СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковки и недопустимости использования для искусственного осеменения.

Оценку качества спермы проводят по органолептическим признакам, концентрации, подвижности и переживаемости сперматозоидов, наличию морфологических отклонений, осмотической резистентности, устойчивости (толерантности) к холодовому и другим видам стресса, содержанию высокоэнергетических молекул, активности дегидрогеназ и гидролаз (гиалуронидазы, акрозина и другие), суммарной антиокислительной активности, фрагментации (целостности) окрашенного хроматина/ДНК сперматозоидов путем измерения размера гало, метилированию ДНК и др. [1-5].

Основная задача в оценке физиологического статуса клеток, связанного с характеристикой жизнеспособности и функциональной активности, заключается в выборе интегрального показателя, характеризующего состояние метаболизма, антиоксидантной, репарационной и других функциональных систем клетки. Для сперматозоидов с различным уровнем функциональной активности таким интегральным показателем может выступать способность связываться с гиалуроновой кислотой. Известно, что с гиалуроновой кислотой связываются лишь зрелые, функционально активные сперматозоиды, имеющие специфические рецепторы к ее остаткам [6].

Гиалуроновая кислота - природное соединение, которое получают из соединительной ткани животных или с помощью специальных бактерий и используют в свободном или связанном виде. Известна флуоресцентная форма гиалуроновой кислоты, представляющая собой гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином (Hyaluronate fluorescein, Sigma):

Для гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, характерно возбуждение Е_х при длине волны 470 нм и эмиссии E_m при 494-518 нм. Гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином, вследствие высокой аффинности рецепторов гиалуроновой кислоты в метастазирущих клетках используется для связывания и выявления клеток злокачественной мезотелиомы у человека. Показано, что рецепторы гиалуроновой кислоты экспрессируются только на клетках злокачественной мезотелиомы, но не на нормальных мезотелиальных клетках [7].

Гиалуроновая кислота с флуоресцентной меткой обладает слабой и быстро гаснущей флуоресценцией. При воздействии гиалуронидазы, расщепляющей гиалуроновую кислоту и в результате этого снижающей миграцию энергии между молекулами флуоресцеина, флуоресценция пробы, содержащей клетки и гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, возрастает [8].

Таким образом, применение гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, с целью связывания с наружной поверхностью мембраны сперматозоида, содержащей экспонированные рецепторы к гиалуроновой кислоте, является обоснованным и может выступать в качестве эффективного приема для оценки генетической полноценности и функциональной зрелости сперматозоидов на молекулярном уровне как способа молекулярной и клеточной диагностики.

Известен способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, в котором применен комплексный подход для оценки генетической полноценности сперматозоидов, основанный на определении риска окислительных модификаций ДНК, образовании сшивок, фрагментация хроматина, обусловленных высоким уровнем свободнорадикальных процессов, включая перекисное окисление липидов и образование активных форм кислорода, запуск процессов апоптоза в сперматозоидах [9].

Однако молекулярно-генетические исследования, несмотря на максимальную точность результатов, требуют применения сложной и дорогостоящей аппаратуры и не могут быть воспроизведены в зоотехнических и ветеринарных лабораториях.

Технический результат заключается в повышении эффективности оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе оценки генетической полноценности сперматозоидов, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом при 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми и генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считаются генетически неполноценными

Способ осуществляется следующим образом. Полученный препарат спермы разбавляют в среде для разбавления с рН 6,8-7,2, которая может быть либо лактозо-желточно-глицериновой, либо глюкозо-хелатоцитратной, либо другой, рекомендованной производителями до концентрации 1-5 млн. клеток в 1 мл. Полученный препарат спетматозоидов делят на две равные части. Одну пробу оставляют в нативном состоянии (контроль), а ко второйдобавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в конечной концентрации 0,5-1,0 ммоль. Пробы инкубируют при 37°С в течение 5-10 мин и регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 470 нм и эмиссии E_m при 495 нм. При интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми и генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными. При интенсивности флуоресценции пробы в пределах 36-49 а.u. сперматозоиды также пригодны для искусственного осеменения, как и сперматозоиды первой группы, однако при этом возрастает риск наличия у них структурно-функциональных нарушений. Оценку генетической полноценности сперматозоидов проводят при температуре 37°С, выявляя в сперматозоидах полученных образцов с помощью комплекса методик структурные изменения ядра и хроматина, модификации ДНК. При анализе генетической полноценности сперматозоидов используются методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258 и пропидиума иодида, определяется фрагментация ДНК методом Гало и с помощью флуоресцентного красителя акридинового оранжевого, анализируется интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [10-12].

Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л). Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.

При выявлении высокой интенсивности флуоресценции до 50-60 а.u. сперматозоиды оценивают как генетически полноценные, характеризующиеся высоким уровнем жизнеспособности клеток с низким апоптотическим индексом, рассчитываемым как соотношение числа клеток в состоянии апоптоза к 100 клеткам в % (ниже 80%), отсутствием одноцепочечных разрывов хроматина, с низким содержанием ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л), отсутствием внеклеточной ДНК и обладающие максимальным оплодотворяющим потенциалом. В случае если интенсивность флуоресценции пробы будет иметь величину ниже 30-35 а.u., это характеризует сперматозоиды как функционально малоактивные, имеющие высокий уровень запущенности программы апоптоза, фрагментированности ДНК, модификации белков, липидов и ДНК продуктами свободнорадикального окисления, включая перекисное окисление липидов, что свидетельствует о наличии генетических дефектов и неполноценности сперматозоидов. При интенсивности флуоресценции пробы в пределах 36-49 а.u. сперматозоиды также пригодны для искусственного осеменения, как и сперматозоиды первой группы, однако при этом возрастает риск наличия у них структурно-функциональных нарушений.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.

Источники информации:

1. ABS Global, Inc. Руководство по искусственному осеменению. Пятое издание, 2002.

2. Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы, 2010.

3. Muriel L., Rivero M.T., Goyanes V., et al. // The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation // J. Androl., 2003; 24: 59-66.

4. WO 2009059327, G01N 33/48, 30 December, 2009.

5. RU 2278382, МПК G01N 33/487, опубл. 20.06.2006.

6. Husar G., Ozensi C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril 2003; 79 Suppl 3: 1616-24.

7. Asplund Т., Heldin P. Hyaluronan receptors are expressed on human malignant mesothelioma cells but not on normal mesothelial cells. Cancer Res. 1994 Aug 15; 54(16): 4516-23.

8. Fudala R., Mummert M.E., Gryczynski Z., Rich R., Borejdo J., Gryczynski I. Lifetime-based sensing of the hyaluronidase using fluorescein labeled hyaluronic acid. J. Photochem Photobiol B. 2012. Jan 5; 106:69-73.

9. RU 2568845, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2015.

10. Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39.

11. Fernandez J.L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66.

12. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, Pages 515-540.

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для выявления генетически неполноценных сперматозоидов, их выбраковки и недопустимости использования для искусственного осеменения. Изобретение представляет собой способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, отличающийся тем, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными. Изобретение позволяет повысить эффективность оценки генетической полноценности сперматозоидов для определения целесообразности дальнейшего их использования при искусственном осеменении.

Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов, включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, отличающийся тем, что в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными.