L. // Агрохимия. 2021. №6. С. 36-42). Однако к недостаткам данных способов можно отнести недостаточно высокий коэффициент размножения на этапе пролиферации побегов и недостаточный в рамках возможного уровень укореняемости и развития корневой и надземной систем растений на этапе укоренения в культуре in vitro, а также их приживаемости после пересадки в нестерильные условия ex vitro. Это приводит к снижению выхода посадочного материала и увеличению цепочки технологического цикла его производства.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы: повышение коэффициента размножения и процента укоренения микропобегов; снижение затрат на получение стандартного посадочного материала; увеличение урожайности.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении коэффициента размножения растений морошки приземистой при снижении трудозатрат на выращивание саженцев.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата: В способе выращивания морошки приземистой, включающем посадку экспланта на питательную среду, укоренение в культуре in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, в соответствии с предложенным техническим решением:

- перед введением в культуру черенки выдерживают в растворе препарата Иммуноцитофит 0,5 г/л в течение 5 часов;

- в качестве источника углеводов в питательной среде используют глюкозу в количестве 27,0 г/л питательной среды;

- на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП 0,5 мг/л и экстракт хлореллы 1,0 мл/л;

- на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют активированный уголь 5,0 г/л и янтарную кислоту 5,0 мг/л;

- на этапе адаптации растений in vitro к почвенным условиям ex vitro используют субстрат из смеси торфа и шунгита в соотношении 3:1 и проводят подкормку водорастворимым комплексным минеральным удобрением Акварин 1,0 г/л.

Преимущества предложенного способа, поясняющими сущность изобретения представлены в таблицах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа. Примеры конкретного выполнения.

Стерилизация растительного материала. Для стерилизации стеблей, почек, и других фрагментов растений, предназначенных для вычленения экспланта, применяют различные стерилизующие растворы: водные растворы 0,1% диацида, сулемы (двухлористая ртуть), 3-6% хлорамина, 5-10% гипохлорита натрия.

После выдержки черенков в растворе препарата Иммуноцитофит 0,5 г/л в течение 5 часов, их тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, промывают бидистиллированной водой и отпускают на 5 секунд в абсолютный спирт, а затем на 5-15 минут - в основной стерилизующий раствор.

Этап введения в культуру in vitro. Свободный от вирусов посадочной материал для клонального микроразмножения растений можно получить методом культуры изолированных апикальных меристем, которые являются наиболее здоровой, свободной от вирусов частью растений и представляют собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкр) и шириной 0,25 мм. На этапе введения в культуру эксплант помещают на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением цитокинина в концентрации 6-БАП 0,5 мг/л. Полученные из апикальных меристем растения-регенеранты размножают методом микрочеренкования.

В результате исследований выявлено, что на этапе введения в культуру in vitro эксплантов морошки приземистой наиболее эффективными стерилизаторами оказались нитрат серебра AgNO₃ 0,2% и препарат Лизоформин 3000 5% при времени стерилизации 15 мин, жизнеспособность эксплантов в этих вариантах достигала 80-82%. Достаточно высокая жизнеспособность эксплантов морошки приземистой (72%) была отмечена при использовании препарата Экостерилизатор бесхлорный 5% при времени стерилизации 15 мин. При времени стерилизации 5 и 10 мин процент жизнеспособных эксплантов при обработке исследуемыми стерилизующими агентами был невысоким и не превышал 8-22% и 10-62%, соответственно.

Клоналъное микроразмножение путем черенкования. При культивировании микрорастений на питательной среде с добавлением цитокинина 6-БАП происходит снятие апикального доминирования, что приводит к активации развития пазушных меристем, которые в дальнейшем развиваются в микропобеги. Полученные адвентивные микропобеги отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на новой питательной среде. Для увеличения коэффициента размножения применяют микрочеренкование - деление побегов на черенки, содержащих одну или две пазушные почки.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения морошки на микрочеренки с 2-3 междоузлиями и пересадить на питательную среду с добавлением цитокинина 6-БАП 0,5 мг/л. Уровень рН среды должен быть 5,0…5,3. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, 16-часовой фотопериод, температура +25°С и влажность воздуха 70%. Культивирование проводят в течение 25-30 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Процесс корнеобразования in vitro. На данном этапе необходимо создать наиболее благоприятный состав питательной среды, обеспечивающий получение высокого процента укорененных микропобегов. Для этого на последнем этапе клонального микроразмножения уменьшают концентрацию минеральных солей, сахарозы, а также исключают из состава питательной среды цитокининов. Основным регуляторным фактором корнеобразования является присутствие в составе питательной среды ауксинов. Наиболее часто для этого используют ИМК или ИУК в концентрациях от 1,0 до 5,0 мг/л. Выбор гормона и его концентрации зависит от видовых и сортовых особенностей исследуемых растений. Укоренившиеся микропобеги высаживают в условия грунта для адаптации.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения на микрочеренки длиной 1,0-1,5 см с двумя междоузлиями, удаляя нижние листочки и пересадить их на питательную среду, содержащую ауксины ИМК или ИУК в концентрации 0,5-1,0 мг/л. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, фотопериод 16/8 ч, температура +25°С и относительная влажность воздуха 80%). Культивирование проводят в течение 30-50 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Выявлено, что выдерживание черенков морошки приземистой в растворе препарата Иммуноцитофит 0,5 г/л в течение 5 часов и последующее стерилизации эксплантов в растворах нитрата серебра 0,2% или препарата Лизоформин 3000 5% перед введением в культуру in vitro оказало положительный эффект на жизнеспособность эксплантов (80-82%). На этапе собственно микроразмножения наибольшие значения суммарной длины микропобегов морошки приземистой (в среднем 44,2 см) выявлены на питательной среде MS с добавлением 6-БАП 0,5 мг/л и экстракта хлореллы 1,0 мл/л. На этапе укоренения микропобегов in vitro морошки приземистой наибольшие значения суммарной длины корней (22,5 см) отмечены на питательной среде MS с добавлением активированного угля 5,0 г/л и янтарной кислоты 5,0 мг/л.

Адаптация растений in vitro к нестерильным условиям ex vitro. Для адаптации пробирочных растений в почвогрунт самым благоприятным временем года считается период со 2-й декады апреля. Тогда растения с хорошо развитой корневой системой с 2-3 листьями способны адаптироваться к условиям ex vitro. Почвенный субстрат предварительно проливают 5% раствором перманганата калия и оставляют на 14 суток в темном месте. Для лесных ягодных культур в качестве субстрата используют верховой или переходный торф и песок (3:1) и мульчируют сверху мхом сфагнумом, так как мох является хорошим антисептиком и влагоудержителем. Приготовленный субстрат раскладывают в кассеты или микропарники, в которые пересаживают растения in vitro. Температура должна быть +25°С, влажность - 80…90%. Для успешного и 100% приживаемости целесообразно использовать туманообразующую установку (как правило, используется в производственных масштабах). Для небольших партий растений целесообразно применять микропарники или использовать индивидуальное закрытие растений полиэтиленовыми стаканчиками на 14-20 суток, которые потом убирают. По мере роста растений, их пересаживают в более объемные емкости со свежим субстратом. Дальнейшее их выращивание проходит по принятой агротехнике для данного вида растения.

Растения in vitro с хорошо развитой корневой системой вынимают из пробирки пинцетом. Корни промывают в 1% раствором перманганата калия (слабо-розовый цвет) для того, чтобы впоследствии не развивалась патогенная микрофлора. Растения пересадить в кассеты с почвогрунтом, прижать почву и полить водой. После чего кассеты поставить в условия освещения (5000 лк). Каждый день необходимо опрыскивать растения в течение 1 недели, после чего провести первую подкормку раствором комплексного минерального удобрения Акварин 1,0 г/л. Через 10 суток провести первую ревизию растений.

Состав субстрата по-разному влиял на процент приживаемости, длину побегов и количество листьев морошки приземистой. Наилучший показатель приживаемости (100%) морошки приземистой составил в варианте использования смеси торфа и шунгита в соотношении 3:1, тогда как на верховом торфе - 70-75%. Применение водорастворимого комплексного минерального удобрения Акварин 1,0 г/л оказало положительное влияние на рост и развитие побегов и листьев морошки приземистой.

Технико-экономические преимущества или иная эффективность изобретения по сравнению с прототипом. Данная технология получения посадочного материала морошки приземистой (Rubus chamaemorus L.) может быть использована при массовом получении оздоровленного посадочного материала с последующей закладкой маточников, питомников и сортоучастков. Предложенный способ предусматривает использование в качестве эксплантов меристемы растений, которые пересаживаются на модифицированную питательную среду MS с добавлением глюкозы, экстракта хлореллы, активированного угля, а также янтарной кислоты и цитокининов. Данный способ позволяет повысить коэффициент размножения растений морошки приземистой в 8 и более раз, ее адаптацию в нестерильных условиях с применением субстрата из смеси торфа и шунгита (3:1) - до 100% и применением водорастворимого комплексного минерального удобрения Акварин, а также снизить в 2 раза трудозатраты при выращивании саженцев морошки приземистой.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного получения посадочного материала. Способ включает посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro. Перед введением в культуру черенки выдерживают в растворе препарата Иммуноцитофит 0,5 г/л в течение 5 часов, в качестве источника углеводов в питательной среде используют глюкозу в количестве 27,0 г/л питательной среды. На этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и экстракт хлореллы в количестве 1,0 мл/л. На этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют активированный уголь в количестве 5,0 г/л и янтарную кислоту в концентрации 5,0 мг/л. Адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси торфа и шунгита в соотношении 3:1 и проводя подкормку водорастворимым комплексным минеральным удобрением Акварин 1,0 г/л. Изобретение обеспечивает получение посадочного материала морошки приземистой. 5 табл.

Способ выращивания морошки приземистой, включающий посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, отличающийся тем, что перед введением в культуру черенки выдерживают в растворе препарата Иммуноцитофит 0,5 г/л в течение 5 часов, в качестве источника углеводов в питательной среде используют глюкозу в количестве 27,0 г/л питательной среды, при этом на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и экстракт хлореллы в количестве 1,0 мл/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют активированный уголь в количестве 5,0 г/л и янтарную кислоту в концентрации 5,0 мг/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси торфа и шунгита в соотношении 3:1 и проводя подкормку водорастворимым комплексным минеральным удобрением Акварин 1,0 г/л.