СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗРЕЛОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/52 

Область применения: Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.

Уровень техники

Аналоги

1. Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm (Ewenson et al.) [1]. При осуществлении данного метода происходит распределение сперматозоидов на группы в зависимости от степени конденсации их хроматина, на что указывает его способность связываться с флуорохромом (акридиновым оранжевым). Метод носит описательный характер, учитывается число сперматозоидов с конденсированным хроматином, но не выделяется степень конденсации.

2. Изучение деконденсации хроматина в сперматозоидах кролика (Кузнецова И.В., Лущиков С.Б., Кузнецов А.В.) [2]. Данный метод предлагает количественную оценку процесса деконденсации хроматина сперматозоидов, происходящего под воздействием различных реагентов. Метод носит описательный характер, требует проведения сложного преаналитического этапа и одновременного применения сложных диагностических аппаратов (электронный микроскоп, спектрофлуориметр, люминесцентный микроскоп).

Прототип

Прототипом предложенного способа является метод Воробьевой О.А. и др. [3, 4]. Авторы оценивают степень конденсации хроматина, сравнивая интенсивность флуоресценции хроматина сперматозоидов до и после принудительной деконденсации гепарином. Однако четкий математический анализ, необходимый для динамического наблюдения за пациентом или для сравнения разных пациентов, в данной методике отсутствует.

Сущность изобретения

Цель изобретения заключается в разработке способа определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов.

Способ осуществляют следующим образом:

Проводят исследование эякулята, полученного способом мастурбации после 4-6-дневного периода полового воздержания. Для приготовления пробы в две пробирки, содержащие по 100 мкл спермы, добавляют по 500 мкл трис-буфера, пробирки центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, после чего удаляют надосадочную жидкость и осадок ресуспендируют в 250 мкл трис-буфера. В обе пробирки добавляют по 500 мкл детергента, содержащего тритон Х-100, и непрерывно встряхивают 30 секунд. В одну из пробирок добавляют 50 мкл гепарина (5000 ед/мл), инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Добавляют в обе пробирки по 1500 мкл нитратного буфера и по 1 мкл этидия бромида.

Измеряют флуоресценцию ДНК на проточном цитофлуориметре в красной области спектра (λ=620 нм), используя программу CELLQuest. Скорость сортировки составляет 300 клеток в секунду. Степень конденсации хроматина сперматозоидов характеризуют гистограммы распределения клеток до и после обработки гепарином. Сравнение гистограмм проводят, используя статистический метод Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия двух кривых n.

При изначальной максимальной конденсации хроматина, характерной для нормальных зрелых сперматозоидов, насильственная деконденсация гепарином приведет к значительным изменениям флуоресценции ДНК, кривые на графике будут значительно различаться и показатель n будет высоким. При аномальной организации структуры хроматина сперматозоидов насильственная деконденсация приводит к меньшим изменениям флуоресценции ДНК и показатель n будет низким.

Установлено, что значение n>48,5 свидетельствует о зрелом состоянии сперматозоидов (норма), а значение n<48,5 характеризует незрелость сперматозоидов (патология).

Пример 1. Мартынов С.В. проходил обследование по поводу бесплодного брака. При первом обследовании выявлена астенотератозооспермия, показатель n составил - 24,7 (65/03 от 2.10.03), что характеризует незрелость сперматозоидов. Проведено лечение, после которого результаты спермограммы соответствуют нормозооспермии, показатель n=62,69 (8/04 от 29.01.04), что характеризует зрелое состояние сперматозоидов. В настоящее время супруга Мартынова С.В. беременна.

Пример 2. Зубарев В.М., проходит обследование по поводу бесплодного брака. При первом обследовании выявлена астенотератозооспермия, показатель n составил 19,3 (от 08.04.03). Проведено лечение, после которого результаты спермограммы соответствуют нижним границам нормы, а показатель n=24,27 (720/03 от 16.10.03). Назначен повторный курс лечения.

Примеры показывают, что индекс подобия двух кривых интенсивности флуоресценции ДНК сперматозоидов n может служить дополнительным критерием для диагностики и оценки качества лечения пациента. Достоверно установлено, что при n большем 48,5 состояние сперматозоидов соответствует норме, а при n меньшем 48,5 состояние сперматозоидов незрелое, пациенту требуется лечение.

Источники информации

1. U.S. Patent, Date of patent: Dec. 17, 1985. Patent Number: 4559309.

2. Кузнецова И.В., Лущиков С.Б., Кузнецов А.В. Изучение деконденсации хроматина в сперматозоидах кролика. Проблемы репродукции, 4, 1995, 8-12.

3. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А., Семенова Е.В. Влияние аномальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека. Проблемы репродукции, 4, 1997, 23-26.

4. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А. Влияние аномальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека. Проблемы репродукции, 1, 1998, 14-18.

Изобретение относится к области медицины. Способ определения проводят по степени конденсации хроматина сперматозоидов на основе интенсивности флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после принудительной деконденсации гепарином методом проточной цитометрии, с использованием в качестве флуорохрома этидия бромида. Проводят измерение флуоресценции ДНК на проточном цитофлуориметре в красной области спектра (λ=620 нм), используя программу CELLLQuest, скорость сортировки 300 клеток в секунду. Используя статистический метод Колмогорова-Смирнова, проводят сравнение гистограмм с определением индекса подобия двух кривых n. При изначальной максимальной конденсации хроматина, характерной для зрелых сперматозоидов, индекс подобия n будет высоким (>48,5). При низкой изначальной конденсации хроматина, характерной для незрелых сперматозоидов, индекс подобия n будет низким (<48,5). Способ обеспечивает точность определения.

Способ определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов при исследовании эякулята, отличающийся тем, что сравнивают интенсивность флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после насильственной деконденсации хроматина гепарином посредством статической обработки методом Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия кривых интенсивности флуоресценции n, при значении которого меньше 48,5 судят о незрелом состоянии сперматозоидов, а при значении n больше 48,5 судят о зрелости сперматозоидов.