Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 G01N33/533 

Изобретение относится к области медицины для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) половых клеток мужчин и может быть использовано для обнаружения сперматозоидов, имеющих повреждения в ДНК, у мужчин, перенесших Covid-19.

Мужское бесплодие – это глобальная проблема человечества. Перспективным решением данной проблемы в урологии является исследование жизнеспособности мужских половых клеток и выявление фрагментации геномной ДНК за счёт меченных олигонуклеотидов.
На мировом рынке представлено много различных тестов и методик для определения разрывов в ДНК сперматозоидов.

Известен TUNEL-тест, сущность которого заключается в том, что при добавлении специального реактива находятся сперматозоиды с поврежденной ДНК и окрашиваются. Отличительной чертой позднего апоптоза является обширная фрагментация геномной ДНК, которая создает множество двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с доступной 3'-гидроксил (3'-OH) группой. TUNEL анализ идентифицирует апоптозные клетки с помощью терминальной деоксинуклеотидил трансфераза (TdT)-опосредованного добавления меченых (X) деоксиуридин трифосфат нуклеотидов (X-dUTP) к 3’-OH концу разрыва ДНК цепи, что затем визуализируется способом, соответствующим внедренной метке, таким образом служа показателем процентного соотношения апоптозных клеток в анализируемой клеточной популяции. Чувствительность анализа зависит от эффективности внедрения модицицированных dUTP, что определяется размером прикрепленной метки (Kyrylkova, K. Detection of apoptosis by TUNEL assay / K. Kyrylkova, S. Kyryachenko. – Текст : электронный // Methods Mol Biol : электронный журнал. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22566045/. – Дата публикации: 2012).

Недостатками TUNEL-теста являются дороговизна данного метода оценки фрагментации ДНК, а также не достаточно стандартизированные пороговые значения. Также данный метод Tunel Assay является неспецифичным, так как используется для оценки других повреждений в организме.

Известен другой тест, который также представлен на рынке – HALOSPERM тест (Halotech, Испания). Он основан на обнаружении разрывов ДНК по дисперсии хроматина вокруг ядра клетки после гидролиза. Сперматозоиды обрабатывают раствором кислоты, затем после инкубации клетки прокрашивают и просматривают в световом микроскопе. Сперматозоиды, которые содержат целую ДНК, образуют ореол дисперсии («halo-эффект»). Сперматозоиды с фрагментированной ДНК образуют минимальный ореол или не образуют его вообще. Метод прост в использовании (Феськов, А.М. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с повышенным содержанием незрелых спермиев в эякуляте / А.М. Феськов. – Текст : электронный // Мир медицины и биологии : электронный журнал. – URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=17947630. Дата публикации: 2012).

Недостатком данного способа является относительно низкая чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами исследования фрагментации ДНК.

Известен способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, заключающийся в том, что на преаналитическом этапе проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют в них гидроксиметилированную ДНК с помощью иммунофлуоресценции, затем оценивают при микроскопическом анализе флуоресценцию в не менее чем 5000 индивидуальных сперматозоидов, при этом нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0,5% от общего числа проанализированных сперматозоидов (RU 2673472, МПК G01N 33/53, опубл. 27.11.2018).

Недостатками заявленного способа являются сложность подготовки к исследованию, так как на рынке не представлено готового набора для проведения анализа, а также подсчёт клеток осуществляется лаборантом, где не исключается человеческая ошибка, что ведет к недостоверности данных.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому решению является способ оценки генетической полноценности сперматозоидов , включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными (RU 2679312, МПК G01N 33/52, опубл. 07.02.2019). Данный способ является прототипом тест-системы.

Недостатками данного способа являются малая специфичность и эффективность, так как молекулы гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, находятся в растворе, что не позволяет зафиксировать клетки.

Таким образом, представленные способы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах малоэффективны, обладают малой чувствительностью и специфичностью, а также некоторые являются недостоверными.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечении доступности используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.

Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках включает разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.

Предложенный способ обеспечивает эффективное обнаружение поврежденных сперматозоидов с фрагментированной геномной ДНК за счёт фиксации данных клеток на поверхность бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроной кислоты к рецепторам мужских половых клеток. Это улучшает и облегчает проведение дальнейшего анализа. В данном случает используется биоразлагаемая, прочная и с высокой частотой – бактериальная целлюлоза. Одним из главных плюсов также является то, что ее можно «сшить» с любыми молекулами.

В данном способе бактериальная целлюлоза с иммобизизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой используется в качестве контроля для измерения интенсивности флуоресценции, а результаты исследования выражаются в процентах относительно контроля.

Способ осуществляется следующим образом. Для получения бактериальной целлюлозы используют штамм бактерии рода Gluconacetobacter. Культивирование и получение гель-пленки проводят известным способом в среде Шрама Хетрикс.

Бактериальную целлюлозу очищают от избытка клеток, промывая 4-5 раз 1Н NaOH с выдержкой 30 мин при 80°С и проводят нейтрализацию избытка щелочи промыванием дистиллированной водой до рН 7. Затем очищенную бактериальную целлюлозу размером 2×4 см, весом 8 мг и толщиной 20 мкм высушивают при комнатной температуре и проводят сшивание флуоресцеин гиалуроновой кислоты с бактерицидной целлюлозой.

Для этого 5 мг флуоресцеин гиалуроновой кислотой растворяют в 10 мл 1%-ного раствора NaOH. Разведенный раствор флуоресцеин гиалуроновой кислоты поместить в емкость с бактериальной целлюлозой, так чтобы раствор покрывал пленку. Раствор оставляют на 60 мин, переодически перемешивая по 5 мин. Сшивание производят с помощью сшивающего агента 20%-ным 1,4-бутандиол-диглицидиловым эфиром; для этого 3 мл раствора разводят в 1%-ном растворе NaOH в соотношении 1:5, добавляют к бактериальной целлюлозе. Раствор перемешать стерильной лопаточкой в течение 10 мин. Гель-пленку поместить на водяную баню на 3 часа при 52°С для лучшего протекания реакции сшивки. Об эффективности сшивки судят по интенсивности поглощения на FTIR-ИК спектрах в диапазоне 1075-1000 см^-1, свидетельствующей об образовании эфирных связей между компонентами композиции.

После иммобилизации гель-пленку переместить в лабораторную посуду для in vitro исследований (чашка Петри культуральная, 60 мм с центральным отверстием), на поверхность которой наносится препарат спермы (в 1 – биологическая жидкость здоровых мужчин-доноров; во 2 – биологическая жидкость, полученная от мужчин, переболевших Covid-19) – 300-400 мкл. Полученные пробы оставить на 10-15 мин при 37°С для инкубации, после чего регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 494 нм и максимумом излучения при 512 нм.

Контрольным образцом является бактериальная целлюлоза с иммобилизованными остатками флуоресцеин гиалуроновой кислоты, интенсивность флуоресценции которой принимается как 100%. Снижение интенсивности флуоресценции при добавлении сперматозоидов до 40% относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными; при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.

Было показано, что у мужчин, переболевших Covid-19, процент связавшихся клеток с флуоресцеин гиалуроновой кислотой ниже за счёт снижения интенсивности флуоресценции, что свидетельствует о том, что после перенесенной болезни половые клетки утрачивают рецептор к гиалуроновой кислоте и являются генетически неполноценными.

Исследование проводилось на сперматозоидах, полученных от мужчин-доноров. У каждого мужчины уточнялись следующие данные: переболел ли Covid-19, период болезни и степень тяжести. С полученным эякулятом проводились исследования на полноценность генетической информации (Пример 1, 2).

Пример 1.

В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента А, который официально не болел Covid-19. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента А. составила 19,33%, означающая, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными.

Пример 2.

В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента Б, который официально переболел Covid-19 в конце 2021 года. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента Б. составила 50,7%, означающая, что сперматозоиды имеют большое количество разрывов ДНК и являются генетически неполноценными.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечить доступность используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.

Изобретение создано за счет средств Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (соглашение № 17051ГУ/2021 от 28.10.2021).

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках. Осуществляют разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Полученные результаты сравнивают с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля выявляют, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными. Способ обеспечивает повышение эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов за счёт их фиксации на поверхности бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроновой кислоты к рецепторам мужских половых клеток. 2 пр.

Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках, включающий разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, отличающийся тем, что интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином, интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%, сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля, при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля выявляют, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.