Способ получения туляремийного антигена Советский патент 1991 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению диагностических препаратов, и может быть использовано для конструирования иммунохимических тест- систем для обнаружения специфических противотуляремийных антител и для постановки аллергической пробы.

Известны способы приготовления антигенных препаратов из убитых формалином микробных клеток 1, из разрушенных ультразвуков микробных клеток 2 и из препаратов наружных мембран 3.

Известны способы получения разной степени очистки препаратов специфических антигенов водно-фенольной 4, водно- ацетоновой 5, и солевой 6 экстракции.

Недостатком указанных способов является использование токсических для человека веществ (фенола, эфира, ацетона), обработка которыми микробной массы может изменять нативные свойства и экстра- гируемость бактериальных антигенов. Использование цельных микробных клеток или их фрагментов (наружные мембраны) или водно-солевых экстрактов в качестве специфического антигена нежелательно из-за возможности ложноположительных реакций, связанных с наличием неспецифических антигенов.

Известен способ получения туляремий- ного антигена (туляринлизата), включающий получение микробной массы, обработку ее детергентом в течение 2 ч при 37°С для обеспечения лизиса и экстракции поверхностных антигенов туляремийного микроба с последующим прогреванием в течение 10 мин при 90°С для обеззараживания микробной массы и центрифугированием при ЮОООхд в течение 30 мин 7.

Недостатком способа является низкая степень очистки препарата специфического антигена от детергента, балластных бактериальных антигенов и нековалентно-свя- занных липидов, не обеспечивается выход стандартизованного высокоактивного препарата.

Целью изобретения является повышение антигенной активности и специфичности препарата.

В качестве исходного продукта для получения специфического белково-липопо- лисахаридного антигена туляремийного микроба используют взвесь вирулентных клеток возбудителя туляремии штамма Tr. tularensis 777. Культуру выращивают на желточном агаре Анциферова в течение 48 ч при 37°С. Затем после проверки на чистоту, путем микроскопирования, культуру смывают стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрир рН 7,2 и готовят микробную

взвесь в концентрации 20 млрд микробных клеток по ОСО мутности ГИСК имени Л.А,Тарасовича. К полученной взвеси стерильно добавляют 1 % твина-80 до конечной

концентрации, выдерживают 2 ч при 37°С и прогревают 10 мин при 90°С на водяной бане при периодическом перемешивании. Полученную микробную массу проверяют на стерильность и при отсутствии специфического роста проводят центрифугирование при ЮОООхд в течение 30 мин для освобождения от неразрушенной микробной массы. Супернатант, содержащий экстрагированные антигены туляремийного микроба,

подвергают ультрацентрифугированию при 105000хд в течение 2 ч при 4°С для осаждения белково-липополисахаридного комплекса туляремийного микроба, освобождения от детергента и низкомолекулярных соединений, Образовавшийся осадок ресуспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем проводят окончательную очистку препарата, предварительно растворенного в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,5 с добавлением 2% додецилсульфата натрия, для полного растворения антигенного осадка, гельфильтрацией на колонке с севакри- лом S-300, уравновешенной 0,01 М

аммоний-ацетатным буфером в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Препарат элюируется этим же буфером под контролем проточного спектрофотометра и самописца и собирается в пробирки по 2 мл. Объединяют фракции, содержащие целевой продукт, диализуют в течение суток против проточной воды и осаждают антиген добавлением к раствору десяти объемов охлажденного до 4°С этанола, Выдерживают смесь в холодильнике в течение суток и центрифугируют в течение 40 мин при бОООхд. Осадок растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Полученный препарат является комплексным белково-липополисахаридным антигеном. В его состав входит около 7% белка, 20% эквивалентов глюкозы (реакция с фенолом и концентрированной серной кислотой). Препарат дает положительную

качественную реакцию с Суданом черным на наличие липидов, практически свободен от примесей нуклеиновых кислот, Препарат вызывает сдвиг максимума поглощения карбоцианинового красителя Stains all

5 (Serva, ФРГ) (метахроматический эффект) в коротковолновую часть спектра (472 нм), что характерно для липополисзхаридов грамот- рицательных бактерий. Препарат иммуно- химически идентичен ЛПС, выделенному

водно-фенольной экстракцией, что следует

из слияний полос преципитации антигена, полученного предлагаемым способом и известным 4.

По своей специфической активности в иммуноферментном анализе полученный очищенный препарат превосходит препарат, полученный по известному способу 7 в 16-32 раза.

Эритроцитарный диагностикум, приго- товленный сенсибилизацией предлагаемого антигена, также пригоден для иммунохимических исследований.

При изучении биологических свойств отмечено, что полученный белково-липопо- лисахаридный антиген нетоксичен для белых мышей, стимулирует выработку антител у кроликов до титра 1:1000000 - 1:8000000, при иммунизации неочищенным тулярин- лизатом 1:6400 - 1:512000, при иммунизации водно-фенольным ЛПС - до титра 1:6400 в иммуноферментном анализе. Кроме того, препарат при изучении In vivo обладает аллергенными свойствами (накожная аллергическая реакция до 15 мм по сравнению с реакцией на введение эквивалентной дозы коммерческого тулярин-ли- зата - 7 мм).

Формула изобретения Способ получения туляремийного антигена, включающий культивирование туляремийного микроба, отделение бактериальных клеток, обработку детергентом, стерилизацию прогреванием с последующим низкоскоростным центрифугированием и выделением надосадочной жидкости, содержащей целевой продукт, отличающийся тем, что, с целью повышения антигенной активности и специфичности препарата, проводят дополнительную очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием при 105000хд в течение 2 ч, полученный осадок растворяют в 0,01 М ам- моний-бикарбонатном буфере, содержащем додецилсульфат натрия, затем очищают гельхроматографией на колонке с сефакрилом S-300, собирают фракции, содержащие античен, диализуют их, далее осаждают целевой продукт этанолом, отделяют осадок центрифугированием, растворяют его в дистиллированной воде и лиофилизуют.

Изобретение относится к медицине, а именно к получению диагностических препаратов. Цель изобретения-повышение антигенной активности и специфичности препарата. Способ включает выращивание вирулентного штамма туляремийного микроба на твердой питательной среде, экстрагирование антигена неионным детергентом Твин-80, отделение микробной массы центрифугированием и дополнительную очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием с последующей гель-хроматографией раствора полученного осадка в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере, содержащем додецилсульфат натрия, на колонке с сефакрилом S-300, диализом антиген содержащих фракций, осаждением продукта этанолом и лиофилизацией. (Л С о. о ю ел 00 о